1.

ETAPELE DEZVOLTĂRII BIOTEHNOLOGIILOR

INDUSTRIALE

Abordarea analizei, chiar sumară, a etapelor de

dezvoltare a biotehnologiilor nu se poate face fără a
remarca faptul că procesele biotehnologice nu reprezintă o
achiziţie nouă, întrucât lumea microorganismelor a existat
dintotdeauna. De exemplu, încă din antichitate a fost
posibilă fabricarea brânzeturilor prin fermentaţia laptelui,
fabricarea berii şi a vinului prin procese fermentative.
Dezvoltarea în timp a proceselor biotehnologice s-a
realizat în 5 etape, sau 5 ere:

1. Era pre-Pasteur, care s-a desfăşurat din antichitate

până în 1857, s-a concretizat prin folosirea proceselor
fermentative în mod primitiv, pe baza observaţiilor practice
pentru obţinerea de brânzeturi prin fermentaţia laptelui, a
băuturilor alcoolice (vin şi bere) şi a altor preparate
alimentare, inclusiv pâine. Indienii din America Centrală
foloseau fungi pentru tratarea rănilor infectate, iar în China
se foloseau tratamente contra infecţiilor cu culturi
microbiene din laptele acru.

2. Era Pasteur este extinsă pe perioada 1857-1940.

Pasteur a observat în 1857 că fermentaţia alcoolică este
provocată de microorganismele din drojdie
(Saccharomyces cerevisiae), mult răspândite în natură, şi
că o soluţie de zahăr, sterilizată prin încălzire, poate fi
păstrată o perioadă de timp nedeterminată, fără să
fermenteze dacă este izolată de aer printr-un dop de vată
sterilă.
Pasteur a postulat că fermentaţia zaharurilor din fructe
sau alte surse este un proces legat de funcţia vitală a
celulelor de drojdii, iar Liebig a susţinut că fermentaţia se

1
datorează descompunerii proteinelor din celulele drojdiei,
proces care antrenează şi descompunerea zaharurilor.
În 1897 Buchner a demonstrat că în celule există o
substanţă care reacţionează independent de celula vie şi
care produce fermentaţia. S-a pus în evidenţă faptul că
fermentaţia este un proces enzimatic, Buchner denumind
enzima din drojdia producătoare de fermentaţii zimază.
În această perioadă s-a evidenţiat că prin fermentaţia
butanolică cu Bacterium acetobutylicum se obţine un
amestec de 60% butanol, 30% acetonă, 10% etanol, iar
prin fermentaţia zaharurilor cu diferite tulpini de Citromyces
sau cu fungi din specia Penicillium şi Aspergillus niger se
obţine acidul citric.
Astfel că era Pasteur se caracterizează prin extinderea
dirijată a proceselor fermentative în scopul obţinerii
alcoolilor (butanol, etanol, glicerol), a unor solvenţi
(acetonă), a acizilor organici (acid citric), dar şi printr-o serie
de descoperiri epocale, precum cea a lui Fleming,
descoperitorul penicilinelor naturale în anul 1928. Acesta a
descoperit faptul că unele specii de Penicillium (în mod
deosebit P. Chrysogenum) produc o serie de substanţe
(penicilinele) care sunt mai active decât sulfamidele în
tratarea infecţiilor produse de diverse microorganisme,
utilizate pe scară largă în terapeutică. Această observaţie a
pus problema cultivării speciilor de Penicillium la nivel
industrial, inaugurându-se astfel, era antibioticelor.

3. Era antibioticelor (1940-1960). A debutat în anul în

care în Anglia a intrat în funcţiune prima fabrică de
fermentaţie submersă, pentru obţinerea penicilinei G.
Astfel s-au pus bazele unei noi industrii, care a impus
pe de-o parte, dezvoltarea unei noi ştiinţe, şi anume:
ingineria biochimică, iar pe de altă parte a aporfundat şi
dezvoltat procese cunoscute pentru separarea produselor
de biosinteză. Au apărut studii precum sterilizarea mediilor

2
de cultură, sterilizarea aerului, pasteurizarea, liofilizarea,
fermentaţia etc.
Era antibioticelor se caracterizează prin descoperirea
şi introducerea în fabricarea curenta a unei game largi de
medicamente de biosinteză, de vaccinuri, de vitamine, cât
şi prin transformări chimice în clasa steroidelor cu
microorganisme.

4. Era post-antibioticelor include perioada 1960-

1975 şi se caracterizează în prima parte prin biosinteza de
aminoacizi esenţiali, iar a doua parte prin obţinerea
enzimelor care au revoluţionat tehnologia de producere a
aminoacizilor, permiţând separarea economică a
steroizomerilor aminoacizilor sintetizaţi chimic prin
procedee rentabile, procese din care rezultă întotdeauna
amestecuri racemice.
În acelaşi timp, s-a dezvoltat puternic producţia de
enzime pentru industria detergenţilor, enzime pentru uz
industrial, enzime utilizate în medicină etc.
Au fost concepute noi tehnologii pentru obţinerea
proteinelor microbiene (single cell protein, SCP) pe substrat
de hidraţi de carbon, alcooli, deşeuri alimentare, deşeuri din
industrializarea produselor agricole, ape bisulfitice din
industria prelucrării celulozei, dar şi pe suport de parafine şi
motorină.
De asemenea, s-au dezvoltat tehnologiile de
imobilizare a enzimelor şi a celulelor microbiene conţinând
(glucozizomeraza), dar şi biotehnologii pentru polizaharide
microbiene (xantan, pullulan), cu largi utilizări în diferite
domenii. Au fost perfecţionate tehnicile de tratare a apelor
reziduale, prin procedee microbiologice.

5. Era noilor tehnologii a debutat în 1975 şi se

desfăşoară cu mult succes în prezent. De altfel, mileniul III
va fi dominat, conform previziunilor specialiştilor futurologi,
de biotehnologie şi informatică. Această eră se

3
caracterizează prin dezvoltarea ingineriei genetice şi a
donării de gene, ceea ce a permis obţinerea suşelor
microbiene cu proprietăţi genetice prestabilite, oferind
posibilitatea atingerii, la preţuri modice, a unor performanţe
ridicate ale biosintezei produselor de mare utilitate. În acest
context, pot fi amintite biosinteza insulinei umane şi a
hormonului creşterii.
S-au obţinut biosenzori, anticorpi monoclonali,
vaccinul antidiareic, s-au dezvoltat culturile de ţesuri, tehnici
noi de imobilizare a enzimelor, ingineria proteinelor (pentru
modificări structurale prestabilite). De asemenea, a fost
utilizarea sistemelor computerizate în conducerea şi
controlul proceselor biotehnologice, în paralel cu
conceperea de noi tipuri de bioreactoare şi noi procedee de
separare.
Toate acestea demonstrează că biotehnologiile sunt
chemate să reprezinte alternativa viabilă a acestor
tehnologii neperformante şi poluante din diverse sectoare
ale activităţii. Biotehnologiile constituie baza viitoarelor
tehnologii neconvenţionale şi conceperea acestor noi
biotehnologii nu poate fi realizată fără dezvoltarea
simultană a ingineriei biochimice, care reprezintă
fundamentul biotehnologiilor cu performanţe economice
deosebite.

4
 1.1. Etapele elaborării tehnologiilor de biosinteză

Procesul de bază din tehnologiile de biosinteză este

un "proces biologic” (de fermentaţie), transpus la scară
industrială, ceea ce a făcut ca el să aparţină unui nou
domeniu, cel al ingineriei biochimice, domeniu care
studiază procese de fermentaţie aerobe şi anaerobe şi
elaborează tehnologiile pentru obţinerea antibioticelor,
vitaminelor, hormonilor, alcoolilor, proteinelor, a produselor
destinate agriculturii, culturilor de celule etc.
O tehnologie de biosinteză poate fi reprezentată printr-
o schemă bloc (figura 1.1) ca o succesiune de trepte
specifice în care rolul central îl deţine treapta de fermentaţie
biochimică.
Suşă

Materii Treapta Treapta Treapta

prime A B C

Aer steril

Figura 1.1. Reprezentarea schematică a unui proces de

biosinteză

Treapta de prelucrare A include procesele

premergătoare fermentaţiei biochimice, respectiv:
pregătirea mediilor de cultură, sterilizarea mediilor,
sterilizarea aerului tehnologic şi sterilizarea aparaturii, iar
treapta de prelucrare C cuprinde procesele prin care se
realizează separarea produselor obţinute prin biosinteză,
incluzând eventuala recirculare a unei părţi din biomasă
sau recircularea fazei lichide, dacă nu au fost epuizate în
totalitate componentele mediului de cultură (aceste

5
recirculări sunt specifice proceselor continue de
fermentaţie).
În treapta B de prelucrare biochimică are loc procesul
de biosinteză prin fermentaţie aerobă sau anaerobă,
reprezentând treapta determinantă pentru performanţele
biotehnologiei, performanţe dependente, pe de o parte, de
productivitatea suşei folosite, legată direct de potenţa
acesteia, compoziţia mediului şi gradul de sterilitate, iar pe
de altă parte, de performanţele proceselor specifice
ingineriei biochimice care intervin în conducerea
fermentaţiei (transfer de masă, căldură, impuls, criterii
geometrice etc.).
Prin urmare, caracteristica fundamentală a
biotehnologiilor constă în aceea că productivitatea obţinută
pe m3 de bioreactor, cu aproximativ aceleaşi cheltuieli,
diferă de la un producător la alt producător în limite foarte
largi (40-90%), iar aceste diferenţe sunt determinate de cele
două caracteristici prezentate mai sus (productivitatea suşei
şi performanţele proceselor bioinginereşti).
Conceperea, elaborarea şi aplicarea tehnologiilor
biochimice, domeniu interdisciplinar prin excelenţă, se
poate realiza numai printr-o colaborare strânsă între
microbiologi, geneticieni, biochimişti, ingineri biochimişti,
ingineri automatişti şi specialişti în conducerea
computerizată a proceselor industriale. Rolul fiecăruia este
bine determinat, iar implicarea se face într-o anumită etapă.
Dacă microbiologii şi geneticienii trebuie să ofere o suşă
înalt productivă, în faza de fermentaţie trebuie să existe o
colaborare strânsă între microbiolog, biochimist, care oferă
informaţiile necesare privind stadiul şi direcţia de biosinteză,
pe baza determinării componentelor din mediul de cultură,
şi inginerul biochimist, care urmăreşte evoluţia proceselor
specifice biosintezei, astfel încât să fie atinse performanţele
aşteptate. Aceşti trei specialişti nu pot fi substituiţi unul cu
celălalt. În acelaşi,timp, tehnologiile cu productivitate

6
ridicată nu pot fi realizate fără a se apela la controlul
automat al parametrilor şi fără a fi asistate de calculator.
În elaborarea tehnologiilor de biosinteză se parcurg
următoarele etape:
1. izolarea tulpinilor de microorganisme utile;
2. ridicarea productivităţii tulpinilor prin mutaţie şi selecţie
repetată;
3. cultivarea microorganismelor pe medii potrivite în
bioreactoare adecvate;
4. separarea produselor biosintetizate;
5. caracterizarea şi utilizarea produselor biosintetizate.
Din cele prezentate mai sus, rezultă că tehnologiile
biochimice aparţin unui domeniu de graniţă între biologie şi
ştiinţele inginereşti, şi anume ingineria biochimică, care a
preluat din biologie legile de izolare prin selecţie şi mutaţie
a tulpinilor active, iar din ingineria chimică legile transferului
de masă, căldură, impuls, la care şi-a adăugat legi şi
procese proprii, definindu-se, astăzi, ca o nouă ramură a
ştiinţei care tinde să domine lumea.

1.1.1. Selecţia şi ameliorarea genetică a suşelor

Tulpinile de microorganisme, izolate de pe fructe,

cereale, deşeuri alimentare, din sol, sunt supuse unui
proces de selecţie în scopul obţinerii unei suşe active. Cea
mai eficientă metodă de obţinere a suşelor înalt productive
o reprezintă selecţia sub influenţa factorilor mutageni.
Selecţia mutanţilor se face prin metode repetate de
tratament mutagen, urmat de selecţia celor mai viguroşi
mutanţi.
Mutanţii sunt acele microorganisme care apar
întâmplător, în mod natural, sau ca rezultat al tratării cu
diferiţi factori fizici, respectiv chimici, şi care se disting prin
caractere diferite faţă de masa microorganismelor din care
provin. Mutanţii apar spontan printr-un mecanism de
modificare la nivelul genelor. La acest proces este afectat

7
un număr foarte mic de celule, şi anume 10-10 – 10 -6 celule
în mutaţia naturală, respectiv 10-3 – 10-2 celule sub acţiunea
agenţilor mutageni, din numărul total de celule supuse
mutaţiei.
Suşele obţinute prin repetarea proceselor de tratare
mutagenă-selecţie a permis creşteri impresionante ale
randamentului în produse utile. Astfel, pentru suşa
producătoare de penicilină (Penicillium chrysogenum), care
în condiţii naturale produce 1-20 mg/l, prin tratamente şi
selecţie s-a ajuns la o producţie de 55-60 g/l. Creşterea
productivităţii suşei este dependentă de numărul de cicluri
mutaţie-selecţie. Astfel, pentru suşa producătoare de
leucomicină, dependenţa dintre numărul de cicluri de
ameliorare-selecţie şi capacitatea de producţie este
prezentată în tabelul 1.1.

Tabel 1.1. Dependenţa dintre numărul de cicluri de

ameliorare şi pacitatea de producţie a suşei, pentru
biosinteza leucomicinei

Număr de
Nr. Capacitatea
cicluri
de de producţie,
mutaţie-
t. mg/l
selecţie
Suşa
1 70
originală
2 10 1.200
3 20 2.800
4 30 5.600
5 40 9.200
6 50 11.000

Tratamentele mutagene se fac cu agenţi fizici, precum:

razele UV, raze X, raze ionizate, raze γ, agenţi chimici, ca
de exemplu: agenţi alchilanţi (metil-etil-sulfonat, N-metil-N'-
nitro-N-nitrozoguanidină), agenţi nonalchilanţi

8
hidroxilamina, 4-nitrochinolin-l-oxid), baze analoage (5-
bromuracil-analog al imidinei, 2-aminopurină-analog al
adeninei), şi agenţi de intercalare (acridin-orange, etidium
bromură), precum şi tratamente combinate. Numărul de
suşe tratate care se examinează pentru un mutant
ameliorat este variabil. Acest număr este estimat la 50 – 2
000 pentru o ameliorare de 5% şi la 1 000 – 20 000 pentru
o ameliorare de 10%.
Toţi agenţii mutageni sunt cancerigeni, ceea ce
impune măsuri deosebite de protecţie în procesul de
selecţie a tulpinilor înalt productive.
Suşa obţinută prin mutaţie-selecţie trebuie să posede
câteva calităţi deosebite, şi anume productivitatea ridicată
simultan cu conservarea calităţilor obţinute prin selecţie.
Pentru caracterizarea completă a suşei înalt productive,
trebuiesc determinate principalele caracteristici:
• indicatorii de creştere ai microorganismelor;
• rezistenţa la acţiunea produsului biosintetizat şi a
enzimelor de degradare;
• dependenţa rezistenţei de concentraţia precursorului;
• rezistenţa la factorii externi (lumină, pH, oxigen,
temperatură) în procesul de conservare.
Principalii indicatori de creştere ai microorganismelor
sunt:
a. rata de creştere, μ, definită prin raportul dintre
numărul de generaţii apărute în unitatea de timp (μ = n/t),
ceea ce sugerează că rata de creştere variază progresiv pe
toată perioada multiplicării până la o concentraţie maximă,
ce caracterizează starea de creştere constantă a culturii
microbiene.
b. numărul de generaţii, n, reprezintă intervalul de
timp în care numărul de microorganisme se dublează.
Astfel, dacă la un moment dat numărul de microorganisme
este Xo, prin diviziune celulară în prima treaptă numărul
devine Xi = 2Xo, iar timpul necesar constituie o măsură a
duratei de apariţie a unei noi generaţii. Repetarea

9
procesului de diviziune înseamnă creşterea numărului de
generaţii, astfel încât, după un timp oarecare, numărul de
microorganisme devine:

Xn=2n - Xo (1.1)

această ecuaţie permiţând determinarea numărului de

generaţii.
c. timpul de generaţii, Td, cunoscut şi ca timp de
dublare a masei celulare, este definit ca timpul necesar
dublării masei celulare a populaţiei microbiene raportat la
momentul declanşării procesului de creştere. Acest
indicator se exprimă în ore sau minute şi poate fi determinat
cu relaţia:

t
Td =
n
(1.2)

Admiţându-se că procesul de fermentaţie se

analizează după 20 ore, timp în care au apărut 5 generaţii,
rezultă că Td = 20/5 = 4 ore. Deci, dublarea masei celulare
se face după 4 ore. Analizând aceste date, se poate afirma
că este posibil de calculat cantitatea de celule acumulate
după un timp de fermentaţie fie în funcţie de numărul de
generaţii, fie în funcţie de timpul de generaţii, cu expresia:
t
−
Xt = 2 ⋅ Xo = 2
n Td
⋅ Xo (1.3)

Obţinerea de suşe rezistente la produsul biosintetizat

şi negenerarea enzimelor care pot degrada antibioticele,
constituie două condiţii de bază pentru programul de
ameliorare a suşei. Luând exemplul biosintezei
leucomicinei, se constată că există o corelaţie directă între
gradul de rezistenţă a masei microbiene la leucomicină şi
productivitatea în acest antibiotic.

10
 Această dependenţă este extrem de importantă, nu
numai pentru antibiotice, ci şi pentru alte fermentaţii în care
produsul biosintetizat poate juca rolul de inhibitor. Din cele
prezentate, se desprinde concluzia că în stabilirea
numărului de cicluri de mutaţie-selecţie trebuie luată în
consideraţie şi această corelaţie.
Adăugarea precursorilor în mediul de cultură permite
dirijarea fermentaţiilor spre obţinerea anumitor produse,
absenţa acestora conducând la reducerea drastică a
concentraţiei finale a produselor utile. Astfel, în absenţa
acidului fenoxiacetic, respectiv fenilacetic, antibioticele β-
lactamice biosintetizate de P. chrysogenum şi proporţiile
acestora au fost: acid 6-aminopenicilanic 50%, penicilina K
30%, penicilina DF 15%, alte molecule neidentificate
(probabil penicilina F) 4-5%. Prin adăugarea acidului
fenilacetic în mediu, s-a obţinut cu precădere penicilină G,
în timp ce penicilina K a reprezentat sub 10% din total, iar
proporţia de acid 6-aminopenicilanic şi penicilină DF a
scăzut sub 3%.
Deoarece în foarte multe tehnologii de fermentaţie se
utilizează precursori, se pune problema analizei influenţelor
pe care le poate avea precursorul asupra procesului de
biosinteză. Pentru a avea răspunsul, este necesar să se
aplice un program de experimentare care să reflecte
influenţele produse de precursor asupra fermentaţiei
diferiţilor mutanţi, exprimaţi prin suşele corespunzătoare.
Marea majoritate a studiilor existente în literatura de
specialitate subliniază faptul că obţinerea unor suşe înalt
productive este dificilă şi nu la îndemâna oricui, dar
conservarea calităţilor mutantelor este şi mai dificilă şi, de
obicei, constituie secretele producătorilor de suşe
ameliorate înalt productive. Se pare că această conservare
a calităţilor dobândite prin mutaţie-selecţie şi prevenirea
apariţiei unor noi variante mai slabe (tulpina selectată
devine extrem de labilă la factorii externi datorită tratărilor

11
mutagene) se poate face prin liofilizare, care conservă
capacitatea vitală şi productivitatea sporilor.
Din aceştia se iau spori care se însămânţează pe un
mediu de geloză (agar-agar), se menţin la incubat 4 zile la
23°C, după care se examinează omogenitatea coloniei
apărute. O parte din acest material biologic se conservă pe
un mediu de protecţie (de exemplu, 20% glicerol, 1%
peptonă), la temperatura ambiantă, iar peste restul de
material biologic se adaugă 100 ml mediu de cultură utilizat
industrial şi se menţine 24 ore sub agitare la 23°C. Se
examinează, din nou, cultura microbiană, după care se
selecţionează mutantele cele mai viguroase, care constituie
materialul de inoculare pentru cultivare la nivel industrial.
Dintre microorganismele utilizate în industria de
biosinteză, bacteriile şi fungii sunt predispuse, într-o măsură
mai mare, să dea mutanţi, fungii permiţând obţinerea
mutanţilor cu productivităţi de 20 000 – 45 000 de ori mai
mari comparativ cu tulpina naturală.

1.1.2. Medii de cultură

Suşa activă obţinută este cultivată pe un mediu nutritiv

steril. Mediile de cultură sunt formate din soluţii apoase care
conţin substanţele necesare creşterii microorganismului
cultivat şi elaborării produsului dorit.
În funcţie de natura componentelor care intră în
compoziţia lor, mediile de cultură sunt: sintetice,
semisintetice şi organice. Indiferent de mediul utilizat,
pentru dezvoltarea microorganismelor trebuie asigurate
sursele de energie, azot, fosfor, săruri minerale,
oligoelemente.
În practică se folosesc, curent, mediile semisintetice
pe bază de extract de porumb cu adaos de hidraţi de
carbon şi săruri minerale. Datorită inconstanţei proprietăţilor
şi compoziţiei extractului de porumb, rezultatele fazei de

12
fermentaţie nu sunt reproductibile, ceea ce constituie
marele inconvenient al acestor medii.
În prezent, se cercetează intens extinderea mediilor
sintetice, perfect reproductibile la scară industrială, dar
rezultatele obţinute sunt mai puţin cunoscute, ele
constituind secretul de fabricaţie al firmelor care le-au
experimentat.
Pentru ridicarea randamentelor în faza de biosinteză,
este necesară adăugarea în mediul de cultură a anumitor
substanţe care conţin porţiuni structurale ale moleculei
produsului de biosinteză; aceste fragmente poartă,
denumirea de precursori. Nu toate tulpinile au acelaşi mod
de a reacţiona sub, influenţa precursorilor. Eficacitatea
precursorului depinde de compoziţia mediului de cultură,
aeraţie şi agitare.
Utilizarea ca precursor a unor substanţe chimice este
dependentă de stabilitatea lor în timpul fermentaţiei,
respectiv de uşurinţa oxidării lor de către miceliu, ceea ce
face ca eficienţa lor să se reducă puternic, iar produsele de
oxidare pot avea efect contrar.

1.1.3. Procedee de fermentaţie

Adoptarea unui anumit procedeu de fermentaţie este

condiţionată de asigurarea celor mai bune condiţii de
dezvoltare a microorganismelor, fără a fi neglijate
caracteristicile tipurilor de microorganisme cultivate (aerobe
sau anaerobe, cultivabile în sistem septic sau aseptic etc).
Procedeele de fermentaţie pot fi clasificate în funcţie
de:
1. modul de realizare a culturilor microbiene:
- culturi în suprafaţă
- culturi în profunzime
2. necesarul de oxigen:
- sisteme de fermentaţie aerobe
- sisteme de fermentaţie anaerobe

13
 3. modul de funcţionare a instalaţiei de fermentaţie:
- fermentaţii discontinue
- fermentaţii continue.
Fermentaţiile în suprafaţă se practică mai rar şi, de
obicei, pentru microorganisme anaerobe. Fermentaţiile în
profunzime se utilizează la majoritatea proceselor de
creştere a microorganismelor. Industrial, acest tip de
fermentaţie poate fi realizat prin procedee de fermentaţie
discontinuă şi procedee de fermentaţie continuă.
Fermentaţia discontinuă, întâlnită în literatura de
specialitate şi sub denumirea de "sistem de cultivare batch",
se caracterizează prin aceea că microorganismele parcurg
într-un singur bioreactor toate etapele de dezvoltare, după
care procesul se reia de la capăt.
Deoarece în acest sistem de fermentaţie nu se poate
asigura de la început întreaga cantitate de substrat limitativ
(o concentraţie mare a acestuia în mediul de cultură
manifestă un efect inhibitor pentru creşterea
microorganismelor, fenomen cunoscut sub denumirea de
inhibiţie de substrat), se impune adăugarea de substrat,
precum şi de precursori, pe parcursul procesului
fermentativ, fapt care generează probleme suplimentare în
menţinerea sterilităţii în bioreactor.
Fermentaţia continuă, studiată foarte mult în ultimii
ani, oferă o serie de avantaje comparativ cu procedeul
discontinuu:
 utilizarea bioreactoarelor de capacitate mai redusă;
 realizarea mai eficientă a proceselor de transfer de
masă, căldură şi impuls;
 productivitate sporită;
 epuizarea mai avansată a componentelor mediului de
cultură.
Procesul de fermentaţie continuă poate fi realizat într-
un singur bioreactor sau într-o baterie de bioreactoare, cu
un debit constant (viteză de diluţie constantă), caz în care
acest sistem mai este întâlnit în literatură sub denumirea

14
"cultivare continuă tip turbidistat sau chemostat", în funcţie
de stadiul de dezvoltare al microorganismului. De
asemenea, acelaşi proces continuu poate fi realizat în mai
multe bioreactoare aranjate liniar, cu variaţie a vitezei de
diluţie sau a debitului de alimentare prin baterie. Ambele
sisteme pot funcţiona fie cu recircularea unei părţi din
biomasă, fie cu recircularea fazei apoase, dacă aceasta
conţine cantităţi apreciabile din componentele nutritive.
Se mai remarcă un sistem de fermentaţie continuă
cunoscut sub denumirea de "sistem de cultivare sincronă",
caracterizat prin aceea că întreaga populaţie de
microorganisme din bioreactor este foarte asemănătoare ca
vârstă, dimensiuni şi productivitate. Tehnicile şi metodele
cele mai folosite pentru obţinerea unui sistem de cultivare
sincron sunt:
• filtrarea biomasei cultivate un anumit timp printr-o
membrană care permite trecerea, odată cu faza lichidă,
numai a microorganismelor de anumite dimensiuni, folosite
ulterior pentru obţinerea culturilor sincrone (de obicei, se
filtrează culturile aflate în etapa creşterii exponenţiale).
• centrifugarea unei culturi microbiene cu gradienţi de
densitate, procedeu bazat pe aceea că microorganismele
de dimensiuni mai mici (aflate la începutul etapei de
diviziune) sedimentează mai greu şi sunt antrenate în
lichidul separat, acesta fiind, apoi, supus fermentaţiei.
Sistemul de fermentaţie sincronă se utilizează atunci
când biosinteza decurge în două etape distincte: creşterea
biomasei şi, apoi, biosinteza produsului activ, situaţie în
care produsele elaborate pot manifesta un efect inhibant
pentru dezvoltarea populaţiei microbiene tinere.
Există şi alte procedee de obţinere a culturilor
sincrone, bazate pe modificări ale mediului şi ale condiţiilor
de cultivare, în mod special exploatându-se influenţa
temperaturii într-un anumit stadiu de diviziune celulară,
precum şi influenţa anumitor tratamente chimice.

15
 1.1.4. Separarea produselor obţinute prin
biosinteză

Scopul proceselor de fermentaţie îl reprezintă fie

obţinerea biomasei microbiene, utilizabilă ca sursă de
proteine SCP, fie a metaboliţilor primari (aminoacizi, acizi
organici, nucleotide purinice şi pirimidinice, etanol, butan
acetonă, vitamine) şi a metaboliţilor secundari (antibiotice,
alcaloizi, hormoni de creştere de tip gibereline, antifungice,
substanţe antitumorale), a enzimelor microbiene (proteaze,
amilaze, lipaze, pectinaze, catalaze, invertaze etc.), a
polizaharidelor microbiene (dextrani, xantani, pullulan) etc.
Aceste produse se găsesc, în cea mai mare parte, în faza
lichidă, dar există şi numeroase cazuri în care produsele
utile sunt localizate intracelular.
Din aceste motive, procedeele de separare utilizate în
tehnologiile de biosinteză se pot clasifica în două grupe
principale:
 procedee de separare a fazei solide (masă
microbiană), care se folosesc apoi ca atare sau se
prelucrează pentru separarea produselor utile
intracelulare;
 procedee de separare a antiboticelor, enzimelor,
polizaharidelor microbiene etc. din soluţia apoasă.
Alegerea procedeului de separare a fazei solide se
face în funcţie de proprietăţile fizice, chimice şi biologice ale
mediului, precum şi de cantitatea de mediu care trebuie
prelucrată. Pentru separarea masei microbiene se
utilizează filtrarea, realizabilă prin centrifugare sau cu
ajutorul filtrelor rotative, cu sau fără modificarea
proprietăţilor reologice ale suspensiei de biomasă, cu sau
fără adaos de substanţe filtrante.
În ultimul timp, au fost dezvoltate procedee care
realizează separarea biomasei simultan cu extracţia

16
produselor extracelulare. Dacă scopul fermentaţiei a
constat în obţinerea de proteine microbiene (SCP) de uz
veterinar, separarea fazei solide se face prin atomizare.
În cazul în care produsele de metabolism (primar sau
secundar) şi enzimele sunt localizate intracelular, biomasa
separată se usucă, se macină, prin diferite procedee, în
scopul distrugerii membranei celulare, după care se supun
extracţiei cu solvenţi.
Separarea produselor utile din soluţia rezultată de la
fermentaţie, după îndepărtarea fazei solide, constituie o
problemă dificilă, datorită labilităţii structurale a produselor
biosintetizate. Pentru a se putea alege cel mai adecvat
procedeu, este necesară cunoaşterea proprietăţilor fizico-
chimice ale produsului care urmează a fi separat din soluţia
apoasă, ca şi comportarea lui în anumite condiţii de mediu
ambiant.
Principalele proprietăţi care se impun a fi cunoscute
sunt:
1. solubilitatea:
- în apă şi soluţii diluate de săruri;
- în solvenţi polari (metanol, acetonă, butanol);
- în solvenţi slab polari (cloroform, hidrocarburi);
2. stabilitatea în soluţie:
- domeniul optim de pH;
- efectul temperaturii;
- efectul soluţiilor-tampon;
- efectul solvenţilor organici;
- efectul liofilizării;
3. stabilitatea în stare solidă:
- efectul temperaturii;
- efectul oxigenului şi al umidităţii;
4. principalele proprietăţi fizice si chimice în soluţie:
- dializabilitatea prin membrane;
- adsorbţia pe suporturi solide;
- migrarea în câmp electric funcţie de valoarea
pH-ului;

17
 - sedimentarea în ultracentrifugare;
- stabilitatea la acţiunea diverselor enzime;
- stabilitatea la acţiunea unor agenţi chimici.;
Pentru separarea produselor utile din faza lichidă
rezultată de la fermentaţie, se pot aplica următoarele
tehnici:
• extracţia fizică cu solvenţi organici;
• extracţia reactivă în solvenţi organici cu diferiţi
extractanţi;
• extracţia cu fluide supercritice;
• extracţia în sisteme apoase bifazice;
• sorbţia pe schimbători de ioni;
• distilarea;
• cromatografia;
• separarea şi concentrarea prin tehnici membranare
(ultrafiltrare, osmoză inversă, electrodializa);
• complexarea produsului biosintetizat cu reactivi
specifici, distrugerea complexului şi extracţia cu solvenţi;
• precipitarea etc.
În extracţia fizică direct din soluţie sau după eliberarea
din complex, este necesar ca produsul să treacă prefenţial
în solvent, respectiv valoarea coeficientului de repartiţie K
(definit ca raportul concentraţiei produsului din solvent şi
concentraţia sa în faza apoasă după stabilirea echilibrului
dintre faze trebuie să fie cât mai mare, pentru a favoriza
grade de extracţie ridicate şi un consum cât mai redus de
solvent. Uneori, pentru mărirea coeficientului repartiţie se
apelează la o serie de metode de reducere a solubilităţii
produsului în faza apoasă, cum ar fi adăugarea unor săruri.
În ultimii ani se studiază din ce în ce mai intens
utilizarea extracţiei reactive, procedeu în care solubilizarea
produselor de biosinteză într-un solvent organic se
realizează pe baza unei reacţii chimice cu un agent de
extracţie (denumit şi extractant, agent purtător). Extractanţii
sunt compuşi organici cu structuri voluminoase, solubili, de
preferinţă, în faza organică, capabili să reacţioneze cu

18
produsul util şi să formeze compuşi solubili numai în faza
organică. Performanţele extracţiei reactive, comparativ cu
cea fizică, sunt superioare ca rezultat al participării
simultane a celor două tipuri de extracţie, fizică şi reactivă
la realizarea separării.
Utilizarea extracţiei cu fluide supercritice permite, pe
de o parte, evitarea degradării produselor extrase, datorită
condiţiilor termice blânde de operare, iar pe de altă parte,
oferă eficienţă sporită, comparativ cu alte procedee de
separare. Fluidele supercritice prezintă avantajul îmbinării
puterii de solubilizare specifice lichidelor cu capacitatea de
transport a gazelor.
Pentru separarea, în special, a moleculelor proteice,
au fost propuse sisteme de extracţie bifazice apoase,
constituite din amestecuri de două soluţii apoase ale unor
polimeri diferiţi sau dintre o soluţie apoasă a unui polimer şi
a unei sări, care, pentru anumite valori ale concentraţiei
componenţilor, devin două faze distincte. Prin modificarea
concentraţiei componenţilor sau a valorii acestor parametri
(pH, concentraţie electrolit, temperatură), sunt posibile
separări selective din amestecuri a produselor
biosintetizate, cu conservarea caracteristicilor acestora.
Extracţia cu schimbători de ioni, un caz special de
absorbţie, se bazează pe schimbul dintre ionii aflaţi în
soluţie şi cei reţinuţi de particulele solubile. Capacitatea
mare de absorbţie şi selectivitatea ridicată a răşinilor au
impus folosirea lor pe scară largă. Alegerea unui anumit
schimbător de ioni se face în funcţie de caracterul chimic al
produsului care se separă, mărimea lui moleculară,
stabilitatea în condiţiile extracţiei şi eluţiei. Această tehnică
de separare evită folosirea solvenţilor costisitori şi oferă
randamente ridicate.
Metodele cromatografice prezintă importanţă mai
redusă, ele fiind aplicate, în principal, pentru purificarea
produselor brute obţinute prin utilizarea anterioară a
celorlalte procedee de separare.

19
 1.2. Rolul ingineriei biochimice în dezvoltarea
biotehnologiilor

Studiul mecanismelor de biosinteză, dirijarea şi

controlul lor, precum şi studiul proceselor care
influenţează sensul de desfăşurare şi performanţele
fermentaţiei sunt doar câteva din problemele majore ale
tehnologiilor de biosinteză. Spre deosebire de tehnologiile
chimice, la care numărul de factori determinanţi este redus,
în biotehnologie factorii determinanţi ai procesului sunt
numeroşi şi legaţi organic între ei, astfel încât modificarea
unuia provoacă modificarea indirectă a celorlalţi. În acest
sens, este suficientă afirmaţia că, pentru un regim normal
de biosinteză, trebuiesc stabilite programe care să
coreleze, pe tot parcursul fermentaţiei, regimul de agitare
cu aportul de oxigen, cu regimul optim de temperatură, cu
valoarea pH-ului şi a rH-ului, în condiţiile în care
acumularea biomasei produce o modificare permanentă a
parametrilor reologici din bioreactor.
Explicarea mecanismului prin care regimul
hidrodinamic influenţează dezvoltarea microorganismelor
reprezintă o altă problemă extrem de importantă pentru
stabilirea regimului tehnologic, pentru perfecţionarea
formelor constructive ale bioreactoarelor şi pentru
determinarea corelaţiei dintre forma constructivă a
bioreactorului şi performanţele proceselor de transfer (de
masă, căldură, impuls), în strânsă legătură cu condiţiile
impuse de atingerea unei productivităţi maxime.
În concluzie, optimizarea procesului de biosinteză
poate fi realizată nu prin stabilirea condiţiilor concrete de
aerare şi agitare, ale valorii pH-ului, rH-ului etc, ci prin
întocmirea programelor care să coreleze parametrii
tehnologici în continuă modificare (ca rezultat al modificării
vâscozitătii biomasei) cu parametrii care caracterizează
activitatea biologică a microorganismului.

20
 În aceste condiţii, luând în considerare şi problemele
proceselor care urmează fazei de fermentaţie - fază de
maximă importanţă în orice biotehnologie, se poate afirma
că ingineria biochimică este solicitată să dea soluţii în
problemele fundamentale ale fiecărui proces biotehnologie,
şi anume:
1. asigurarea condiţiilor necesare pentru realizarea
biotehnologiilor în regim aseptic;
2. proiectarea biotehnologiilor şi a bioreactoarelor pentru
atingerea unor performanţe maxime;
3. proiectarea tehnologiilor şi a tehnicilor de separare a
produselor obţinute prin biosinteză.
O însemnată contribuţie adusă de ingineria biochimică
în realizarea tehnologiilor biochimice în regim aseptic a
reprezentat-o, pe de o parte dezvoltarea tehnicilor de
sterilizare avansată a mediului de cultură, în condiţiile
conservării compoziţiei şi calităţii sale, iar, pe de altă parte,
dezvoltarea tehnicilor de sterilizare a aerului şi a
instalaţiilor, simultan cu asigurarea sistemelor sterile de
transvazare şi însămânţare.
În proiectarea biotehnologiilor, ingineria biochimică
trebuie să dea soluţii la problemele enunţate anterior, la
care se mai adaugă conceperea procedeelor eficiente şi a
tehnicilor de mare performanţă pentru realizarea proceselor
de transfer în regim reologic nestaţionar, stabilirea ecuaţiilor
modelelor de creştere microbiană combinate cu ecuaţiile
care descriu performanţele tehnologice oferind, în acest
mod, modele matematice care să permită conducerea
automată asistată de calculator, a proceselor
biotehnologice. De asemenea, tot ingineria biochimică
trebuie să ofere căile prin care se poate realiza
transpunerea sistemelor de biosinteză la o scară
superioară.
Separarea produselor obţinute prin biosinteză
constituie o altă problemă extrem de importantă, care
devine din ce în ce mai complicată odată cu obţinerea prin

21
procedee biochimice, a unor produse valoroase cu o
structură mai complexă, mai labile termic sau chimic, de
multe ori localizate intracelular. Această ultimă situaţie a
determinat, uneori, modificări în conducerea fazei de
fermentaţie în sensul utilizării unor mutanţi care pot bloca
formarea membranei celulare, creând astfel, posibilităţi noi
de separare. Şi în acest caz, ingineria biochimică trebuie să
ofere soluţii tehnologice şi tehnice care să facă rentabilă
separarea produselor de biosinteză.
Toate aceste aspecte sunt detaliate în capitolele
următoare ale prezentei lucrări, lucrare care şi-a propus să
aducă contribuţii la înţelegerea şi dezvoltarea problemelor
specifice biotehnologiilor şi să evidenţieze statutul, rolul şi
sarcinile inginerului biochimist în elaborarea, proiectarea şi
conducerea tehnologiei biochimice.

22