Sunteți pe pagina 1din 29

Capitolul 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice.

Culturi starter de microorganisme.

1.1 BIOTEHNOLOGII ALIMENTARE – DEFINIŢIE.


OBIECTUL BIOTEHNOLOGIEI
Biotehnologia este o ştiinţă complexă, ce se enzimatice proprii ţesuturilor vegetale şi animale sau a
caracterizează prin utilizarea integrată a biochimiei, celor elaborate de microflora de contaminare.
microbiologiei, biologiei celulare şi a ingineriei
Enzimele proprii ţesuturilor vegetale şi animale sunt
genetice. (fig. 1.1).
esenţiale în transformările pe care le oferă produsele
agroalimentare: maturarea fructelor şi legumelor,
cerealelor şi făinurilor sau diferitelor produse alimentare
pe bază de cereale germinate, maturarea brânzeturilor,
maturarea cărnii.
Enzimele pot avea însă şi rol deteriorativ cu implicaţii în
modificarea caracteristicilor senzoriale şi a valorii
nutritive a materiilor prime agroalimentare până la
prelucrarea termică a acestora.
De asemenea, rolul microorganismelor este hotărâtor,
unele dintre ele având acţiune dăunătoare, altele având
rol esenţial în obţinerea unor produse alimentare datorită
acţiunii lor fermentative: produse lactate acide,
brânzeturi, bere, vin, spirt, pâine, salamuri crude,
alimente fermentate din cereale şi leguminoase.
Figura 1.1. Biotehnologia o ştiinţă complexă
Microorganismele intervin şi în fermentarea unor
Denumirea de biotehnologie provine de la cuvintele produse vegetale: varza, murături, măsline, castraveţi,
greceşti: cacao, etc.
-„Bios” care înseamnă viaţă, Biotehnologiile în industria alimentară s-au dezvoltat
-„Tehnikos” care înseamnă tehnici şi impresionant prin folosirea enzimelor exogene (industria
laptelui, berii, spirtului, amidonului, cărnii, sucurilor de
-„Logos” care însemnă „studiu al”. fructe, zahărului, panificaţiei, etc.) şi a culturilor starter
Biotehnologia este aplicată in diverse domenii, cum ar (industria berii, laptelui, cărnii, panificaţiei, etc.) La
fi: agricultură, industria alimentară, producţie toate acestea trebuie să avem în vedere obţinerea de
industrială, mediu şi medicină. metaboliţi secundari (alcool etilic, acetonă, acizi
organici, aminoacizi, etc.) prin folosirea de
Biotehnologia alimentară se referă la prelucrarea
microorganisme precum şi de biomasă alimentară şi
industrială a diferitelor materii prime cu ajutorul
furajeră, etc.
microorganismelor şi enzimelor proprii sau a unor
agenţi biologici (microorganime, enzime) adăugaţi în Cu ajutorul enzimelor microorganismelor se pot
scopul realizării unor produse sau a ameliorării unor accelera procesele biochimice, se pot perfecţiona
procese tehnologice. procesele de producţie, se poate îmbunătăţi calitatea
produselor alimentare şi se poate mări gradul de
Rolul biotehnologiei este covârşitor în industria
diversificare a producţiei alimentare.
alimentară. În fapt, industria alimentară este o
biotehnologie, deoarece materiile prime agroalimentare __________________________________________________
sunt produse biologice şi prin urmare conservarea lor __________________________________________________
până la consum, în stare proaspătă (cazul fructelor şi __________________________________________________
legumelor) sau până la industrializare (cazul tuturor
__________________________________________________
produselor agroalimentare) implică controlul activităţii
__________________________________________________
Capitolul 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. 2
Culturi starter de microorganisme.
__________________________________________________ 3.Hidrolaze ce catalizează scindarea hidrolitică (implică
__________________________________________________ apa) a legăturilor chimice covalente;
________________________________________________ 4.Liaze, care catalizează scindarea legărutilor chimice
altfel decât prin hidroliză sau oxidare;
5.Izomeraze ce catalizează rearanjarea structurală a
1.2. PREPARATE ENZIMATICE
moleculelor;
1.2.1. Aspecte generale
6.Ligaze sau sintetaze care catalizează formarea de noi
Enzimele sunt din punct de vedere structural proteine legături te tip C-N, C-O, C-C, C-S, cu consumare de
constituite din aminoacizi, iar din punct de vedere ATP.
funcţional acţionează ca nişte biocatalizatori biologici
care au rolul de a permite realizarea unor reacţii cu o
viteză mărită. Utilizări ale enzimelor în industrie:
Enzimele sunt utilizate drept catalizatori în condiţiile în Principalele domenii în care enzimele şi-au găsit
care există şi catalizatori chimici, deoarece prezintă utilizări sunt:
următoarele avantaje:
- Fabricarea unor produse prin transformarea
1. Au capacitatea de a cataliza reacţiile chimice în enzimatică a amidonului;
condiţii blânde de temperatură, pH, presiune. Aceasta
- La fabricarea altor produse alimentare : produse
permite un consum mai redus de energie şi nu necesită
lactate, bere, sucuri, vin, panificaţie;
echipamente scumpe rezistente la coroziune.
- În compoziţia detergenţilor;
2. Enzimele sunt catalizatori specifici, deseori
stereoselective, care nu conduc la obţinerea de produşi - Industria textilă, hârtiei şi a furajelor pentru
de reacţie secundari nedoriţi. În aceste condiţii nu sunt animale;
necesare cheltuieli mari privind rafinarea şi purificarea - Sinteza catalitică a unor substanţe chimice;
produsului ce urmează a fi fabricat.
- Analiza alimentelor, diagnoză chimică şi
3. Comparativ cu procesele chimice, enzimele sunt din terapie;
punctul de vedere al mediului compuşi biodegradabili
care nu necesită costuri semnificative de epurare. - Inginerie genetică;

4. Anumite enzime nu sunt limitate numai la acţiunea în


mediul apos, putând acţiona şi la interfaţa dintre două Biotehnologia preparatelor enzimatice este un domeniu
faze, apă: solvent organic sau apă:ulei etc. de bază al biotehnologiei, având drept scop studierea
Totuşi există şi o serie de dezavantaje: tehnicilor de obţinere a preparatelor enzimatice folosind
materii prime de origine animală, vegetală şi
- au stabilitate limitată; microbiană, sub formă liberă sau imobilizată pentru a fi
- de cele mai multe ori sunt utilizate industrial o folosite ca agenţi biologici în industria alimentară,
singură dată. industria furajelor, industria textilă, detergenţilor,
farmaceutică, cosmetică, chimică, etc. Prin utilizarea
Clasificarea enzimelor. Enzimele se clasifică conform
preparatelor enzimatice, tehnologiile tradiţionale se
sistemului stabilit de Comisia de Enzime a Uniunii
transformă în biotehnologii, devenind mai eficiente şi
Internaţionale de Biochimie (1979). Conform acestei
mai puţin poluante. În figura 1.2. este prezentată
clasificări există 6 clase principale grupate conform cu
ponderea de utilizarea a preparatelor enzimatice în
reacţiile pe care le catalizează astfel:
diferite ramuri.
1. Oxidoreductaze care catalizează reacţii de
oxidoreducere, transfer de atomi de hidrogen, oxigen
sau electroni;
2. Transferaze care catalizează transferul unei
grupări de pe o moleculă pe alta;
Capitolul 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. 3
Culturi starter de microorganisme.
Preparate enzimatice lichide
Alte domenii; 6 1. Preparate enzimatice brute, formă sub care se
Morarit,
panificatie; 5 livrează enzimele extracelulare (eliberate de către
Sucuri, vinuri; 10 Amidon; 30
microorganisme în mediul de cultură în timpul
Bere; 4
fermentaţiei).
Distilate; 5
Produse lactate;
2. Preparate parţial purificate, în care se adaugă
5 Detergenti; 35 conservanţi pentru a le mări stabilitatea în timp.
In tabelul de mai jos sunt prezentate principalele tipuri
de preparate enzimatice, sursele din care se obţin şi
aplicaţile în industria alimentară.
Figura 1.2. Poderea utilizării preparatelor enzimatice 1.2.3. Surse de enzime
Aşa cum se observă din datele de mai sus, cea mai mare Preparatele fabricate la scară industrială folosesc trei
pondere o are utilizarea în industria alimentară, urmată tipuri de surse: ţesuturi animale şi vegetale sau
de industria detergenţilor. microorganisme.
În figura 1.3. sunt prezentate principalele tipuri de Sursele animale sunt reprezentate de subprodusele din
preparate enzimatice produse pe plan mondial. Cea mai industria cărnii (ficat, pancreas, inimă, rinichi, creier,
mare pondere o au preparatele de proteaze urmate de mucoasă stomacală şi intestinală). Utilizarea acestr surse
amilaze. este pe scară din ce în ce mai redusă, fiind înlocuite de
sursele microbiene, deoarece sursele animate prezintă o
serie de dezavantaje, cum ar fi: producţia limitată,
Glucozizomeraze;
apariţia unor boli cum ar fi encefalopatia spongiformă la
Alte enzime; 4
Pectinaze; 10 14
bovine.
Amilaze fungice;
Proteaze fungice; 18
4
Principalele enzime de origine animală care se obţin sub
formă de preparate sunt chimozină (renina) care se
Amilaze bcteriene;
10
extrage din stomacul de miel sau viţei care se utilizează
Proteaze Proteaze de
bacteriene; 35 coagulare; 5 pentru coagularea laptelui la fabricarea brânzeturilor. O
altă enzimă este α -amilaza pancreatică care are utilizări
în industria farmaceutică.
Sursele vegetale sunt reprezentate de seminţe(germinate
Figura 1.3. Principalele tipuri de preparate enzimatice.
sau negerminate), rădăcini, fructe, sevă, latexuri,
1.2.2. Tipuri de preparate enzimatice. Preparatele frunze. Utilizarea surselor vegetale pentru obţinerea
enzimatice se comercializează sub diverse forme şi preparatelor enzimatice ridică o serie de probleme, cum
grade de purificare: ar fi: prezenţa unor substanţe potenţial dăunătoare
Preparate enzimatice solide: sănătăţii omului (ex. Compuşii fenolici) sau a unor
compuşi toxici de comtaminare. Aceste dezavantaje face
1. Preparate enzimatice brute, sub formă de pulbere, ca sursele de origine vegetală să fie destul de puţin
obţinute prin uscarea şi măcinarea mediului fermentat; utilizate. Principalele enzime obţinute din surse vegetale
2. Preparate sub formă cristalizată, enzime pure sunt.
utilizate preponderent în chimia analitică şi ingineria - papaina, protează obţinută din latexul fructelor de
genetică; Caryca Papaia. Enzima este utilizată pentru
3. Preparate liofilizate, care sunt enzime purificate în tenderiyarea cărnii sau în industria berii;
amestec cu substanţe crioprotectoare, care sunt urcate în - ficina, protează obţinută din latexul fructului de
vacum la temperaturi de -20......-50°C. smochin (Ficus carica), utilizată pentru degradarea
proteinelor miofibrilare.
Capitolul 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. 4
Culturi starter de microorganisme.
- bromelina, protează obţinută din sucul de ananas ( condiţiilor optime fizice şi chimice pentru producerea de
Ananas comosus ), folosită pentru hidroliya proteinelor enzime;
colagenice.
- proprietăţile enzimelor şi specificitatea de acţiune
Alte enzime de origine vegetală sunt lipoxigenaza din diferă cu natura microorganismelor producătoare, astfel
soia şi complexul enzimatic din malţ ( amilaze, industrial se pot obţine preparate care corespund
proteaze, glucanaze). Preparatele enzimatice ale acestor întocmai scopului dorit.
enzime nu sunt purificate, fiind sub formă de făină de
- preparatele enzimatice obţinute pot avea activităţi
soia sau de malţ.
diferite cu predominanţa unei activităţi.
Microorganismele reprezintă principala sursă pentru
1.2.4. Tehnologii de obţinere a preparatelor
obţinerea de preparate enzimatice. Avantajele utilizării
enzimatice
microorganimelor constau în:
Schema tehnologică generală de obţinere a preparatelor
- microorganismele se pot obţine în cantităţi mari
enzimatice este prezentată în figura Tehnologia de
(biomasă) prin cultivare în instalaţii speciale pe medii de
obţinere a preparatelor enzimatice implică operaţiile
cultură ieftine (tărâţă de grâu, extract de porumb,
indicate în schema prezentată în fig. 1.4. din care rezultă
melasă, şroturi de soia sau floarea soarelui, zer),
ca preparatele enzimatice pot fi obţinute sub formă de:
- ciclul de dezvoltare al microorganismelor este foarte
- preparate enzimatice brute-uscate;
scurt faţă de cel al plantelor sau animalelor;
- preparate enzimatice brute – lichide concentrate;
- producţia de enzime de către microorganisme poate fi
mărită prin selectarea şi utilizarea de tulpini mutante, - preparate enzimatice purificate – concentrate, respectiv
înalt performante (productive) şi prin stabilirea şi uscate.
Capitolul 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. 5
Culturi starter de microorganisme.
Capitolul 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. 6
Culturi starter de microorganisme.

Figura 1.4. Schema tehnologică generală de obţinere a preparatelor enzimatice


Capitolul 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. 7
Culturi starter de microorganisme.
Procesele biotehnologice de obţinere a preparatelor - azot anorganic: amoniac, săruri de amoniu, sulfatul
microbiene sunt complexe, realizarea lor presupune de amoniu, forfatul acid de diamoniu,
parcurgerea a trei etape:
- azot organic: hidrolizate proteice de cazeină, soia,
1. Pregătirea mediului de cultură, prin prelucrarea carne etc.
mecanică şi fizico chimică a materiilor prime ce intră în
Surse de ioni anorganici. Pentru dezvoltarea
compoziţia mediului de cultură (fermentativ). Această
microorganimelor în timpul procesului de fermentaţie
etapă presupune operaţii de dozare, mărunţire,
este necesară prezenţa ionilor anorganici, aceştia
solubilizare, sterilizare etc.
reprezintă circa 8% din substanţa urcată a a celulelor
2 Etapa biologică care constă în obţinerea culturilor microbiene. Principalii ioni anorganici care trebuie să
starter intermediare şi a culturii de producţie, urmată de fie prezenţi în mediul de cultură sunt: macronutrienţii
etapa fermentativă prorpiu-zisă. (azot, fosfor, sulf, potasiu, şi magneziu) şi
micronutrienţii (sodiu, calciu, clor, fier, cobalt, zinc,
3. Etapa de separare, purificare şi standardizare a
molibden, cupru, mangan, nichel şi seleniu).
enzimelor.
Surse de factori de creştere. Factorii de creştere sunt
compuşi organici a căror prezenţă în mediul de cultură
A. Pregătirea mediului de cultură este necesară în cantităţi mici, având un rol catalitic sau
Materii prime utilizate pentru fabricarea mediilor de structural pentru microorganisme. Factorii de creştere
cultură. includ vitaminele, purine, pirimidine, nucleotide şi
nucleozide, aminoacizi, acizi graşi, steroli şi poliamide.
Materiile prime trebuie să asigure principalii nutrienţi
microorganismelor în vederea dezvoltării lor în timpul Principalele vitamine necesare ca factori de creştere
fermentaţiei. sunt: biotina, acid pantotenic, acidul nicotinic, tiamina.

Surse de carbon. Principala sursă de carbon (sursă de Tratementul termic al mediilor de cultură. Pentru buna
energie) pentru microorganisme o constituie glucidele, desfăşurare a procesului de fermentaţie este necesară
sub formă de glucoză, fructoză, galactoză care sunt uşor cultivarea microorgnimelor pe un mediu de cultură steril
asimilabile, în timp ce maltoză, zaharoza şi lactoza sunt pentru a preveni contaminarea. Sterilizarea mediului de
asimilate doar dacă microorganismele posedă enzime cultură se poate realiza direct în bioreatorul în care se
capabile să le transforme în monoglucide. Poliglucidele realizează fermentaţia sau într-un vas sub presiune
pot fi utilizate doar de către microorganismele apte să separat, ulterior fiind transferat în bioreactor.
sitetizeze enzimele care să le hidrolizeze extracelular în B. Etapa biologică.
monoglucide capabili să difuzeze prin membrana
Obţinerea culturilor starter de producţie
celulară.
Pentru producerea enzimelor, fermentaţiile industriale se
Ca surse de carbon în reţetele mediilor industriale se
desfăşoară în volume de 150 – 250 de mc de mediu,
folosesc urmatoarele:
motiv pentru care trebuie pregătită o cantitate suficientă
- Melasele care provin de la rafinarea zahărului. de inocul. Cultura folosită drept inocul trebuie să fie în
- Extractul de porumb, este reprezentat de extractul faza exponenţială de creştere. La microorganismele care
obţinut din industria amidonului după ce suferă o au viteză de creştere redusă, se recomandă să se
concentrare până la 50% S.U. folosească o cantitate mai mare de inocul, pentru a se
reduce durata iniţieirii fermentaţiei. Cultura starter de
- Leşiile sulfitice provin din industria hârtiei ca urmate a producţie trebuie să conţină celule active, adaptate la
transformării masei lemnoase în pulpă celulozică sub mediul industrial pentru ca fermentaţia să se declanşeze
acţiunea bisulfitului de calciu. rapid. În cazul fermentaţiilor desfăşurate pe mediul
Surse de azot. Azotul din mediul de cultură are rol solid, pentru care se utilizează inocule sporifere se
anabolic, participând la biosinteza proteinelor recomandă să se asigure prin inoculare concentraţii de
structurale, a enzimelor şi acizilor nucleici. 105-106 spori pe g mediu, iar în cazul celor submerse
cultura starter de producţie să fie de circa 10% din
Principalele surse de azot sunt:
mediul de cultură.
Capitolul 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. 8
Culturi starter de microorganisme.

Figura 1.5. Schema bloc pe operaţii de obţinere a preparatelor enzimatice microbiene brute
Capitolul 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. 9
Culturi starter de microorganisme.

Tehnici de fermentaţie
Pentru producţia de preparate enzimatice de origine - concentraţia în enzimă (activitatea enzimatică a
microbiană se poate aplica două tehnici de bază : mediului) ;
Fermentaţia de suprafaţă în care se utilizează un - consumul de glucide ;
mediu solid pe care se cultivă microorganismul (de
- nivelul de proteine.
regulă un mucegai filamentos). Această tehnică are
avantajul că mediul de cultură va deveni un mediu La procedeul nealimentat se pot monta diferiţi
bogat în activitate enzimatică ; senzori care arată :

Fermentaţia de submersă, în care mediul este lichid - pH-ul – care se poate regla prin adaus de baze sau
ce se află într-un reactor unde toţi parametrii acid ;
fermentaţiei sunt perfect controlaţi. Această ultimă - temperatura – care se poate regla prin debitul de
tehnică este superioară primei metode din punct de circulaţie al apei reci în mantaua fermentatorului
vedere tehnologic şi biochimic. sau în serpentina din interiorul fermentatorului ;
Dintre speciile de microorganisme ce se folosesc - nivelul de spumă – care se poate combate cu un
menţionăm următoarele : Aspergillus niger, antispumant aflat într-un rezervor ataşat
Aspergillus oryzae, Mucor miehei, Saccharomyces fermentatorului;
cerevisiae, Endothia parasitica, Penicillium emersonii,
Kluyveromyces lactis, Bacillus amylolichefaciens, - presiunea – care se reglează prin supape care se
Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus, deschid la presiuni de 1 până la 3 bar ;
Actinoplanes missouriens, Klebsiella planicola. - coeficientul respirator QR – care se măsoară prin
La sfârşitul fermentaţiei microorganismul trebuie cantitatea de CO2 produsă faţă de cantitatea de
distrus cu condiţia păstrării intacte a activităţii oxigen consumată ;
enzimatice. - nivelul de oxigen consumat, pornind de la analiza
Microorganismele cultivate pot produce enzime efluenţilor.
extracelular sau intracelular. În funcţie de tipul acestora Procedeul alimentat, în care se începe cu un volum
variază şi procedeul de extracţie. În ceea ce priveşte de 10 – 30% de substrat în care se introduce
tipurile de culturi submerse, ne putem situa în unul inoculum, după care fermentatorul se alimentează cu
din următoarele cazuri: restul de mediu, după care oprirea fermentaţiei se
Procedeul nealimentat, în care caz toate face după un anumit timp fixat experimental. Acest
ingredientele mediului de fermentare sunt pregătite procedeu se aplică în cazul în care sinteza
în fermentator la pH-ul şi temperatura dorită înainte enzimelor ar fi reprimată de concentraţiile ridicate
de a introduce inoculum. După introducerea într-unul din nutrienţii mediului de cultură sau în
inoculum, fermentaţia principală începe şi finalizarea cazul când creşterea microorganismelor, în funcţie de
ei se urmăreşte prin prelevarea de probe, în mod concentraţia în unul din componenţii mediului, ar
steril, care arată : provoca creşterea vâscozităţii, care trebuie să fie
reglată în timp. Alimentarea fermentatorului poate fi
- creşterea microorganismelor (biomasă, vâscozitatea repetată de mai multe ori efectuându-se sutiraje
mediului) ; (evacuări) programate, dar întotdeauna trebuie lăsat în
fermentator un volum de ≤ 30%, care serveşte în
acest caz drept cultură de producţie.
Capitolul 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. 10
Culturi starter de microorganisme.

Fig. 1.8. Cultivarea submersă a microorganismelor.


Capitolul 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. 11
Culturi starter de microorganisme.
Procedeul continuu necesită alimentarea continuă a chimice ;
fermentatorului cu mediu şi folosirea unei culturi
-costurile energetice sunt destul de ridicate;
concentrate de microorganisme. În acest caz,
bioreactorul (fermentatorul) de dezvoltare a celulelor -mediul de cultură poate fi colmatant pentru
este cuplat cu o unitate de micro sau ultrafiltrare. În membrana de ultrafiltrare;
figura 1.9. se arată schiţa unei astfel de instalaţii -chiar la densităţi mari de celule, la sfârşitul ciclului
formată dintr-un bioreactor cuplat cu o unitate de de dezvoltare este posibilă o oarecare liză a
ultrafiltrare la care există şi posibilitatea de a celulelor, ceea ce face necesară o purjare a
recicla biomasa. bioreactorului prin unitatea de ultrafiltrare, fapt care
conduce la micşorarea vârstei medii a celulelor care
rămân în sistem.
O variantă a procedeului continuu de obţinere a
biomasei/ enzimelor constă în folosirea bioreactorului
cu membrană.

C. Etapa de separare a enzimelor


Extracţia. La procedeul discontinuu (nealimentat) şi
cel alimentat, după terminarea fermentaţiei se separă
partea solidă insolubilă (celule şi produse insolubile)
de partea lichidă care conţine enzimele, separare
care se poate face prin centrifugare, filtrare frontală
sau microfiltrare. Soluţia sterilă obţinută este apoi
ultrafiltrată pentru a concentra enzimele. În cazul în
care enzimele sunt destinate a intra în compoziţia
Procedeul continuu unui preparat comercial lichid, ultrafiltratul se
stabilizează cu polioli (sorbitol, glicerol) şi/sau săruri
Avantajele unui astfel de procedeu sunt (NaCl, MgSO4), respectiv se adaugă bacteriostatici
următoarele : alimentari (benzoat, sorbat, ascorbat).
-se poate detoxifica mediul de cultură prin În cazul în care enzima (enzimele) intră în
eliminarea produsului de inhibare ; compoziţia unui preparat comercial pulbere,
-celulele reciclate devin perfuzate ; ultrafiltratul se suplimentează cu un suport şi se
usucă prin atomizare (suplimentarea se face cu
-cantitatea de mediu de cultură care se introduce în
amidon, dextrine). Înainte de atomizare mai poate fi
bioreactor este controlată de cantitatea de permeat
realizată o filtrare sterilă.
care traversează membrana de ultrafiltrare ;
Pentru a obţine şi enzimele intracelulare, biomasa
-celulele au posibilitatea de a se dezvolta până la
din fermentator, separată de partea lichidă, este
concentraţii relativ mari (∼ 300 g substanţă uscată/l, supusă lizei. Liza poate fi realizată chiar de
în cazul drojdiilor) ; enzimele proprii microorganismelor ce alcătuiesc
-aceste concentraţii mari de celule se constituie ca biomasa, fie prin folosirea de preparate exogene, cum
o barieră eficace faţă de contaminarea exterioară ; ar fi lizozimul din albuşul de ou, preparate
enzimatice exogene complexe de natură bacteriană
-retenatul poate fi evacuat şi el periodic, fiind
care conţin chitinază, mananază, α -1,6–glucanază,
constituit din biomasă care conţine enzime
proteaze, câteodată în combinaţie cu adaosul de
intracelulare, după care este trecut la prelucrare
metabisulfit.
ulterioară (extracţie) ;
În cazul în care enzima este periplasmică, un şoc
-permeatul de la ultrafiltrare, care conţine enzime nu
osmotic este suficient pentru a elibera enzimele. Se
mai are celule microbiene şi poate fi, deci, stocat
poate realiza şi o liză mecanică (folosire de presiuni
sau dirijat direct la o operaţie în aval de purificare
mari de 600 – 1000 bar, urmată de detenta brutală)
sau concentrare.
Se pot folosi şi ultrasunetele cu frecvenţe mai mari
Neajunsurile acestui procedeu de obţinere a de 20 MHz pentru liza celulelor şi deci pentru
biomasei şi enzimelor sunt următoarele : eliberarea enzimelor intracelulare. Odată eliberate,
-membranele trebuie să fie rezistente la sterilizarea enzimele intracelulare sunt supuse operaţiilor
cu vapori de apă şi la igienizare cu substanţe aplicate şi enzimelor extracelulare.
Capitolul 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. 12
Culturi starter de microorganisme.
Preparatele enzimatice se comercializează de regulă de vedere al reglării automate a parametrilor de
sub formă de pulbere, de microgranule, precum şi lucru;
sub formă lichidă.
• enzima nu pătrunde în substratul ce se tratează
Preparatele enzimatice sub formă de pulbere sunt în cursul catalizei enzimatice;
formulate cu un suport cum ar fi amidonul,
maltodextrinele, zahărul, sarea. La aceste preparate se • se poate modula micromediul în care acţionează
enzima imobilizată (concentraţie substrat,
controlează granulometria, umiditatea (∼ 6%). Suportul
încărcarea suportului cu enzimă, grupările
trebuie să nu fie higroscopic pentru a se evita
hidrofile);
formarea de cocoloaşe. În preparatele comerciale
pulbere sau lichide, conţinutul de enzimă este redus • refolosirea treptată a enzimei, deci cu aceeaşi
raportat la suport şi de aceea cantitatea de preparat cantitate de enzimă se poate transforma o
comercial este mult mai mare, în comparaţie cu cantitate mai mare de substrat;
nivelul de enzimă conţinut.
• se poate lucra în sistem semicontinuu sau
În ceea ce priveşte preparatele comerciale continuu, putându-se automatiza procesul, ceea ce
microgranulate, acestea se obţin dintr-un ultrafiltrat asigură un control riguros al parametrilor de
care se amestecă cu un suport (sare, amidon solubil, lucru;
maltodextrine etc.). Cantitatea de substrat este astfel
calculată încât să se obţină titrul enzimatic dorit în • are loc o creştere a vitezei de lucru, prin
microgranule. Amestecul respectiv este pulverizat controlul riguros al vitezei fluxului de substrat
împreună cu un agent liant care reprezintă 0,1% şi al concentraţiei acestuia;
până la 0,5% faţă de masa suportului. Picăturile • se poate stopa reacţia enzimatică la momentul
pulverizate sunt uscate într-un turn de uscare, cu aer dorit şi se evită trecerea enzimei în produsul
la 70 - 90°C. transformat;
Preparatele comerciale lichide sunt formulate în • costurile globale de producţie sunt mai mici în
general cu polioli (gliceroli, sorbitol) care se comparaţie cu procedeele în care se folosesc
utilizează în proporţie de 20 – 50% faţă de enzime libere;
preparatul lichid. La aceste formulări se adaogă o
substanţă bacteriostatică (de exemplu benzoat de • se pot folosi şi enzime care nu sunt trecute în
sodiu în proporţie de 0,1 – 0,2%). liste GRAS (Generally Reconized as Safe);
1.2.5. Enzime imobilizate Există şi dezavantaje, cum ar fi:
Imobilizarea unei enzime (sau a unui sistem • costuri privind imobilizarea;
multifuncţional) înseamnă legarea sau fixarea
• pierderi ale activităţii enzimatice,
acesteia de un suport care trebuie să îndeplinească
următoarele condiţii : • o investiţie iniţială în utilaje mai mare,
-să fie insolubil în apă ; • un proces mai complex din punct de vedere tehnic şi
-să asigure păstrarea proprietăţilor catalitice ale o supraveghere mai atentă;
enzimelor, respectiv specificitatea de acţiune ; • utilizarea numai a unor substraturi solubile.
-să asigure acţiunea enzimei la un pH şi Aspecte teoretice privind enzimele imobilizate.
temperatură optime, apropiate de cele ale enzimelor
libere (neimobilizate). În cazul enzimelor imobilizate se observă un
comportament cinetic diferit faţă de cel al enzimelor
Avantajele imobilizării enzimelor sunt următoarele : libere, solubile. Activitatea enzimatică scade ca urmare
• creşterea stabilităţii enzimei, ca proteină şi ca a imobilizării. Acest lucru se datorează schimbărilor
activitate catalitică. Această stabilitate este în conformaţionale ale enzimei după imobilizare. O astfel
legătură cu diminuarea gradului de libertate al de modificare apare în primul rând în cazul legării
macromoleculei, ceea ce are consecinţă asupra covalente a enzimelor de suport. Un alt aspect este
variaţiilor de conformaţie a enzimei (se influenţa mediului, în cazul enzimelor imobilizate acesta
diminuează aceste variaţii). Imobilizarea conduce este diferit de cel apos. Astfel, grupările funcţionale
şi la creştere a concentraţiei locale a protein- acide
enzimei care are un efect stabilizant; La imobilizare, în funcţie de enzimă şi catalizator se
poate vorbi de :
• se poate lucra în flux continuu din punct de
vedere al catalizei enzimatice, dar şi din punct - randament de fixare care reprezintă cantitatea
efectivă de enzimă imobilizată în raport cu
Capitolul 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. 13
Culturi starter de microorganisme.
cantitatea de enzimă introdusă în procesul de - eficienţa economică a imobilizării
imobilizare : determinate de : costul enzimei, costul
suportului, costul tehnicii de imobilizare ;
enzimă fixată pe suport
- activitatea enzimei imobilizate care este
η = · 100 influenţată de : tehnica de imobilizare;
enzimă utilizată caracteristicile materialului suport, viteza de
difuzie a substratului la enzimă şi a
- randament de activitate care reprezintă activitatea produsului (lor) de transformare ;
reziduală a enzimei imobilizate:
- caracteristicile substratului ce trebuie
Activitatea (E0) după fixare transformat ;
· 100
Activitatea (E’0) înainte de fixare - stabilitatea enzimei care trebuie menţinută
activă un timp cât mai îndelungat ;
Factorii critici care trebuie luaţi în consideraţie la - contaminarea microbiologică a sistemului
folosirea enzimelor imobilizate enzimă/suport în timpul utilizării reactorului
Aceşti factori se referă la : respectiv.

Figura 1.10. Metode de imobilizare a enzimelor


Metode de imobilizare a enzimelor cu TiCl4). Adsorbţia se realizează prin contactul dintre
o soluţie apoasă de enzimă cu suportul solid şi va fi
a) Metode fizice, la care enzima se leagă de un suport
influenţată de : pH, tipul de solvent utilizat pentru
prin intermediul legăturilor slabe sau relativ puternice
solubilizarea enzimei, puterea ionică, calitatea enzimei,
(legături Van der Waals, legături de hidrogen, interacţiuni
temperatura şi durata de contact a enzimei cu suportul.
proteină – proteină, legături ionice).
Practic imobilizarea se face prin amestecul dintre
Imobilizarea în cadrul metodelor fizice poate fi : soluţia de enzimă şi suport într-un reactor cu agitator
sau prin trecerea soluţiei de enzimă într-o coloană în
- prin adsorbţie pe suporturi organice : amidon, colagen,
care suportul este menţinut sub forma unui pat.
Sepharoză modificată, polistiren modificat, răşini
Adsorbţia enzimei de suport poate fi îmbunătăţită prin
schimbătoare de ioni (DEAE celuloză, DEAE Sephadex,
ataşarea de suport a unor cofactori, cum ar fi
carboximetil-celuloză, Amberlit, Dowex 50 etc.) ;
piridoxal-fosfatul sau lanţuri cu grupări hidrofile.
- prin adsorbţie pe suporturi minerale : alumină, argilă
Adsorbţia este influenţată de raportul dintre suprafaţa
(bentonită, montmonirolită etc.), ceramică, hidroxiapatită,
şi volumul suportului, mărimea particulelor, raportul
sticlă poroasă sau silice poroasă, titanit (punţi metalice
dintre grupările hidrofile şi hidrofobe.
Capitolul 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. 14
Culturi starter de microorganisme.
coreticulare utilizând agenţi bi- sau polifuncţionali. Cel
mai mult utilizată pentru reticulare este glutaraldehida.
Avantajele şi dezavantajele imobilizării prin adsorbţie
Avantajele şi dezavantajele legării enzimelor de suport
Avantaje
prin legături covalente
• Simplicitate în execuţie (incubarea enzimei cu
suportul, agitare câteva minute, enzima care Avantaje
rămâne în soluţie fiind eliminată prin spălare). • Stabilitate mărită datorită faptului că legăturile
• Absenţa reacţiilor chimice (numai dacă nu se covalente sunt cele mai puternice dintre toate
formează punţi metalice). legăturile menţionate anterior
• Posibilitatea de regenerare a complexului • Varietatea mare a suporturilor : sticlă, silice,
enzimă/suport. ceramică, celuloză, polimeri sintetici etc.
Dezavantaje • Posibilitatea de a efectua imobilizarea în prezenţa
• Stabilizare slabă. unui substrat pentru a se evita inactivarea (protecţia
• Riscul de desorbţie a enzimei de către : fluxul situsului activ).
de substrat, variaţie lejeră de pH, forţa ionică, Dezavantaje
temperatură • Trebuie realizate reacţii chimice, adesea complexe
• Etapa de activare a suportului este lungă
• Randamentul de fixare este < 100%
-prin includere într-un suport, în care caz se pot
include şi microorganisme. Includerea poate fi făcută • Există riscul modificării chimice a enzimei (pierdere
în gel, microincapsulare, includere în fibre. de activitate)
• Este necesar ca enzima să fie purificată în prealabil
Avantajele şi dezavantajele imobilizării enzimelor • Investiţia (costul) este importantă
prin incluziune
Suporturi de imobilizare comerciale
Avantaje Suporturile comerciale cele mai des utilizate pentru
• Reacţiile de polimerizare sau gelificare sunt bine imobilizarea enzimelor sunt :
cunoscute
• Reacţiile chimice dintre suport şi enzimă sunt - polizaharide : agaroză, celuloză şi derivaţi, alginaţi,
limitate (enzima este inclusă în geluri naturale) carageenani, dextrani ;
• Se poate aplica la toate enzimele (chiar şi la - poliacrilamide utilizate sub formă de bile ;
amestec de enzime)
• Se pot folosi suporturi cu forme diferite : filme, - polistiren (bile şi tuburi) ;
fibre, bile. - silicea şi sticla poroasă.
• Riscul de “evadare” a enzimei este redus prin
1.2.6. Condiţiile de inocuitate pe care trebuie să le
reticularea suportului după imobilizare
îndeplinească preparatele enzimatice
Dezavantaje
• Anumite polimerizări necesită agenţi denaturanţi Număr total de germeni (NTG), maximum 5.104/g ;
sau radicalici
Coliformi, maximum 30/g ;
• Se pun probleme de transfer de masă
(inaccesibilitatea unor substraturi la enzimă) Escherichia coli – absent/ 25 g ;
• Riscul de evadare al enzimei prin micropori Salmonella – absent/ 25 g ;
• Proprietăţile mecanice ale gelurilor sunt
nesatisfăcătoare Activitate antibiotică de origine microbiană – absentă ;
Aflatoxina B1, ochratoxină A, sterigmatocistină, toxina T
b) Metode chimice de imobilizare, în care caz – 2 (zearalenona) în cazul preparatelor de origine
imobilizarea se face prin intermediul legăturilor microbiană – absente ;
covalente de suporturi insolubile, care posedă grupări Metale grele :
reactive sau care pot fi activate prin diferite reacţii
chimice. Se poate realiza imobilizarea şi prin -arseniu < 3 mg/Kg ;
copolimerizarea enzimelor cu un monomer reactiv şi -plumb < 10 mg/Kg ;
legarea încrucişată (Cross-linking) sau reticulară intra şi
intermoleculară a enzimelor de un suport prin -alte metale grele < 40 mg/Kg (exprimată la Pb).
intermediul unui reactiv multifuncţional.
_______________________________________________
La legarea prin legături covalente, imobilizarea poate fi
_______________________________________________
făcută : prin fixare de un suport insolubil, dar trebuie
să se ţină seama de gruparea funcţională care poate _______________________________________________
reacţiona cu protein-enzima şi de caracteristicile fizico-
_______________________________________________
chimice ale suportului. Adesea este necesar să se
creeze, pe cale chimică, funcţii reactive pe suport; prin _______________________________________________
Capitolul 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. 15
Culturi starter de microorganisme.
_______________________________________________ Prima situaţie se întâlneşte la obţinerea biomasei de drojdie
de panificaţie, represiunea catabolică de către glucide
_______________________________________________
antrenează şi o producţie de alcool etilic, producţie ce
trebuie evitată prin două soluţii şi anume: evitarea
_______________________________________________
excesului de substrat şi lucru cu cultura “în pat” şi
_______________________________________________ respectiv plasarea unui detector de alcool în efluentul de
gaz (CO2) care permite să se cunoască ce aport de substrat
_______________________________________________
trebuie furnizat.
_______________________________________________
A doua situaţie se întâlneşte la producţia de culturi lactice a
_______________________________________________ căror dezvoltare este însoţită de acumularea de acid lactic
(bacterii lactice homofermentative) sau acid lactic şi acetic
_______________________________________________
(bacterii lactice heterofermentative).
_______________________________________________
Soluţia care se impune în acest caz este o dializă a culturii
_______________________________________________ sau centrifugarea substratului cu celule, celulele fiind apoi
reciclate.
_______________________________________________
Dacă dezvoltarea culturii are loc fără acumularea de
_______________________________________________
metaboliţi, alimentarea cu substrat se poate face la un debit
_______________________________________________ constant, dar la o concentraţie crescătoare a acestuia,
respectiv la o concentraţie constantă a substratului dar la un
_______________________________________________
debit programat exponenţial.
_______________________________________________
Metoda continuă, în care caz are loc alimentarea
1.3. CULTURI STARTER DE MICROORGANISME constantă a aparatului de cultivare a microorganismelor cu
substanţe nutritive şi eliminarea neîntreruptă a biomasei
Microorganismele sunt utilizate în industria alimentară sau metaboliţilor. Această metodă poate fi realizată prin
pentru: cultivarea de suprafaţă sau de adâncime a
microorganismelor.
- Obţinerea de celule (culturi starter = culturi pure) care
la rândul lor sunt folosite pentru fermentarea La fermentarea continuă se are în vedere natura
produselor lactate acide sau brânzeturi, la fabricarea catalizatorului (imobilizat sau nu; sistem eterogen sau nu;
produselor de carne (salamuri crude uscate), produse celule incluse, adsorbite, grefate prin covalenţă); gradul de
tradiţionale vegetale, produse lactate acide, pâine etc. reciclare al celulelor microbiene; gradul de amestecare a
În acest produsele se consumă fie împreună cu fluidelor în reactorul cu funcţionare continuă.
celulele respective fie după îndepărtarea celulelor cum
este cazul băuturilor de tipul berii, vinului. Creşterea concentraţiei de celule se poate realiza prin:
folosirea tehnicilor de membrană sau centrifugarea;
- Obţinerea de biomasă care poate fi utilizată ca folosirea de celule imobilizate; reciclarea celulelor.
ingredient de fermentare (drojdia de panificaţie ) sau
1.3.1. Microorganisme utilizate în industria alimentară
de îmbogăţire a unor produse alimentare cu proteine,
respectiv ca furaje proteice pentru păsări, peşte, BACTERIILE utilizate în industria alimentară aparţin
porcine. următoarelor genuri:
În ceea ce priveşte metodele de cultivare ale Genul Streptococcus Acest gen cuprinde specii de bacterii
microorganismelor se folosesc metode periodice sub formă de coci sferici sau ovali cu φ < 2µ , grupate în
(discontinui) şi metode continui, în ambele cazuri fiind diplo sau formă de lanţuri. Sunt Gram pozitive, facultativ
necesară optimizarea procesului. anaerobe, neciliate, nesporulate, unele specii fiind
Metoda periodică de cultivare a microorganismelor capsulate.
prevede alimentarea continuă a aparatului de cultivare cu Importanţi pentru industria alimentară sunt:
substanţe nutritive şi înlăturarea culturii de
microorganisme. În acest fel, se creează condiţii optime de Streptococii mezofili : Streptococcus lactis (Lactococcus
acumulare a cantităţii necesare de biomasă sau a lactis subsp. lactis), Str. cremoris (Lactococcus lactis
metaboliţilor. La cultivarea periodică concentraţia subsp. cremoris), Str. diacetilactis (Lactococcus lactis
substanţelor nutritive scade, iar cea a celulelor şi subsp. diacetilactis);
metaboliţilor creşte, fapt care conduce la modificarea Streptococii termofili: Str. thermophilus.
cineticii creşterii microorganismelor.
Aceşti streptococi lactici sunt homofermentativi, produc
La metoda periodică trebuie să avem în vedere două situaţii acid lactic L(+) şi prezintă următoarele activităţi:
şi anume:
- activitate fermentativă: fermentează lactoza şi glucoza;
- când substratul este inhibitor pentru producţia de
biomasă şi metaboliţi; - activitate proteolitică;

- când produsul este inhibitor. - produc diacetil şi acetoină din acid citric ( în principal
Str. diacetilactis).
Capitolul 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. 16
Culturi starter de microorganisme.
Fermentarea lactozei de către streptococii lactici se face
prin transformarea iniţială a acesteia în glucoză şi galactoză
– 6P prin intermediul fosfo-β -galactozidazei. În
continuare, glucoza este apoi fermentată pe calea hexozo –
difosfatului în acid lactic, iar galactoza – 6P este utilizată
pe calea tagatozei în vederea producerii unei cantităţi
suplimentare de acid lactic (fig. 1.11.).

Figura 1.11. Calea tagatozei de degradare a lactozei de


către streptococii lactici Figura 1.13. Transformarea citratului de către Str. lactis
subsp. diacetilactis şi Leuconostoc
Fermentarea glucozei de către streptococii lactici poate fi
făcută pe cale homofermentativă cu producerea în principal Genul Leuconostoc Acest gen cuprinde bacterii cu formă
de acid lactic şi pe cale heterofermentativă, în condiţile în sferică, lenticulară, grupate în perechi sau lanţuri, imobile,
care glucoza este limitată, calea heterofermentativă fiind asporogene, Gram negative, facultativ anaerobe.
calea ribulozei – 5P cu formare de acid acetic, etanol şi
acid lactic (fig. 1.12.). Pentru dezvoltare, leuconostocii au nevoie de vitamine
(acid nicotinic, tiamină, biotină) şi zaharuri
fermentescibile. Nu sunt proteolitici şi nu reduc azotaţii.
Specii de Leuconostoc formează polimeri (dextran). Se
dezvoltă bine la 20-30°C.
Genul Leuconostoc cuprinde speciile: Leuconostoc
cremoris (citrovorum); Leuconostoc lactis; Leuconostoc
dextranicum; Leuconostoc mezenteroides.
Aceste specii sunt heterofermentative şi se dezvoltă greu în
laptele fără adaos de stimulatori. În produsele lactate,
leuconostocii au două funcţii de bază:
- produc compuşi de aromă (diacetil, acetoină);
- produc ochiuri de fermentare prin formare de CO2 în
unele tipuri de brânzeturi (Edam, Goude, Tilsit).
Ambele funcţii sunt realizate prin metabolismul citratului,
dar leuconostocii produc CO2 şi din lactoză. Leuconostocii
intervin deci în metabolismul glucidelor şi al citratului.
Metabolismul glucidelor Fermentarea glucidelor de către
leuconostoci se face pe calea fosfocetohexozelor, dintr-un
mol de hexoză regenerându-se câte un mol de ATP. Genele
care codifică etapele iniţiale ale fermentării lactozei (ca de
altfel şi ale metabolizării citratului, producerii de proteaze)
sunt localizate în plasmide.
Figura 1.12. Calea homo şi heterofermentativă de
degradare a glucozei de către bacteriile lactice Metabolismul citratului Metabolismul citratului de către
leuconostoci este acelaşi ca şi la streptococi cu menţiunea
Fermentarea acidului citric cu formare de diacetil, acetoină că leuconostocii produc diacetil şi acetoină la pH scăzut.
şi 2,3 butilenglicol este arătată în figura 1.13. Acelaşi Acetoina se poate forma pe două căi:
mecanism îl folosesc şi leuconostocii.
- prin decarboxilarea acetolactatului;
- din diacetil prin intermediul diacetil reductazei, într-o
Capitolul 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. 17
Culturi starter de microorganisme.
reacţie care necesită NADH sau NADPH. Această ultimă unor produse de carne la temperatura de 16-27°C, producţia
cale este redusă sau chiar lipseşte în cazul lui Str. de acid lactic este mai lentă şi implicit se pot dezvolta şi
diacetilactis, din cauza capacităţii limitate a acestuia de a microorganismele care contaminează carnea, durata de
produce acetil- CoA, unul din precursorii diacetilului. fermentaţie fiind mai mare.
Culturi starter Temperatura de Durata, pH-ul P. pentosaceus produce o fermentaţie rapidă când
incubare, °C ore substratul conţine un glucid fermentescibil, temperatura de
P. pentosaceus 26,7 20 5,00 fermentare fiind cuprinsă între 15-27°C.
P. acidilacti 26,7 38 5,65
P. pentosaceus 29,4 13 5,00 Din tabelul de mai sus rezultă că P. pentosaceus este mai
P. pentosaceus 29,4 28 5,40 eficace în ceea ce priveşte producţia de acid lactic atât la
Leuconostocii (ca de altfel şi lactobacilii) pot produce la 26,7°C cât şi 29,4°C în comparaţie cu P. acidilactici.
unele brânzeturi unele defecte şi anume: Având în vedere că pediococii produc acid lactic şi
- crăparea pastei la brânza Cheddar ( defect numit “Blit bacteriocine, ei exercită o acţiune inhibitoare faţă de
opennes”); microorganismele patogene şi cele de alterare (stafilocici,
salmonele, Cl. botulinum, bacili, enterobacterii gram
- apariţia timpurie de gaze la brânza Goude (Str. negative, drojdii).
diacetilactis poate produce şi el defectul de “plutire” a
coagulului, la brânza Cottage). În produsele de carne fermentate, pediococii pot scade pH-
ul de la 5,6 la 4,5-5,2 ceea ce face ca proteinele să fie aduse
Aceste defecte se datorează formării de CO2. Pentru a se aproape de punctul izoelectric fapt ce favorizează sinereza
preveni defectul de “plutire” a coagulului, brânza Cottage şi deci uscarea produsului.
se fabrică cu o cultură care nu conţine Str. diacetilactis,
adăugându-se apoi în brânza obţinută o cultură de Acidul lactic produs contribuie la denaturarea proteinelor
Leuconostoc citrovorum cultivată pe lapte cu adaos de din carne ceea ce contribuie la realizarea unei texturi ferme
citrat sau o cultură concentrată de Leuconostoc citrovorum. a produsului finit.
Genul Lactobacillus. Acest gen aparţine familiei
Lactobacillaceae. Această familie cuprinde bacterii sub
formă de bastonaşe de lungimi şi grosimi variabile, precum
şi cocobacili scurţi, aşezaţi obişnuit în lanţuri în faza de
înmulţire logaritmică.
Sunt asporogene, imobile, Gram pozitive, anaerobe sau
În afară de industria laptelui, leuconostocii se utilizează şi facultativ anaerobe. În general sunt catalază –negative
pentru: citocrom-oxidază –negative, nu reduc azotaţii, nu lichefiază
- fermentarea unor produse vegetale (varză, castraveţi, gelatina. Au activitate proteolitică şi lipolitică redusă.
măsline) intervenind în cadrul microflorei spontane Glucidele cele mai bine fermentate sunt: lactoza, maltoza,
sau sub formă de culturi concentrate; zaharoza (mai ales în faza de dezvoltare), apoi hexozele
(glucoza, fructoza, galactoza).
- fermentarea malolactică a vinurilor;
Pentru dezvoltare necesită substanţe minerale şi toate
- producţia de dextran. vitaminele din grupul B. Se dezvoltă bine în mediu cu pH
În industria laptelui se folosesc culturi lactice care conţin 5,5-5,8, dar şi la pH ≤ 5 . Se pot dezvolta în limite largi de
streptococi acidifianţi (Str. lactis şi Str. cremoris), precum temperatură (5-53°C), dar temperatura optimă este cuprinsă
şi bacterii producătoare de aromă şi unele specii de între 30 şi 45°C.
Leuconostoc şi Str. diacetilactis, ultimul fiind aromatizant
În funcţie de temperatura optimă de dezvoltare lactobacilii
şi acidifiant.
pot fi:
Genul Pediococcus. Acest gen aparţine familiei
termofili: L. lactis, L. helveticus, L. bulgaricus, L.
Streptococaceae şi cuprinde bacterii sub formă de coci
acidophilus, temperatura optimă fiind 37-45°C;
perechi sau tetrade. Metabolismul acestor bacterii este
predominant fermentativ, homolactic. Se produce acid mezofili: L. casei, L. plantarum, L. brevis etc.; temperatura
lactic racemic (DL) din glucoză, fructoză, manoză. optimă de dezvoltare fiind 26-30°C.
Sorbitolul şi amidonul nu sunt fermentaţi. Multe specii sunt
catalază-negative, dar se întâlnesc şi specii care au Orla Jensen a împărţit genul Lactobacillus în următoarele
activitate catalazică independentă de hem. grupe:

Principalele criterii de diferenţiere între diferitele specii de 1. grupa Thermobacterium care cuprinde lactobacili
pediococi sunt menţionate în tabelul 3.8 homofermentativi termofili: L. lactis, L. helveticus, L.
bulgaricus, L. acidophilus, L. delbrueckii; L. leichmanii;
P. acidilacti, în culturi starter, este utilizat pentru obţinerea
de produse din carne fermentate la temperaturi mai ridicate, 2. grupa Streptobacterium – care cuprinde lactobacilii
deoarece are o dezvoltare bună la 42-52°C, producând rapid homofermentativi mezofili: L. casei, L, plantarum;
acidul lactic şi deci scade efectiv pH-ul, produsul obţinut
având gust acrişor. Atunci când se utilizează la fermentarea
Capitolul 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. 18
Culturi starter de microorganisme.
3. grupa: Betabacterium – care cuprinde lactobacili fosforilat al glucozei (glucozo-6P), care apoi suferă
heterofermentativi, ce contaminează frecvent brânzeturile: transformări pe calea Embden – Meyerhof (fig. 1.15.).
L fermenti, L. buchneri, L. brevis, L. viridiscens.
Streptobacteriile la rândul lor, au fost clasificate de către
unii autori în neacidorezistente şi acidorezistente.
Lactobacilii neacidorezistenţi produc compuşi aromatici
(diacetil, acetoină). Se prezintă sub formă de bastonaşe de
lungimi variabile şi rar formează lanţuri .
Se pot dezvolta la 2-15°C. Nu se dezvoltă la pH < 5,6. Se
utilizează în culturi starter la fermentarea salamurilor crude
cu pH = 5,6 – 6,1, produsele având o durată mare de
maturare, iar gustul final fiind slab acrişor dulceag.
Lactobacilii acidorezistenţi au formă de bastonaşe scurte Figura 1.15. Transformarea galactozei în glucoză-6P de
care formează lanţuri. Se dezvoltă bine la pH ≤ 5,0. către lactobacili
Activitatea metabolică a lactobacililor în produsele Activitatea proteolitică. Activitatea proteolitică a
alimentare fermentate se referă la metabolismul lactozei, lactobacililor contribuie atât la textura cât şi la aroma unor
galactozei şi glucozei. Zaharoza este fermentată numai produse alimentare (produse lactate, produse vegetale
după hidroliza acesteia în glucoză şi fructoză. fermentate, produse din carne fermentate etc.), dar şi la
eliberarea unor aminoacizi care stimulează creşterea şi
Metabolismul lactozei Pentru a se dezvolta în lapte,
activitatea altor bacterii lactice folosite în culturile starter în
lactobacilii homofermentativi hidrolizează lactoza cu
amestec cu lactobacilii. Se consideră că activitatea
ajutorul β -galactozidazei şi/sau β -D–fosfogalactozid– endoproteinazică a lactobacililor este asociată cu
galactohidrolazei, aşa cum arată în schema din figura 1.14. membrana celulelor, iar activitatea exopeptidazică este
localizată intracelular. Enzimele din membrana celulelor
produc hidroliza parţială a macromoleculelor proteice, din
care se formează peptide suficient de mici pentru a fi
transportate în interiorul celulelor unde se continuă
degradarea lor până la aminoacizi, necesari creşterii (figura
1.16.).
Activitatea proteolitică a lactobacililor este optimă la pH
Figura 1.14. Transformarea lactozei în glucoză şi 5,2- 5,8 şi temperatura de 45-50°C. La temperaturi mai
galactoză respectiv glucoza şi galactoza 6P de către mari de 55°C activitatea proteolitică este mult redusă
lactobacilii homofermentativi datorită termodenaturării enzimei iar la 70°C/1min
enzimele sunt complet inactivate.
β -D-galactozid–galactohidrolaza este utilizată de Lb.
casei iar β -galactozidaza este utilizată de majoritatea În cazul laptelui, proteinazele extracelulare ale L.
lactobacililor (L. bulgaricus, L. lactis, L. helveticus etc.), bulgaricus sunt active faţă de β -cazeină, apoi în ordine
deşi aceştia din urmă au şi activitate β -D–fosfogalactozid– descrescătoare şi faţă de Қ şi β cazeină.
galactohidrolazică, însă mai redusă.
L. bulgaricus are β -galactozidază activă la pH = 7,0 şi este
activată de Mg2+, Mn2+ şi Fe2+. În cele mai multe cazuri,
lactobacilii folosesc mai mult glucoza ca sursă de energie
în comparaţie cu lactoza şi galactoza. Unii lactobacili
eliberează în mediu galactoză care se acumulează.
Metabolismul hexozelor După hidroliza lactozei în celulele
lactobacililor homofermentativi, hexozele rezultate sunt
metabolizate pe calea Embden – Meyerhof.
Lactobacilii heterofermentativi fermentează hexozele pe
calea hexozomonofosfatului, aceşti lactobacili neavând
aldolază şi triozofosfat izomerază care sunt enzime cheie în Figura 1.16. Acţiunea endoproteinazelor extracelulare şi a
calea Embden – Meyerhof. Aceasta este de fapt şi diferenţa exopetidazelor intracelulare în cazul lactobacililor
dintre cele două grupe de microorganisme, adică
lactobacilii homofermentativi posedă atât aldolază cât şi Producerea de compuşi de aromă şi H2O2 Principala
triozofosfatizomerază, în timp ce lactobacilii contribuţie a lactobacililor este producţia de acid lactic. În
heterofermentativi nu posedă aceste enzime. cazul produselor lactate acide, deşi speciile de lactobacili
implicate sunt homofermentative, acestea însă produc şi alţi
Galactoza, rezultată din lactoză, pentru a fi fermentată metaboliţi, printre care produşi volatili ca: acetaldehida,
trebuie mai întâi să fie transformată într-un derivat diacetil şi alcool. In cantitate mai mare fiind produsă
Capitolul 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. 19
Culturi starter de microorganisme.
acetaldehida. În plus, L. casei produce diacetil din citrat, foloseşte glucono – delta – lactona ca acidifiant chimic.
mai ales atunci când laptele se suplimentează cu citrat (L. Lactobacillus plantarum poate reduce NaNO3 dacă pH-ul
casei nu este însă un producător major de diacetil). Anumiţi mediului este mai mare de 6,0 şi nu există zaharuri
lactobacili produc H2O2 care se acumulează în mediul şi fermentescibile în mediul de cultură. Lactobacillus sake şi
jenează dezvoltarea altora. Acumularea H2O2 în mediul de Lactobacillus curvatus produc H2O2 în prezenţa O2
cultură este posibilă pentru ca lactobacilii sunt catalază – atmosferic. Cei doi lactobacili se întâlnesc frecvent în
negativi. Incapacitatea lactobacililor de a distruge salamurile crude fără adaos de culturi starter (sunt
metabolic H2O2 explică de ce aceştia nu se dezvoltă bine în componenţi ai microflorei spontane a compoziţiei de
condiţii puternic aerobe, oxigenul fiind toxic pentru carne).
lactobacili care nu posedă superoxiddismutază, enzimă care
se constituie ca un sistem de protecţie faţă de toxicitatea • Alte utilizări Lactobacilii interesează şi în
oxigenului, cum este cazul altor bacterii. fermentarea măslinelor, verzii, castraveţilor, gogonelelor,
în producerea spirtului şi drojdiei presate în vederea
Acţiunea lactobacililor este îmbunătăţită prin interacţiuni acidifierii plămezilor, la fermentarea unor produse
cu alte bacterii lactice. De exemplu, cultura mixtă formată fermentate din cereale (bragă, cvas), la fabricarea acidului
din L. bulgaricus şi Str. thermophilus este adecvată pentru lactic prin fermentare etc.
fabricarea iaurtului, deoarece cultura mixtă produce mai
rapid acid lactic.
Interacţiunea dintre cele două bacterii lactice este benefică Genul Micrococcus şi Staphylococcus Microorganismele
din următoarele motive: din genurile Micrococcus şi Staphylococcus aparţin
familiei Micrococaceae care cuprinde bacterii sub formă de
- L. bulgaricus produce aminoacizi liberi, în particular coci. Se pot dezvolta în medii care conţin 15% NaCl.
histidină, care stimulează producţia de acid lactic a lui Str. Pentru industria cărnii interesează anumite specii de
thermophilus; micrococi şi stafilococi care sunt folosite pentru:
- Str. thermophilus, pe de altă parte, produce acid - capacitatea lor de a reduce azotaţii la azotiţi (contribuie
formic, care stimulează activitatea lui L. bulgaricus; la formarea culorii cărnii sărate în prezenţă de azotaţi);
- Str. thermophilus, deşi produce o cantitate suficientă - activitatea lor catalazică;
şi de CO2 care stimulează dezvoltarea lui L. bulgaricus,
- activitatea de acidificare, proteolitică şi lipolitică.
totuşi dezvoltarea acestuia este mai redusă, deoarece Str.
thermophilus utilizează mai rapid anumite substanţe Dintre speciile de micrococci interesează Micrococcus
nutritive esenţiale pentru dezvoltarea lui L. bulgaricus. În aurantiacus şi Micrococcus varians.
plus, lactobacilii, în general, sunt sensibili chiar la niveluri
foarte reduse de antibiotice, în comparaţie cu Str. Pentru industria laptelui, micrococii formează partea
thermophilus ( de aici şi necesitatea ca laptele să nu conţină principală a populaţiei nelactice din laptele crud şi
urme de antibiotice). respectiv brânzeturile fabricate din laptele crud. Din brânza
Cheddar fabricată din lapte crud a fost izolat Micrococcus
Utilizarea culturilor de lactobacili: freundenreichii, care a fost ulterior utilizat sub formă de
cultură pură în scopul accelerării formării aromei brânzei
• În industria laptelui se utilizează Lactobacillus fabricate din lapte pasteurizat datorită activităţii proteolitice
lactis şi Lactobacillus bulgaricus, singuri sau în amestec la şi lipolitice. Tot în scopul maturării unor brânzeturi cu
fabricarea iaurtului, chefirului, cumâsului, brânzei pastă presată s-a utilizat un preparat enzimatic şi anume
Ementhal, brânzeturilor italiene. Lactobacillus helveticus Rulactina ce conţine o metal-protează cu activitate strict
este şi el implicat în unele din aceste produse. endoproteinazică obţinută din Micrococcus caseolyticus.
Lactobacillus acidophilus este folosit la fabricarea laptelui
acidofil, laptelui acidofil nefermentat şi a altor produse Din genul Staphylococcus interesează speciile de
acidofile. Lactobacillus casei se utilizează pentru obţinerea stafilococi coagulază-negativi, nepatogeni cum ar fi:
produsului yakult. Staphylococcus carnosus, Staphylococcus xilosus,
Staphylococcus simulans.
• În industria cărnii interesează Lactobacillus sake, Combinaţiile de micrococi şi stafilococi sunt eficace pentru
Lactobacillus curvatus şi în special Lactobacillus
activitatea azotat-reductazică şi catalazică. În aceste
plantarum care se caracterizează prin faptul că nu produce
combinaţii, Staphylococcus carnosus acţionează mai bine
CO2 la fermentarea glucozei dar produce CO2 din gluconat.
decât micrococii în formarea culorii, reducând azotaţii la
Riboza este fermentată la acid lactic şi acid acetic. Posedă
azotiţi şi respectiv azotiţii la oxid de azot, chiar în condiţii
activitate aldolazică, glucozo – 6P – dehidrogenazică. Prin
de aciditate ridicată a substratului. Aroma produselor la
fermentaţie lactică se produce acid lactic racemic (DL).
care este utilizată cultura starter de Staphylococcus
Lactobacillus plantarum este facultativ anaerob, nu
carnosus este superioară.
produce NH3 din arginină. Poate acidifica laptele şi are
temperatura optimă de dezvoltare la 30-35°C. Nu necesită
pantotenat, tiamină, niacină pentru dezvoltare.
Genul Streptomyces. Specii din genul Streptomyces pot
Lactobacillus plantarum ca şi Lactobacillus sake pot altera alimentele, producând mirosuri şi gusturi
descompune acidul gluconic cu formare de acid acetic ceea dezagreabile, altele (puţine la număr) sunt patogene.
ce este dezavantajos în cazul salamurilor la care se
Capitolul 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. 20
Culturi starter de microorganisme.
Streptomyces griseus senso Hötter este însă inofensiv şi a brânzeturi este sporită prin dezvoltarea anterioară sau
fost folosit pentru capacitatea sa de a reduce azotatul la concomitentă a bacteriilor lactice. Viteza formării prolinei
azotit, putându-se dezvolta bine în substraturi care conţin ~ la valorile pH şi concentraţia de NaCl atinsă în brânza
8% NaCl şi care au pH = 5,8-8,5. Temperatura optimă de şvaiţer este temporar încetinită, dar maturarea prelungită
dezvoltare este la 30°C. Este catalază – pozitiv având anulează efectele de inhibare ale pH-ului şi concentraţia de
capacitate proteolitică dar nu şi lipolitică. Poate fi asociat NaCl. Se consideră că ionii de cupru ar inhiba producerea
cu micrococii şi/sau lactobacilii. În salamurile crude se de prolină pe unele căi, această inhibare parţială fiind
inoculează la nivel de 5·103 /g compoziţie. benefică, deoarece permite evoluarea altor procese de
aromatizare.
Producerea de diacetil şi acetoină Bacteriile propionice
Genul Propionibacterium. Bacterile din genul pot produce diacetil şi acetoină, cantităţile formate fiind
Propionibacterium fac parte din familia
mai mari la 21°C decât la 32-37°C. Producţia de diacetil
Propionibacteriaceae. Bacteriile propionice fermentează
este urmată de reducerea acestuia la acetoină şi 2,3
carbohidraţii, piruvatul/lactatul. Bacteriile propionice “tip
butilenglicol. Cantitatea de diacetil creşte prin adaos de
lapte” sunt: Propionibacterium freundreichii (cu
citrat, piruvat sau glucoză în mediu de cultură. În culturile
subspeciile freundreichii, globosum şi shermani),
mixte de Str. lactis şi bacterii propionice, producţia de
Propionibacterium theonii, acidipropionici şi jensenii.
diacetil se intensifică ca o consecinţă a scăderii pH-ului de
Principalii produşi de fermentaţie a bacteriilor propionice către streptococi. Bacteriile propionice produc şi alte
sunt CO2, cantităţi mari de acid propionic şi acetic şi substanţe care contribuie la aroma brânzeturilor: aldehidă
cantităţi mici de acid izovalerianic, formic, succinic, lactic. acetică, aldehidă propionică, alcool etilic, alcool propilic,
Toate speciile produc acid lactic din glucoză. Se dezvoltă dimetilsulfură, acid izovalerianic.
foarte bine la 30-37°C şi la pH = 7,0. Alte activităţi metabolice Bacteriile propionice pot avea şi
Producerea de propionat, acetat şi CO2 Lactatul (respectiv activitate proteolitică şi lipolitică.
piruvatul) este transformat în propionat prin reacţia: Bacteriile propionice pot contribui într-o măsură mai mică
3CH3-CHOH-COOH la activitatea proteolitică din brânza Şvaiţer prin enzimele
2CH3-CH2-COOH + CH3-COOH + CO2 + H2O proteinazice (~12 enzime) şi peptidazice (~ 7 enzime), dar
activitatea proteolitică a bacteriilor propionice este
Propionatul, acetatul şi CO2 se formează în proporţie de inferioară bacteriilor lactice (L. bulgaricus, L. helveticus,
2/1/1. Diferitele tulpini de bacterii propionice se deosebesc Str. thermophilus).
între ele prin raportul acid propionic /acid acetic format, o
influenţă în acest sens având şi aciditatea substratului, Bacteriile propionice pot contribui şi la lipoliza
cantitatea de lactat şi adaosul de carbonat şi succinat. trigliceridelor, eliberând acizi graşi cu lanţ lung, dar această
activitate lipolitică este nesemnificativă.
Producerea de prolină Prolina este considerată ca
principalul component care conferă aromă dulceagă
brânzeturilor de tip şvaiţer, prezenţa prolinei fiind asociată DROJDIILE, ciuperci unicelulare care se înmulţesc prin
cu dezvoltarea bacteriilor propionice la maturarea înmugurire, mai rar prin sciziparitate şi care formează
brânzeturilor de tip şvaiţer. Se consideră că există trei căi ascospori (sunt şi drojdii care nu formează spori, acestea
pentru producerea de prolină: denumindu-se drojdii/false torule şi micoderme), sunt
- proteoliza generală; agenţi tipici ai fermentaţiei alcoolice.
- hidroliza peptidelor care conţin prolină; Se prezintă sub formă de celule rotunde sau ovoide
(Saccharomyces cerevisiae), eliptice (Saccharomyces
- biosinteza prolinei. elipsoideus), foarte alungite (Saccharomyces pasteurianus),
La prima cale se ia în considerare producerea de prolină de forma unei lămâi (Saccharomyces apiculans), de forma
prin hidroliza cazeinei. unei sticle (Saccharomyces ludwigii) sau sub formă de
cilindru (Pichia).
La a doua cale se ia în considerare formarea de prolină din
hidrolizatul cazeinic prin acţiunea peptidazelor Dintre drojdii interesează (în sens util) cele aparţinând
(Propionibacterium shermanii posedă imidopeptidază şi familiei Saccharomycetaceae, genul Saccharomyces care
proliniminopeptidază intracelulare cu optim de pH la 5,5- cuprinde drojdii alcooligene folosite în industria berii,
6,0). vinului, pâinii, spirtului, genul Kluyveromices care
fermentează lactoza, genul Debaryomices care se utilizează
La a treia cale se are în vedere biosinteza prolinei din în industria cărnii.
arginină şi mai puţin din acid glutamic, dar calea de
biosinteză este nesemnificativă în raport cu cea de-a doua Mai interesează drojdiile familiei Cryptococcaceae
cale menţionată. (genurile Candida, Torulopsis) care se folosesc ca agenţi
de fermentare şi producători de biomasă.
În orice caz, concentraţia de prolină din interiorul celulelor
este mai mică decât cea a prolinei din mediul de cultură . Utilizări ale drojdiilor
Eliberarea prolinei din peptide coincide cu eliberarea 1. Utilizarea pentru fermentarea alcoolică Pentru
enzimelor celulare în mediu. Bacteriile propionice singure fermentaţia alcoolică se folosesc drojdiile adevărate care
hidrolizează încet cazeina, dar producerea de prolină în aparţin genului Saccharomyces (Meyen) Ress şi care se
Capitolul 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. 21
Culturi starter de microorganisme.
caracterizează prin aceea că nu formează micelii tipic, Aceşti alcooli superiori se formează prin reacţii de
produc 1-4 spori, iar puterea de fermentare depăşeşte dezaminare şi decarboxilare ale aminoacizilor leucină,
puterea de respiraţie. Sunt adaptate la condiţii de izoleucină şi valină.
anaerobioză şi prin urmare nu formează voaluri la
Fermentaţia alcoolică se aplică la:
suprafaţă.
După modul de comportare în timpul fermentaţiei drojdiile • obţinerea alcoolului din produse amidonoase
pot fi: (cartofi, porumb, secară), produse care conţin zaharoză
(sfeclă, melasă), produse care conţin lactoză (zer), produse
• de fermentaţie superioară care se ridică în cantităţi care conţin glucoză (hidrolizate celulozice, leşii sulfitice);
mari la suprafaţa lichidului de fermentare sub forma unui • obţinerea berii şi vinului, cidrului inclusiv cvas din
strat gros de spumă care se păstrează astfel până la sfârşitul pâine, rom, whisky;
fermentării. După sedimentare aceste drojdii rar dau un
precipitat dens. Au optim de temperatură la 28…30°C şi • obţinerea de băuturi fermentate pe bază de cereale
fermentează 1/3 din rafinoză. În categoria drojdiilor de şi leguminoase;
fermentare superioară se încadrează cele care produc
• obţinerea unor tipuri de produse lactate (chefir);
fermentarea alcoolică în cazul obţinerii alcoolului etilic,
pâinii şi unele suşe pentru bere (Saccharomyces • obţinerea de băuturi fermentate pe bază de zer.
cerevisiae);
2. Utilizarea pentru obţinerea de biomasă (s-a menţionat
• de fermentaţie inferioară care se dezvoltă în anterior);
lichidul fermentat, nu se ridică la suprafaţă în spumă, dar 3. Utilizarea în industria cărnii, în care caz se foloseşte
formează flocoane şi se sedimentează repede. Au optim la drojdia Debaromyces hansenii care este tolerantă la NaCl,
temperatura de 8…12°C şi fermentează complet rafinoza. nu reduce NaNO3 şi necesită oxigen atmosferic pentru
Drojdiile de fermentare inferioară se folosesc la obţinerea dezvoltare.
berii, vinului, cidrului (Saccharomyces carlsbergensis,
Saccharomyces oviformis, Saccharomyces vini, Se dezvoltă bine în straturile periferice ale salamurilor
Saccharomyces uvarum). neafumate sau puţin afumate. Această drojdie are
capacitatea de a consuma oxigenul din pastă şi de a
Fermentaţia alcoolică produsă de drojdii este distruge peroxizii produşi de bacteriile lactice. De regulă,
influenţată de: Debaromyces hansenii se foloseşte în combinaţie cu
- concentraţia zahărului fermentescibil din mediu; Staphylococcus carnosus şi Lactobacillus plantarum sau
Staphylococcus xilosus şi Lactobacillus sake. Se consideră
- temperatură ; că prin folosirea drojdiei menţionate produsele capătă o
aromă cu totul deosebită.
- conţinutul în alcool din substrat;
4. Utilizarea în industria laptelui La fabricarea
- felul drojdiei.
brânzeturilor, drojdiile se dezvoltă la suprafaţa
Concentraţia favorabilă de zahăr fermentescibil este de 10- brânzeturilor dar şi în interiorul brânzeturilor cu pastă
15%. Fermentaţia alcoolică se desfăşoară lent la pH 4-4,5, moale sau cu mucegai în pastă în timpul presării, zvântării
în mediu alcalin sensul fermentaţiei fiind schimbat. şi maturării, având următoarele acţiuni pozitive:
Viteza maximă de fermentare este la 30°C, dar în practică • consumă lactatul şi în acest fel contribuie la
se realizează la 4…28°C. Alcoolul pe măsura acumulării în neutralizarea pastei, îmbunătăţind prin aceasta consistenţa
mediu devine toxic pentru drojdii. Există drojdii care se şi favorizând implantarea bacteriilor;
dezvoltă la 16-18% alcool (Saccharomyces chevalieri
• produc factori de creştere pentru dezvoltarea
Guilliermond, Saccharomyces oviformis), însă în cele mai
bacteriilor;
multe cazuri fermentaţia se opreşte la 12-14%
(Saccharomyces uvarum, Saccharomyces carlsbergensis, • produc o peliculă de “acoperire” la anumite tipuri
Saccharomyces vini, Saccharomyces cerevisiae). de brânzeturi;
Odată cu creşterea temperaturii de fermentare se măreşte • produc proteoliză şi lipoliză şi prin urmare
toxicitatea alcoolului. Fermentaţia alcoolică este un proces contribuie la consistenţa şi aroma brânzei respective;
anaerob. Prin trecerea la aerobioză, drojdiile se înmulţesc
rapid şi produc biomasă. • produc compuşi volatili de aromă.
Fermentarea alcoolică nu este o fermentaţie pură. Se mai Dintre drojdii, Candida hansei a fost cultivată în asociaţie
formează glicerină ( 8% din totalul zaharurilor existente în cu lactobacili şi Str. thermophilus, favorizând oxidarea
mediu), acid lactic, acid acetic, substanţe acetoinice (acetil lactatului, scăderea potenţialului de oxidoreducere şi
metil carbinol = acetoină şi diacetil), acid malic, acid producerea de factori de creştere, precum şi dezvoltarea
succinic, acid propionic, acid citramalic, acid culturilor starter în care este asociată. Drojdia Candida
dimetilgliceric, alcooli superiori: izobutilic, izoamilic, lipolitica este uneori folosită la fabricarea brânzeturilor cu
amilic, care provin din aminoacizii rezultaţi la degradarea mucegai în pastă, datorită faptului că prin lipazele
substanţelor pectice din musturi şi plămezi. conţinute realizează o hidroliză a lipidelor din brânză, fapt
ce favorizează utilizarea acizilor graşi de către Penicillium
Capitolul 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. 22
Culturi starter de microorganisme.
în reacţiile de β -oxidare. Drojdia Torulopsis candida În cazul salamurilor crude afumate/neafumate,
găsită pe brânzeturi se dezvoltă bine în medii acide şi mucegaiurile de acoperire contribuie la:
suportă concentraţii de NaCl până la 10%. Drojdia - reglarea eliminării apei din produs şi a schimbului de
Candida kefir şi alte drojdii din granula de chefir realizează
gaze;
fermentaţia alcoolică în produsul lactat acid dietetic chefir.
- formarea aromei;
Kluyveromices lactis şi Kluyveromices fragilis se utilizează
la obţinerea de lactază care are multe utilizări. - îmbunătăţirea aspectului comercial al produsului.
Kluyveromices lactis şi Kluyveromices fragilis se utilizează
Aroma este mai evidentă la salamurile cu diametru mai
la obţinerea de biomasă prin cultivare aerobă pe zer
mic. Produsele pot fi livrate cu mucegaiul de acoperire
(procedeul Bell – Franţa).
intact sau după “ periere”. Culoarea miceliului rămas este
Kluyveromices fragilis şi Candida pseudotropicalis se dependentă de varietatea mucegaiului folosit: alb-ivorie
utilizează pentru obţinerea alcoolului etilic din zer (preferabilă în Italia); gri (preferabilă în Ungaria); alb-mat
(procedeul Carbery –Irlanda). (preferabilă în România).
Prin utilizarea culturilor pure de mucegai se suprimă
apariţia la suprafaţa salamurilor a mucegaiurilor
MUCEGAIURILE Pentru industria alimentară interesează toxicogene, în special a celor producătoare de aflatoxine
clasa Phycomycetes cu următoarele genuri:
precum şi a mucegaiurilor de “pătare” care produc spoturi
Genul Mucor şi Rhizopus aparţinând familiei de culoare verde sau neagră.
Mucoraceae. Aceste mucegaiuri care se întâlnesc pentru
Penicillium nalgiovensis Se utilizează spori de Penicillium
diferite produse vegetale şi alimentare, sub formă de nalgiovensis pentru salamurile crude cu miceliu alb la
colonii pufoase, au o acţiune fermentativă netă.
suprafaţă. Sporii, în suspensie, se pulverizează la suprafaţa
Specii de Mucor şi Rhizopus se folosesc pentru: produselor. După 3-4 zile de la însămânţare se formează
micelii, iar după 5-6 zile de la însămânţare apar corpii de
- obţinerea unor produse alimentare fermentate în Orientul fructificaţie purtători de conidii. Temperatura optimă de
Îndepărtat, pe bază de cereale şi leguminoase;
dezvoltare a mucegaiului este de 22-23°C.
- în producţia de spirt prin zaharificarea amidonului Penicillium nalgiovensis foloseşte ca substrat nutritiv
(procedeul Amilo care foloseşte Amylomyces rouxi – glucidele dar are şi activitate proteolitică şi lipolitică. Nu
Mucor rouxianus); are activitate celulazică şi nu produce micotoxine.
- în producţia de enzime, în principal amilolitice şi Penicillium expansum se dezvoltă bine la 22°C şi
proteolitice. umiditatea relativă a aerului este de ~ 82% pentru sporulare
Din clasa Ascomycetes interesează ordinul Plectascales cu şi ~ 88% pentru germinare. Dezvoltarea bună este la ϕ =
genurile Aspergillus şi Penicillium. 92-95%. Sporii pulverizaţi la suprafaţa batoanelor
formează un miceliu pufos în circa 8 zile de la însămânţare,
Mucegaiurile din genul Aspergillus se utilizează în: maturizarea deplină având loc după 30 zile de la
- producţia de şuncă în SUA şi Spania (mai puţin); însămânţare. Penicillum expansum nu produce micotoxine
dacă substratul conţine proteine cu sulf (cazul pastei
- obţinerea de produse fermentate tradiţionale în Orientul salamurilor crude).
Îndepărtat (ceva mai mult);
În industria laptelui culturile de spori de mucegai se
- obţinerea de enzime: amilaze, proteaze, enzime utilizează, aşa cum deja s-a menţionat, la fabricarea
pectolitice. brânzeturilor cu mucegai în pastă cât şi cu mucegai la
Mucegaiurile din genul Penicillium se utilizează în: suprafaţă (brânzeturi cu pastă moale).
Pentru brânzeturile cu mucegai în pastă (Brânza Roquefort,
- industria brânzeturilor cu mucegai la suprafaţă şi în pastă Gorgonzola, Stilton, Gammelost) se utilizează spori de
(Penicillium camemberti şi Penicillium roqueforti);
Penicillium roquefort. Pentru brânzeturile de tip
- industria cărnii cu mucegaiuri de acoperire (Penicillium Camembert se utilizează sporii de la două specii de
nalgiovensis şi Penicillium exposus); Penicillium: P. camemberti şi P. caseicolum.

- obţinerea de enzime amilolitice, proteolitice, pectolitice. Mucegaiurile dezvoltate în/pe aceste brânzeturi au rol
fundamental în:
În industria cărnii, culturile de spori de mucegai se
utilizează pentru maturarea unor şunci, care se - formarea aromei şi gustului;
însămânţează cu spori de Penicillium netoxicogen, în - formarea consistenţei;
special P. nalgiovensis, P. exposum, şi P. chrysogenum,
respectiv Country curred ham şi Jambon Serano, care se - definitivarea aspectului, procesele care intervin în
însămânţează cu spori de Aspergillus glaucus şi a unor formarea aromei şi consistenţei fiind proteoliza,
tipuri de salamuri crude fabricate în România , Italia, lipoliza şi β -oxidarea acizilor graşi.
Ungaria, Elveţia, Spania, Franţa, Bulgaria; Austria, Belgia,
Germania (şi mai puţin în SUA, Israel, Iugoslavia, Suspensiile de spori se pot adăuga/folosi:
Polonia).
Capitolul 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. 23
Culturi starter de microorganisme.
- în laptele destinat brânzeturilor sau amestecarea cu 1.3.2. Culturi starter
coagulul obţinut în cazul brânzei cu mucegai în pastă;
Culturile starter sunt definite ca acele culturi care se obţin
- în laptele destinat fabricării brânzei, sau pulverizare la plecând de la o cultură pură stoc şi care prin trecere prin
suprafaţa brânzei formate în cazul brânzeturilor cu culturi intermediare (pasaje) devin apte de a fi folosite
mucegai la suprafaţă. Mucegaiurile mai importante pentru producţia unor alimente fermentate. Culturile starter
pentru industria laptelui sunt: pot fi formate numai dintr-un singur microorganism sau din
mai multe microorganisme.
Penicillium roqueforti Thom se dezvoltă bine la 20-25°C şi
pH 4,5-7,5. Tolerează concentraţii de 5-8% NaCl. Are Culturile starter de microorganisme sunt utilizate în
activitate proteolitică, lipolitică şi de β -oxidare a acizilor vederea:
graşi. Activitatea mucegaiului este stânjenită de prezenţa • dirijării unor procese biochimice prin care se
acidului propionic în brânză, la concentraţii mari de 30%
asigură produsului un anumit grad de inocuitate (inclusiv
CO2 în aerul depozitului. Pentru intensificarea formării capacitatea de conservare);
aromei se recomandă ca lipidele din lapte să fie în prealabil
lipolizate cu esterază pregastrică, astfel ca pe măsură ce • asigurării unor însuşiri senzoriale;
mucegaiul sporulează, acizii graşi liberi să fie β -oxidaţi
• asigurării, în unele cazuri, şi a unor însuşiri
până la metilcetone. P. roqueforti se dezvoltă în canalele şi
nutritive.
golurile practicate în pasta brânzei, sporii formaţi având
culoare verde închis care conferă brânzei un aspect La folosirea culturilor starter în industria alimentară trebuie
marmorat. să se aibă în vedere următoarele:
Penicillium camemberti şi Penicillium caseicolum Sporii • să conţină un anumit număr de microorganisme
acestor mucegaiuri se utilizează în producţia brânzeturilor viabile (g/ml) şi un număr cât mai redus de germeni
de tip Camembert incluzând Camembert, Brie, Neufchatel, nedoriţi;
Coulommier, Garré de l’Est, Olivet.
• produşii metabolici, primari şi secundari, să nu
Penicillium camemberti Thom (Penicillium album) se prezinte pericol pentru sănătatea oamenilor;
utilizează la brânzeturile tip Camembert cu pastă mai
untoasă, mai parfumată, de culoare gri – alburie. • să nu conţină şi să nu producă antibiotice care se
utilizează în scop terapeutic la oameni;
Penicillium caseicolum Bainer (Penicillium candidum) se
utilizează la brânzeturile de tip Camembert cu pasta mai • să aibă o anumită (anumite) activităţi specifice: de
compactă, o aromă mai delicată, mai discretă şi de culoare producere a acidului lactic, de reducere a azotului etc;
alb – imaculat.
• microorganismele existente în cultură să fie
La însămânţare prin pulverizare de spori la suprafaţă a declarate cu numele ştiinţific întreg;
brânzeturilor cu umiditate ~ 55-60% se formează miceliile
de mucegai care consumă din aciditatea pastei, consecinţa • speciile (suşele) noi care se introduc în producţie,
fiind creşterea pH-ului începând cu a 12 –a zi, iar după 27 trebuie să fie înregistrate la MS şi să fie depozitate în
de zile pH-ul rămâne constant. colecţii cu nomenclator; înainte de utilizare în producţie să
fie testate din punct de vedere al inocuităţii în conformitate
Mucegaiurile din genul Penicillium au activitate cu legislaţia în vigoare;
endoproteinazică faţă de α - şi β cazeină, dar au şi
activitate exopeptidazică importantă, fiind demonstrat • suşele declarate a fi sigure trebuie controlate la
faptul că atât P. roqueforti cât şi P. camemberti sintetizează intervale regulate de către institute specializate, în ceea ce
2 endopeptidaze (o metal proteinază şi o aspartil priveşte puritatea lor;
proteinază) precum şi două exopeptidaze cu acţiune • speciile, care pe baza noilor cunoştinţe ştiinţifice au
carboxi- şi aminopeptidazică, activitatea celor două grupe fost recunoscute ca având potenţial patogen sau toxicogen,
de enzime fiind relativ echivalentă în stratul de suprafaţă al trebuie să fie supuse unui control riguros pentru fiecare
brânzeturilor. suşă, realizându-se studii de toxicitate pe termen lung, de
Unele specii de Penicillium camemberti pot produce o carcinogenitate şi mutagenitate.
micotoxinâ (acidul ciclopiazonic, dar activitatea toxicogenă Toate cele menţionate trebuie să se constituie ca o
a mucegaiului este aproape nulă la temperatura tehnologică obligativitate absolută deoarece:
de maturare a brânzei (14-16°C).
• culturile starter se pot consuma în stare vie, odată
La brânza Camembert se pot utiliza şi spori de Geotricum cu produsul alimentar, aşa cum este cazul produselor
candidum care se introduc în lapte. Geotricum reduce lactate acide, brânzeturilor, salamurilor şi cârnaţilor cruzi, a
pericolul formării peptidelor amare, inhibă dezvoltarea lui unor sortimente de bere, a unor produse vegetale: varză
Penicillium, consumă acidul lactic şi deci contribuie la murată, castraveţi muraţi, gogonele murate, măsline verzi;
neutralizarea pastei, având şi acţiune protolitică şi
lipolitică. Brânza Camembert obţinută din lapte pasteurizat • culturile starter se pot consuma după distrugerea
cu adaos de Geotricum candidum are o aromă lor, rămânând în produsul alimentar atât ele cât şi produşii
asemănătoare cu cea a brânzei Camembert tradiţionale, lor de metabolism, aşa cum este cazul brânzei proaspete de
adică fabricată din lapte crud. vaci şi a iaurtului care au fost pasteurizate, brânzeturilor
topite, produselor de panificaţie etc.;
Capitolul 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. 24
Culturi starter de microorganisme.
• produşii de metabolism ai culturilor starter se - bacteriocinele sunt excretate în mediu în cea mai
consumă odată cu produsele alimentare, însă mare parte; o mică parte rămân în celulele bacteriene;
microorganismele sunt eliminate în cea mai mare parte, aşa - bacteriocinele diferă de antibiotice prin natura
cum este cazul berii, vinului, alcoolului, oţetului, acidului
speciilor şi suşelor producătoare, modalităţile de producere
citric, acidului lactic etc. şi natura lor chimică;
Culturi starter de bacterii lactice
- bacteriocinele secretate de bacteriile lactice din
Culturile starter de bacterii lactice sunt folosite în diferite culturile starter sau de protecţie au un spectru de acţiune
domenii: industria laptelui, cărnii, produselor vegetale relativ limitat în raport cu mai multe specii sau mai multe
murate, industria vinului, industria panificaţiei, industria suşe ale aceleiaşi specii.
sucurilor de fructe şi legume fermentate etc.
- bacteriocinele sunt sensibile la acţiunea enzimelor
Folosirea culturilor starter de bacterii lactice asigură proteolitice metabolice, ceea ce înseamnă că ingerarea de
produselor alimentare în care se introduc un anumit grad de produse ce conţin bacteriocine nu modifică microbiota
inocuitate. Această asigurare este realizată deoarece tractului intestinal şi nu va conduce la riscuri în ceea ce
bacteriile lactice produc: priveşte folosirea de antibiotice comune;
• acizi organici, în principal acid lactic, dar şi acid - bacteriocinele sunt stabile la căldură, deci rezistă
acetic, alcool, CO2; în laptele pasteurizat la 63°C/30s minimum sau la 72°C/15
s; rezistenţa lor termică se datorează structurii moleculare
• substanţe bacteriocine eliberate în mediul de simple (excepţie face helveticina J care are o structură
cultură; proteică mai elaborată);
• peroxizi organici (H2O2). - bacteriocinele sunt stabile la pH neutru sau acid,
În plus, bacteriile lactice intră în competiţie cu ceea ce înseamnă că sunt adaptate la condiţiile de mediu ale
microorganismele patogene şi cele de alterare în ceea ce bacteriilor producătoare;
priveşte consumul de substanţe nutritive, iar datorită şi - eficacitatea bacteriocinelor în produsele fermentate
acidifierii mediului, consecinţă a acumulării acizilor este limitată de condiţiile de conducere a fermentaţiei
organici, bacteriile patogene şi de alterare sunt inhibate în (temperatură, pH, aw)
dezvoltarea lor. Dintre bacteriile patogene sunt inhibate
stafilococii, salmonelele, Listeria monocytogenes, Cl. Culturi starter utilizate in industria laptelui
botulinum etc.
La obţinerea culturilor starter trebuie să avem în vedere în
Datorită acidităţii se inhibă şi dezvoltarea microflorei cu mod deosebit următoarele:
activitate proteolitică şi decarboxilazică, deci se formează
cantităţi mai reduse de amine biogene, iar în cazul - mediul de cultură (laptele);
cărnurilor sărate în prezenţă de azotiţi, datorită acidităţii se
favorizează descompunerea mai completă a azotiţilor, deci - tratamentul termic aplicat laptelui;
scade producţia de nitrozamine, mai ales la produsele care
se supun coacerii şi prăjirii. - condiţiile de incubare;
Culturile starter de bacterii lactice folosite ca atare sau sub - interacţiunile dintre speciile/tulpinile din cultura
formă de produse lactate dietetice acide sunt benefice starter;
pentru sănătatea oamenilor deoarece:
• aciditatea lactică favorizează acţiunea pepsinei ce - eventualele infectări cu bacteriofagi;
produce hidroliza proteinelor, respectiv coagularea cazeinei - instabilitatea culturilor starter de bacterii lactice.
laptelui care este în continuare degradată de tripsina
pancreatică; De la început, facem precizarea că prin cultură starter
• aciditatea mediului intestinal blochează dezvoltarea înţelegem culturile obţinute din cultura pură stoc
microflorei cu activitate patogenă şi favorizează (inoculum) prin diferite pasaje. Culturile starter sunt
implantarea bifidobacteriilor cu consecinţe pozitive pentru folosite la fabricarea unor produse lactate acide, smântână,
organismul uman (vezi capitolul probiotice). unt, brânzeturi.

În legătură cu bacteriocinele, în continuare se fac Culturile starter de bacterii lactice utilizate în industria
următoarele precizări: laptelui pot fi clasificate în mezofile şi termofile.

- bacteriocinele sunt secretate de bacteriile Gram Culturile starter mezofile, care la rândul lor, pot fi
negative; clasificate în:

- bacteriocinele sunt proteine şi activitatea lor a) Culturi starter singulare (single strain starter) care
dispare prin hidroliza lor de către proteaze; conţin numai Str. lactis subsp. lactis şi respectiv Str. lactis
subsp. cremoris (Lactococcus lactis şi Lactococcus
- bacteriocinele au acţiune bactericidă, dar nizina cremoris) ambii homofermentaticvi care produc acid lactic
este şi bacteriostatic. Multe bacteriocine sunt (L+) în proporţie de 0,8%. Folosirea acestor culturi starter
bacteriostatice la aplicarea lor în produsele alimentare; singulare a apărut ca o necesitate de a se evita formarea
Capitolul 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. 25
Culturi starter de microorganisme.
“ochiurilor” de fermentare la unele brânzeturi, “ochiuri” • culturi starter mixte tip LD care conţin atât specii
formate în urma producerii de CO2 de către bacteriile de leuconostoci cât şi Str. lactis subsp. diacetilactis ca
aromatizante. producători de aromă.
Culturile starter singulare mezofile prezintă următoarele La folosirea culturilor starter mixte trebuie să avem în
avantaje: vedere că:
- se poate utiliza continuu aceeaşi cultură cu - streptococii acidifianţi mezofili homofermentativi
activitate relativ constantă şi previzibilă; produc acid lactic din lactoză;
- nu este necesară alternarea culturilor, eliminându- - leuconostocii, cei heterofermentativi, şi Str. lactis
se riscul deprecierii acestora de către fagi, subsp. diacetilactis (homofermentativ) produc diacetil şi
acetoină din citrat, dar produc şi acid lactic, acetic prin
- se folosesc cantităţi mai mici de inoculum pentru
fermentarea lactozei şi glucozei;
obţinerea de cultură primară şi secundară;
Culturi starter termofile
- influenţele compoziţionale sezoniere ale laptelui
sunt mai reduse; Culturile starter termofile pot fi:
- se creează condiţii de realizare a unei producţii • acidifiante: Lactobacillus acidophilus;
standardizate de produse lactate de calitate superioară;
• acidifiante/aromatizante care la rândul lor pot fi
- cultura poate fi controlată şi supravegheată din constituite din unul sau mai multe specii de lactobacili şi
punct de vedere al caracteristicilor sale (sensibilitate la dintr-o specie de streptococi. În această direcţie amintim:
fagi, producerea de acid lactic, compatibilitatea ei,
aglutinarea şi eventual lisogenia). - cultura starter termofilă pentru iaurt: Lactobacillus
bulgaricus şi Str. therrmophilus;
Culturile starter singulare mezofile prezintă însă
următoarele dezavantaje: - cultura starter termofilă pentru brânzeturi:
Lactobacillus bulgaricus + Lactobacillus lactis +
- pot fi depreciate de tulpinile producătoare de Lactobacillus helveticus + Str. thermophilus. Această
bacteriocine; cultură starter se foloseşte la fabricarea brânzeturilor cu
- pot fi depreciate de fagi, deci sunt predispuse la pastă tare şi semitare, deci la care se practică încălzirea a
liză fagică; doua a bobului de coagul.

- pot suferi pierderi de plasmide şi deci pot pierde una sau Utilizarea culturilor starter termofile este benefică
mai multe din funcţiile lor. deoarece:

b) Culturi starter multiple mezofile sunt acele culturi care • produc acid lactic deci scad pH-ul laptelui şi
se bazează pe folosirea a 5-6 tulpini selecţionate, neînrudite determină coagularea acestuia (cazul iaurtului); la
pe plan fagic şi cultivate separat până la stadiul de cultură brânzeturi acidifierea favorizează eliminarea zerului din
primară sau chiar până la stadiul de cultură starter de coagul;
producţie când se amestecă între ele. În aceste condiţii, • au activitate proteolitică şi prin urmare contribuie
tulpinile nu se dezvoltă împreună decât cel mult timp de la ameliorarea proprietăţilor reologice şi la aroma
10 generaţii, ceea ce face ca nici o tulpină să nu devină produselor fermentate; ca urmare a activităţii proteolitice
dominantă. Asemenea culturi pot fi folosite mai multe luni rezultă şi aminoacizi din proteine care stimulează
în şir fără a-şi pierde capacitatea de acidifiere. dezvoltarea celorlalte bacterii din culturile starter termofile;
c) Culturi starter mezofile mixte Aceste culturi sunt
• produc şi compuşi de aromă, dar în principal
formate, de regulă, din două tipuri de bacterii lactice:
aldehidă acetică, acetonă, precum şi urme de acetoină;
- bacterii lactice acidifiante: Str. lactis sau Str.
cremoris; • produc şi substanţe cu caracter filant care
influenţează vâscozitatea produsului (Str. thermophilus în
- bacterii lactice producătoare de aromă: Str. cultura pentru iaurt);
diacetilactis (Lactococcus lactis var. diacetilactis) sau
specii de leuconostoci. • produc o serie de bacteriocine (Lactobacillus
helveticus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei
După tipul bacteriilor aromatizante culturile starter mixte etc.);
mezofile pot fi clasificate în următoarele grupe:
• produc H2O2 (Lactobacillus bulgaricus).
• culturi starter mixte tip L care conţin numai specii
din genul Leuconostoc: Leuconostoc cremoris Având în vedere cantităţile mari de iaurt ce se fabrică pe
(citrovorum), Leuconostoc dextranicum şi/sau Leuconostoc plan mondial, este necesar să cunoaştem factorii care
lactis care sunt toţi heterofermentativi şi produc acid lactic influenţează performanţa optimă a culturilor pentru iaurt.
D(-); Aceşti factori se referă la:

• culturi starter mixte de tip D care conţin Str. lactis • temperatura de incubare care este de 41-42°C
biov. diacetilactis ca singură specie producătoare de aromă; (apropiată de temperatura optimă de dezvoltare a lui
Lactobacillus bulgaricus ). După 3 ore de incubare se
Capitolul 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. 26
Culturi starter de microorganisme.
ajunge la ~ 500 mil bacterii/g, raportul dintre L. bulgaricus • rezistenţa la răcire care este importantă pentru
şi Str. thermophilus fiind 1/1; produsele lactate ce se congelează (iaurt, îngheţata de
iaurt). Rezistenţa la răcire se urmăreşte la – 6 ÷ - 9°C şi
• tratamentul laptelui – pasteurizarea influenţează
pozitiv dezvoltarea lui L. bulgaricus prin: apoi la -18°C sau -25°C ;

- modificarea structurii proteinelor; • producerea de substanţe filante care constă în


măsurarea vâscozităţii pe o probă inoculată de lapte cu
- eliminarea parţială a oxigenului şi realizarea unei 12% s.u., cu adaos de CaCl2 0,012%, incubată 4 ore/37°C
microaerofilii propice; până ce se atinge un pH de 4,2-4,3. Se pot depista în acest
- distrugerea inhibitorilor din lapte; fel culturile filante;

- formarea de acid formic care favorizează • activitatea proteolitică se poate urmări pe o cultură
dezvoltarea culturii; păstrată la 4°C la care se determină tirozina sau aminoacizii
liberi prin metoda formol titrimetrică;
• disponibilitatea substratului Laptele este un bun
substrat dar trebuie arătat că Lactobacillus bulgaricus are • activitatea lipolitică se poate determina prin
preferinţă faţă de glucoză şi deci ar trebui ca lactoza să fie măsurarea indicelui de aciditate din grăsimea culturii
prehidrolizată la β -galactozidaza; (lapte);

• metaboliţi produşi în mediu. Lactobacillus • proprietăţile senzoriale se determină la culturile de


bulgaricus produce H2O2 în mediul de cultură şi deci 24-48 ore la 20°C (se pot determina şi substanţele de aromă
adausul de catalază va stimula producţia de acid lactic de respectiv diacetilul, acetaldehida, acetoina).
către Str. thermophilus care este mai sensibil la H2O2 decât
Lactobacillus bulgaricus. Laptele destinat iaurtului nu
trebuie să fie agitat prea mult ca să nu includă aer (oxigen) CULTURI STARTER CONCENTRATE DE
care ar strica condiţiile de microaerofilie pentru L. MICROORGANISME
bulgaricus şi ar deveni toxic pentru Str. thermophilus.
Definiţie
Lactobacillus bulgaricus se apără de acţiunea oxigenului
prin intermediul manganului intracelular care înlocuieşte Culturile starter concentrate sunt definite ca acele culturi
acţiunea superoxiddismutazei; dezvoltate în condiţii controlate, concentrate într-un volum
mic şi conservate prin congelare sau uscare în vederea
• interacţiunile dintre bacterii din cultura pură depozitării şi transportului.
(inoculum) sau cultura starter. Între cele două
microorganisme există un sinergism deosebit. Culturile concentrate pot fi de bacterii, drojdii, spori de
Lactobacillus bulgaricus produce aminoacizi din cazeină mucegai. În ceea ce priveşte culturile starter concentrate de
care sunt necesari dezvoltării lui Str. thermophilus care, la bacterii cele mai des utilizate sunt culturile de bacterii
rândul său, favorizează dezvoltarea lui L. bulgaricus prin lactice. Pe lângă acestea se folosesc şi alte culturi de
producerea de acid formic şi CO2; bacterii concentrate: micrococi, pediococi, stafilococi,
streptomicii, bacterii propionice etc.
• calitatea laptelui ca substrat de fermentare. Acesta
nu trebuie să conţină antibiotice, substanţe conservante, Culturile concentrate de bacterii pot fi utilizate pentru:
dezinfectante şi să provină de la animale sănătoase cu
• obţinerea culturilor starter de producţie (maiele de
maximum 400000 leucocite/ml.
producţie);
• obţinerea produselor fermentate prin utilizare
directă în lapte, compoziţii carnate etc.
Controlul culturilor starter de bacterii lactice Indiferent de domeniul de utilizare, culturile starter
concentrate pot fi obţinute prin două procedee:
Controlul culturilor starter implică următoarele
determinări: • procedeul de cultivare periodică;
• examenul microscopic care trebuie să arate raportul • procedeul de cultivare continuă.
dintre coci şi bacili, raport care trebuie să se situeze în
limitele 1/1-1,5/1; Tehnologia de obţinere a culturilor starter concentrate
Tehnologia de obţinere include următoarele operaţii de
• activitatea acidifiantă care se urmăreşte prin
bază:
determinarea acidităţii titrabile atunci când cultura se află
în fază logaritmică. În acest fel se pot pune în evidenţă • inocularea mediului de cultură cu microorganismul
culturile “rapide” şi “lente” (fast and slow); din cultura stoc;
• rezistenţa la aciditate, ţinându-se seama că • incubare pentru multiplicare la nivel maxim;
Lactobacillus bulgaricus rezistă până la ~ 1,7% aciditate
iar Str. thermophilus până la 0,8%. Rezistenţa la aciditate • concentrarea mediului împreună cu celulele sau
se urmăreşte prin determinarea supravieţuitorilor după ce separarea celulelor, de regulă prin centrifugare şi
în mediul de cultură se atinge o aciditate critică; resuspendare într-un lichid adecvat,
Capitolul 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. 27
Culturi starter de microorganisme.
• conservare prin congelare şi uscare; introduce în pungi de plastic care se congelează în azot
lichid.
• depozitare în stare congelată şi uscată.
Depozitarea culturilor starter concentrate se poate face:
În tehnologia de obţinere a culturilor starter concentrate
trebuie ales un mediu de cultură care să asigure toate a) la temperaturi de –20…-40°C;
substanţele pentru dezvoltarea (multiplicarea) culturii,
b) la temperatura de -196°C (în azot lichid);
realizându-se un control riguros al temperaturii şi
menţinerii pH-ului la valori optime. - conservarea prin reducerea conţinutului de apă
se face prin liofilizare, în care caz concentratul de bacterii
Pentru eventuala neutralizare a acidităţii se utilizează
se amestecă cu un suport adecvat (lapte praf degresat,
Avantaje Dezavantaje lactoproteine pulbere lactoză, zaharoză) după care se
• Activitatea culturilor • Necesită spaţii de liofilizează. La liofilizare (faza de desicare secundară)
poate fi controlată şi depozitare la temperaturi temperatura produsului nu trebuie să depăşească 40-45°C.
supravegheată înainte de scăzute atât la producător După liofilizare se face ambalarea sub vid sau în
expediere cât şi la cumpărător pentru atmosferă de gaz inert. Depozitarea produselor liofilizate
• Se elimină operaţiile păstrare până la folosire trebuie să se facă la temperaturi scăzute (-18°C).
de întreţinere şi de preparare • Concentrarea nu Culturile starter concentrate trebuie să conţină între 2,5·1010
a maielelor intermediare este posibilă la toate – 5,5·1010 celule viabile-active/ g sau ml.
(primară, secundară, terţiară) culturile starter
• Se face economie la • Depozitarea în
forţa de muncă stare congelată sau uscată, Utilizarea culturilor starter concentrate de bacterii
• Se pot stabili uşor în funcţie de timp, poate lactice în industria laptelui
sistemele de rotaţie în conduce la micşorarea
vederea evitării infecţiei cu drastică a numărului de Culturile starter concentrate de bacterii lactice care se
bacteriofagi celule viabile folosesc în industria laptelui sunt acelea destinate:
• Se obţin produse de • Culturile pot să fie • pentru brânza Cheddar, brânzeturi tip italian şi
calitate mai constantă influenţate negativ în ceea elveţian;
• Se scurtează ce priveşte unele plasmide
procesele tehnologice ale ce codifică anumite • pentru brânza de vaci, smântână, lapte bătut, iaurt.
fabricării produselor prin funcţiuni Avantajele şi dezavantajele folosirii culturilor starter de
accelerarea acidifierii, bacterii lactice în industria laptelui sunt arătate în tabelul de
deoarece se suprimă faza de mai jos.
dezvoltare logaritmică în
laptele de fabricaţie Avantajele şi dezavantajele folosirii culturilor starter de
hidroxid de amoniu şi/sau hidroxid de calciu. bacterii acterii lactice

Conservarea prin congelare a concentratului de


microorganisme se face în două moduri: Culturi starter concentrate de bacterii propionice
- sub formă lichidă, în care caz, concentratul de pentru industria laptelui
bacterii se suspendă într-un antigel solubil în apă (alcooli Mediul de cultură pentru realizarea culturilor starter
polihidrici) care se utilizează în proporţie de 40-50% faţă concentrate de bacterii propionice poate fi laptele degresat
de concentrat. Congelarea se face la -40°C (de fapt se cu adaos de 1% tripticază, 1% extract de drojdie ca sursă de
realizează o subrăcire). vitamine şi factori suplimentari de creştere 1% lactat de
Acest gen de conservare prezintă următoarele avantaje: sodiu; 0,025% KH2PO4; 0,0005% MnSO4. Mediul de
cultură se ajustează la pH = 7,0 şi se sterilizează.
• se împiedică acţiunea dăunătoare a gheţii asupra
Incubarea mediului de cultură inoculat cu bacterii
celulelor de bacterii;
propionice din cultura stoc se face la 32°C/3 zile.
• manipularea concentratului este mai uşoară;
Dacă mediul de cultură conţinând bacterii propionice
• concentratul se poate încălzi până la temperatura de dezvoltate după incubare se utilizează ca o cultură (maia)
utilizare chiar în timpul manipulării fără ca celulele să-şi de producţie, atunci dezvoltarea bacteriilor propionice se
piardă viabilitatea şi activitatea; opreşte înainte de coagularea laptelui, deoarece în stare de
coagul, cultura starter se repartizează greu în laptele
- congelarea în azot lichid (-196°C) în care caz destinat fabricării brânzeturilor.
concentratul se amestecă cu un agent crioprotector: 10%
glicerol, 7,5% lactoză în cazul bacteriilor lactice. Celelalte operaţii de obţinere a culturii starter concentrate
de bacterii propionice sunt aceleaşi ca cele descrise la
Pentru culturile starter concentrate de pediococi s-a propus celelalte tipuri de culturi starter concentrate.
ca la concentrat să se adauge agenţi de stabilizare cum ar fi:
glicerolul, lapte praf degresat, extract de malţ, Depozitarea culturilor starter concentrate de bacterii
metalglicerofosfaţi alcalini, glutamat monosodic, acid propionice se face la 5°C în care caz celulele îşi păstrează
glutamic, cistină şi/sau dextran. Amestecul respectiv se
Capitolul 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. 28
Culturi starter de microorganisme.
viabilitatea şi activitatea 8 săptămâni. Depozitarea la 25°C • Folosirea culturilor starter în pasta cu adaos de
poate fi făcută pentru cel mult 2 săptămâni. uleiuri eterice. Aceste uleiuri eterice au acţiune
bacteriostatică, mai ales dacă solventul lor este şi alcoolul
Culturile starter concentrate se adaugă direct în laptele
etilic şi, deci, inhibă culturile starter. În acest caz se
destinat fabricării brânzeturilor (deci nu se mai folosesc
recomandă să se folosească o cantitate mult mai mare de
obţinerea de culturi intermediare).
cultură starter, pe de altă parte uleiurile eterice să fie
Utilizarea culturilor starter concentrate de bacterii în încapsulate.
industria cărnii
Culturile starter concentrate folosite în industria cărnii
Culturile starter concentrate de bacterii folosite în industria trebuie să îndeplinească următoarele condiţii:
cărnii pot fi singulare sau în amestec. Ele pot fi formate din
- să fie tolerante la NaCl (concentraţie 2,5-3%);
bacterii lactice (L. plantarum, L. sake, L. pentosus, L.
alimentarius), pediococi (P. acidilacti, P. pentosaceus), - să se dezvolte bine în saramura de concentraţie 6%;
stafilococi (S. carnosus, S. xilosus), micrococi (M.
- să se dezvolte bine în prezenţă de 80-100 mg
varians), streptomicii (Streptomyces griseus).
NaNO2/kg compoziţie dar să acţioneze şi la temperatură
În literatura de specialitate sunt menţionate următoarele mai scăzută (14-24°C);
culturi starter concentrate de bacterii singulare sau în
amestec: - să producă numai acid lactic (culturile starter
concentrate de bacterii lactice să cuprindă numai specii
• S. carnosus homofermentative);
• S. carnosus + P. pentosaceus;
- să fie puţin lipolitice şi proteolitice;
• S. xylosus + P. pentosaceus;
• M. varians; - să nu producă mirosuri şi gusturi nedorite din cauza
• M. varians + P. pentosaceus + P. acidilacti; produşilor secundari de metabolism;
• M. varians + P. pentosaceus; - să fie nepatogene (să nu producă infecţii şi să nu
• S. carnosus + Streptomyces griseus. producă toxine);
Culturile starter de micrococi sau stafilococi sunt
recomandate la maturarea lentă a salamurilor crude unde se - să se adapteze compoziţiei de carne utilizată şi
realizează o scădere lentă a pH-ului şi deci consistenţa condiţiilor de fermentare a produselor, respectiv la
produsului se realizează în timp. Gustul acestor produse creşterea concentraţiei de NaCl, la temperatura de afumare
este puţin acrişor (pH 5,6-6,1). rece şi de uscare, de activitate a apei care scade progresiv
pe măsura uscării produsului;
Culturile starter mixte (micrococi/stafilococi/lactobacili) se
utilizează la maturarea rapidă a salamurilor crude în care - să producă catalază şi nitratreductază (cele cu
caz realizarea consistenţei merge paralel cu acidifierea. micrococi, streptomicii, stafilococi);

Culturile starter concentrate de utilizare în industria cărnii - să fie inactivate la 57-60°C.


pot fi livrate în stare lichidă subrăcită sau uscată. Adaosul Folosirea culturilor starter concentrate de bacterii (în
în compoziţie trebuie să asigure o concentraţie de cel puţin special lactice şi pediococi) prezintă următoarele avantaje:
106-107/g pastă. Modul de folosire al culturilor starter
concentrate este în funcţie de modul lor de conservare. - se micşorează durata de maturare a produselor
Cele congelate în antigel se utilizează ca atare; cele carnate;
liofilizate se suspend în apă pentru o distribuţie mai - se îmbunătăţesc proprietăţile senzoriale (gust,
uniformă în compoziţie. miros, consistenţă);
Culturile starter concentrate de bacterii lactice pentru - se asigură un grad înalt de inocuitate produsului
industria cărnii nu se amestecă cu sare, condimente, acid carnat (salamurile şi cârnaţi cruzi) prin controlul dezvoltării
ascorbic, acizi alimentari şi nici nu se păstrează în amestec microorganismelor patogene şi de alterare şi prin limitarea
cu substanţele menţionate deoarece se inactivează rapid. folosirii unor substanţe cu caracter toxic (amine şi
De asemenea trebuie să se aibă în vedere două situaţii nitrozamine).
particulare:
• Folosirea culturilor starter concentrate în pasta cu
adaos de GDL (glucono delta lactona). În condiţiile
folosirii GDL pH-ul pastei scade rapid, proteinele sunt Lactobacilii din culturile starter concentrate produc în
aduse la pH izolelectric şi pierd apa de hidratare, azotitul compoziţia salamurilor crude următoarele efecte:
de reduce bine la NO, se favorizează dezvoltarea bacteriilor • acidifierea pastei cu următoarele consecinţe:
lactice care produc şi H2O2. Acidifierea rapidă împiedică
însă dezvoltarea micrococilor care sunt necesari dacă se - scăderea pH-ului şi deci aducerea proteinelor la
lucrează cu NaNO3. La folosirea GDL este deci recomandat punctul izoelectric deci şi la starea de hidratare minimă,
să se folosească culturi starter concentrate de stafilococi favorizându-se în acest fel uscarea;
care produc catalază, reduc azotatul la azotit şi se pot - reducerea mai rapidă şi mai completă a NaNO2;
dezvolta la pH 4,7 fiind şi un bun producător de aromă;
Capitolul 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. 29
Culturi starter de microorganisme.
- inhibarea microorganismelor patogene:
Staphilococcus aureus, Salmonella, Cl. botulinum;
• producerea de substanţe de aromă;
• controlul producţiei de amine biogene prin
inhibarea bacteriilor cu activitate decarboxilazică (inhibare
prin competiţie faţă de nutrienţi şi, respectiv, prin
acidifiere);
• controlul producţiei de nitrozamine (aciditate
formată, respectiv pH-ul scăzut favorizează transformarea
NaNO2 în NO şi deci rămâne în produs o cantitate mai
mică de NaNO2 care ar putea intra în combinaţie cu
aminele secundare pentru a forma nitrozaminele;
• controlul microflorei de alterare şi patogene prin
producţia de H2O2, bacteriocine.
Pediococii din culturile starter concentrate produc în
compoziţia salamurilor crude următoarele efecte:
• acidifierea mai redusă a pastei la temperaturi mai
ridicate fără formarea de produşi care să afecteze negativ
gustul şi mirosul;
• producerea de H2O2, bacteriocine cu acţiune
inhibitoare faţă de microorganismele patogene.
Culturi starter concentrate de spori de mucegai
Tehnologia de obţinere include următoarele operaţii:
• prepararea mediului de cultură, sterilizarea acestuia
şi repartizarea în eprubete (agar înclinat);
• însămânţarea mediului în eprubete cu spori de
mucegai ce se doreşte a se cultiva;
• termostatare pentru germinare spori cu organe
purtătoare de spori şi sporulare;
• preluare spori cu 2 ml ser fiziologic 0,8% şi
însămânţare medii de cultură Czapek cu 2% agar aflate în
vase Roux;
• recoltare spori din vase Roux cu ser fiziologic
0,8% astfel ca să se asigure în suspensie 108-1010 spori/ml;
• păstrare suspensie la 0-4°C.
Cultura cu spori de mucegai concentrată poate fi livrată şi
sub formă de emulsie liofilizată, emulgatorul fiind
polietilsorbitanul .
Se pot realiza culturi starter concentrate de spori cu
mucegaiurile utilizate în industria laptelui şi cărnii,
utilizarea lor fiind în funcţie de produsul alimentar în care
se foloseşte cultura respectivă de spori de mucegai.
Pentru industria cărnii, la utilizare suspensia de spori de
mucegai concentrată se diluează cu apă fiartă şi răcită în
raport de 1/3.