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BIOQUIMICA CLINICA I
CÁTEDRA- TALLER
CONTROL DE ERRORES
EN ESPECTROFOTOMETRÍA
Concentración
LEYES DE LA
ESPECTROFOTOMERIA
Io ε
c It Lambert-Bourguer-Bunsen-Roscoe-Beer
( Lambert-Beer)
b
Entonces:
Abs = -log (10-εbc)
Abs = ε*b*c
Errores en Espectrofotometría
B C
D E
Longitud de onda
INTERFERENCIAS ESPECTRALES
60
Absorbanci
40
20
Oxihemoglobina
a
0
400
500 600 700
Longitud de onda (nm)
Espectro parcial de la oxihemoglobina
(HbO2)
Curva estándar para medir proteínas totales
por reacción de Biuret: A540 v/s concentración.
Líneas continua, A540 para un estandar de proteínas de
50 g/L; línea punteada, A540 para el mismo estándar que
además contiene hemoglobina.
1.2
Absorbancia (540
1.0
0.8
Hemoglobina
0.6 estándar 50 g/L
0.4
nm)
0.2
0 25 50 75 100
Proteínas totales (g/L)
CORRECIÓN DE LA
INTERFERNCIA ESPECTRAL
Blancos de
muestras
Mediciones
cinética
PROPIEDADES FOTOMÉTRICAS
LINEALIDAD FOTOMÉTRICA
PRECISIÓN FOTOMÉTRICA
METODOS PRIMARIOS
METODOS SECUNDARIOS
Dicromato de Potasio:
Calidad máxima normalizado del National Bureau of
Standar, secado overnight a 110ªC y enfriado a
temperatura ambiente en un desecador. Otras soluciones
usadas son :
SOLUCIÓN DE SULFATO DE COBRE:
SOLUCIÓN DE SULFATO DE AMONIO Y COBALTO
SOLUCIÓN DE CROMATO DE POTASIO
EXACTITUD FOTOMÉTRICA
340 nm 0,316
375 nm 0,991
400 nm 0,396
450 nm 0,033
LINEALIDAD FOTOMÉTRICA
SOLUCIONES DE DISTINTA
CONCENTRACIÓN CUYAS ABSORBANCIAS
ABARQUEN EL RANGO DE TRABAJO A CADA
LONGITUD DE ONDA
LECTURA DE ABSORBANCIA O % DE T
ABSORBANCIA
LÍMITE DE ACEPTABILIDAD: CV< 1 %
SERIE DISTRIBUCIÓN NORMAL
88,2
95,5
99,7
Curva de Gauss
ANÁLISIS DE LOS
n
DATOS
x= x i
n
S2 = ( xi - x)2 Varianza
n-1
CV = DE - 100 Coeficiente de
Variación
x
Distribuciones de
Frecuencia
Frecuencia
Valores
Distribución de frecuencia de los resultados de una muestra
por dos métodos diferentes, 1 y 2. Ambos métodos son de
igual precisión ( ) pero con promedios diferente una de
otra (x1 = x2).
1 2
Frecuencia
x1 = x2
x1 x2
ESTABILIDAD FOTOMÉTRICA
Absorbancia
Absorbancia
Tiempo
Tiempo bajo deriva y alto ruido
bajo ruido y baja deriva
Absorbancia
Absorbancia
Tiempo
Tiempo alta deriva y alto ruido
alta deriva y bajo ruido
Error constante y proporcional
(Westgard J, de Vos D, Hunt M, et al: Am J Med Technol 1978;44:290)
30
Error constante
Sin error
20 Error proporcional
10
10 20 30
Medido por métodos comparativos
A continuación se presenta una serie de datos al medir diferentes
concentraciones de una sustancia determinada por un método de referencia
( IDEAL, teóricamente sin errores) en el eje X y por otra metodología en el
eje Y.
De acuerdo a los siguientes datos y observando el gráfico Ud. debe encontrar
para cada uno de ellos la ecuación de la recta que los identifica, e interpretar su
resultado.