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CAPÍTULO 3
Cultura e isolamento de bactérias
3.1 - Introdução

3.1.1 - Generalidades
A maior parte das técnicas bacteriológicas (conservação, isolamento, identificação, ou
contagem de bactérias), exigem a utilização de meios de cultura, sendo a composição
dos meios de cultura função dos conhecimentos sobre os princípios de nutrição
microbiana. Os meios de cultura devem conter, de uma forma utilizável, os nutrientes
necessários ao crescimento das bactérias, nomeadamente, macronutrientes (C, H, N, O,
P, S, K, Mg, Na, etc.), micronutrientes (Fe, Cu, Zn, etc.), e factores de crescimento (por
ex. vitaminas e aminoácidos). Para que se observe crescimento bacteriano há ainda que
incubar os meios em condições adequadas de pH, tensão de oxigénio e temperatura.

Somente em casos excepcionais, se pode identificar uma bactéria pelas suas

características morfológicas. É portanto essencial obtê-la em cultura em meio artificial
e, na hipótese de estarem presentes diversas espécies, separá-las ou isolá-las em cultura
pura, para se poderem efectuar testes de identificação de natureza bioquímica.
Para cultivar uma espécie bacteriana deve adicionar-se a um meio de cultura estéril
adequado uma pequena amostra contendo células vivas da espécie. A essa amostra
chama-se inóculo, e à adição desse inóculo ao meio, chama-se inoculação. O meio
inoculado é então incubado em condições convenientes de temperatura, humidade, etc.,
durante um certo tempo. Durante a incubação, as bactérias multiplicam-se e formam
uma cultura, o que se define como uma população de bactérias (organismos) que se
desenvolve num meio ou à sua superfície.

3.1.2 - Classificação dos meios de cultura

Os meios de cultura podem ser classificados em função da sua consistência, composição
e tipo de utilização.

a) Consistência
Existem meios de cultura em três estados físicos:
• líquido

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• semi-sólido
• sólido

Os meios líquidos, como os caldos nutritivos de crescimento, podem ser utilizados para
a multiplicação de microrganismos em estudos de fermentação e em vários testes
bioquímicos. Apresentam no entanto, dois inconvenientes: 1) as culturas desenvolvidas
não revelam em geral quaisquer características especiais e portanto o seu valor é
limitado na identificação de bactérias; 2) é impossível a separação de espécies
bacterianas que se encontrem em misturas.

Ao contrário dos meios líquidos, os meios sólidos e semi-sólidos contêm um agente

solidificante, normalmente o agar. O agar é um polissacárido complexo extraído de
uma alga marinha (agar-agar) e tem várias propriedades que o tornam um agente
solidificante ideal, incluindo ficar transparente no ponto de ebulição da água, não ser
um nutriente para a maior parte dos microrganismos e não ser metabolizado durante o
crescimento microbiano.
Os meios semi-sólidos (aos quais são adicionados geralmente 5 g/l de agar) podem ser
utilizados em estudos de fermentação, estudos de mobilidade bacteriana (ex.: meio
manitol-mobilidade) e na promoção do crescimento de bactérias anaeróbias.
Os meios sólidos (aos quais são adicionados geralmente 15 g/l de agar) permitem
observar as colónias das diferentes bactérias que se desenvolvem à superfície (e por
vezes no interior) do meio e que mostram muitas vezes aspecto e cor diferentes,
auxiliando a sua posterior identificação. São praticamente indispensáveis à obtenção de
culturas puras. São ainda utilizados para a conservação de culturas, e permitem observar
determinadas reacções bioquímicas específicas (ver meios diferenciais).

Uma colónia é um número elevado de células bacterianas em meio de cultura sólido que
é visível a olho nú como uma entidade discreta. Assume-se que uma colónia provém de
uma única célula e portanto representa um clone de uma cultura pura.

b) Composição
Os microrganismos podem ser cultivados utilizando dois tipos diferentes de meios. Os
meios sintéticos, ou quimicamente definidos que são compostos por produtos químicos
bem definidos e dissolvidos em água destilada em proporções determinadas, de modo a

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constituir uma solução de nutrientes devidamente tamponada (ex. meio de citrato de

Simmons), e os meios complexos, compostos por uma variedade de substâncias
nutricionalmente indefinidas, de origem animal, vegetal ou microbiana como por
exemplo, extracto de carne, peptonas, e extracto de levedura, que são naturalmente ricos
em nutrientes e vitaminas. Como exemplos destes meios têm-se as geloses de
McConkey, Drigalsky ou Endo.

c) Tipo de utilização

• Meios de isolamento
Os meios de isolamento permitem a obtenção de culturas puras e podem ser de vários
tipos:
Meios basais - Permitem o crescimento de bactérias pouco exigentes. Não existe um
meio de cultura universal (ex. caldo nutritivo, água peptonada, triptona sal, gelose
nutritiva).
Meios selectivos - Permitem o crescimento só de um tipo de bactérias em detrimento
das outras cujo crescimento é inibido. Torna-se útil, no caso de uma população
plurimicrobiana, porque permite favorecer a cultura preferencial de certas bactérias.
Meios diferenciais - São utilizados quando se pretende diferenciar entre vários
microrganismos presentes no meio de cultura. Por exemplo, no caso da gelose sangue,
dado que algumas bactérias produzem enzimas (hemolisinas) que vão lisar os glóbulos
vermelhos enquanto outras não; dependendo do padrão de hemólise pode-se distinguir
entre bactérias hemolíticas (Streptococcus pyogenes) e não hemolíticas.
Meios selectivos e diferenciais - Alguns meios de cultura são simultaneamente
selectivos e diferenciais. São sobretudo utilizados em microbiologia clínica e na área da
saúde pública, como por exemplo na determinação da qualidade da água ou num surto
de intoxicações alimentares. Temos como exemplos deste tipo de meio:

a. Gelose de McConkey - É um meio selectivo, uma vez que contém sais biliares e
cristal violeta que inibem o crescimento das bactérias Gram positivas, permitindo o
crescimento, apenas das bactérias Gram negativas. É diferencial porque a lactose está
presente neste meio e permite diferenciar entre as bactérias Gram negativas que utilizam
a lactose como substrato fermentativo e as que não utilizam. As bactérias Gram
negativas fermentadoras de lactose, tornam o meio ácido e o indicador de pH do meio

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de cultura (vermelho de metilo) em meio ácido fica vermelho. As bactérias Gram

negativas que não fermentam a lactose, não acidificam o meio, e este permanece da cor
original.
b. Gelose de Drigalsky - É um meio muito semelhante ao anterior e contém,
igualmente, lactose, indicador de pH (azul de bromotimol), cristal violeta (inibidor das
bactérias Gram positivas). Permite distinguir também entre bactérias Lac +
(fermentadoras de lactose) e Lac - (não fermentadoras de lactose). As primeiras
originam colónias de cor amarela (o pH do meio baixa devido à acumulação de produtos
de fermentação e o indicador “vira” para amarelo); as segundas originam colónias azuis
(a cor original do meio).
c. Meio de Chapman - É um meio selectivo para os estafilococos devido à elevada
concentração de cloreto de sódio (7.5 %) que somente aquelas bactérias suportam. Por
conter manitol (um poliálcool derivado de um açúcar - a manose) é também, diferencial
(por ex.) para Staphylococcus aureus, uma vez que as espécies potencialmente
patogénicas do género Staphylococcus são fermentadoras de manitol. A acumulação dos
produtos de fermentação acidifica o meio, e o indicador de pH (vermelho de fenol)
“vira” de vermelho (cor original do meio) para amarelo, originando colónias amarelas
rodeadas de um halo também amarelo. As espécies de estafilococos não fermentadoras
de manitol apresentam neste meio, colónias incolores (ex. S. epidermidis).

Meios enriquecidos - Os ambientes naturais são geralmente habitados por populações

de vários tipos de bactérias. Quando uma espécie com especial interesse e
nutricionalmemte exigente, se encontra presente num determinado produto mas em
número muito baixo, é fundamental a utilização de um meio muito rico
nutricionalmente e em que nenhum agente inibidor se encontre presente. Estes meios
enriquecidos são meios basais adicionados de produtos biológicos ricos em nutrientes
como o soro, ovo ou sangue. Exemplos: gelose sangue, gelose chocolate, “brain heart
infusion” (BHI).

Gelose Chocolate - É um meio enriquecido com sangue previamente sujeito a

aquecimento a 80ºC durante 20 minutos o que promove a lise dos glóbulos vermelhos e
lhe confere a cor castanha, responsável pelo nome atribuído. A lise dos glóbulos
vermelhos liberta para o meio extracelular, proteínas, cujos cofactores são importantes
factores de crescimento para bactérias muito exigentes (ex. o grupo heme é fundamental

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para o crescimento de Haemophilus influenzae, agente importante de meningites

bacterianas em crianças).

• Meios de enriquecimento
São meios líquidos, que favorecem o crescimento de determinadas espécies aumentando
a sua quantidade relativamente a outras, podendo conduzir depois a culturas puras por
sobreposição de espécies (ex. meio de enriquecimento para organismos fotoautotróficos
- meio sem fonte de carbono adicionada; ex. caldo de selenito de sódio para
enriquecimento de fezes em Salmonella e Shigella, agentes causadores de intoxicações
alimentares).

• Meios de transporte
Servem para o transporte de um determinado material biológico a partir do qual se
propõe isolar um ou mais organismos. É então importante manter a viabilidade dos
microrganismos nele existentes sem que haja multiplicação dos mesmos (durante um
período de 48 a 72 horas) e também a sua quantidade relativa no produto biológico para
que depois a inoculação dos meios origine resultados que reflictam a proporção relativa
dos microrganismos nesse produto biológico (ex. meio de Stuart).

• Meios de identificação
São meios que permitem pôr em evidência as características bioquímicas das bactérias
e, por conseguinte, resolver os problemas de identificação postos entre espécies (ex.
meio Clark-Lubs - permite distinguir entre bactérias que fazem a fermentação
butanodiólica da glucose e bactérias que fazem a fermentação ácida mista da glucose).

• Meios de conservação
São meios que permitem a manutenção das bactérias num estado de vida latente durante
meses, anos ou décadas.

3.1.3 - Reconstituição de meios de cultura (esquema geral)

a) Pesagem do meio liofilizado ou, no caso dos meios sintéticos, dos vários compostos
químicos.
b) Adição de água destilada.

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c) Dissolução completa dos componentes em banho-maria agitando periodicamente.

d) Esterilização (geralmente em autoclave).
e) Adição da fonte de carbono esterilizada por filtração, no caso dos meios sintéticos,
uma vez que soluções concentradas de glúcidos não devem ser submetidas a
temperaturas elevadas porque caramelizam.
f) Distribuição em tubos ou caixas de Petri após arrefecimento a 40 - 45º C.

3.1.4 - Técnicas de inoculação ou sementeira de meios de cultura sólidos

a) Inundação
É utilizada uma suspensão (que pode previamente ser submetida a várias diluições),
com que se inunda a superfície do meio sólido a usar. O excesso de inóculo é removido
por sucção a vácuo após agitação e a superfície do meio é deixada secar ao ar em
atmosfera asséptica.

b) Espalhamento
É utilizada para contagem de colónias e o inóculo (suspensão) é, neste caso, aplicado à
superfície de meio sólido com um espalhador em L ou, simplesmente, com uma pipeta
de Pasteur dobrada a quente, ou ainda por intermédio de uma zaragatoa.

c) Estrias
A inoculação por estrias é realizada com a finalidade de obter colónias isoladas, e
realiza-se à superfície de meio sólido, com uma ansa de Henle, a partir de uma
suspensão ou de uma colónia isolada (Fig. 3.1).

Figura 3. 1. Esquema
da inoculação de meios
de cultura sólidos pela
técnica das estrias.

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d) Incorporação
A inoculação por incorporação é utilizada para contagem de colónias à superfície e no
interior de meio sólido e realiza-se por incorporação do inóculo (suspensão) no meio,
enquanto quente (não mais do que 40ºC para não destruir o inóculo) e portanto ainda
liquefeito.

e) Picada central
Este tipo de inoculação é utilizado por exemplo, no estudo da mobilidade bacteriana e
realiza-se por picada central com a ansa de Henle, ou pipeta de Pasteur fechada, num
meio gelosado em tubo.

3.1.5 - Incubação dos meios de cultura inoculados

Após a inoculação e a devida identificação dos tubos ou caixas de Petri, os meios de
cultura devem ser incubados, isto é, colocados em estufas próprias para o efeito, em
condições adequadas de temperatura, humidade e tempo (geralmente em microbiologia
clínica, 37ºC/24h, uma vez que quase todos os agentes patogénicos são organismos
mesófilos).

3.1.6 - Leitura dos resultados

A observação dos resultados deve ser feita tendo em conta alguns aspectos como a
densidade da cultura, presença de pigmentos solúveis, a presença de odor característico
e o aspecto da cultura, e nomeadamente em meio sólido, a existência de colónias
isoladas e suas características particulares (ver 3.1.7).

3.1.7 - Aspecto das colónias crescidas em meio sólido (Fig. 3.2)

a) Tamanho
• colónias pequenas - diâmetro (d) < 1 mm
• colónias médias - 1.5 < d < 3 mm
• colónias grandes - d > 3 mm

b) Forma geral

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• desenho dos contornos:

bordos lisos regulares
bordos irregulares
bordos dentados
bordos com prolongamento

• forma de relevo:
lisas
convexas
semi-convexas
acuminadas
mamelonadas
umbilicadas

c) Transparência:
• transparentes
• translúcidas
• opacas
• lactescentes

d) Aspecto da superfície:
• colónias lisas
bordos regulares
superfície lisa e brilhante por vezes
consistência cremosa
suspensão homogénea
muitas vezes semi-convexas
• colónias rugosas
bordos muitas vezes dentados
superfície rugosa, baça
consistência pulvurulenta
suspensão heterogénea
sobretudo lisas

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• colónias mucosas
bordos lisos e regulares
convexas
superfície lisa e brilhante
suspensão heterogénea

e) Pigmentação:
A elaboração de um pigmento por certas bactérias pode ser um elemento precioso de
identificação. Exemplos:
Serratia marcescens - colónias vermelhas
Pseudomonas aeruginosa - colónias verdes azuladas (pigmentos - pioverdina e
piocianina)

Forma
Forma
Ponto
Ponto Circular
Circular Filamentosa
Filamentosa Irregular
Irregular Rizoidal
Rizoidal Fuso
Fuso

Elevação
Elevação
Achatada
Achatada Elevada
Elevada Convexa
Convexa Pulverulenta
Pulverulenta Umbilical
Umbilical

Margem
Margem
Inteira
Inteira Ondulada
Ondulada Lobulada
Lobulada Erusionada
Erusionada Filamentosa
Filamentosa Encaracolada
Encaracolada

Figura 3. 2. Representação esquemática da forma, elevação e margem das colónias

bacterianas obtidas em meio sólido.

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3.2 - Protocolos experimentais

Utilizando bactérias em meio líquido:

1) No meio de tripticase-soja-agar (TSA), inocular por espalhamento E. coli, utilizando
uma pipeta Pasteur como espalhador.

2) No meio de Drigalsky, dividir a placa em duas partes e inocular Proteus spp. e E. coli
por estrias, usando a ansa de Henle.

3) No meio de Chapman, dividir a placa em duas partes e inocular Staphylococcus spp.

e E. coli por estrias, usando a ansa de Henle.

4) Na gelose chocolate, dividir a placa em três partes e inocular por estrias, utilizando
uma zaragatoa as seguintes bactérias: E. coli, Proteus spp. e Staphylococcus spp.

5) Nos tubos de manitol-mobilidade, com a ansa de Henle, inocular Staphylococcus spp.

e Proteus spp por picada central.

Utilizando bactérias isoladas em meio sólido:

1) Com a ansa de Henle retirar 3 ou 4 colónias:

• de uma das bactérias inoculadas no meio de Drigalsky e suspender em soro
fisiológico (SF) ou meio BHI
• de uma das bactérias inoculadas no meio de Chapman e suspender em SF ou BHI

2) Com a ansa, tirar 4 ou 5 gotas das suspensões anteriores para lâminas, fazer
esfregaços, e realizar para cada uma a coloração de Gram.

3.3 – Resultados e discussão

3.3.1 - Classifique quanto à mobilidade as bactérias que inoculou no meio manitol-

mobilidade.

3.3.2 - Identifique as bactérias fermentadoras e não fermentadoras de lactose.

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3.3.3 - Identifique as bactérias fermentadoras e não fermentadoras de manitol.

3.3.4 - Identifique a morfologia e o modo de agrupamento das bactérias estudadas.

3.3.5 - Classifique as bactérias estudadas como Gram (+) ou Gram (-).

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