Memorias V Congreso de la Sociedad Cubana de Bioingeniería, Habana 2003, Junio 10 al 13 de 2003
VALIDACIÓ N DE CICLOS DE ESTERILIZACIÓ N
EN AUTOCLAVES
J. A. Padró n, M. E. Reyes, C. E. Gandolff
Grupo Nacional de Validació n - Instituto Finlay
Ave. 25 # 222A14 e/ 222A y 230, La Coronela, La Lisa, AP 13600. Jorgepp@finlay.edu.cu
RESUMEN
Se estudió el proceso de esterilizació n realizado en una
autoclave de una instalació n farmacéutica. Como parte
del estudio se llevó a cabo una revisió n acerca de la
esterilidad, sus aspectos teó ricos y de los procesos de
esterilizació n en equipos empleados a escala de
producció n. Se describen conceptos fundamentales,
particularmente el concepto de Fo y su empleo, en la
evaluació n de la efectividad de un proceso de
esterilizació n. El diseño de un protocolo de validació n y
la posterior ejecució n de éste, permitió aplicar un método
científico en las diversas fases del estudio. Las corridas
experimentales se realizaron por triplicado, registrándose
automáticamente las temperaturas de 16 canales de
medició n; durante estas etapas se calculó , en tiempo real,
el tiempo equivalente (Fo), en cada uno de los canales y
simultáneamente se realizó un desafío con un indicador
bioló gico. Los resultados experimentales demostraron la
efectividad de los procesos estudiados, con los patrones
de carga definidos, así como la configuració n de los
ciclos del esterilizador. Las conclusiones de este estudio,
son aplicables también en los entornos hospitalarios.
Palabras clave: tiempo equivalente, esterilizació n,
validació n, biondicadores, , perfil de temperatura.
1. INTRODUCCIÓ N
El objetivo de una instalació n productora de formas
farmacéuticas estériles es fabricar un producto libre de
microorganismos capaces de reproducirse en el propio
producto o después de su administració n a un paciente.
Para lograr este objetivo la fabricació n de soluciones
parenterales es típicamente acompañada de una
esterilizació n terminal o mediante procesamiento
aséptico, sin embargo ambos procesos tienen sus
limitaciones.
Los procesos de esterilizació n terminal no son
aplicables a los productos termosensibles por la
degradació n que sufren debido a la acció n del calor. Por
otro lado, el procesamiento aséptico ha estado
histó ricamente asociado con fallos en la esterilidad y el
retiro de productos del mercado [2].
Independientemente del método utilizado para lograr
la esterilidad de un producto, es indiscutible la
importancia que tiene el equipamiento empleado en este
proceso, ocupando un lugar fundamental las autoclaves ó
esterilizadores. Es debido a esto que la calificació n de los
equipos involucrados y la validació n de los procesos
ejecutados en ellos, sean de sumo interés para garantizar
la calidad y seguridad de los productos farmacéuticos.
959-212-095-1 © 2003, Sociedad Cubana de Bioingeniería, artículo T_0111
Además, las regulaciones nacionales e internacionales
establecen que todos los procesos críticos deben ser
validados, haciendo marcado énfasis en los procesos de
esterilizació n.
Los esterilizadores modernos son diseñados y
fabricados bajo estrictas normas y cuentan además de los
dispositivos de seguridad y de otras características que
aseguran la fiabilidad de los procesos, con un sistema de
control completamente automatizado que se ocupa no
só lo de la ejecució n de todas y cada una de las etapas de
un ciclo de esterilizació n, sino también de la verificació n
de las condiciones de operació n para evitar daños en el
equipo, en el proceso e incluso en el operador [1].
Una particularidad importante es que estos sistemas de
control permiten el registro, en papel o en formato
electró nico, de todos los parámetros de los ciclos
ejecutados, lo cual además de ser un requisito exigido por
las regulaciones y las Buenas Prácticas de Producció n,
permite la detecció n de posibles condiciones de fallo, aú n
antes de que ocurran.
Otro aspecto importante en el control de los ciclos de
esterilizació n, mediante vapor saturado, es que además
del tradicional control mediante la combinació n tiempo-
temperatura es posible controlar por un parámetro
denominado “ tiempo equivalente” . Esta variante es de
suma importancia en los procesos de esterilizació n donde
la carga sea termolábil, pues evita una exposició n
prolongada al calor. Este enfoque es usualmente es
empleado en el caso de líquidos.
La esterilizació n por vapor saturado es el mecanismo
mejor comprendido para la destrucció n de la vida
microbiana. Es el método preferido en equipos que
puedan operar en el rango de 120 a 135 °C. Aunque
existen aú n diferencias entre los especialistas, en cuanto
al mecanismo de muerte a escala molecular, hay un
acuerdo universal acerca de los tres parámetros críticos
que afectan la esterilizació n: tiempo, temperatura y
humedad [5].
Cuando una població n grande de células bacterianas,
esporas o virus, son expuestos al vapor saturado a una
temperatura fija el nú mero de sobrevivientes puede ser
determinado como una funció n del tiempo de exposició n.
La temperatura afecta dramáticamente la tasa de
muerte. Al aumentar la temperatura la resistencia de los
microorganismos disminuye sensiblemente, por lo que en
la misma unidad de tiempo se observa una acentuada
disminució n de su població n.
El efecto de la humedad en la esterilizació n por calor
es evidenciada por las grandes diferencias observadas en
las temperaturas requeridas por la esterilizació n mediante
1/4
calor seco y la esterilizació n mediante calor hú medo.
Mientras que un proceso de calor seco ocurre
generalmente entre 160 y 180 °C, un proceso de calor
hú medo ocurre a temperaturas mucho menores que varían
desde 115 °C hasta 135 °C [1], [5].
Este fenó meno ha sido atribuido a que la presencia de
agua disminuye la temperatura requerida para
desnaturalizar las proteínas, sin embargo en el caso del
calor seco se requiere inicialmente un proceso de
deshidratació n antes de que la temperatura alcance un
valor suficiente para producir la desnaturalizació n o
coagulació n de las proteínas, consecuentemente este es un
proceso de oxidació n, con una cinética diferente al
proceso de calor hú medo [1], [3], [5].
En el enfoque cinético de la muerte microbiana se
asume frecuentemente que esta sigue un modelo similar a
una reacció n química de primer orden. Se ha encontrado
experimentalmente que la tasa de muerte, la cual es
medida, en términos prácticos, como una tasa de
supervivencia, tiene un comportamiento exponencial, en
el cual la constante de velocidad de reacció n k del paso
más lento, es la que controla el proceso [1], [5], tal como
se muestra en la expresió n (1):
N = N o e − kt (1)
donde:
N: població n microbiana en cualquier instante
No: població n microbiana inicial
k: constante de velocidad de reacció n
t: tiempo
e: base de los logaritmos neperianos
Debe destacarse que cada reacció n de inactivació n
enzimática o de degradació n de ADN tiene su propio
valor de k.
La caracterizació n y estudio de un proceso de
esterilizació n térmico requiere de la medició n de los
perfiles de temperatura y además de un reto con un
microorganismo, empleado como bioindicador, cuyos
parámetros de resistencia al calor sean conocidos y
cuantificables; estos parámetros se denominan D y Z.
El valor D, conocido también como tiempo de
reducció n decimal, es una magnitud cuantitativa del
índice de muerte de los microorganismos. Se define como
el tiempo requerido en minutos, a una temperatura
específica, para lograr una reducció n de un orden de
magnitud, esto equivale a una reducció n del 90 % de la
població n microbiana inicial [4], [6], [7]. El valor D nos
permite una comparació n directa de la resistencia al calor
de varios microorganismos.
Un cambio en la temperatura afecta de forma
significa la tasa de muerte de las bacterias. Al aumentar la
temperatura, el log D disminuye de forma lineal y esta
dependencia se define a través de Z y se expresa en °C. El
valor Z se define como el cambio de temperatura
requerido para reducir el valor D en un orden de
magnitud, lo cual es igual a una reducció n del 90 % del
propio valor D [4], [6], [7].
El microorganismo usualmente empleado como
desafío, es el B. stearothermophilus, ampliamente
conocido por su resistencia al calor. Los valores más
comunes de D varían entre 1,0 y 3,0 minutos a 121 °C,
mientras que el valor Z oscila entre 8 y 13 °C [1], [6],
aunque recientemente el autor ha empleado en estudios de
validació n indicadores bioló gicos con un valor Z = 30 °C.
Una vez conocidos estos parámetros es posible
desarrollar un modelo matemático que permita calcular la
capacidad de un proceso de esterilizació n, para eliminar
los microorganismos, en términos de letalidad, segú n la
expresió n (2):
( T −Tb )
(2)
L = 10 Z
donde:
L: letalidad
T: temperatura instantánea
Tb: temperatura base
Z: valor Z
La letalidad puede ser determinada en un instante
dado, pero si se calcula la sumatoria de todas las
letalidades acumuladas, es decir se integra como una
funció n de la temperatura en el tiempo ( L = f (T,t) ),
entonces es posible calcular el tiempo equivalente F. La
expresió n (3) sería:
t2
∫
F = L dt (3)
t1
Una solució n gráfica de esta ecuació n sería calcular el
área bajo la curva en un gráfico de Temperatura vs.
tiempo, segú n se muestra en la Fig. 1.
Temperatura vs tiempo
Temperatura (°C)
tiempo (min)
Fig.1. El área bajo la curva en un gráfico de Temperatura vs. tiempo,
equivale al tiempo equivalente ó valor F. No obstante la solució n
numérica es la más empleada.
El valor F es definido como el “ tiempo equivalente”
durante el cual un producto ha sido sometido a una
temperatura de esterilizació n determinada [4], [6], [7]. En
el cálculo de F se toman en consideració n distintos
factores: la temperatura instantánea en cualquier
momento, la temperatura base, el valor Z y el intervalo de
2/4
tiempo. El concepto de tiempo equivalente
necesariamente implica que este tiempo es diferente al
tiempo real [4], [6], [7].
La solució n de la ecuació n 3 se expresa en la forma
siguiente:
( T −Tb )
(4)
F = ∆t ⋅ Σ 10 Z ampollas conteniendo esporas del microorganismo de
donde:
F: tiempo equivalente (min)
T: temperatura instantánea (°C)
Tb: temperatura base (°C)
Z: valor Z (10 °C)
∆t: intervalo de tiempo (min)
En el caso particular de la esterilizació n por vapor
saturado, la temperatura base (Tb) es igual a 121 °C y el
valor Z es igual a 10 °C, en ese caso el término F se
denomina Fo.
2. METODOLOGÍ A
Para ejecutar el estudio se diseñó un protocolo de
validació n en el cual se describen las pruebas necesarias,
así como la metodología a seguir en su ejecució n. La
fases de mayor interés que abarcan este trabajo, fueron las
etapas de Calificació n de la Operació n y de Calificació n
del Desempeño.
El registro de los perfiles de temperatura fue realizado
con un sistema de medició n de temperatura industrial,
formado por una microcomputadora PC IBM compatible,
un sistema multicanal Kaye, modelo Portable Validator y
la aplicació n Validator v1.05; los elementos de medició n
utilizados fueron termopares tipo T. La calibració n
inicial, previa a las corridas, se realizó en tres
temperaturas: 100, 121 y 140 °C, empleando para ello un
calibrador de temperatura Kaye HTR-400 y como patró n
de temperatura una sonda IRTD-400, del mismo
fabricante.
A continuació n se mencionan las pruebas de mayor
relevancia:
} Prueba de hermeticidad
} Distribució n de temperatura con cámara vacía
} Penetració n de calor sin reto
Por ú ltimo, los estudios de penetració n de calor
persiguen demostrar la eficiencia con que el vapor
saturado es capaz de penetrar en los materiales y objetos
que se pretenden esterilizar. La medició n de temperatura
solo nos daría un criterio físico, sin embargo el desafío
microbioló gico nos daría un criterio bioló gico de la
efectividad del proceso. En este estudio los termopares se
colocan en el interior de la carga, conjuntamente con
reto.
El estudio requirió la ejecució n de varias corridas
experimentales en el siguiente orden cronoló gico: prueba
de hermeticidad, distribució n de temperatura con cámara
vacía y penetració n de calor con reto microbioló gico.
3. RESULTADOS
La prueba de hermeticidad se realizó con un
programa, identificado como P6, previsto en el sistema de
control del esterilizador. Una vez alcanzado el nivel de
vacío requerido (P < 100 mbar) y luego de un tiempo de
estabilizació n de 5 minutos la pérdida de vacío no superó
los 13 mbar en 10 minutos.
Los estudios de distribució n de temperatura con
cámara vacía, se realizaron con un ciclo identificado
como P3, con una temperatura de 121 °C durante 30
minutos. Sus resultados aparecen en la Tabla I, mientras
que en la Fig.1 se muestran los perfiles de temperatura.
La duració n promedio de las tres corridas fue de 48
minutos.
Tabla I
Distribució n de temperatura con cámara vacía
TEMPERATURA, (°C)
CORRIDA
MÍNIMA MEDIA MÁXIMA
1 122,7 123,0 123,4
2 122,6 122,9 123,3
3 122,5 122,8 123,2
Las diferencias entre las temperaturas máximas y mínimas, con respecto
a la temperatura media no supera 0.5 °C.
Temperatura durante el ciclo
140.0

} Penetració n de calor con reto 120.0

100.0

El objetivo de la primera prueba es demostrar que la 80.0

T (°C)

cámara es hermética, lo cual implica que no hay 60.0

posibilidad de penetració n de aire no filtrado (aire no 40.0
Tavg
Tmax
estéril) hacia el interior del esterilizador, ya que esta 20.0 Tmin
condició n puede comprometer la fiabilidad del proceso, 0.0
en las etapas finales. Esta prueba se realiza ejecutando el
0:00:00

0:02:29

0:04:59

0:07:29

0:09:59

0:12:29

0:14:59

0:17:29

0:19:59

0:22:29

0:24:59

0:27:29

0:29:59

0:32:29

0:34:59

0:37:18

0:39:29

0:41:59

programa de prueba de vacío del esterilizador y tiempo (min)

registrando el perfil de la presió n. La pérdida de vacío no
debe ser superior a 13 mbar en un periodo de 10 minutos.
Los estudios de distribució n de temperatura con Fig.2. Perfil de temperatura durante las corridas de distribució n con la
cámara vacía. Se observa la coincidencia de las tres curvas (Tmín, Tmed,
cámara vacía y cámara cargada tienen como objetivo y Tmáx) en la fase de exposició n.
demostrar que la cámara del esterilizador es homogénea y
que la presencia de la carga no afecta la distribució n de
calor, respectivamente. Esta prueba es ejecutada fijando
los termopares homogéneamente, en el interior de la Una vez realizadas las corridas requeridas para
cámara y registrando el perfil de temperatura. demostrar que el autoclave opera de acuerdo a las

3/4
especificaciones del fabricante se realizaron las pruebas
con carga.
El estudio de penetració n de calor se realizó a un
patró n de carga formado por frascos, probetas y beakers,
junto a otros accesorios envueltos en papel permeable al
vapor. En las tres corridas se obtuvieron valores de Fo
superiores a 24 minutos, de acuerdo con el criterio
aplicado. El ciclo empleado se identificó como P3, con
una temperatura de 121 °C durante 25 minutos.
La Tabla II expone los resultados obtenidos
mostrando los valores mínimos y máximos de Fo
obtenidos en cada corrida.
Tabla II
Resumen de las corridas de penetració n de calor
CORRIDAS VALOR DE Fo (minutos)
Fo mín. Fo máx.
1 33,4 38,7
2 34,4 44,2
32,6 36,1
3
El criterio asumido fue realizar un proceso de esterilizació n que
permitiera obtener un Fo > 24 minutos.
Los indicadores sometidos a la esterilizació n y los
empleados como controles positivos fueron incubados en
las condiciones recomendadas, 58 °C durante 48 horas.
Ninguno de los indicadores bioló gicos sometidos al
proceso mostró evidencia de crecimiento, mientras que
los controles positivos evidenciaron un cambio de
coloració n como signo del crecimiento microbiano.
4. DISCUSIÓ N
Los resultados de la prueba de hermeticidad indicaron
que la cámara es hermética, lo cual aunque no tiene
marcada influencia en el comportamiento térmico, es un
aspecto de suma importancia en la etapa de post-
tratamiento pues es en esta donde generalmente se realiza
un pulso de vacío prolongado, para extraer la humedad
residual, en los procesos de esterilizació n para cargas
só lidas.
La Tabla I indica que la cámara del esterilizador es
homogénea pues las diferencias entre los valores mínimos
con respecto a la media es inferior a 1 °C; de igual forma
la diferencia entre los valores máximos y la media es
menor que 1 °C. De aquí se infiere que cualquier
comportamiento anó malo del perfil de temperatura, en la
carga, se debe a la configuració n de la misma y no al
desempeño del esterilizador. En la Fig. 1 se observan las
tres curvas correspondientes a la temperaturas mínimas,
máximas y media durante todo el ciclo. Durante las fases
de pre- y post-tratamiento los valores de temperatura se
diferencian notablemente, lo cual es de esperar debido a
que los pulsos de inyecció n de vapor y de vacío no
permiten el establecimiento de condiciones estables. Una
vez que se inicia la fase de exposició n las variaciones de
la presió n del vapor saturado son muy pequeñas, lo que
trae como consecuencia que las temperaturas en todos los
puntos de la cámara estén pró ximas. Debe destacarse que
el sistema de control de esta autoclave, por diseño del
fabricante, asume siempre 1 °C por encima del valor de
consigna fijado, como una garantía de que en un peor
caso el punto mas frío nunca estará por debajo de este.
Las pruebas de desafío microbioló gico, ejecutadas
simultáneamente, con el estudio de penetració n de calor,
dieron como resultado que los bioindicadores recibieron
una cantidad de calor suficiente para eliminar las esporas
de B. stearothermophilus brindando un criterio bioló gico
de la efectividad del proceso de esterilizació n.
5. CONCLUSIONES
El control automático de todos los pasos de un
proceso de esterilizació n garantiza que la ejecució n del
ciclo se efectú e siempre de la misma forma, asegurando la
consistencia y reproducibilidad de los resultados. Este
aspecto constituye un elemento fundamental en la
obtenció n de productos farmacéuticos.
Los estudios previos con la cámara vacía demostraron
que el sistema tiene un comportamiento muy homogéneo
durante la fase de exposició n del ciclo de esterilizació n,
con diferencias inferiores a 0.5 °C, lo cual favorece el
desempeño del proceso.
La medició n y registro de los perfiles de temperatura,
durante la ejecució n del ciclo de esterilizació n, así como
el cálculo simultáneo de los valores de Fo y el desafío
microbioló gico con esporas de B. Stearothermophilus
constituyen un método adecuado para demostrar la
efectividad de los procesos de esterilizació n.
Los valores de Fo que se obtuvieron en cada uno de
los puntos estudiados, indicaron que el proceso brindó
suficiente letalidad para eliminar las formas de vida
microbiana potencialmente presentes en los materiales
que conformaron el patró n de carga.
REFERENCIAS
[1] S. Denyer and R. Baird, “ Guide to Microbiological Control in
Pharmaceuticals” , Ed. Ellis Horwood, pp. 22-45 1990.
[2] R. M. Enzinger and W. R. Frieben, "An Overview of aseptic
Processing versus Terminal Sterilization", Sterilization of medical
products. vol. 6, pp. 89-96, 1993.
[3] M. J. Groves and R. Murty, "Aseptic Pharmaceutical
Manufacturing II", Interpharm Press, pp. 101-116, 1995.
[4] R. J. McBride, “ The Fo Concept” , Tutorial No. 1, Parenteral
Society, pp. 3-15, 1993.
[5] F. M. Nordhauser and W. P. Olson, “ Sterilization of Drugs and
Devices” , Interpharm Press, pp.45-74, 1998.
[6] Parenteral Drug Association, European Forum, “ Steam
Sterilization & Parametric Release - Science and Regulation” , pp
18-43, 1999.
[7] Parenteral Drug Association, “ Moist Heat Sterilization In
Autoclaves Cycle Development - Validation and Routine
Operation” PDA Technical Report # 1, pp 12-17, 2000.
4/4