BILIRRUBINA-T

Números de catálogo: 204-04 Presentaciones: 2 x 250 mL

204-S7 2 x 125 mL

USO
Para la determinación cuantitativa in vitro de bilirrubina (total) en suero.

PRECAUCION
Evitar la ingestión y el contacto con la piel y ojos. El reactivo es corrosivo y contiene DMSO. Use guantes al
manipularlo. Almacenar a 18-26°C.

REACTIVOS
Reactivo de Bilirrubina (Directa): 2 x 250 mL de una solución que contiene 35.6 mmol/L de ácido sulfanílico,
dimetilsulfóxido (DMSO) y ácido clorhídrico.
Reactivo de Nitrito de Sodio: 1 x 15 mL de una solución que contiene 60.0 mmol/L de nitrito de sodio.

ANTECEDENTES
La bilirrubina es un pigmento biliar que se encuentra normalmente en el suero como resultado de la destrucción
de los eritrocitos. Es un producto de la degradación de la hemoglobina por el sistema reticuloendotelial y existe
en dos formas. La bilirrubina no conjugada (indirecta) es transportada hacia el hígado fijada a la albúmina
donde luego es conjugada (directa) con ácido glucurónico y excretada.
La bilirrubina sérica elevada indica afección hepática, hemólisis excesiva u obstrucción de vías biliares.
Ehrlich (1) describió el acoplamiento de la bilirrubina con el ácido sulfanílico diazotado para formar un pigmento
rojo en soluciones neutras y un pigmento azul en soluciones muy ácidas o alcalinas. La bilirrubina conjugada
(de reacción directa) se acopla directamente con el reactivo en un medio acuoso. Puede agregarse un
acelerador para promover el acoplamiento de la bilirrubina libre con el reactivo diazo. Esto permite la
determinación de la bilirrubina total. Alcohol (2) o benzoato de cafeína-sodio (3) se utilizan comúnmente como
aceleradores. Winsten and Cehelyk (4) usaron dimetilsulfóxido (DMSO) como acelerador. Este método se basa
en una modificación al método de DMSO de Walters y Gerarde (5).

PRINCIPIO
El ácido sulfanílico reacciona con el nitrito de sodio para formar ácido sulfanílico diazotado. En presencia de
DMSO la bilirrubina indirecta (así como la directa) reacciona con el ácido sulfanílico diazotado formando
azobilirrubina.
Bilirrubina Total + Ácido Sulfanílico Diazotado → Azobilirrubina (Roja)

La absorbancia de la mezcla de reacción a 555 nm es directamente proporcional a la concentración de

bilirrubina total en la muestra.

PREPARACION DEL REACTIVO

Los reactivos son suministrados listos para usarse.
Puede prepararse un reactivo de trabajo de bilirrubina total al añadir una gota (0.05 mL) de reactivo de nitrito a
cada 3.0 mL de reactivo de bilirrubina total.
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ESTABILIDAD Y ALMACENAMIENTO DEL REACTIVO
Los reactivos suministrados son estables hasta la fecha de caducidad indicada en las etiquetas almacenados a
18-26°C. El reactivo de trabajo es estable por 8 horas cuando se conserva en un frasco de color ámbar a una
temperatura entre 18 y 26°C. Los reactivos deben mantenerse fuera de la luz solar directa.

DETERIORO DEL REACTIVO

La solución del reactivo debe ser clara. La turbidez indica deterioro.
El reactivo de bilirrubina total puede desarrollar una coloración rosa con el tiempo pero esto no afecta su
eficiencia.
El reactivo de nitrito deberá desecharse si presenta una coloración amarillo oscuro.

INSTRUMENTOS
Puede usarse cualquier analizador con control de temperatura de ± 0.5°C que sea capaz de leer la absorbancia
con exactitud a una sensibilidad de 0.001 a 555 nm. El ancho de banda debe ser de 10 nm ó menos, la
desviación de la luz de 0.5% ó menos y la exactitud de longitud de onda dentro de 2 nm.

RECOLECCION Y PREPARACION DE LA MUESTRA

La muestra de elección debe ser suero fresco, claro y no hemolizado. La muestra debe protegerse de la luz.
Las muestras para los análisis deben almacenarse a una temperatura de 2-8°C y son estables durante 7 días.
Pueden conservarse por periodos más largos a temperaturas de -20° a 0°C.

INTERFERENCIAS
Una concentración de hemoglobina mayor de 5 g/L en la muestra puede interferir con el análisis. Se puede
consultar un resumen sobre la influencia de drogas en pruebas clínicas de laboratorio consultando a Young,
D.S. (6).

PROCEDIMIENTO

Materiales Proporcionados
Se proporcionan los reactivos necesarios para la determinación de bilirrubina total.

Materiales Requeridos
1. Un analizador que reúna los requisitos mencionados en la sección de Instrumentos.
2. Cubetas de 1 cm ó una celda de flujo capaz de transmitir luz a 555 nm.
3. Tubos de ensaye con capacidad de 4 mL.
4. Pipetas capaces de dispensar 3.0 mL y 200 µL.
5. Un cronómetro para la medir el tiempo de incubación por 1 ó 5 minutos.
6. Un calibrador para bilirrubina.

Condiciones

Longitud de onda ............................................ 555 nm

Temperatura ................................................... 18-26°C ó 37°C
Paso de luz ..................................................... 1 cm
Tipo de reacción ............................................. Punto final
Tiempo de reacción ........................................ 5 min a una temperatura de 18-26°C ó 1 min a 37°C
Volumen de la muestra ................................... 200 µL
Volumen de reactivo ....................................... 3.0 mL
Volumen total .................................................. 3.2 mL
Relación muestra/reactivo .............................. 1/15

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Procedimiento
1. Para cada calibrador, control y sueros, etiquetar los tubos de ensayo, el blanco y la muestra. En cada
tubo pipetee 3.0 mL de reactivo de bilirrubina total.
2. Añada una gota (0.05 mL) de reactivo de nitrito a todos los tubos de ensayo etiquetados con
"muestras". Mezcle bien. No añada reactivo de nitrito a los tubos etiquetado como “blanco”. Ver Nota.
3. Pipetee 200 µL de calibrador de bilirrubina, controles y suero en cada uno de los tubos etiquetados
adecuadamente como "muestra" y "blanco", y mezcle.
4. Incubar a una temperatura de 18-26°C durante 5 minutos, ó a 37°C durante un minuto.
5. Determine la absorbancia de cada blanco y de cada muestra a 555 nm contra agua deionizada.
Nota: Como se indicó anteriormente, puede prepararse un reactivo de trabajo para utilizarse con los
tubos etiquetados con "muestra". Véase "Preparación del Reactivo".

ESTABILIDAD DE LA MEZCLA DE REACCION FINAL

El color de la mezcla de reacción final es estable por 1 hora. Evite la luz solar directa.

CALIBRACION
El procedimiento puede calibrarse de la siguiente manera:
1. Puede usarse un solo calibrador de bilirrubina conforme instrucciones para calibrar el procedimiento.
2. Prepararse una curva de calibración con cuatro o cinco niveles de calibrador de bilirrubina, que oscilen
desde 2 µmol/L (0.1 mg/dL) hasta el límite de linealidad de 342 µmol/L (20 mg/dL). Los calibradores
debe analizarse de acuerdo al procedimiento dado y trazarse la absorbancia neta contra sus valores
conocidos a fin de formar una curva de la cual puedan leerse directamente los valores desconocidos.

CONTROL DE CALIDAD
Debe analizarse un suero de control normal y otro de control anormal con cada serie de muestras, y los
resultados deberán caer dentro de ± 2 desviaciones estándar del valor establecido.

CALCULO Y RESULTADOS

Resultados
La bilirrubina total se expresada en µmol/L (mg/dL).

Cálculo - Calibrador
A – A1
Bilirrubina total µmol/L (mg/dL) =  x concentración del calibrador
As – As1
A = absorbancia de la muestra desconocida
A1 = absorbancia del blanco desconocido
As = absorbancia de la muestra de calibración
As1 = absorbancia del blanco de calibración
Ejemplo
0.076 - 0.031
Bilirrubina total µmol/L (mg/dL) =  x 103
0.409 - 0.022

= 12.0 µmol/L (0.7 mg/dL)

0.076 = absorbancia de la muestra desconocida

0.031 = absorbancia del blanco desconocido
0.409 = absorbancia de la muestra de calibración
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0.022 = absorbancia del blanco de calibrador
103 µmol/L (6.0 mg/dL) = concentración del calibrador

Limitaciones
1. Una muestra con una concentración de bilirrubina que exceda el límite de linealidad deberá diluirse con
solución salina a 0.9% y ser vuelta a analizar incorporando el factor de dilución en el cálculo del
resultado.
2. Para cada número de lote de reactivos deberá prepararse una curva de calibración.

VALORES ESPERADOS (7)

3.4-17.0 µmol/L (0.2-1.0 mg/dL)
Se sugieren estos valores como referencia. Se recomienda que cada laboratorio establezca su propio rango
normal para el área donde está localizado.

CARACTERISTICAS DE RENDIMIENTO
Estas características de rendimiento del método fueron generadas en los laboratorios DCL usando
procedimientos automatizados.

Estudio de Recuperación
Se añadió bilirrubina a un suero control para aumentar el valor de bilirrubina total. La recuperación de la
bilirrubina añadida tuvo un promedio de 101%.

Rango Lineal
El procedimiento manual es lineal hasta 342 µmol/L (20 mg/dL) de bilirrubina total. La linealidad usando
procedimientos automatizados dependerá de la relación muestra/reactivo utilizada.

Estudios de Precisión
La precisión de un día a otro se estableció analizando dos sueros control, dos veces al día durante 10 días.

Media Desviación Estándar Coeficiente de Variación

Bilirrubina Total
µmol/L µmol/L %
Suero 1 102.6 2.1 2.0
Suero 2 343.0 10.1 2.9

La precisión diaria se estableció analizando 2 sueros control, 33 veces cada uno.

Media Desviación Estándar Coeficiente de Variación

Bilirrubina Total
µmol/L µmol/L %
Suero 1 13.5 0.85 6.3
Suero 2 103.0 1.40 1.4

Exactitud
En una evaluación de este método se empleó un procedimiento similar de bilirrubina total como método de
referencia. El análisis de regresión lineal di0 la siguiente ecuación:

Este método = 1.00 (método de referencia) + 0.02 µmol/L.

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REFERENCIAS
1. Ehrlich, P., Sulfadiazobenzol, ein Reagens auf Bilirubin. Centr. Klin. Med. 4: 721-723 (1883).
2. Malloy H.T., and Evelyn, K.A., The Determination of Bilirubin with the Photoelectros Colorimeter., J. Biol.
Chem. 119: 481-490 (1937).
3. Jendrassik, L. and Grof. P. Vereinfachte, Photometrische Methoden zur Bestimmung des Blutbilirubins,
Biochem. Z. 297: 81-89 (1938).
4. Winsten, J. and Cehelyk, B., A Rapid Micro Diazo Technique for Measuring Total Bilirubin., Clin. Chem.
Acta 25: 441-446 (1969).
5. Walters, M. and Gerarde, H., An Ultramicromethod for the Determination of Conjugated and Total
Bilirubin in Serum or Plasma, Microchem. J. 15: 231-243 (1970).
6. Young, D.S., Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests, AACC Press, Washington, Third Edition,
1990.
7. Tietz, N.W. (Ed.), Fundamentals of Clinical Chemistry, Second Edition, W.B. Saunders Co., Toronto,
Page 1208, (1982).

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