Revista Brasileira de Reprodução Animal v.25 (3), p.

474 - 475, 2001

Efeito das etapas do processo de criopreservação sobre

a qualidade do sêmen canino diluído em Tris
(Effect of the cryopreservation process stages on the Tris extended canine semen quality)
1 1 1 1
Silva, A.R. , Cardoso, R.C.S. , Uchoa, D.C. , Silva, L.D.M.
1
Laboratório de Reprodução de Carnívoros – FAVET / UECE
legio2000@yahoo.com

RESUMO
Os efeitos de cada etapa da criopreservação sobre a qualidade do sêmen canino foram
investigados. O sêmen de 24 cães foi coletado, avaliado, diluído em Tris acrescido de gema de ovo e
o
submetido ao equilíbrio. Ao atingir 4 C, fez-se a adição de 6% de glicerol. O sêmen foi congelado e
estocado em nitrogênio líquido. Após uma semana, foi procedida a descongelação. A motilidade e o vigor
o
espermático foram similares para o sêmen fresco e diluído. Após o resfriamento a 4 C, houve um declínio
significativo na motilidade espermática e, após a adição do glicerol, o vigor também declinou. A queda
mais crítica na motilidade foi após a descongelação. Desse modo, os resultados sugerem que diversos
fatores estão envolvidos no decréscimo da qualidade espermática durante a criopreservação. Além disso,
a etapa mais crítica para o espermatozóide é aquela entre a adição de glicerol e a descongelação.
Palavras Chave: sêmen canino, criopreservação, Tris

SUMMARY
The effects of each cryopreservation stage on the canine semen quality were investigated. Semen
from 24 stud dogs was collected, evaluated, diluted in Tris plus egg yolk and submitted to the equilibrium.
o
When it reached 4 C, 6% of glycerol were added. The semen was frozen and stored in liquid nitrogen.
After one week, it was proceeded the thawed. Sperm motility and vigor was similar for the fresh and
o
extended semen. However, after cooling at 4 C, there was a significant fall in sperm motility and after
glycerol addition, vigor also fell. The most significant fall was after thaw. Thus, results suggest that several
factors are involved in the fall of the sperm quality during cryopreservation. Besides that, the most critical
stage for the spermatozoa is that between glycerol addition and thaw.
Key Words: canine semen, cryopreservation, Tris,

INTRODUÇÃO
O método mais usual para a criopreservação do sêmen canino é aquele descrito por Andersen
(1975), que consiste na utilização de um diluidor à base de Tris acrescido de gema de ovo e glicerol.
Atualmente, esse método serve como base para inúmeros trabalhos, os quais vêm alcançando
excelentes resultados in vitro, tendo sido verificada motilidade espermática após a descongelação em
torno de 70% (Ström et al., 1997), bem como excelentes taxas de concepção após inseminações
artificiais (Andersen, 1975; Rota et al., 1998).
Silva et al. (2000) congelaram o sêmen de cães com diluidores à base de Tris e água de coco,
ambos submetidos a uma modificação da metodologia descrita por Nunes et al. (1997) para a congelação
do sêmen de caprinos com o diluidor à base de água de coco. Esses autores verificaram que o diluidor à
base de Tris possibilitou uma melhor conservação da qualidade espermática do que a água de coco.
Assim, esse trabalho objetivou investigar o efeito de cada fase do processamento de
criopreservação, ou seja, diluição, resfriamento, glicerolização e descongelação sobre a qualidade do
sêmen canino diluído em Tris, submetido à metodologia descrita por Silva et al. (2000).

MATERIAL E MÉTODOS
Foram selecionados, através de exame andrológico completo, 24 cães das raças: Pastor Alemão
(n=8), American Staffordshire Terrier (n=5), Boxer (n=4), Rotweiller (n=3), Bassethound (n=1), Doberman
(n=1), Fila Brasileiro (n=1) e Samoieda (n=1), provenientes do canil da Polícia Militar do Ceará ou de
canis particulares. Todos tinham idade acima de 18 meses e foram alimentados com ração comercial
uma vez ao dia, com livre acesso à água. Cada cão foi submetido a uma coleta de sêmen por
manipulação digital. A fração espermática foi avaliada quanto ao seu volume, viscosidade e coloração.
Com auxílio de um microscópio óptico (100x), foram avaliados a porcentagem de espermatozóides
móveis (motilidade) e o vigor dos mesmos, pontuado em escala de 0 a 5 (Feldman & Nelson, 1996).
Apenas as amostras com motilidade > 80% e vigor > 4 foram diluídas e congeladas.
A diluição do sêmen foi feita na proporção de 1:1. Utilizou-se um diluidor constituído por 3,028g
de Tris-Hidroximetil-aminometano, 1,78g de ácido cítrico mono-hidratado e 1,25g de D-frutose,
dissolvidos em 100 mL de água destilada (Silva et al., 2000). A osmolaridade desta solução variou de 306
a 315mOsm/L e o pH estava em torno de 6,6. Fez-se a substituição de 20% dessa solução por gema de
ovo, fazendo-se então o fracionamento desse diluidor em duas porções iguais, onde a primeira porção
o
não possuía o crioprotetor e foi adicionada ao sêmen a 37 C, e a segunda, que continha 12% de glicerol,
o
foi acrescida ao sêmen de uma só vez quando ambos atingiam 4 C. Após a glicerolização, foi alcançada
a concentração final de 6% de glicerol no diluidor em questão.
O processamento (Silva et al., 2000) consistiu em adicionar a porção não glicerolizada do diluidor
o
ao sêmen a 37 C. Nos 40 minutos iniciais do período de equilíbrio, o sêmen foi mantido em uma caixa
o o
térmica entre 12 e 15°C. Em seguida, foi repassado para um refrigerador por 30 minutos a 4 C. Foi
realizada a glicerolização e o envase em palhetas de 0,25mL lacradas com álcool polivinílico. Estas
foram colocadas horizontalmente em uma caixa térmica por cinco minutos, ficando a 5cm do nível do
o
nitrogênio (N2) líquido, o que permitiu uma temperatura em torno de -70 C proporcionada pelos vapores
o
do N2. Seguiu-se o acondicionamento do sêmen em N2 líquido a -196 C. Após uma semana, foi feita a
o
descongelação em banho-maria a 37 C / 1 minuto. A motilidade e o vigor espermático foram avaliados
após coleta, diluição, resfriamento, glicerolização e imediatamente após a descongelação.
O efeito das etapas do processamento sobre a motilidade espermática foi analisado pelo teste de
Student, e o efeito das mesmas sobre o vigor espermático foi analisado pelo teste de Whitney-Mann. Os
resultados foram considerados significativos quando P < 0,05.

RESULTADOS E DISCUSSÃO
O sêmen fresco dos cães apresentou aspecto normal, coloração branco-opalescente e
viscosidade leitosa. O volume da fração espermática foi de 1,54 ± 0,64 mL. Observou-se uma motilidade
espermática de 97,3 (± 3,3)% com um vigor 4,9 (± 0,1). As características avaliadas estavam de acordo
com os valores descritos para a normalidade da espécie canina (Feldman & Nelson, 1996).

Tabela 1 - Motilidade e vigor espermático no sêmen canino diluído em Tris-gema-glicerol em cada fase
do processo de congelação/descongelação (n=24).
Avaliações do sêmen Motilidade (%) Vigor (0 – 5)
a a
Após a coleta 97,3 ± 3,3 4,9 ± 0,1
o a a
Diluição a 37 C 96,3 ± 4,2 4,9 ± 0,1
o b a
Resfriamento a 4 C 91,9 ± 5,5 4,9 ± 0,2
c b
Glicerolização 83,5 ± 8,1 4,7 ± 0,4
d c
Descongelação 54,4 ± 12,5 3,6 ± 0,5
a,b,c,d
Letras diferentes na mesma coluna indicam diferença estatística significativa (P < 0,05)

Do mesmo modo que neste experimento, Rota et al. (1998) não observaram diferenças entre a
qualidade do sêmen canino fresco e diluído. Isso se deve ao fato de ter sido utilizado um excelente
diluidor de sêmen que possui atividade tamponante, promovendo ajustes no pH, bem como, promove
uma pressão osmótica e concentrações de eletrólitos dentro dos parâmetros fisiológicos do sêmen
canino (Concannon & Battista, 1989).
Entre a diluição e o resfriamento, observou-se um decréscimo significativo na motilidade
espermática da ordem de 5%, o que pode ser devido ao choque térmico oriundo da queda de
o o
temperatura de 37 para 4 C (Farstad, 1996). Nessa etapa, foi importante a ação da gema de ovo como
um protetor de resfriamento, visto que esta contém a lecitina, a qual acredita-se ser responsável pela
reposição de fosfolipídios perdidos durante o choque térmico (Watson & Plummer, 1985).
Na glicerolização, verificou-se uma queda significativa da ordem de 8% na motilidade, bem como
um decréscimo no vigor espermático. McLaughin et al. (1992) observaram que o glicerol exerce efeitos
tóxicos sobre os espermatozóides como alterações físico-químicas que podem levar à ruptura da
membrana plasmática ou à remoção de importantes proteínas membranárias (Holt, 2000). Assim, esse
decréscimo nos parâmetros seminais avaliados deve-se, possivelmente, à ação do glicerol, visto ser
pequeno o limite entre seus efeitos tóxicos e protetores sobre a célula (England, 1993).
O maior decréscimo nos parâmetros seminais foi realmente oriundo da etapa de descongelação,
sendo este, quando confrontado com a etapa de glicerolização, da ordem de 30% para a motilidade
espermática. Vale salientar que entre estas etapas está compreendida a mudança térmica causada
o o
durante a exposição do sêmen ao vapor de N2, ou seja de 4 para - 70 C; aquela ocasionada pela
o o
imersão do sêmen no N2 líquido, de – 70 para – 196 C; bem como, a mudança térmica oriunda da
o o
descongelação, de - 196 para 37 C. Assim, diversos fatores podem contribuir para a queda da
o o
qualidade espermática nesse momento, tais como: a fase de cristalização que ocorre entre - 6 e - 10 C,
cujo efeito é reduzido pela adição do crioprotetor (Colas, 1975); as alterações osmóticas oriundas da
adição do crioprotetor e do rearranjo de íons que ocorre durante a criopreservação; as alterações na bi-
camada lipídio-protéica e modificações nas enzimas membranárias da célula espermática (Holt, 2000); o
choque térmico decorrente das diversas mudanças de temperatura às quais o espermatozóide é
submetido (Farstad, 1996).
A maioria dos pesquisadores tem usado a motilidade espermática como o principal parâmetro
para a avaliação de diluidores, crioprotetores e técnicas de criopreservação de sêmen canino. Porém, a
relação entre a motilidade e a capacidade fecundante do espermatozóide canino não está ainda
totalmente elucidada (Ivanova-Kicheva et al., 1997). Neste trabalho, a motilidade de 55% obtida após a
descongelação encontra-se dentro da faixa ideal para a realização de inseminações artificiais utilizando-
se sêmen congelado (Concannon & Battista, 1989). Outros autores citam, para o uso do mesmo diluidor,
resultados pós-descongelação que variam de 33% (Peña et al., 1998) a 70% (Ström et al., 1997). Essa
variabilidade deve-se à grande diversidade de metodologias empregadas na congelação do sêmen
canino. Em adição, England (1993) sugere que existe uma marcada variação quanto à capacidade de
sobrevivência espermática pós-descongelação entre indivíduos diversos, sugerindo que a seleção de
cães doadores pode exercer um marcado efeito sobre a fertilidade do sêmen congelado, tal qual é
descrito para a espécie eqüina. No presente experimento, foram utilizados 24 cães de raças diversas, o
que possibilitou uma redução do efeito da congelabilidade do sêmen do indivíduo sobre os resultados.
Porém, observou-se que a motilidade espermática após a descongelação variou de 30 a 75%, conforme
o animal utilizado.
A partir dos resultados obtidos, é possível concluir que diversos fatores estão envolvidos na
queda da qualidade espermática durante os procedimentos de congelação e descongelação. Além disso,
a etapa mais crítica para a célula espermática é aquela compreendida entre a glicerolização e a
descongelação. Desse modo, em trabalhos futuros, faz-se necessário uma maior atenção sobre essa
etapa, visando-se tentar diminuir os danos sobre o espermatozóide canino.

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