Introdeucere

Biologia moleculară a evoluat în ultimii 10 ani datorită progreselor realizate în

cercetările de biochimie, genetică, tehnicilor de microscopie electronică, tehnologia ADN
recombinat şi a informaticii. Toate acestea au permis modificarea experimentului biologic cu
a substratului molecular.
Ultimii ani s-au caracterizat prin accelerarea cercetărilor la nivelul întregului genom
la multe specii.
Secvenţializarea genomului uman a avut un rol important în biologia moleculară prin
care, lumea ştiinţifică de azi speră să înţeleagă modul în care acesta este organizat, cum
funcţionează şi va permite tratarea unor boli. Gradul înalt de conservare ale secvenţelor
genomului uman şi a principalelor specii de fermă, a permis folosirea hărţilor fizice ale
acestora.
Primul genom secvenţializat aparţinând unei specii de fermă a fost cel de găină
(Hillier şi col., 2004; Wong şi col., 2004), taurine, iar în 2005 a început cel de la suine.
Existenţa acestor informaţii va permite localizarea genelor cu efect major asupra caracterelor
economico-productive, va asigura informaţiile din domeniul molecular în managementul şi
ameliorarea animalelor.
Numărul de markeri moleculari descoperiţi a crescut, iar o parte din aceştia vor fi
folosiţi în programele de ameliorare, acolo unde se va considera că pot îmbunătăţi progresul
genetic. Informaţiile provenite de la aceşti markeri vor fi completate cu performanţele
rezultate în urma testării, ambele fiind luate în considerare la estimarea valorii de ameliorare
a unui anumit caracter, îmbunătăţindu-se acurateţea estimării sale şi creând astfel, o generaţie
mai valoroasă din punct de vedere productiv sau al rezistenţei la îmbolnăviri.
În România există o serie de unităţi de cercetare dezvoltare cu preocupări în
ameliorarea şi în identificarea markerilor moleculari la rasele crescute de noi. Primele studii
au fost realizate utilizând markeri imunohistochimici şi biochimici (grupe sanguine şi
proteine serice pentru taurine cabaline şi ovine la IBNA Baloteşti şi la ICDB Baloteşti. Alte
unităţi de cercetare determină profilele proteinelor serice şi din lapte pe care le corelează cu
diferitele caractere fenotipice de interes economic folosite în ameliorarea ovinelor, ICDOC
Palas Constanţa, SCDO Popăuţi, SR Romsuin.
În domeniul diagnosticului şi profilaxiei unor boli majore la animale (gripa aviară,
pesta porcină, etc) s-au făcut progrese remarcabile. Tehnicile de biologie moleculară se aplică
în cadrul Institutului de Diagnostic şi Sănătate Animală dar şi în multe laboratoare sanitare
veterinare judeţene.

I. EVOLUŢIA CELULELOR
Lehninger (1992), consideră celula ca o combinaţie complexă de molecule organice
capabile de autoorganizare, autoreplicare, schimb de energie şi materie cu mediul, prin
intermediul unor reacţii organice consecutive şi catalizate enzimatic.
Primii polimeri biologici sunt consideraţi acizii nucleici deoarece sunt singurele
molecule capabile de autoreglare (care ar fi putut servi drept matrice pentru propria lor
replicare).
În orice proces de copiere se produc inevitabil erori, care vor genera copii imperfecte.
Prin replicări repetate, secvenţa de nucleotide din polinucleotidul original va suferi modificări
importante. În acest mod va apărea o varietate de molecule cu informaţie diferită. În cazul
ARN aceste molecule diferite, care apar, pot explica proprietăţile fundamentale, forma şi
comportamentul acestuia. Molecula de ADN posedă două caracteristici speciale;
 • conţine în secvenţa nucleotidelor informaţia pe care o poate transmite în procesul
de sinteză a proteinelor prin ARN mesager;
• molecula are o structură unică de înfăşurare care permite să interacţioneze cu alte
molecule si să răspundă la condiţiile de mediu (ARN ribozomal şi ARN de
transfer).
Cele două caracteristici una informaţională şi alta funcţională reprezintă două
proprietăţi esenţiale pentru evoluţie. Secvenţa nucleotidică din ADN reprezintă genotipul,
adică informaţie transmisibilă a unui organism, în timp ce forma structurală reprezintă
fenotipul, adică expresia informaţiei genetice asupra căreia operează selecţia naturală (1, 34,
56, 86).

Dintre acizii nucleici ARN a apărut primul

Cercetările de biologie moleculară (1981) au arătat că intronul, o secvenţă care se
găseşte în molecula de ARN premesager, dar care este eliminată din ARN mesager matur,
poate să se autoexcizeze din molecula precursor, fără intervenţie enzimatică. Apare prima
dovadă că ARN poate funcţiona ca o enzimă şi că secvenţa intronică poate reprezenta enzima
ARN replicaza care ar cataliza propria replicareas.
În 1983 s-a descoperit a doua specie de ARN catalitic ARN replicaza, care poate fi
considerată, primul sistem viu sau molecula primordială a vieţii. ARN replicaza se
presupune că a apărut ca o condensare prebiotică aleatorie care a condus la formarea de
polimeri cu o creştere progresivă în lungime a catenelor. La început, aceşti polimeri nu aveau
nici o funcţie dar o moleculă dintre acestea a putut să dobândească funcţia de ARN
polimeraza-replicaza, capabilă de a introduce erori din când în când. ARN replicaza ipotetică
a evoluat spre variante capabile de a asigura replicări mai rapide şi cu o precizie mai mare de
copiere a moleculelor parentale (52, 56, 86).
ARN este considerată molecula primordială a vieţii şi nu ADN, deoarece:
• riboza (glucidul conţinut de ARN) se realizează mult mai uşor decât dezoxiriboza
(glucidul conţinut de ADN);
• structura ciclică a dezoxiribozei (din ADN) nu posedă gruparea 2´hidroxil. Grupările 2´
şi 3´ joacă rol structural în ARN şi sunt implicate în formarea structurii terţiare a ARN
de transport (forma de treflă), prin legături de H; ADN neavând gruparea 2´hidroxil nu se
poate replia pentru a lua forme tridimensionale compelxe, impuse de activitatea catalitică.
o gruparea 2´hidroxil a ribozei joacă ea însăşi un rol catalitic direct. Exemplu
capacitatea de autoexcizie (matisare) a intronilor din ARN mitocondrial
o celulele cunoscute azi, toate au în genom ADN, dar precursorii ADN sunt
todeauna sintetizaţi prin reducerea precursorilor difosfaţi nucleotidici ai ARN cu
ajutorul unei enzime conservate de-a lungul evoluţiei: ribonucleoziddifosfat
reductaza.
S-a demonstrat astfel că molecula de ARN posedă cele două proprietăţi obligatorii
evoluţiei: de replicare al informaţiei genetice şi de catalizator enzimatic (ribozomii).
Se sugerează că acum 3,5-4 miliarde ani molecula de ARN a devenit un sistem
autoreplicativ. Cu acest sistem începe evoluţia sistemelor vii pe pământ, pentru ca mult mai
târziu ADN să preia funcţiile ARN, la nivelul celulei organizate. Această schimbare apare
atunci când celula devine mai complexă şi când ea va necesita o cantitate mai mare de
informaţie şi mai stabilă decât cea oferită de moleculele de ARN. Deci ADN apare ca o
adaptare la creşterea complexităţii sistemului celular şi nu ca o parte componentă a celulei
ancestrale.
Este foarte greu de stabilit momentul în care molecula de ADN a preluat funcţia
exercitată de ARN. Ambele tipuri de molecule se găsesc în celulele actuale, îndeplinind
funcţii diferite , fiind în strânsă colaborare.
 Funcţiile distincte se datoresc diferenţelor chimice mici (ADN conţine timină şi
dezoxiriboză, iar ARN conţine în loc de timină, uracil şi riboză în loc de dezoxiriboză).
ADN ca depozit al informaţiei genetice, este mult mai stabil din punct de vedere
chimic (genetic) decât ARN. Stabilitatea moleculei de ADN este dată de:
• structura dublu catenară, care permite moleculei să se repare rapid, în cazul în care
apare o modificare în secvenţa ei (în timpul replicării) sau o leziune la nivelul catenei
• datorită dezoxiribozei care nu are gruparea 2´hidroxil ceea ce o face mai rezistentă
la hidroliză comparativ cu riboza din ARN.
ADN care conţine întreg setul de gene şi sisteme de control care permit transcripţia
sub forma moleculelor de ARNm specifice proteinelor celulare şi celorlalte tipuri de ARN
(de transport şi ribozomal) necesare pentru sinteza lor (2, 15, 29, 34).

1.1 Caracteristicile procariotelor

Celula procariotă (pro- înainte, karyion – sâmbure sau nucelu).

Din categoria procariotelor fac parte toate bacteriile de forme şi mărimi diferite. Au
membrana celulară care formează un singur compartiment citoplasmatic, fără o structură
internă bine organizată. Conţine un singur cromozom, constituit dintr-o singură moleculă de
ADN circulară, fără a prezenta un nucleu bine conturat (fig.1.1). Bacteriile se multiplică prin
diviziune simplă, în două părţi, numită diviziune binară, în funcţie de condiţiile de mediu.
Neexistând compartimente intracelulare transcripţia ADN şi transducţia ARNm (sinteză
proteică) au loc concomitent. Un singur tip de ARN polimerizează, transcrie cele trei tipuri
de ARNm, ARN r, ARNt.

Fig.1. 1. Celula procariotă.ADN circular, specific procariotelor.

Bacteria cea mai cunoscută din punct de vedere biochimic şi genetic este Escherichia
coli (E.coli).
Cercetările de biologie moleculară au demonstrat că 90-99% din informaţia genetică,
existentă în genomul unei celule eucariote, este represată, deci este netranscriptibilă şi nu se
exprimă fenotipic. Există gene funcţionale comune aproape tuturor tipurilor celulare ale
organismului respectiv, sunt în mod selectiv activate sau represate în funcţie de tipul şi
stadiul de diferenţiere al celulei respective. Dacă toate genele din organism ar fi transcrise,
toate celulele constitutive ar produce acelaşi tip de proteine şi în consecinţă ar fi identice.
Realitatea nu este aceasta, pentru că deşi toate celulele conţin întreg patrimoniul genetic,
provenit de la oul fecundat, există un sistem de control care decide şi menţine expresia
anumitor gene şi represia altora, în funcţie de necesităţile celulei respective.
Factorii de control sunt proteinele reglatoare. Aceste proteine sunt codificate de gene
reglatoare, mai mult sau sau mai puţin active în funcţie de tipul celular funcţiile şi vârsta
celulei. Proteinele reglatoare au capacitatea de a se lega de ADN, la nivelul unor secvenţe
(regiuni) care controlează activitatea unei anumite gene structurale şi pot bloca represa) sau
activa expresia acestei gene (transcripţia ARNm necesar sintezei unei proteine specifice), în
funcţie de cerinţele fiziologice ale celuei.
Diferitele forme de viaţă nu sunt stabile, de aceea ele au putut da naştere în mod
continuu, la organisme diferite faţă de predecesori. La schimbarea mediului organismele
răspund prin capacitatea de adaptare.
Teoria darwinistă implică repetarea a trei procese:
1) selecţia, procesul care triază indivizii apţi;
2) reproducerea, procesul de generare a progeniturilor şi
3) mutaţia, care introduce variaţii, fără de care nu ar exista alternative asupra cărora
selecţia ar putea acţiona.

1.2. Caracteristicile celulelor eucariote

Nucleul, component fundamental prezent la toate celulele eucariote, conţine aproape

întreaga cantitate de ADN care formează genomul celular. Nucleul ocupă aproximativ 10%
din volumul total al celulei, dar acesta variază în funcţie de ţesut, vârsta celulei, activitatea
metabolică, gradul de diferenţiere, patologia celulei.
În structura nucleului s-au pus în evidenţă patru componente distincte: cromatina
nucleară, nucleolul şi matrixul nucleolar care formează nucleoplasma (sau carioplasma) şi
membrana nucleară care închide acest compartiment.

Membrana nucleară
Nucleul este înconjurat de o membrană dublă trilaminată:
- membrana nucleară internă, prin proteinele specifice se leagă de lamina nucleară.
Membrana nucleară este în contact cu ADN şi ARN-urile transcrise în nucleu;
- membrana nucleară externă, care se continuă cu membrana reticulului endoplasmatic.
Între cele două membrane nucleare există un spaţiu perinuclear care are diametrul de
20-40 nm. Proteinele sintetizate de ribozomii legaţi de membrana nucleară externă, sunt
transportate în spaţiul perinuclear, care se continuă cu lumenul reticulului endoplasmatic
(fig.1.2).

Fig.1.2. Structura nucleului la microscopul electronic.

Nucleul reprezintă centrul metabolic activ care realizează funcţii primordiale pentru
celulă: replicarea ADN, transcripţia informaţiei în ARN, realizarea diviziunii celulare,
repararea ADN. În desfăşurarea acestor funcţii proteinele joacă un rol important. ARN-urile
sintetizate şi procesate în nucleu, sunt urmate de sinteza proteică care se desfăşoară în
citoplasmă (fig. 1.3).

Fig.1.3 Celula prokariotă şi eukariotă.Transcripţia şi transducţia la celula eukariotă.

ARN-urile şi alte componente ca proteinele din nucleu trebuiesc exportate în
citoplasmă, şi invers. Toate aceste componente traversează membrana nucleară prin porii
nucleari, fiind un proces selectiv, nepermiţând decât anumitor proteine pătrunderea în
nucleu.
Porii nucleari apar ca nişte canale de legătură între conţinutul nucleoplasmatic şi cel
citoplasmatic (fig. 1.4). Numărul porilor variază cu specia şi tipul celular.

Fig. 4. Porii membranei nucleare la ME.

În centrul fiecărui complex al porului nuclear apare un „canal” prin care moleculele
solubile în apă pot circula din nucleu şi citoplasma şi invers. Acest canal conţine adesea şi un
complex proteic granular, situat în zona centrală, care apare ca o diafragmă în mijlocul
canalului.
Diametrul porului (tunelul cilindric) este de 9 nm şi lungimea de 15 nm. S-a observat
că moleculele mici (greutate moleculară până la 1500 daltoni) difuzează rapid, iar cele mari,
mai greu. Proteinele porului nuclear sunt în număr de 100, diferite. Unele au rol de receptori
specifici pentru proteinele selectate şi un mecanism deosebit de utilizare a energiei pentru
trecerea lor în interiorul nucleului sau spre citoplasmă. Astfel de proteine conţin o peptidă
caracteristică, numită secvenţă de localizare nucleară (NLS) care este esenţială pentru
traversare. Transportul nuclear este selectiv necesită un semnal nuclear de import care este
prezent numai în proteinele nucleare (enzime, histone, factori de transcripţie). Acest semnal
este reprezentat de o secvenţă scurtă de aminoacizi (4 până la 8 aminoacizi) care are sarcina
electrică pozitivă (conferită de obicei de lizină şi arginină) şi este recunoscut de receptorii
specifici din complexul por.
Moleculele mai mari decât diametrul porului (de exemplu, ARNm) sunt complexate
cu diferite proteine (nucleoproteine), şi interacţionează cu receptorii specifici conţinuţi de
proteinele globulare ale porului (2, 30, 34, 56). Receptorii activează tranzitul acestor
particule în sau în afara nucleului, prin lărgirea canalelor porilor.
1.2.1 Structura cromatinei

Cromatina este complexul ADN-proteine al unei mase dezorganizate de fibre în care,

sunt agregaţi cromozomii în interfază. Moleculele de ADN ale unui cromozom de la
organisme superioare s-ar întinde pe o distanţă de centimetri dacă ar fi desfăşurată, dar ea
trebuie să fie foarte împachetată (printr-un proces numit compactare) în nucleu. Molecula de
ADN trebuie, de asemenea, să se organizeze în unităţi funcţionale care să permită exprimarea
genelor şi replicarea lor.
Prin colorare se pot distinge două zone care formează eucromatina şi
heterocromatina. Genele active transcriptibile în ARNm formează zona eucromatică, pe când
cele inactive zona heterocromatică. Cele două zone se disting prin sensibilitatea la atacul
ADN-azei. La nivelul eucromatinei, cromatina fiind mai puţin condensată, enzima are acces
şi poate acţiona, în timp ce la nivelul heterocromatinei enzima este inactivă, accesul ei fiind
împiedicat de gradul mare de condensare a acesteea. Cromatina eucariotelor conţine şi
proteine nehistonice (proteine reglatoare, factori de transcripţie precum şi enzime ca ADN
polimeraza sau ARN polimeraza, enzime de reparare, topoizomeraze).
Toată informaţia genetică conţinută de nucleu constituie aşa numitul genom.
Genomul bacteriei E.coli este format de 4, 7x106 pb conţinute de o singură moleculă de ADN
(deci un singur cromozom). Genomul uman (celulele diploide) conţine 46 de cromozomi şi
ADN este format din 6x109 pb iar celulele haploide conţin 3x109 pb (6, 25, 32, 34, 75, 86).

1.1.2. Nucleolul

Nucleolul (fig. 1.5) este situat la celulele aflate în interfază (excepţie fac celulele
embrionare care nu au început sinteza proteinelor proprii).
La microscopul electronic, nucleolul este format din:
- centru fibrilar, de ADN netranscriptibil;
- o regiune fibrilară densă, de ARN în curs de sinteză;
- o componentă granulară care conţine particulele de preribozomi (15, 56, 86).

Fig.1.5 . Nucleolul la MO în plasmocite (a) şi la ME (b).

În 1960 s-a descoperit că nucleolul joacă rol în sinteza ARN ribozomal (ARNr) şi în
asamblarea componentelor ribozomale. Sinteza ARNr în nucleol a fost pusă în evidenţă prin
folosirea uridinei marcate (3H uridină). Astfel a fost relevată sinteza unui singur tip de
transcript primar, reprezentat de molecule precursor de ARNr 45S. Din ARNr 45S, prin
clivarea parţială rezultă cele 3 tipuri de ARN ribozomal: ARNr 18S (încorporat în
subunitatea mică a ribozomilor, ARNr 5,8S şi ARN 28S (încorporate în subunitatea mare a
ribozomilo). Aceste molecule de ARN, înainte de a fi exportate în citoplasmă, formează
complexe ribonucleoproteice cu mai multe tipuri de proteine (peste 70 proteine). Proteinele
necesare sunt sintetizate în citoplasmă şi importate de nucleu. Complexele formate stau la
baza formării ribozomilor.
Transcripţia ADN deci sinteza ARNr, are loc numai în interfază. Pe măsură ce se
apropie faza mitotică, cromozomii se condensează, nucleolul se micşorează iar în metafaza el
dispare complet. În telofază sinteza ARNr este reluată şi mininucleolii se reformează în
apropierea genelor ARNr localizate, în regiunile bine delimitate a 10 cromozomi.
La sfârşitul mitozei mininucleolii fuzionează rapid şi formează un nucleol mare, care
obişnuit se observă în interfază. În mod normal nucleolul ocupă 30% din volumul nucleului.
În celulele canceroase nucleolii apar hipertrofiaţi având o formă neregulată. Gradul lor de
hipertrofie este proporţional cu gradul de malignitate (2, 15, 34, 86).

1.2.3. Matricea nucleară

Matricea nucleară este structurată dintr-o reţea de filamente insolubile, care ar fi

echivalentă citoscheletului citoplasmei. Se consideră că fiecare tip celular ar avea un set
distinct de proteine, pe acestea fiind structurate loops-urile din structura cromozomilor.
Acestea ajută la organizarea cromozomilor, reglarea replicării şi a transcripţiei ADN.
S-a observat de asemenea, că şi ARNm şi de transport este conţinut în cadrul unor
compartimente specifice din nucleu. S-a pus în evidenţă că sinteza acestor molecule de ARN
are loc în zone numite „domenii de transcripţie”. În aceste domenii are loc şi îndepărtarea
intronilor din transcriptul primar (matisare ), înainte ca ARNm să fie exportat în citoplasmă
(1, 2, 32, 86, 88).
 2. STUCTURA ACIZILOR NUCLEICI
AND
Acizii nucleici sunt
ADN-ul şi ARN-ul
• Sediul principal al localizării ADN-ului este nucleul celulelor.
• Sedii secundare sunt: mitocondriile şi cloroplastele (în celula vegetală).
• ARN
• Diferitele tipuri de ARN sunt localizate în nucleu, citoplasmă, mitocondrii,
ribozomi.
• Acizii nucleici sunt polinucleotide (produşi de policondensarea aunor unităţi
denumite nucleotide).
• Nucleotidele reprezintă unitatea monomerică a acizilor nucleici şi sunt compuse
din:
• - o bază azotată heterociclică:
• - purine: adenină (A) şi guanină (G)
• - pirimidine: citozină (C) şi timină (T) pentru ADN
• citozină (C) şi uracil (U) pentru ARN
• - o pentoză:
• - dezoxiriboza (este prezentă în ADN)
• - riboza (este prezentă în ARN)
• - fosfat

2.1. Fosfaţii

Moleculele biologice care conţin informaţia genetică sunt acizii nucleici. Acizii
nucleici sunt polimeri.
Există două tipuri de acizi nucleici: acidul dezoxiribonucleic (ADN) şi acidul
ribonucleic (ARN). Acizii nucleici sunt produşi de policondensare, unitatea monomeră fiind
un nucleotid, astfel că toţi acizii nucleici sunt polinucleotidici.
Un nucleotid este format din fosfat, glucid cu 5 atomi de C (pentoza) şi baze azotate
(purine sau pirimidine).
Fosfatul anorganic este un complex stabil, format pornind de la acidul fosforic PO4H3 (scris
Pi).
Esterii fosfat se pot forma dintr- un fosfat şi o grupare hidroxil liberă (alcool, enol,
fenol).
Condensarea unui fosfat şi a unui acid de exemplu, sau a unui fosfat cu un alt fosfat
dă o anhidridă. Există şi anhidride mixte între un acid fosforic şi un acid carboxilic de
exemplu.
Pirofosfatul care este o anhidridă a acidului fosforic (14, 42, 52, 67).
 Fig. 2.1. Fosfaţii.

2.2. Riboza şi deoxiriboza

Glucidul specific ARN-ului este riboza iar al ADN-ului este deoxiriboza.

Riboza este o pentoză din seria D în care toţi hidroxilii sunt orientaţi la dreapta.
Deoxiriboza derivă din riboză printr-o reducere a funcţiei alcool a C2´-hidroxil.
Gruparea 2´-hidroxil prezentă în ARN îl face susceptibil la hidroliză alcalină, în timp ce
ADN este rezistent. În schimb atât ADN cât şi ARN sunt hidrolizaţi în mediu acid.

• Atomii de carbon ai pentozelor sunt numerotaţi de la 1’ la 5’.

Fig. 2.2. Riboza şi deoxiriboza.

2.3. Baze azotate

Bazele azotate sunt împărţite în două grupe: purinice-adenina, guanina şi
pirimidinice-citozina, uracil,timină.
Singura diferenţă între ele este că ADN conţine timină (T) în timp ce ARN conţine
uracil (U). În ARNt, este prezentă şi inozina (I). Inozina este nucleozidul hipoxantinei,
adenina care este deaminată. ARNt conţine, de asemenea, alte nucleozide neuzuale cum
pseudouridina, ribotimidina şi dihidrouridina.
Bazele azotate ale acizilor nucleici aparţin celor două molecule în funcţie de nucleul
aromatic de bază care constituie scheletul. Nucleul aromatic pirimidinic este format din 6
atomi din care 4 de C şi 2 de N (fig.2.3). Cei doi atomi de N se află în poziţia meta (numărul
1 şi 3).
O bază purinică este constituită din doi nuclei heterociclici alipiţi, unul de 6 atomi şi
altul de 5 atomi, având 2 atomi de C în comun (situaţi la mijloc). În raport cu carbonii
comuni, atomii de N ocupă poziţii simetrice 1 şi 3 la stânga, 7 şi 9 la dreapta(fig.2.3).

Fig.2.3. Nucleu purinic şi pirimidinic.

Diferite baze întâlnite în compoziţia acizilor nucleici se deosebesc prin substituienţii

purtaţi de aceştia.

Bazele purinice
Adenina este constiuită dintr-un nucleu purinic în care atomul de C 6 este substituit
cu gruparea amină. Ea este singura bază azotată nucleotidică a cărei formulă nu conţine
atomi de oxigen (fig.2.4).
Guanina este constituită dintr-un nucleu purinic la care atomul carbon 2 este
substituit cu o grupare amină şi carbonul 6 printr-o legătură cetonică.

Adenina Guanina
NH2 O
6
7 N
1
N
4
N HN

2 8
N 5 H2N N NH
NH
3 9

Fig. 2.4. Baze purinice.

Atomii heterociclului purinic sunt numerotaţi de la 1 la 9 (astfel încat atomii de N din ciclu să
primească indicele minim).

Bazele pirimidinice
Sunt reprezentate de citozină, uracil şi timina.
Citozina este formată dintr-un nucleu pirimidinic în care C4 este substituit de
gruparea amină şi C2 cetonă.
 Uracilul este constituit din nucleu pirimidinic în care carbonii 2, 4 poartă gruparea
cetonă (fig. 14).
Timina este constiuită din nucleu pirimidinic în care C2 şi C4 posedă gruparea
cetonă dar C5 are legat un metil şi se mai numeşte metil-uracil.

C itozina T im ina U racil

NH2 O
O
4
5 3 H3C
N NH
NH
2
6
NH O NH O
1 NH O

Fig.2.5. Baze pirimidinice.

Bazele azotate prezintă fenomenul de tautomerie

NH
NH2 NH2

C C
N N NH

NH O forma amino forma imino

Citozina

C C
HN O N OH

forma lactam forma lactim

• Formele mai stabile:

– Forma lactam este mai stabilă decît forma lactim
– Forma amino este mai stabilă decît forma imino

• În acizii nucleici există formele lactam şi amino

2.4. Nucleozide şi nucleotide

Glucidele, riboză sau deoxiriboză se leagă de bazele azotate prin legături care implică
unii din atomii de N ai bazei (N1 la bazele pirimidinice sau N9 la purinice). Legătura dintre o
bază azotată cu zaharurile (ozele) dă un nucleozid; acestea sunt legături N-ozidice. Într-o
nucleozidă atomii bazei se numerotează prin cifre 1 ...n, iar pentru a se distinge carbonii ozei
sunt numerotaţi 1′ - 2′ (4, 42, 46, 52, 67, 69).
 Legătura unei ozide cu un fosfat se face prin esterificare la funcţia alcool primară
(C5′ ) a ozei cu una din cele 3 grupări acide ale fosfatului. Esterul obţinut este o nucleotidă
formată dintr-o bază azotată legată printr-o legătură N-ozidică cu o oză şi aceasta fiind de
asemenea, legată esteric de un fosfat (fig. 2.6).

Fig. 2.6. Nucleozide şi nucleotide

2.4.1 Denumirea nucleotidelor

Bazele azotate sunt notate convenţional printr-o iniţială şi o culoare. Adenina cu A şi

verde; G cu galben. Fiecare bază poate intra în structura a 2 nucleozide în funcţie de oză,
riboză sau deoxiriboză, fiecare nucleozidă poate fi legată de una, două sau trei grupări fosfat.
Se notează prin sigla convenţională GMPguanozin monofosfat, ADP adenozindifosfat sau
ATP adenozintrifosfat.
 Baza Nucleozidul Nucleotidul
Adenina Adenozina (A) Adenozin
(A) monofosfat (AMP) sau
adenilat

Adenozin difosfat
(ADP)

Adenozin trifosfat
(ATP)

Nucelotidelor li se desemnează baza nucleozidei monofosfat exemplu adenozin

monofosfat sau AMP.
Nucleozidele polifosfat sunt difosfat ADP sau trifosfat, ultimile fiind mai bogate în
energie ATP.

Baza Nucleozidul Nucleotidul

Adenina Adenozina (A) Adenozin monofosfat
(A) (AMP)
Adenozin difosfat
(ADP)
Adenozin trifosfat
(ATP)
Guanina Guanozina (G) Guanozin monofosfat
(G) (GMP)
Guanozin difosfat
(GDP)
Guanozin trifosfat
(GTP)
Citozina Citidina (C) Citidin monofosfat
(C) (CMP)
Citidin difosfat (CDP)
Citidin trifosfat (CTP)
Uracil (U) Uridina (U) Uridin monofosfat
(UMP)
Uridin difosfat (UDP)
Uridin trifosfat (UTP)
 Timina (T) Timidina (T) Timidin monofosfat
(TMP)
Timidin difosfat (TDP)
Timidin trifosfat (TTP)

Adenozina

Este o nucleozidă formată dintr-o pentoză riboză legată printr-o legătură N ozidică la
o bază azotată adenina (fig 2.7). Alte ribonucleozide sunt guanozina, citidina şi uridina.

Fig. 2.7. Adenozina.

Dezoxiguanozina
Este o moleculă formată din pentoză-dezoxiriboză legată de o bază azotată-guanina
(fig.2.8).
Alte dezoxiribonucleozide sunt dezoxiguanozina, dezoxitimina.

Fig. 2.8. Dezoxiguanozina.

Uridinmonofosfat
 Uridinmonofosfatul sau acidul uridinic UMP este o moleculă rezultată prin legătură
esterică a fosfatului cu riboza şi N ozidică cu uracilul (fig. 2.9).

Fig. 2.9. Uridina monofosfat sau uridilat.

Baza Nucleozidul Nucleotidul

Adenina Dezoxiadenozina (A) Dezoxiadenozin monofosfat
(A) (dAMP)
Dezoxiadenozin difosfat
(dADP)
Dezoxiadenozin trifosfat
(dATP)
Guanina Dezoxiguanozina (G) Dezoxiguanozin monofosfat
(G) (dGMP)
Dezoxiguanozin difosfat
(dGDP)
Dezoxiguanozin trifosfat
(dGTP)
Citozina Dezoxicitidina (C) Dezoxicitidin monofosfat
(C) (dCMP)
Dezoxicitidin difosfat (dCDP)
Dezoxicitidin trifosfat (dCTP)
Uracil Dezoxiuridina (U) Dezoxiuridin monofosfat
(U) (dUMP)
Dezoxiuridin difosfat (dUDP)
Dezoxiuridin trifosfat (dUTP)
Timina Dezoxitimidina (T) Dezoxitimidin monofosfat
(T) (dTMP)
Dezoxitimidin difosfat
(dTDP)
Dezoxitimidin trifosfat
(dTTP)
 Dezoxitimidinmonofosfat
O nucleotidă timin monofosfat sau acidul timidilic este o nucleotidă formată din
timina legată de dezoxiriboză. Se neglijează adesea precizarea denumirii de dezoxitimidin
monofosfat dTMP. Dezoxiriboză se leagă numai de timină şi riboză de uracil (fig. 2.10).

Fig. 2.10. Dezoxitimidina Mono Fosfat.

Adenozin Tri Fosfat -ATP

Un nucleotid în care trei grupări fosfat sunt ataşate la un nucleozid la poziţia C5′ a
glucidului se numeşte nucleozid trifosfat (fig.2.11). Asfel ATP se numeşte adenozin trifosfat
(P-P-P- C5′ - riboză-adenină).

Fig 2.11. Adenozin Tri Fosfat –ATP.

Dezoxicitozina trifosfat este o nucleotidă compusă, cu structura bazată pe adenina

legată N ozidic de β D riboză trifosfat (fig. 2.12). Funcţiile acide ale acizilor fosforici distali
sunt foarte ionizate la pH fiziologic. Legăturile anhidridice sunt bogate în energie. Dintre
grupările fosfat CTP este unul din substratul ADN polimerazei. Enzimele care utilizează
nucleotid trifosfat necesită Mg cofactor. Alte nucleotide trifosfat sunt ATP, GTP, CTP, UTP,
TTP (14, 31, 42, 52, 67).
 Fig. 2.12. Dezoxicitozina trifosfat

Ribonucleotide Dezoxiribonucleotide

Adenozin monofosfat Dezoxiadenozin monofosfat

(AMP) sau adenilat (dAMP) sau dezoxiadenilat

Adenozin difosfat Dezoxiadenozin difosfat

(ADP) (dADP)

Adenozin trifosfat Dezoxiadenozin trifosfat

(dATP)

Nucleotide naturale libere: AMPc

• 3’,5’adenozin monofosfatul ciclic (AMPc) este mesager secund imlicat în
transmiterea mesajului hormonal din mediul extracelular în interiorul celulei.

NH2 A d e n in e
N
N

N N

O CH 2
O
R ib o s e

O P O OH
O

AMPc
 2.5. Legăturile de hidrogen

O legătură de hidrogen este o legătură săracă în energie între doi atomi care se
atrag electrostatic primul fiind bogat în electroni- nucleofil şi celălalt bogat în protoni deci
electrofil (atrage electroni).
Astfel, atomul de H cu electron unic necesită pentru completarea orbitalului un alt
electron deci nu poate fi decât electrofil fiind atras de atomi care au dublete electronice libere
(fig.2.13). Atomii de N şi O au 2 şi respectiv 4e- pe stratul perifric care nu participă la
orbitalii legăturilor covalente ai moleculei, (O2 are 2e- neparticipanţi) şi N are 4 e-. Aceasta le
conferă caracter nucleofil care le permite atracţia atomilor electrofili, în special a atomilor de
H această atracţie constituie o legătură de H. Atunci când orbitalii care unesc atomul de H cu
molecula la stânga şi dubletele electronice libere cu atom nucleofil sunt pe aceeaşi axă
legătura de H este mai puternică.

Fig. 2.13. Legături de H

2.6. Hibridizarea bazelor azotate

Hibridizarea AT
Un acid nucleic prezent în soluţie moleculară formează legături de H asociind
nucleotidele 2 câte 2 astfel că o nucleotidă cu A să se lege cu T sau cu U în ARN şi o
nucleotidă de G cu C (fig.2.14). Această legătură se numeşte hibridizare (46, 52, 59).
 Fig. 2.14 Hibridizarea adenina- timina.

Legătura-hibridizare AT este mai puţin stabilă decât G C, deoarece între adenină şi

timină se formează două legături de H iar între citozină şi gunină 3 (fig. 2.15).

Fig. 2.15. Hibridizarea Guanină-Citozină.

2.8. Conformaţia helixului dublu catenar al ADN

Moleculele ADN există ca un dublu helix cu două lanţuri (catene) care au direcţii
opuse (antiparalele), extremitatea 5′ a uneia este opusă cu 3′ a celeilalte (modelul Watson şi
Crick 1953). Ele diferă prin conformaţie, fenomen numit polimorfism structural.
La ADN se cunosc două conformaţii dublu helicoidale orientate spre dreapta: ADN-A
şi ADN-B (lanţurile se răsucesc spre dreapta pe măsură ce progresează în sus). ADN-B este
caracterizat printr-o repetiţie regulată a şanţurilor de tip minor şi major. O formă diferită de
ADN este ADN-Z care un helix orientat spre stânga dar care are un schelet neregulat.
Neregularitatea ADN-Z este ilustrată prin linia groasă care leagă grupările fosfat. Se
speculează că este posibilă schimbarea conformatiei ADN in vivo şi că aceasta poate fi
importantă în exprimarea genică. Astfel, transcripţia ADN are loc, probabil, la joncţiunea
dintre ADN-B şi ADN-Z unde are loc desfacerea helixului.
ADN este format din două catene în care nucleotidelele sunt hibridate 2 câte 2 pe
bază de complementaritate pe toată lungimea, prin legături de H, AT, GC. Pentru ca toate
nucleotidele să se poată hibridiza trebuie ca ordinea în care se leagă să fie complementară
catenei opuse. Bazele azotate legate prin legături de H se orientează spre interior în timp ce
ribozele şi acizii fosforici hidrofili sunt orientaţi spre exterior.
 Fig. 2.16 Tipuri de ADN.

Se formează o secvenţă complementară secvenţei originale. Datorită enzimelor

specfice o secvenţă de acid nucleic zisă „originală” este capabilă de a dirija sinteza unei
secvenţe de acid nucleic complementară (14, 42, 46, 52, 67).
În al doilea rând această secvenţă complementară izolată va fi de asemenea capabilă
să dirijeze sinteza secvenţei originale care îi este complementară (Fig. 2.17).

Fig. 2.17. Complementaritatea bazelor azotate

Se denumesc nucleotidele prin A, C, G şi T în funcţie de bazele azotate care le conţin

şi se poate astfel citi un text.
 Fig. 2.18. Complementaritatea purină-pirimidină sau pirimidină-purină

Complementaritatea purină-pirimidină sau pirimidină-purină conferă structurii

helicoidale bicatenare a ADN o formă filiformă regulată cu un diametru constant de-a lungul
întregului traiect (fig.2.18). O împerechere purină-purină sau pirimidină-pirimidină ar face ca
dublul helix ADN să prezinte de-a lungul său neuniformităţi, regiuni cu diametru mai mare
(purina-purină) sau mai mici (pirimidină-pirimidină). Ar apărea astfel distorsiuni neregulate,
care ar împiedica funcţionarea normală, ceea ce nu se întâmplă în condiţii normale. Planurile
bazelor azotate sunt perpendiculare pe axa fibrei. Fiecare spiră a dublului helix cuprinde câte
10 perechi de nucleotide (fig. 2.19).

Fig. 2.19 Dublu helix- structura secundară a ADN

Cele două catene se pot disocia la căldură. Structura bicatenară a ADN prezintă de
regulă o mare stabilitate fizică la temperatura camerei, asigurată de:
- punţile fosfodiesterice intracatenare, pe verticală între dezoxiriboze;
- legăturile de H, pe orizontală, intercatenare, între bazele azotate;
- forţe de stivuire (staking) a perechilor de baze azotate în cadrul dublului helix.
În cadrul dublului helix ADN, din înfăşurarea relaţională a celor două catene rezultă o
alternanţă regulată de ferestre minore şi majore, astfel că la acelaşi nivel al dublului helix, o
adîncitură minoră de pe o parte corespunde cu una majoră de pe cealaltă parte numite şi
„ferestre” (fig.2.20).
 Fig. 2.20. Ferestre minore şi majore.

Aceste ferestre reprezintă zone de interacţiune cu diferite proteine (ARN polimeraza),

agenţi de intercalare de tip bromură de etidiu sau situsuri de inserţie a profagilor.
Compoziţia de baze azotate este specifică fiecărei specii. Secvenţa de baze azotate din
ADN reprezintă forma în care informaţia genetică este înscrisă în macromolecula de ADN,
aceste secvenţe codificând o anumită proteină.
Dublul helix în secţiune transversală prezintă bazele azotate paralele între ele,
nucleotidele acestora fiind aşezate ca farfuriile, stivuite în interiorul dublului helix (fig. 2.21).

Fig. 2.21. Dezoxiribozele şi fosfaţii orientaţi spre exterior.

Nucleotidele complementare nu sunt diametral opuse, axul helixului este gol (Fig.
2.22).
 Fig. 2.22. Bazele azotate orientate către interiorul dublului helix.

2.8.1 Condensarea şi hidroliza nucleotidelor

Creşterea lanţului de acizi nucleici se face totdeauna prin extremitatea 3′ OH
terminală a acidului nucleic. Condensarea se face pornind de la un substrat activat – o
nucleotidă trifosfat. Hidroliza ultimilor doi fosfaţi va furniza energia necesară condensării.
Nucleotida monofosfat rămasă va fi esterificată printr-o funcţie acidă a fosfatului cu funcţia
alcool eliberată din carbonul 3′ al ribozei.
Va fi eliberată o moleculă de apă.
Invers adăugarea unei molecule de apă pe această legătură ester va produce o reacţie
de hidroliză care va detaşa ultima nucloetidă şi va elibera C3′ a nucleotidei precendente (fig.
2.23).

Fig. 2.23 Condensare şi hidroliza nucleotidelor.

 2.9 Acidul dezoxiribonucleic (ADN)

Un comportament caracteristic doar nucleului celulelor eucariote, este asocierea unor

proteine mici , bazice cu ADN, numite histone. Patru din cele cinci tipuri se grupează în
perechi pentru a forma octamerul histonic, în jurul căreia se înfăşoară ADN.Această structură
se numeşte nucleozom.
ADN este protejat de către proteine atunci când nu se realizează transcripţia sau
replicarea genelor. Această protecţie se face prin rulare în jurul proteinelor bazice (cationice)
capabile de a se lega cu ADN care este un complex de polianioni. Octomerul histonic
prezintă în jur ADN rulat, care realizează două ture în jurul lui. ADN format din 146-166
perechi de baze (fig. 2. 24).

Fig. 2.24 Nucleozomul (21, 97).

Octamerul histonic conţine câte două molecule din fiecare tip de histonă: H2A, H2B,
H3 şi H4. Nucleozomii core sunt conectaţi între ei prin segmente de ADN formate de 20-100
pb şi care reprezintă regiunile de legătură denumite ADN linkeri. La punctul de intrare şi
ieşire ADN se asociază cu o altă histonă H1, situată în afara octamerului. Ea este asociată
atât cu nucleozomul, cât şi cu segmentul ADN linker şi are rol în stabilitatea nucleozomului.
O endonuclează poate digera ADN linker dintre perle şi detaşa particule de 11 nm,
nucleozomii (Fig. 2.25).

Fig. 2.25. Structura nucleozomului (91).

Nucleozomul este o formă de organizare a cromatinei. Celulele umane conţin

aproximativ 3x107 nucleozomi.
Nucleozomii legaţi prin intermediul linkerilor asemănător unui „şirag de perle”
realizează o structură compactă, cu un diametru de 250-300nm numite „fibre groase” care
conţin aproximativ 45000 pb (fig 2.27).
 Fig. 2.27. Fibre de cromatină (46).

Studiile fizico-chimice sugerează că aceste fibre groase se formează printr-o

împachetare helicoidală (a 6-9 nucleozomi), care se rulează pe ele însele şi formează un
solenoid (fig. 2.28). În această structură împachetarea creşte foarte mult.

Fig. 2.28. Organizarea cromatinei in diverse trepte până la stadiul de cromozom în metafază (14).

Fibrele devin mult mai condensate, prin împachetări adiţionale, formând structuri mai
complexe denumite domenii (sau loops-uri) care cuprind 35000-90000 pb de ADN. Acest tip
structural de cromatină este bine legat de un suport structural din nucleu, denumit matrix
nuclear sau scaffold care suferă la rândul lui împachetări şi structurează cromozomul din
metafază.

Proprietăţile fizice ale ADN

Denaturarea ADN poate fi termică şi chimică.

Denaturarea termică. Peste anumite limite de temperatură (63-100ºC) stabilitatea
legăturilor de H cedează, astfel se desface dublul helix în cele 2 catene polinucleotidice,
complementare, fenomen numit denaturarea termică; ADN trece de la condiţia de dublu
catenar la cea monocatenară însoţită de reducerea vâscozităţii soluţiei ADN.
Denaturarea este de obicei efectuată experimental prin încălzire. Temperatura la care
50% dintre catene sunt separate se numeşte temperatură de topire (Tm).
Aspectul curbei de denaturare a ADN ne permite să concluzionăm conţinutul în
perechi de baze azotate având în vedere că perechile A-T cu 2 punţi de H denaturează mai
uşor decât perechile G-C între care sunt 3 legături de hidrogen. Timpul de topire creşte
odată cu creşterea conţinutului G-C, fapt evidenţiat de ADN diferitelor specii de bacterii, al
căror conţinut G-C variază între 20-80%.
Denaturarea chimică. Pentru denaturare se pot utiliza şi alcalii. La pH mare
încărcătura multor gene angajate în formarea legăturilor de H se schimbă. Astfel bazele pierd
capacitatea de a forma legături de hidrogen. La pH mai mare de 11,3-12 toate legăturile de
hidrogen sunt rupte şi ADN este complet denaturat. În tehnicile de bandare cromozomială se
utilizează denaturarea cu alkali, ADN fiind destul de rezistent la hidroliza alcalină .
Dacă amestecul se răceşte brusc, monocatenele rămân permanent separate şi ADN se
numeşte denaturat. Când o soluţie de ADN este supusă unor temperaturi mai mari de 100ºC
are loc ruperea legăturilor fosfodiesterice, cu destrămarea coloanei glucido-fosforice .
Denaturarea ADN este însoţită de efectul hipercromatic, adică de creştere a intensităţii
absorbţiei razelor UV de către bazele azotate expuse la exterior. Bazele azotate sunt
cromofile şi hidrofile.
Pentru a preveni reasocierea monocatenelor (după o denaturare completă la 90º) prin
împerecheri de baze se păstrează ADN denaturant la concentraţii saline mari la temperatura
camerei (14, 42, 46, 52, 67, 69).

Fig. Denaturarea şi renaturarea ADN (97).

Renaturarea
Renaturarea reprezintă refacerea structurii native, dublu catenară a ADN, pornind de
la monocatene separate prin denaturare.
Pentru renaturare sunt necesare două condiţii:
- concentraţia salină trebuie să fie suficient de mare pentru a înlătura repulsia
electrostatică dintre fosfaţii celor două catene polinucleotidice (se utilizează 0,15-0,5
M NaCl).
- temperatura trebuie să fie cu 20-25ºC sub valoarea temperaturii de topire, şi are rolul
de a elimina legăturile de hidrogen intracatenare apărute la întâmplare (randomizat)..
In urma filtrării o soluţie de ADN renaturat are şi monocatene rămase nesociate. Prin
utilizarea filtrelor de nitroceluloză, ADN renaturat trece, pe când monocatenele sunt reţinute
de filtru putând fi măsurată astfel fracţia de ADN care a renaturat.
Renaturarea ADN este însoţită de efectul hipocromatic deoarece prin refacerea
structurii dublu catenare, bazele azotate se află spre interiorul structurii bicatenare. Dacă
denaturarea începe de la nivelul unor sectoare ale dublului helix ADN bogate în A-T,
renaturarea este iniţiată în sectoarele bogate în G-C mai stabile. Aceste sectoare la nivelul
cărora se iniţiază renaturarea se numesc centre de nucleaţie sau de renaturare.
Denaturarea şi renaturarea acizilor nucleici sunt procese fizice folosite pentru studiul
relaţiilor filogenetice dintre specii fie in tehnologia ADN recombinant. Speciile înrudite
filogenetic au secvenţe de baze azotate cu un grad mare de similitudine şi prezintă
temperaturi apropiate de denaturarea ADN, realizând o renaturare mai rapidă a
monocatenelor amestecate.
Renaturarea este un proces mult mai lent decât denaturarea în urma căreia ia naştere o
structură bicatenară hibridă.
Procentul de renaturare între monocatene de ADN de la om si de la cimpanzeu este de
aproximativ 90% pe când cel dintre ADN uman şi de şoarece este de 25%.
În tehnologia ADN recombinant, hibridarea moleculară ajută la stabilirea exactă şi
rapidă a transferului unei gene eucariote în celula bacteriană prin folosirea sondei
moleculare. Aceasta este o monocatenă de ADN sau ARN marcată radioactiv sau
neradioactiv şi care este complementară segmentului genei eucariote transferate. Dacă are
loc asocierea sondei moleculare cu un segment ADN extras de la celula bacteriană în care a
fost clonată gena eucariotă înseamnă că transferul acestei gene în celula bacteriană a fost
eficient.
Totodată prin hibridări moleculare ADN-ARN se poate realiza cartarea genelor
răspunzătoare de sinteza ARN prin hibridarea „in situ” adică fără extracţie de ADN,
denaturarea acesteia realizându-se la nivelul cromozomilor, în preparate citologice, pe lame
microscopice. Aceste preparate sunt incubate cu molecule de ARN ribozomal, de un tip dat,
marcate şi aflate într-o soluţie salină corespunzătoare. Monocatenele ARN se vor uni pe bază
de complementaritate cu un segment dat al monocatenelor ADN pe care se află gena pentru
acel tip de ARN ribozomal. După spălarea preparatelor, pentru a îndepărta restul de
monocatene ARN rămase neasociate, pe aceste lame se aplică emulsie fotografică, se
incubează la întuneric spre a realiza impresionarea, se developează şi se analizează la
microscop. Zona unde a avut loc hibridarea ADN-ARN, la nivelul cromozomului, este
marcată prin urme de argint fiind localizată astfel gena pentru tipul ARN, folosit în
hibridare. Prin astfel de modele de hibridare se pot localiza poziţia altor gene, folosind alte
tipuri de ARN, cum ar fi ARN solubil şi ARNm. De exemplu, folosind în hibridare ARNm
purtător al mesajului genetic pentru sinteza insulinei (ARN nu poate fi extras uşor din
celulele pancreasului endocrin) aceasta se poate localiza pe cromozom la poziţia genei
pentru insulină (14, 31, 42, 52, 67).

2.10.3 Respiraţia şi absorbţia ADN

ADN este o structură dinamică în care regiunile bicatenare se deschid frecvent spre a
forma ochiuri sau bucle monocaternare. Acest fenomen se numeşte respiraţie ADN şi-i
permite acestuia interacţiunea cu diferite proteine spre a-i fi citită informaţia codificată.
Respiraţia apare mai frecvent în regiunile bogate în perechi A-T decât în cele cu G-C,
deoarece perechile A-T sunt mai uşor de denaturat fiziologic. Nu întâmplător la nivelul
originii replicării perechile A-T sunt foarte frecvente.
Absorbţia reprezintă capacitatea unei soluţii ADN de a absorbi lumina UV. Bazele
acizilor nucelici absorb lumina UV de 260 nm.

2.11 ADN mitocondrial

Furnizează energie prin fosforilare oxidativă. Conţin propriul lor ADN diferit de ADN
nuclear, este extracromozomial. ADN mitocondrial este dublu catenar de 16,5 kb circular,
codant pentru 13 subunităţi proteice, constituind 4 complexe biochimice şi 24 molecule de
ARN structural (2 ARNr şi 22 ARNz) indispensabil pentru transducţia mitocondrială a
proteinelor. ARNm este independent de ADN nuclear. Replicarea, transcripţia şi transducţia
este independentă de a ADN nuclear. El codifică proteinele care participă la fosforilarea
oxidativă, necesare funcţionării şi structurii mitocondriale. Aceste proteine (codificate de
gene nucleare) sunt produse în citoplasmă înainte de a ajunge în mitocondrie. Există o
interelaţie ADN nucelar – ADN mitocondrial.
Caracteristicile ADN mitocondrial:
- nu are introni
- are un repertoriu de mutaţii de 10 ori mai mare decât ADN nuclear. Nu are sistem
de reparaţie, nici histone care să protejeze ADN
- are un mare polimorfism genetic
- este transmis de la celula mamă
- nu se recombină
- fiecare mitocondrie conţine 2-10 molecule de ADN
- fiecare celulă conţine numeroase mitocondrii... mii
- în aceeaşi mitocondrie poate coexista ADN normal şi mutant, fenomen numit
heteroplasmie
- prezenţa doar a ADN normal sau numai a ADN mutant, se numeşte homoplasmie
- în cursul replicării proporţionale a ADN normal şi a celui mutant în
heteroplasmie, ADN poate fi modificat în celulele fiice ca urmare a repartiţiei la
întâmplare.

2.12 Acidul ribonucleic -ARN

Pentru a forma ARN nucleotidele GMP, AMP, UMP, CMP sunt condensate prin
legături fosfodiesterice între C3′ a primei nucleotide şi 5′ a nucleoditei următoare.
Prima nucleotidă a lanţului polinucleotidic poartă pe carbonul 5′ al ribozei, un fosfat,
a cărui funcţie acidă nu este esterificată. Aceasta este extremitatea 5′ fosfat terminală a
acidului nucleic este desemnată convenţional ca începutul secvenţei (fragmentului) de acid
nucleic. Ultima nucleotidă a lanţului poartă o funcţiune alcool pe C3′ a ribozei
neesterificată. Aceasta este extremitatea 3′ OH terminală a acidului nucleic descrisă
convenţional ca sfârşitul fragmentului de acid nucleic. Aceste legături definesc sensul
moleculei.
 Fig. 2.29. Extremităţile 3′ -5′ ale acidului ribonucleic (97).

După funcţie se disting mai multe tipuri de ARN:

ARNr–acid-ribonucleic ribozomal (82 %) intră în structura ribonucleotidelor
ribozomilor alături de proteine (fig. 2.29). Se cunosc două tipuri de ribozomi: de tip procariot
cu constanta de sedimentare 70S (subunitatea mică 30S, subunitatea mare 50S) şi eucariot de
80S (subunitatea mică 40S, subunitatea mare 60S). În funcţie de constanta de sedimentare se
distig următarele fracţiuni de ARNr:
-la procariote: ARNr 23S şi ARNr 5S în subunitatea mare şi ARNr 16S în
subunitatea mică;
-la eucariote, ARN 18S intră în structura subunităţii mici a ribozomilor;
-ARN 28 S, ARN 5,8 S şi ARN 5S structurează alături de proteine subunitatea mare a
ribozomilor. Ribozomii sunt implicaţi în sinteza proteinelor.
ARNt –Acid ribonucleic de transfer (16 %) transportă aminoaiczii activaţi pentru
transducţie.
snARN (< 1 %) ribonucleoproteine mici nucleare ARN structurează particula de
recunoaştere a proteinei- semnal. Altele, mai puţine, participă la structura diferită a
ribonucleoprotidelor responsabile de excizie a intronilor, legarea sau matisarea exonilor, în
procesul de maturare a transcriptului primar din timpul transcripţiei şi de selecţie a
poliribozomilor pentru sinteza proteinelor semnal, orientarea proteinelor sau altor
activităţi enzimatice, metabolice.
ARNm- Acid ribonucleic mesager(2%) realizează transcripţia genei purtătoare de
informaţie pentru a fi tradusă (reprezintă o copie a genei) şi este modelul pentru dirijarea
transducţiei. Prin intermediul ARNm ribozomii primesc informaţia pentru sinteza proteinelor.
Alte molecule sunt coenzime transportoare de aminoacizi;

Fig. 2.30 Ribozomii la procariote şi eucariote (97).

2.12.1 Diferenţele dintre ARN şi ADN

Diferenţele dintre ARN şi ADN sunt:

- ARN este mai scurt, are 70-100 000 nucleotide;
- conţine riboză în loc de dezoxiriboză (ADN);
 - uracilul înlocuieşte timina din ADN.
ARN este monocatenar. Totuşi în unele regiuni, pe distanţă scurtă, monocatenele sunt
unite prin legături de H pe bază de complementare, deci devine bicatenar şi formează
structura secundară a ARN. Un exemplu tipic este structura în formă de frunză de trifoi a
ARNt (fig. 2.31).

Fig. 2.31 Structura secundară a ARN (46).

Structura secundară a ARN este prezentată şi în fig 2.32. Lanţul monocatenar

formează următoarele structuri: agrafă de păr, buclă multiplă, pseudonod, buclă interioară,
tulpină (stem).

Fig. 2.32. Structura secundară a ARN (102).

3. GENA
Genomul uman este constituit din 3,5 miliarde de perechi de nucleotide sau perechi
de baze (pb). Gena este estimată între 50000 şi 100000pb şi nu reprezintă decât 3-5% din
acest ansamblu. Restul de ADN este constitut din secvenţele de reglare a expresiei genei,
secvenţe repetitive şi secvenţe cu funcţii necunoscute.
Varianta nepatologică a genomului este polimorfismul
La om, între 2 indivizi există mici variante de secvenţe estimate între 1 şi 2%
considerate ca nepatogene şi numite gene de polimorfism (exp. de polimorfism, culoarea
ochilor: bleo, maron, verde). Acest polimorfism genotipic se poate găsi în regiuni codante şi
necodante ale unei gene. În cursul studiilor de patologie (maladii genetice, cancer) sau în alte
cazuri (epidemiologie bacteriană) astfel de secvenţe specifice pot servi ca markeri genetici
(2,14, 25, 26, 36, 44, 49 67).
 Fig. 3.1 Alele (104).

Un polimorfism constă într-o diferenţă purtată de o singură nucleotidă între 2 secvenţe

ale aceleeaşi perechi de cromozomi (de exp. A pe o alelă şi G pe o altă alelă). Vorbim deci de
polimorfism alelic a unei singure nucleotide (SNP).
Polimorfisumul, este dat de secvenţe scurte, repetate, a unui număr mai mic sau mai
mare baze care pot varia pe fiecare din cei 2 cromozomi, numărul repetiţiilor poate să nu fie
identic. Numărul de variaţii ale secvenţelor poate să nu fie aceleaşi între 2 indivizi diferiţi
(fig. 3.2 ).

Fig.3.2 Polimorfisumul alelic dat de secvenţe scurte, repetate.

Se vorbeşte deci de un polimorfism multialelic în care se disting după talia lor:

- secvenţe scurte repetate STRs (short tandem reapeats)– acestea sunt 2, 3, 4 şi 5
nucleotide de exp. [AC]n’ = 5’AC AC AC repetare de n ori; numărul lor este estimat între
50000 şi 100000 copii în genom;
- secvenţe repetate în tandem în număr variabil sau VNTRs (variabile number of
tandem repeats). Printre aceste secvenţe VNTRs se pot distinge şi secvenţe repetate scurte
de mai puţin 500 pb SINEs (short interopersed repetitive nucleotides elements).
O secvenţă particulară din cadrul SINEs este secvenţa Alu. Secvenţele Alu sunt
repartizate în genom la nivelul intronilor.
 Fig. 3.3 Secvenţe repetate în tandem.

Secvenţă Alu, este considerată de 4 kb- 5 kb. Aşa se face că secvenţa Alu este
repartizată în grupe separate prin câteva sute de baze de ADN numite non Alu. Aceste
secvenţe sunt compuse din 2 părţi omoloage dreapta şi stânga, distincte, derivate din gena
ARN 7SL. În anumite cazuri, aceste secvenţe sunt responsabile de mutaţii sau de modulare a
expresiei genelor;
- secvenţe mai lungi de câteva milioane de pb (în jur de 6-7 kb) sau LINEs (long
interpersed repetitive nucleotides elements);
- ADN satelit α şi β. Sateliţii α, prezenţi la nivelul centromerilor sunt secvenţe
repetate în tandem de 171 pb constituie între 1-3% din cromozomi. Sateliţii β sunt secvenţe
repetate în tandem de 68 pb situate în cromatina cromozomilor 9 şi a celor acrocentrici.

3.1 Structura genei

Secvenţele de nucleotide ADN conţin informaţia necesară pentru sinteza ARNm şi

ulterior a unei proteine.
În secvenţa genei se disting :
-secvenţe în amonte –reglatoare care structurează promotorul,
- un situs de iniţiere al transcripţiei, sau „start point” notat cu +1, locul unde este
încorporat primul nucleotid de unde începe transcripţia
-o succesiune variabilă de exoni şi introni.
În general intronii nu există la virusuri şi bacterii. Ei sunt prezenţi doar la
eucariote. intronii conţinând eventual alte secvenţe reglatoare şi în sfârşit
-ultimul exon sau terminator unde se termină transcripţia.
 Fig.3.4 Structura genei şi expresia ei.

Ansamblul mecanismelor care stau la baza secvenţelor genei conduc la producerea

unui acid ribonucleic sau a unei proteine desemnate prin termenul de expresia genei.
Promotorul este situat în amonte de genă, în poziţia 5', are între 800 şi 1000 pb. El nu
este transcris şi tradus, intervine în iniţierea transcripţiei şi orientarea direcţiei în care
aceasta se va derula, secvenţe consens pentru situl de fixare a ARN polimerazei II şi a unui
capişon pe ARNm indispensabil pentru transducţia sa ulterioară.
În poziţia 3' a genei pe ultimul exon, se află unul din 3 codoni STOP TAA, care se
continuă cu o secvenţă de poliadenilare AAAAA care va semnala oprirea transducţiei la
nivelul ribozomilor. Coada de poliadenilare este situată în aval de codonul STOP, secvenţă
care nu va fi tradusă. Ea reprezintă un sit de recunoaştere a ARNm primar şi este
indispensabilă pentru stabilitatea ARNm. Pot exista mai multe situri de poliadenilare
corespunzătoare mărimii diferite a ARNm. Ele sunt specifice ţesuturilor.
Există gene care se exprimă în toate ţesuturile (ubicvitare sau gene de menaj) sunt
conţinute constant în aceeaşi regiune. Acestea, conţin secvenţe bogate în GC (5'GGG CGG3')
pe care se fixează factori de transcripţie SP1. Factorii proteici numiţi şi factori de
transcripţie interactivă prezintă secvenţe reglatoare care modulează expresia genei.O genă
poate avea mai muţi promotori. Unii promotori pot fi specifici ţesuturilor (2, 14, 26, 36, 44,
46, 49, 67).

3.2 Secvenţa unei gene apoA II

Apolipoproteina apoA este componenta proteică a oricărei lipoproteine, în special a

celor plasmatice. Ea este proteină asociată lipoproteinelor cu densitate mare (HDL) şi
realizează stabilizarea acestora.
Scrierea pe bază de litere ACGT în ordinea în care se întâlnesc nucleotidele pe un lanţ
ADN de la extremitatea 5′ -3′ duce la un text indescifrabil. Suportul acestui text astfel
transcris conţine toată informaţia necesară pentru sinteza unei proteine apolipoproteina AII.
Ansamblul informaţiei genetice transcrisă este de 3 miliarde de litere (o biblioteca de 7000
cărţi cu 300 pagini fiecare).

Fig. 3.5 Secvenţa unei gene (apoA-II) (46).

 Proteinele implicate în transcripţie se vor fixa pe lanţurile dublului helix ADN, pentru
transcripţia unor secvenţe specifice şi va permite expresia informaţiei .

3.3 Expresia unei gene

Expresia unei gene este o succesiune de sinteze chimice care conduc la producerea
unei proteine. În prima etapă are loc sinteza ARN premesager sau ARN precursor (denumit şi
ARN heterogen sau Hn-ARN). Secvenţa de ARN premesager este complementară catenei
antisens a genei, deci identică catenei sens şi este orientată în aceaşi direcţie cu aceasta (Fig.
3.6).
După reacţii de maturare a transcriptului primar ARN devine ARNm şi trece din
nucleu în citoplasmă. Ulterior ARNm este citit de un grup de câte 3 nucleotide de la 5′ la 3′
şi are loc sinteza proteinelor de către ribozomi. Cuplarea aminoacizilor se realizează de la
extremitatea NH2 terminală către extremitatea COOH terminală. După reacţia de maturare
proteina matură este gata să-şi îndeplinească funcţia în celulă (fig. 3.6).

Fig. 3.6. Expresia unei gene (46).

3.4 Transcripţia
Sinteza ARNpremesager este catalizată de ARN polimeraze, ADN-dependente,
utilizând catena antisens ca matriţa ADN. ARN polimeraza ataşează nucleotid trifosfaţi ca
substraturi care polimerizează în direcţia 5'-3', asemănător ADN polimerazelor (fig. 3.7).
Numai un singur lanţ al dublului helix ADN, complementar catenei sens este utilizat ca
matriţă. Întrucât dubla catenă a ADN este conservată, sinteza ARN este descrisă ca fiind
conservativă şi asimetrică (se produce numai un lanţ polinucleotidic).

Fig. 3.7 Prima etapă a transcripţiei, ataşarea ARN polimerazei de promotor (97)
 Secvenţa de baze a ARN sintetizat va fi identică faţă de catena codificatoare, cu
menţiunea că uracilul înlocuieşte timina. ARN polimerazele sunt enzime multisubunitare
mari şi complexe, care au capacitatea de a identifica locul în care este iniţiată sinteza ARN pe
matriţa ADN. Spre deosebire de ADN polimeraze, ARN polimerazele nu au nevoie de
amorsă. Cele două catene de ADN se separă la locul de iniţiere a transcripţiei.

Fig. 3.8 Derulerea transcripţiei (97).

Atunci când ARN polimeraza ajunge la terminator se va desprinde

ARNpremesager, dublul helix se reface şi ARNpolimeraza se desprinde de ADN(fig 3.9).

Fig. 3.8 Terminarea transcripţiei.

Nucleii celulelor eucariote conţin 3 tipuri distincte de ARNpolimeraze:

-ARN polimeraza I este localizată în nucleoli, unde se găsesc genele ribozomale şi
catalizează sinteza precursorilor majorităţii moleculelor de ARNr 18S, 5, 8S, 28S;
-ARN polimeraza II este localizată în nucleoplasmă şi catalizează sinteza
precursorilor ARNm şi a unor snARN (ribonucleoproteine mici). Ea este inhibată specific de
toxic extras Amanite phalloide, α amanitină.
-ARN polimeraza III este localizată în nucleoplasmă şi catalizează sinteza
precursorilor moleculelor ARNr, 5S şi o varietate de mici fragmente de ARN nucleari şi
citoplasmatici (ARNt, , snARN, 7SL-ARN) (14, 25, 26, 36, 44, 46).

Promotorul apolipoproteina AII

Ultima linie a fig. 3.10 este secvenţa primului exon a genei apolipoproteinei AII. Cele
900 nucleotide care o preced conţin numeroase secvenţe recunoscute de proteine care permit
începerea transcripţiei sau reglarea acestei etape şi formează promotorul.
Porţiunea de ADN care va fi transcrisă se numeşte unitate de transcripţie. Aceasta
este delimitată de promotor, urmat de un punct de iniţiere sau „start point” notat cu +1,
unde începe transcripţia şi un terminator unde se termină (Fig. 3,10).
 Fig. 3.10 .Secvenţa unui promotor (46).

.Nucleotidul aflat dinaintea situsului start este notat cu -1. Acesta se referă la
catena sens, nu la catena matriţă. Catena sens are aceeaşi secvenţă ca şi catena ARNm
(doar că T este înlocuită cu U). Promotorii pentru fixarea ARN polimerazei sunt pe latura
5' a startului (în amonte de situsul start).
Secvenţa aflată înaintea punctului start, se numeşte din amonte, iar cea de după
punctul start, în aval.
Promotorului i se disting următoarele secvenţe:
-secvenţă numită caseta TATA(sau domeniu) , care este recunoscută specific prin
proteinele TPB ca subunităţi ale TFIID, cofactor al ARN polimeraza II;
-secvenţe sau casetă CAAT şi GG box, pe care vin să se fixeze alte proteine de
transcripţie CTF şi SP1 (fig. 3.11).
Genele apolipoproteinei AI şi AIII care sunt vecine şi sunt situate pe cele două lanţuri
ADN de la stânga la dreapta şi de la dreapta la stânga.
Transcripţia se face sintetizând ARNpremesager de pe secvenţa lanţului antisens,
deci identic cu catena sens.

Fig. 3.11. Catenă sens şi antisens (46).

3.6 Modularea activităţii promotorilor

Activităţile multor promotori sunt amplificate de către secvenţe de ADN numite
enhanceri sau activatori, situaţi la distanţă, până la câteva sute de perechi de baze de
promotor (fig. 3.12). Legarea poate fi la capătul 5' în amonte, sau 3'(în aval) şi chiar în
interiorul genei, într-un exon sau intron. Funcţia lor este independentă de poziţie şi orientare.
Asemenea amplificatori sunt recunoscuţi de proteine specifice denumite factori de
transcripţie care stimulează legarea ARN polimerazei de un promotor vecin. Fiecare
enhancer conţine cel puţin un sit de fixare pentru un factor de transcripţie. În general sunt
mai multe situsuri pentru factorii de transcripţie care acţionează sinergic.

Fig. 3.12 Modularea activităţii promotorului (7)

Enhancerii sunt secvenţe care stimulează expresia genei. Faptul că amplificatorii

sunt aşezaţi la distanţă (considerând ADN liniar) faţă de promotorii pe care îi controlează
este explicat pe baza foldingului (împachetării sau plierii) ADN. Ia naştere o structură terţiară
care aduce cele 2 elemente în poziţii apropiate (3.13).

Fig. 3.13 Enhancerii sau activatorii.

Silancerii. Aceaste secvenţe diminuă sau inhibă expresia genei. Sunt localizaţi adesea
între promotori şi enhanceri, numiţi şi antienhanceri.
Factori care acţionează în transcripţie. Sunt proteine care acţionează asupra ADN
prin inhibarea parţială sau totală a receptorilor transcripţiei.
Rolul cromatinei. Este un ansamblu complex care constituie asocierea ADN-ului cu
proteine histonice şi nehistonice.
Enzima cheie pentru transcripţia genelor proteinelor structurale este ARNpolimeraza.
Promotorii recunoscuţi de această enzimă sunt mult mai mari şi mai diverşi (1, 14, 25, 26, 36,
44, 46, 49, 67).
 3.7 Operonul lac

În timp ce toate celulele unui individ au acelaşi ADN, natura proteinelor sintetizate de
celule diferenţiate variază atât la celulele eucariote, dar şi la bacterii (determinate de
schimbări nutriţionale şi de mediu). Cea mai frecventă cale de sinteză proteică diferenţiată se
face prin controlul transcrierii ADN pentru producerea de ARNm.
Prima demonstraţie a controlului transcrierii a fost făcută de Jacob şi Monod pentru
operonul lac. Un operon este definit ca un grup de gene adiacente care structurează
promotorul, operatorul şi gene structurale care sunt transcrise într-un singur ARNm.
Operonul controlează transcrierea ARNm pentru 3 proteine. Segmentul de ADN care
conţine toată informaţia pentru producerea unui singur polipeptid este numit cistron şi
operonul lac iar ARN-ul policistronic.
Sinteza proteică specifică unui segment de ADN în operonul lac arată modul general
de acţiune şi controlul transcripţiei în toate tipurile de celule. Operonul lactozei este format
din operator care include şi promotorul, şi trei gene structurale. În amonte de operator sunt
situate gene reglatoare care sintetizează proteine represoare (fig. 3.14). Când în celule lactoza
este absentă proteinele represoare se ataşează la operator iar promotorul realizează o buclă, îşi
modifică configuraţia şi nu permite transcripţia genelor structurale. Genele sunt astfel blocate
transcripţiei (14, 36, 44, 49).

Fig. 3.14 Genele sunt blocate transcripţiei (7).

Atunci când lactoza este prezentă, bacteriile convertesc lactoza în alolactoză care se
leagă de represor. Funcţia acestuia din urmă este alterată, eliberează promotorul operatorului
şi este permisă transcripţia genelor structurale (fig. 3,15).

Fig. 3,15 Prezenţa lactozei permite transcripţia genelor structurale.

Vor fi sintetizate 3 enzime β galactozidaza, permeaza şi transacetilaza care

degradează lactoza având un rol important în metabolismul lactozei.
Întrucât starea normală este aceea în care operonul lac este inhibat, fenomenul descris
este cunoscut ca şi control negativ.
Operonul lac poate realiza şi un control pozitiv. Astfel AMPciclic (cAMP) se leagă de
o proteină de activare a genei catabolit (CAP) şi complexul format stimulează transcripţia
prin intensificarea legării ARNpolimerazei la promotor (fig. 3.16).
 Fig. 3.16 Controlul pozitiv al operonului lac.

Glucoza este sursa preferată de energie şi în prezenţa sa sunt cantităţi mici de β

galactozidaza formată şi alte enzime catabolice, ceea ce explică fenomenul de represie a
catabolismului. Prezenţa glucozei determină scăderea concentraţiei cAMP şi prin urmare se
reduce controlul pozitiv menţionat mai sus (2, 14, 25, 26, 36, 44, 49).

3.8 Controlul sintezei proteice la eucariote

În majoritatea ţesuturilor, toţi ribozomii sunt legaţi de ARNm şi sunt implicaţi în
sinteza proteică. În anumite ţesuturi, cum este glanda mamară la animale gestante, unii
ribozomi nu sunt asociaţi cu ARNm. Activitatea de sinteză proteică a unei celule poate, prin
urmare, să fie schimbată, fie prin formare de poliribozomi din ribozomii existenţi fie prin
producerea de poliribozomi adiţionali. În situaţia în care sinteza unei anumite proteine este
schimbată este cunoscută ca şi control specific.
Sinteza proteică la eucariote poate fi controlată pe căi multiple. Astfel structura
cromatinei suferă schimbări probabil datorate modificării histonelor în nucleozomi.
Este dovedit deja contolul nivelului traducerii prin fosforilarea factorilor de iniţiere. În
acest caz controlul primar este la nivelul transcripţiei. Aşa cum s-a descris pentru
operonul lac, acest control specific este făcut de către porţiunea în amonte a ADN faţă de
situsul de transcripţie şi prin prezenţa multor proteine diferite. Enzima cheie în transcripţia
genelor pentru proteine structurale este ARN polimeraza II. Promotorii recunoscuţi de această
enzimă sunt mult mai mari şi mai diverşi decât cei ai operonului lac.
Factorii care sunt produşi ai genelor, altele decât cele pe care ei le controlează, sunt
denumiţi factori trans-activatori. În organisme superioare acest fenomen nu are loc întrucât
nu sunt ARN policistronici şi genele individuale sunt transcrise în ARN monocistronici
individuali codificând proteine singulare. Astfel trebuie să existe alte căi de coordonare,
mai ales că adesea, genele implicate sunt pe cromozomi diferiţi. În acest fel, producerea
unei molecule de anticorp funcţional necesită sinteza de proteine imunoglobulinice cu lanţ
greu (H) sau uşor (L). În timp ce locusul lanţului greu H este pe cromozomul 14 la om,
genele lanţului uşor sunt pe cromozomii 2 şi 22. O situaţie similară există şi în cazul
hemoglobinei, unde familia α-globinei este pe cromozomul 16 la om, şi gena β-globinelor pe
cromozomul 11.
Antibioticul actinomicina D inhibă transcripţia prin legarea de matriţă, în timp ce
rifampicina o inhibă prin legarea de ARNpolimeraza.
La virusurile cu ADN dublu catenar, transcripţia va avea loc la fel ca în celulele
normale, de obicei utilizând ARNpolimeraza din nucleul celulei gazdă. O excepţie o
reprezintă virusul vaccinia care determină boala vărsatul vacilor (cawpox). În acest caz
replicarea are loc în citoplasma deoarece particulele virale posedă ARNpolimeraza
proprie. Dacă ADN viral este monocatenar, replicarea sa implică o formă replicativă
bicatenară, ADN viral fiind obţinut prin sinteza asimetrică numai a unei singure catene
din cele două.
 În anumite cazuri, genomul virusului este reprezentat de ARN, care apare în două
forme. Dacă ARN serveşte ca ARNm, este notat (+), polimeraza implicată este o proteină
formată din 4 subunităţi, numai una dintre ele este virus specifică, celelalte subunităţi fiind
oferite de către celula gazdă. Dacă ARN viral nu serveşte ca ARNm este notat cu -, celula
gazdă nu îl poate replica şi virionul trebuie să poarte o replică pentru a forma catene
(+) ce servesc ca ARNm. Exemple de astfel de virusuri: influenza, pojar, rabie.

3.9 Controlul transcripţiei prin hormoni

Mulţi hormoni îşi exercită efectele biologice prin legarea la receptorii de la suprafaţa
celulei care activează mesageri secundari cum este AMPc. Hormonii steroizi şi tiroxina
acţionează în mod diferit. Ei intră în celula ţintă şi se leagă de proteine receptor specifice din
citosol. Aceştia migrează în nucleu şi controlează transcripţia prin legare la ADN şi
controlează exprimarea a 50-100 de gene. Diferitele proteine receptor posedă o arhitectură
similară şi reprezintă o superfamilie, Ele conţin un domeniu înalt conservat de legare a ADN,
un domeniu de legare a hormonilor, un domeniu variabil N terminal care interacţionează cu
alţi reglatori ai transcripţiei. Când hormonul leagă receptorul, domeniul de legare al ADN
este blocat (1, 14).

3.10 Reglarea expresiei genelor

Sinteza ARNm se mai numeşte expresie genică, deoarece din molecula de ADN
reprezentând o genă, cand este activată se transcrie un ARNm pentru o proteină dată. Genele
din genomul celulelor eucariote sunt întrerupte de secvenţe care nu vor fi regăsite în secvenţa
proteinelor. Astfel unitatea transcriptibilă a genei la eucariote este formată din introni şi
exoni.
Reglarea întregii căi metabolice se face în principal de la prima reacţie pentru a nu
sintetiza intermediari inutili şi este legată de 4 nivele:
- transcripţia;
- maturarea transcriptului;
- transducţia;
- activarea proteinelor mature.
Punctul de control principal al transcripţiei este ARN polimeraza II, enzima cheie a
expresiei unei gene (Fig. 3,17).

Fig. 3.17
Reglarea expresiei genei (46)
 Secvenţe cis şi transreglatoare
Secvenţa nucleotidelor promotorului formează factorul cis reglator şi este recunoscută
printr-o clasă de proteine specifice, 8 factori transreglatori, a căror structură permite o
legătură cu ADN (ADN proteine de legătură).
Factorii transreglatori influenţeză viteza de transcripţie. Ei pot fi enhanceri cu rol
activator, sau pot fi inhibitori (secvenţe silencer). Legătura lor cu ADN depinde de
circumstanţe fiziologice care induc sau reprimă expresia genelor (3,18).

Fig. 3,18. Cis şi transreglatori (46).

Elementele esenţiale prezente în majoritatea genelor:

- caseta TATA ;
- factorul OCT1 prezent în aproape toate celulele;
- elemente care răspund la semnale care parvin la celule, în special hormoni ca insulina
sau mesagerii de ordinul II ca AMPc;
- elemente specifice tipului celular care permit expresia diferită a genelor în fiecare ţesut.
Astfel, promotorul lipoprotein- lipazei conţine TATA box, elemente de răspuns la hormoni şi
elemente de expresie tisulară specifice. În promotorul genelor există 20-30 situsuri pentru
factorii transreglatori din care majoritatea au efect inductor, sau represor asupra expresiei
unei gene (2, 14, 36, 44, 49, 67).

3.11 Recunoaşterea ADN de către proteine

Au fost identificate 3 motive sau domenii proteice importante care recunosc ADN:
motivul helix-turn-helix, proteină de tipzinc finger şi proteine leucine zipper (fig. 3.19).
 Fig. 3. 19 Proteine de legătură ADN.

• Primul descoperit, motivul sau domeniul helix-turn-helix este prezent în proteine care
leagă gene homeotice (cele care controlează planul arhitectonic al embrionului) în
proteine de structură, factori de transcripţie şi elemente transreglatoare. În structura
spaţială a acestor proteine se recunosc domenii proprii acestei legări specifice. Acest
motiv este format dintr-o regiune scurtă care seamănă cu un helix α urmată de un turn
β şi apoi un alt helix α. Domeniu helix-turn-helix, permite legarea specifică a
helixului α cu nucleotide în marele silon, în jur de 10 perechi de baze (fig. 3.20).

Fig. 3.20 Domeniu helix-buclă-helix (21, 97)

Motivul Zinc finger

• Acest motiv conţine o pereche de resturi de cisteină, urmată de aproximativ 12 resturi
de aminoacid şi o altă pereche de resturi de cisteină sau histidină. Perechile de cisteină
coordonează ionii de zinc, aşa încât ceilalţi aminoacizi formează o proeminenţă
finger. Fiecare deget de zinc se leagă cu 5 nucleotide în marele silon a ADN (fig.
3.21).

Fig.3,21 Amprenta Zinc (Zinc finger)

• Există adesea mai multe prelungiri de zinc în aceeaşi proteină.

Această structură este repetată de 9 ori în factorul de transcripţie TFIIIA (factor de
transcripţie pentru ARN polimeraza III), care se leagă de gena pentru ARN 5S, în ferestrele
mari ale helixului ADN. Acest model s-a găsit în câţiva factori de transcripţie ai ARN
polimerazei II.

3.12 Fermoarul de leucină

Factorul de transcripţie C/EBP, care este implicat în stimularea exprimării unor gene
specific hepatice, are o regiune de 35 aminoacizi, din care tot al 7-lea este leucina. O
asemenea structură a fost găsită în protooncogenele Myc, Fos şi Jun. Fermoarul (zipper)
leucină nu se leagă direct de ADN dar facilitează dimerizarea proteinelor din domenii
specifice, bogate în arginină şi lizină. Pentru a acţiona ca factori de transcripţie, proteinele
trebuie să dimerizeze fie ca homodimeri paraleli (de exp. Fos-Fos), fie ca heterodimeri (Fos-
Jun) (2, 14, 25, 26, 44, 49, 67).

3.13 Reglarea expresiei genelor în timpul hipoglicemiei

În cursul hipoglicemiei concentraţia glucozei în sânge diminuează. Creierul a cărui

nutrient major este glucoza reacţionează, determină secreţia de către hipofiză a unor factori
de stimulare, corticotrofine sau ACTH. Acestea provoacă secreţia unui hormon, de către
celulele din zona fasciculată a corticosuprarenalei, respectiv a cortisolului (Fig.3.22).
Cortisolul acţionează asupra ficatului şi se leagă de proteine specifice, receptorii
pentru cortisol. Aceste proteine leagă hormonii constituind factorii transreglatori.
Factorii transreglatori trec în nucleul hepatocitelor se leagă de ADN la nivelul
promotorului anumitor gene care au elemente cis reglatoare specifice: GRE (glucocorticoid
responsive element).

Fig. 3.22.
Reglarea hipoglicemiei

Legătura factorilor transreglatori (proteine+hormoni) pe secvenţa elementelor cis-

reglatoare (secvenţa AGAACA) vor activa transcripţia genei în aval de acest promotor de
unde se sintetizează ARNm în concentraţie mare. Mesagerii astfel produşi vor induce sinteza
enzimelor ce aparţin căii gluconeogenezei. Creşterea concentraţiei acestor enzime în
hepatocite va permite transformarea aminoacizilor în glucoză, care va fi eliberată în circulaţie
şi va ajunge la creier; are loc o creştere a nivelului glicemiei (1, 46, 66).

3.14 Reglarea la efort

 Stresul activează mecanisme care pregătesc organismul pentru efort fizic, care
necesită utilizarea glicogenului pentru contracţia musculară.
Creierul activează medulosuprarenala pe cale nervoasă pentru producerea adrenalinei.
Dacă concentraţia glucozei în sânge este scăzută (hipoglicemie) pancreasul secretă glucagon.
Cei doi hormoni acţionează asupra muşchilor şi a ficatului activând sinteza AMPc.
Acesta din urmă este activator a protein-kinazei A, care este capabilă să fosforileze
CREB (element responsabil de legarea AMPcilcic de proteine). Fosforilarea CREB-P va trece
în nucleul celulei şi se leagă de ADN la nivelul promotorului unor gene, care au un element
cis reglator specific: CRE (elemente responsabile de AMP cilcic).
Legarea factorilor trans-reglatori (CREB fosforilate) pe secvenţa elementelor cis-
reglatoare (secvenţe TGACGTCA), vor activa transcripţia genei în aval de promotori, cu
formarea ARNm. Mesagerii astfel produşi vor induce sinteza enzimelor aparţinând căii de
glicogenoliză. Creşterea concentraţiei acestor enzime în muşchi vor permite transformarea
glicogenului în energie care va fi utilizată pentru contracţia musculară (Fig. 3.23).

Fig. 3.23. Reglarea la efort (46).

 3.15 Mecanismul transcripţiei
3.15.1 Iniţierea transcripţiei
În urma cercetărilor analitice s-a reuşit să se izoleze şi purifice din extractul nuclear o
serie de factori de transcripţie.

Fig.3.24 Legarea TFIID pe ADN.

Dacă ARN polimerazele sunt universale, identice pentru toate celulele şi ţesuturile,
factorii de transcripţie sunt specifici pentru anumite ţesuturi. Ei joacă un rol important în
diferenţierea celulară şi menţinerea tipurilor de celule.
Pe lângă aceşti factori de transcripţie implicaţi direct în sinteza ARNm, există şi
proteine care reglează desfăşurarea procesului, în sensul că îl intensifică, atenuează dar nu-l
blochează. Atunci transcripţia poate începe dacă sunt prezente şi ribonucleotidele trifosfat
substrat.
Complexul de iniţiere al transcripţiei recunoaşte o secvenţă de aproximativ 100
nucleotide a lanţului antisens de ADN. TFIIH provoacă deschiderea şi derularea parţială a
dublului helix la acest nivel.
ARN polimeraza I şi II formaeză complexe cu factori de transcripţie care se leagă
upstream în amonte (deci înaintea punctului de iniţiere) pe când majoritatea factorilor de
transcripţie pentru ARN polimeraza II se leagă downstrem-în aval (chiar la mijlocul unităţii
de transcripţie).
Fig. 26. Iniţierea transcripţiei.

Transcripţia începe la a 22-a nucleotidă de pe TATA box, în direcţia opusă

elementelor GC-CAAT şi se continuă crescând lanţul antisens în direcţia extremităţii sale 5′ .
Formarea acestui complex este activată sau inhibată de factori transreglatori legaţi de
secvenţa cis reglatoare a aceluiaşi promotor.
Fixarea factorului TFIID pe TATAbox este prima etapă a complexului de iniţiere a
transcripţiei. După această fixare se deformează dublul helix de manieră importantă. Acest
ansamblu va servi ca punct de ancoraj pentru alţi factori de iniţiere a transcripţiei, după cum
urmează:
-complexul ADN-TFIID acţionează ca un situs de legare pentru un alt factor: TFIIB
care leagându-se va stabiliza complexul. Acest factor are acţiune ATP-azică,
eliberând energia necesară desfacerii catenelor de ADN, pentru formarea complex lui
deschis (open);
-la acest complex se asociază alţi factori: TFIIE şi TFIIH;
-ARN polimeraza II şi în urma unui proces ATP-dependent începe iniţierea
transcripţiei. Iniţierea începe cînd s-a format complexul de iniţiere, la nivelul
promotorului genei ţintă;
-la care se asociază un alt factor : TFIIF, care este factorul de elongaţie.
Acest factor împiedică terminarea prematură a sintezei ARN.

Reglarea ARN polimerazei

Activatorii sau inhibitorii transcripţiei (factori trans-reglatori) sunt proteine produse
de ARN polimeraza II şi ca urmare induc sau reprimă expresia genelor transcrise.
Aceşti factori transreglatori se leagă de ADN (ADN proteine de legătură) în regiunea
genei situate în amonte de partea transcrisă. Situsul de fixare a acestor factori transreglatori
pe ADN sunt secvenţe specifice numite elemente cis reglatoare.
Cuplul elemente cis reglatoare cu factorii transreglatori legaţi, intră în contact cu
complexul de iniţiere a ARN polimeraza prin intermediul unui ansamblu de proteine numite
mediatori.
 Fig. 28. Reglarea ARN polimerazei.

ARN polimeraza poate deci demara transcripţia, dacă este activată prin factorii de
transcripţie, unii fiind legaţi de aceste elemente ca TATA box sau CAAT şi dacă prin
intermediul mediatorilor ele au primit un semnal de activare sau inhibare. Acest semnal
depinde de prezenţa unui factor transreglator legat la elemente din promotor. Legarea de
reglatori ai mediatorilor necesită o repliere a ADN din promotor pentru a permite legarea de
aceste proteine.

Elongaţia transcripţiei
Fiecare nucleotidă trifosfat este aleasă specific, pentru a fi complementară cu baza din
lanţul antisens care vine în faţa ei. Legăturile bogate în energie între primul fosfat, care
esterifică C5′ a ribozei şi ceilalţi doi fosfaţi sunt hidrolizate eliberând pirofosfat, care la
rândul lui va fi hidrolizat printr-o pirofosfataza. Fosfatul rămas se leagă printr-o legătură ester
la carbonul 3′ a ultimei nucleotide a transcrisului în curs de sinteză.
ARN polimeraza construieşte un ARN hibrid cu lanţul de ADN antisens, a cărei
secvenţă primară este o copie a lanţului sens dar compusă din ribonucleotide în loc de
dezoxiribonucleotide şi de uracil în locul timinei. În cursul acestei elongări ARN polimeraza
II este însoţită de o serie de factori de elongaţie care modifică cromatina pentru a permite
avansarea enzimei, care împiedică formarea de obstacole, ca o agrafă de păr şi facilitează
avansarea policondensării.
Transcriptul primar rămâne hibridat pe câteva nucleotide cu lanţul antisens apoi se
detaşează pentru a permite dublului helix să se reformeze după trecerea polimerazei
 Fig. 29 Elongaţia transcripţiei
.
Extremitatea 5′ a transcriptului primar eliberat se condensează în diverse structuri
secundare. Polimeraza se aşează pe catena antisens şi merg în sensul 3′ -5′ Ea lecturează
sinteza transcrisului primar prin condensarea ribonucleotidelor, până întâlneşte semnalele de
terminare. La întâlnirea semnalului de terminare, ARN polimeraza se detaşează de ADN
eliberând transcriptul primar şi dublul helix se reânchide.
Viteza de sinteză a ARN este de 45 nucleotide/secundă. Transcripţia trebuie făcută cu
acurateţe pentru că la nivelul ARN nu există sisteme de corectare a erorilor. Daca au apărut
erori, ARN având un timp de injumătăţire biologic (T½) relativ scurt, nu se pot produce
perturbaţii de ordin genetic (transmisibile) ca în cazul ADN.

Fig. 30. Elongaţia transcripţiei.

Discontinuitatea genelor
Moleculele de ADN ale fiecărui cromozom sunt foarte lungi până la sute de milioane
de perechi de nucleotide şi conţin mai multe mii de gene. La om genele sunt foarte dispersate
şi nu reprezintă decât 10% din ADN genomic total.
Fiecare genă conţine regiuni care prezintă secvenţe codate care vor fi exoni, dar şi
regiuni reglatoare ca promotori şi regiuni netraduse numite introni care separă exonii. O genă
poate să nu conţină decât un singur exon şi să nu conţină intron dar există gene cu peste o
sută de exoni. După transcripţia ARN produsă de ARN polimeraza transcrisul primar
conţine de asemenena introni şi exoni dar nu şi promotor.
După excizia intronilor şi matisarea sau înnădirea exonilor, mesagerul nu conţine
decât exoni reuniţi într-o singură secvenţă codantă.

Fig.31 Discontinuitatea genelor.

Exonul

Exonul reprezintă partea secvenţei unei gene transcrise în structura ARNm până la
transducţie. Exonii sunt fragmente ale secvenţei primare ale unor gene care vor fi recopiate în
structura primară a ARNm după matisare. Există exoni de lungimi variabile: fragmente scurte
(34 nucleotide pentru exonul 1 al apoAII), lung (7572 nucleotide pentru exonul 26 al apoB).
Un exon codifică cel mai adesea un domeniu funcţional al proteinei sau o parte a
acestuia. Astfel că poteinele eucariotelor sunt formate din mai multe domenii codificate de
gene care posedă cel puţin atâţea exoni (cât are proteina). În cursul evoluţiei, gena poate fi
modificată prin substituţia, inserţia sau deleţia unui exon întreg (conversia genei) ceea ce
modifică proteina (aduce sau retrage proteinei un domeniu funcţional în întregime).
Exemplu de exon. Exon 1 apoAII.
După fixarea ARN polimerazei pe caseta TATA prin intermediul factorului TFIID,
transcripţia va începe. În acest punct, secvenţa lanţului sens este de 5′ AGGCACAGA3′ cea
a lanţului antisens va fi deci 3′ TCCGTGTGT ... 5′ (complementar şi antiparalel).
 Fig. 32. Exon I.

Pentru a alege ca substrat ribonucleotidele complementare ale acestei catene antisens

ARN polimeraza va compune 5′ AGGCACAGA3′ care va fi începutul secvenţei ARN
transcris. Transcripţia se desfăşoară pe toată lungimea catenei antisens prin încorporarea a
1329 nucleotide în ARN transcris de apoAII.

Sfârşitul transcripţiei
Transcripţia genei apoAII se desfăşoară până la a 1329-a nucleotidă. Către sfârşitul
genei factorii legaţi de ARN polimeraza recunosc pe lanţul antisens o secvenţă 3′ TTATTT5′
urmată la majoritatea genelor de alt semnal 3′ ATACAAAC5′ este eliberată ARN
polimeraza. Transcripţia se opreşte cu puţin după primul semnal şi sfârşitul transcripţiei se
scrie 5′ AAUAAAUGCUGA ... AUCC 3′ OH.
ARN polimeraza fiind eliberată de ADN şi transcriptul primar, care conţine copia
informaiţiei genetice, va reprezenta expresia genei sub formă de proteine.

Modificări ale transcrisului

Capişon sau bonetă: o enzimă adăugă o guanina la fosfatului 5′ a primei nucleotide
a transcrisului formând 7-metilguanilat trifosfat şi transferă radicalii metil pe primele
nucleotide. Aceste modificări au loc în debutul tuturor transcripţilor
 Fig. Capişon sau boneta ARNm.

Enzimele de bonetare (Fig. 33). Elongarea transcrisului primar începe de la

extremitatea COOH terminală a polimerazei compelxului de iniţiere. Pentru adăugarea
coifului un complex multienzimatic excercită trei activităţi:
- hidroliza fosfatului printr-o fosfatază la nucleotidul 5′ a transcriptului primar;
- transferul pe fosfatul rămas a unui guanilat de la GTP de către o guanililtransferază;
- metilarea acestui guanilat pe N7 realizată de o metilază.
 Fig. 33. Enzime de bonetare.

Primele 2 reacţii sunt catalizate de o proteină de 68Kda, iar metilarea de o altă

subunitate de 57Kda.
ARNm sunt distruşi de ribonucleazele din citoplasmă. Prin hidroliza lor se eliberează
nucleotide care vor fi refolosite la sinteza altor acizi nucleici. Pentru a proteja ARNm de acest
catabolism, o structură specială ascunde extremitatea 5′ terminală a acestuia de exonucleaze
specifice. Această structură este numită coiful mesagerului. Există cel puţin o fixare a GMP
pe al II-lea fosfat din nucleotida trifosfat care se găseşte la extremitatea 5′ din transcris.
Acest GMP este metilat pe azotul nr.7. Dacă nucleotida iniţială conţine o adenină această
poate fi metilată pe N6.

Ribozele nucleotidelor iniţiale sunt uneori metilate pe oxigenul fracţiunii alcool

în 2′ .

Coada poli A. O enzimă -endonucleaza- secţionează transcrisul primar cu 10-20

nucleotide înainte de secvenţa AAUAAA şi o polimearază A sintetizează pe C3′ OH liber a
ultimei nucleotide a transcrisului rămas, o catenă de adenină numită cutia de poliadenilare
(coada polyA). Este o catenă cu o lungime de 500-2000 nucleotide a adeninei
policondensate.
 Semnalul de sfârşit al transcripţiei se află la sfârşitul majorităţii genelor mamiferelor
TATGTTTC. Citirea acestor semnale de cătreARN polimerazei II, se opreşte din transcripţie
şi părăseşte ADN eliberând transcrisul primar.
Această coadă polyA este indispensabilă maturării şi activităţii ARNm pe care-l
poartă. Ea va fi digerată lent de o exonuclează din citoplasmă dacă mesagerul va fi activ.
Dacă va fi redusă la câteva sute de nucleotide mesagerul va fi distrus total pentru a fi înlocuit
de un mesager nou.

Fig. 35. Coada poly A.

Transcrisul primar al apoAII

Transcrisul primar al apoAII conţine 1329 nucleotide. El primeşte un coif, bonetă sau
7 metilguanilat care se fixează pe fosfatul β a ATP în poziţia 5′ a transcrisului primar.
Primeşte de asemenea şi o coadă poly A sintetizată în 3′ după sfârşitul transcrierii.
Trei introni vor fi excizaţi: ei vor fi recunoscuţi printr- un situs donor GU în 5′ a
fiecărui intron, urmat de o secvenţă bogată în purine; un situs primitor în 3′ AG a fiecărui
intron precedat de o secvenţă bogată în pirimidină. După această maturare transcriptul primar
devenit ARNm va fi transportat către citoplasmă pentru transducţie.

Fig. 36 Transcrisul primar.

 Excizia, matisarea.
Excizia, matisarea este o etapa de maturare a ARNm, unde intronii, părţile
necodante ale structurii primare a transcrisului sunt secţionaţi din structura primară şi exonii
legaţi unul câte unul formând o singură secvenţă codantă. După excizia intronilor şi matisarea
exonilor, mesagerul nu conţine decât exoni
Etapa de eliminare a intronilor. Intronii, părţile necodante a genelor eucariote, sunt
decupaţi (excizaţi) din structura primară a ARN în cursul maturării mesagerului.
Exonii, părţi codante, sunt temporar legaţi cap la cap (matisare) pentru a forma
secvenţa primară a ARNm. Excizia şi matisarea se realizează prin acţiunea unor enzime şi a
ribozomilor care catalizează secţionarea ARN (endoribonucleaze mici nucleare) şi inchiderea
breşelor prin ARN ligaze. Matisarea poate fi alternativă adică poate conduce la mai multe
structuri ale ARNm. ARNm alternativ are fiecare anumiţi exoni proprii ca şi unii exoni în
comun.

Formarea lasoului
Excizia intronilor şi matisarea exonilor este o etapă foarte importantă a maturării
transcrisului în nucleul celular. Se face apel la factori specifici: ribonucleoproteine conţinând
mici subunităţi de ARN nuclear (snRNP), ARN având proprietăţi catalitice, ribozomi, enzime
specifice (maturaze).
Structura secundară a transcrisului pune în contact 3 secvenţe ale intronului:
- secvenţa de debut a intronului (extremitatea 5′ sau situsul donor),
-secvenţa de sfârşit a intronului (extremitatea 3′ sau sistus acceptor) şi
- un situs situat între 20-50 nucleotide în amonte de situsul de tăiere 3′ numit situs de
ramificare. Situsul de ramificare este folosit pentru formarea unui lasou (laţ).
• Procesul are loc prin două reacţii transesterificare. Situsul donor începe obişnuit
printr-o guanină a cărui fosfat este detaşat de exonul precedent pentru a fi transferat
pe C2′ a A situsului de ramificare. Se formează un grup 2´, 5′ fosfodiesteric, cu
detaşarea concomitentă a exonului în potiţia 5′ . Ultima nucleotidă a situsului acceptor
este de asemenea o guanină, care este detaşată de exonul următor a primei nucleotide,
este legată prin fosfatul 5′ la C3′ a ultimei nucleotide a exonului precedent.
• Apoi gruparea 3′ -hidroxil a exonului 5′ formează o legătură fosfodiesterică cu
capătul 5′ terminal al exonului 3′ , rezultând produsul înnădit.
Intronul eliberat sub formă de lasou este distrus de nucleaze. Transcrisul pierde
succesiv toţi intronii săi şi exonii se leagă constituind secvenţa codantă a ARNm.
Joncţiunile de înnădire sunt recunoscute şi cei doi exoni care trebuiesc uniţi sunt aduşi
împreună prin intermediul unor molecule mici de ARN nuclear (snARNs) care formează
complexe proteice mici, numite ribonucleoproteine mici nucleare (snRNPs). Complexul este
cunoscut ca spliceosome o structură foarte mare de 50-60S. Anticorpii de la pacienţii cu
lupus eritematos sistemic diseminat au avut un rol crucial în descoperirea snRNPs.În această
boală autoimună, pacienţii au o gamă largă de anticorpi faţă de componentele nucleare. S-a
demonstrat că anticorpii specifici anti- snRNPs blochează procesul de splicing.
 Fig.37 Formarea lasoului.

Splicing alternativ care duce la formarea de proteine diferite

În genaral, exonii sunt coliniari cu domeniile proteice. Astfel prin selectarea exonilor
într-un pre-ARNm dat, ar fi posibilă generarea unor molecule de ARNm diferite, pornind de
la aceeaşi secţiune a ADN genomic. Splicing-ul alternativ apare frecvent.
Un exemplu este acela de generare a două imunoglobuline diferite. Limfocitul B
poartă un monomer de IgM pe suprafaţa sa. Când un astfel de limfocit este recunoscut de un
imunogen, acesta este stimulat să formeze o clonă de plasmocite care sintetizează şi secretă
IgM pentamer.

Fig. Monomerul de IgM de pe suprafaţa limfocitului B.

Regiunea C-terminală a lanţului greu H stă la baza diferenţei între monomerul IgM o
proteină membranară şi pentamerul IgM – proteină secretată. Lanţul greu H al monomerului
posedă o peptidă hidrofobă de 26 resturi de aminoacizi care are afinitate pentru membrana
plasmatică, în timp ce lanţurile grele ale pentamerului au o peptidă hidrofilă de 20
aminoacizi.
 Fig. Pentamerul IgM – proteină secretată.

Un animal poate sintetiza multe milioane de anticorpi diferiţi, fiecare cu potenţial de

interacţiune cu un antigen specific. Există 3 surse ale acestei diversităţi:
-o diversitate de gene cu regiuni variabile;
-recombinarea somatică: de exemplu fiecare din cele câteva sute de gene V pot să se
lege de oricare din cele 5 gene J;
-mutaţia somatică (de exemplu formarea lanţurilor uşoare).
Genomul celulei stem conţine multiple variante ale genelor V şi J pentru lanţul uşor
(L) şi ale genelor V, J, D (diversitate) pentru lanţul greu (H). Genele V sunt precedate de un
segment mic S ce codifică o peptidă semnal. Când limfocitele se maturizează, fiecare celulă
în diferenţiere îşi construieşte anumite gene L şi H cu o structură virtuală unică printr-un
proces de recombinare care selectează întâmplător unul din setul de segmente de gene şi le
asamblează împreună cu gena C. PreARNm este prelucrat pentru a da un ARNm matur care
este tradus şi peptida semnal este eliminată. Se formează apoi prin oxidare punţile S-S.
 Fig. Genomul celulei stem cu multiple variante ale genelor V, J, pentru lanţul uşor
(L) şi ale genelor V, J D pentru lanţul greu (H).

Un alt exemplu de splicing alternativ este al troponinei.

Datorită prezenţei proteinelor reglatoare pe transcrisul primar legarea poate fi de mai
multe feluri, se face diferenţiat de la o celulă la alta. Este posibil să se lege alternativ fie la
exonul 3 fie la exonul 4 din gena troponina T. Dacă exonul 3 este păstrat se obţine α-
troponina, iar dacă exonul 4 este păstrat se obţine β -troponina T. Această matisare
alternativă stă la originea numeroaselor proteine izomorfe (Fig.38).
Este de asemenea posibil să se determine dependenţa expresiei genei a 2 promotori
diferiţi, responsabili de reglarea diferenţiată. Fiecare din aceşti promotori este legat de un
exon 1 sau 1bis care vor fi matisaţi alternativ cu secvenţa transcrisului.
Se poate întâmpla să existe mai mulţi exoni la sfârşitul genei care conţin codoni
STOP. În acest caz matisarea alternativă va da proteine cu lungimi diferite.

Fig. 38. Matisare sau episaj alternativ.

 Fig. Formarea proteinelor în urma splicig-ului alternativ.

Maturarea ARN ribozomal

Pentru transcrierea ARN ribozomal, ARN polimeraza I sintetizează un transcris

primar de 13000 nucleotide din 3 fragmente: ARNr 28S de 4518 nt, 18S de 1874 nt şi 5, 8 S
de 160 nt. ARN r 28S, 5, 8S şi 5S se vor asocia cu 50 proteine pentru a forma subunitatea
mare a ribozomilor. ARNr 18S va forma subunitatea mică cu 33 proteine şi ARN polimeraza
III sintetizează mici ARN 5S de 120 nt.
ARN polimeraza I sintetizează un transcris primar al ARNr.

Stabilitatea mesagerului (Fig. 39)

ARNm este o copie de lucru a genelor, destinată dirijării transducţiei şi catalizării prin
ribozomi. Extremitatea 5′ fosfat este protejată prin coif (boneta) fără ca ARN să fie degradat
în cursul transcrierii de 5′ exonucleaze. La extremitatea sa 3′ OH, fără coadă polyA,
mesagerul este inapt pentru transducţie şi va fi distrus de endonucleaze.
Mesagerii care poartă puţini ribozomi pentru că iniţierea transducţiei este încetinită
sau inhibată sunt distruşi direct de către endonucleaze. Anumiţi mesageri au durata de viaţă
scurtă; mulţi dintre aceştia care apar postprandial (după masă) au durată de viaţă de 2 ore şi
sunt resintetizaţi în întregime după fiecare masă. Alţi mesageri din sistemul nervos de
exemplu, sunt complet stabili pe parcursul anilor.
ARNm cuprinde mai multe secvenţe:
- o secvenţă 5′ necodantă care nu va fi tradusă care corespunde exonului 1 şi unei părţi
a exonului 2 din gena apoAII;
- primul codon AUG, fixează ARNt la metionină iniţială;
- secvenţe de codoni pentru a încorpora aminoacizi, ca peptide semnal şi polipeptide;
- secvenţa codonilor a căror aminoacizi vor forma secvenţa primară a proteinelor;
- codonul de terminare (aici UGA);
- secvenţa 3′ netradusă care se va termina prin coada polyA.
Pe secvenţa 5′ netradusă se va constitui complex de iniţiere a transducţiei unde
ribozomii se vor asambla succesiv, pentru continuarea transducţiei.
 Fig. 39. Stabilitatea ARNm.

Transducţia
Expresia genomului, conduce la sinteza în celulă a macromoleculelor de aminoacizi şi
a proteinelor a căror structură primară este determinată de cea a ADN. Transducţia constă în
citirea ARNm de către ribozomi care sintetizează proteinele a căror structură primară este
determinată de acest ARNm. Această expresie se face prin două mecanisme principale:
- structura primară a ADN se exprimă prin sinteza ARNm aceasta fiind transcripţia;
- structura transcrisă pe unii ARNm este exprimată prin sinteza de proteine a căror
structură primară se traduce prin aminoacizi (este transducţia).

Fig. Transcripţia şi transducţia.

Transducţia se face:
-în citoplasma celulelor fie prin eliberarea de proteine citoplasmatice;
-în organitele celulei în RE, apoi proteinele sunt transferate la AG,
-pentru a structura membrana celulară, lizozomală, mitocondrială, nucleară etc.),
-fie pentru a excreta aceste proteine prin exocitoză.

Codul genetic
 ADN este situat compact în nucleu şi se asamblează în cromozomi. Sunt 23 perechi
de cromozomi în celulele umane, fiecare având o secvenţă cu caracteristici unice. Structura
primară a ADN (succesiunea bazelor din lungul catenei helixului, numită încă secvenţă de
ADN) poartă informaţia genetică şi constituie genomul. Informaţia genetică specifică,
codantă este decriptată, apoi tradusă în secvenţa primară a unei proteine. 20 aminoaicizi pot fi
integraţi sub formă de proteine.
Tripletul de baze (numit codon) codifică un aminoacid, moleculă de bază care intră în
structura proteinelor.
Relaţia triplet/aminoacid poartă numele de cod genetic. Limbajul nucleic se scrie
cu 4 litere (A,G,C,T). Dacă o literă nucleică s-ar traduce printr-un aminoacid nu am putea
avea decât 4 aminoacizi. Grupând literele nucleice în cuvinte de cîte 2 litere vom putea avea
16 cuvinte dar acestea nu vor permite decât codificarea a 16 aminoacizi. Grupând literele câte
3 în cuvinte putem avea 64 cuvinte ceea ce permite exprimarea celor 20 de aminoacizi şi a
semnelor de punctuaţie.
Numărul de codoni posibili permit codului genetic interpretarea corespondenţei între
un triplet şi un aminoacid. Totuşi mai mulţi codoni codifică acelaşi aminoacid. Alături de
tripleţii care codifică aminoacizii, există:
- un codon de iniţiere ATG care soseşte la începutul traducerii şi care este codonul
pentru un aminoacid metionină (este aminoacidul corespunzător semnalului de
debut al transducţiei);
- 3 codoni specifici, codonul STOP (TAA, TAG, TGA) semanele de sfârşit de
traducere;
O succesiune de mai mulţi codoni de ADN definesc o zonă codantă a unei gene.
Codonii vor fi traduşi în aminoacizi care vor fi asociaţi pentru a forma scheletul unei
proteine.

Fig. Semnificaţia.

Există mai mulţi codoni în codul genetic decât aminoacizi şi semne de punctuaţie. Vor
exista mai mulţi codoni traduşi prin aminoacizi omonimi. Aceşti omonimi reprezintă o
pierdere de informaţie între limbaj nucleic (64 semnificativi) şi limbajul proteinic (21
semnificativ) face să se spună că acel cod genetic este degenerat.
 Legarea ARNt la ARNm purtător al informaţiei se face prin complementaritatea între
3 nucleotide a fiecăruia din cele două molecule de ARN. Cele 3 nucleotide ale ARNm
constituie un codon şi cele 3 nucleotide ale ARNt un anticodon. În cursul transducţiei
anticodonul şi codonul se leagă de maniera antiparalelă şi aminoacidul purtat prin ARNt este
încorporat în proteină în procesul de sinteză.
O nucleotidă a ARN se poate găsi în poziţiile 1, 2 şi 3 în codon dacă numărul de
nucletotide care le separă de codonul de iniţiere AUG este sau nu este un multiplu de 3.
Această poziţie poartă numele de codon de lectură.
Secvenţa codantă este o secvenţă de codoni, care permite încorporarea specifică a
unui aminoacid în sinteza unei proteine. Codul genetic este acelaşi pentru toate vieţuitoarele
biosferei (universal). Există câteva variaţii (codoni responsabili de biosinteza proteinelor din
mitocondrii).
Codul genetic este compus de 61 codoni pentru codificarea celor 20 de aminoacizi ce
participă la sinteza proteinelor; fiecare aminoacid poate fi codificat prin mai mulţi codoni (de
la 1-6) care diferă în general prin a III-a nucleotidă motiv pentru care se spune că este
degenerat.
Codul genetic este rezultatul unei lungi evoluţii şi dispoziţia sa nu este la întâmplare.
Corespondenţele între codoni şi aminoacizi au fost selecţionate pentru ca schimbările de baze
să aibe efectele minime posibile asupra proteinelor exprimate. Toţi codonii în care a II-a
literă este U corespund aminoacizilor hidrofili, deci au proprietăţi fizice apropiate. La fel
aminoacizii care corespund codonilor începând cu GA fac ca schimbările de la a III-a bază să
nu dispară încărcătura anionică a radicalului.
Cel mai apropiat codon STOP este cel al triptofanului. O schimbare a oricăruia sau a
celor 2 guanine determină formarea codonului STOP şi deci se opreşte transducţia. Dar acest
codon corespunde unui aminoacid foarte rar întânlit în proteinele obişnuite.

Fig. 41 Codul genetic.

Codul genetic degenerat (Fig 42)

Scriind codul genetic în alt sens, s-a arătat că sunt mai mulţi aminoacizi cu codoni
omonimi. Pentru unii sunt 6 codoni diferiţi, pentru alţii 4, 3 sau 2. Aceşti codoni omonimi nu
sunt înlocuiţi la întâmplare pentru că ARN corespunzător nu există în toate celulele în aceiaşi
concentraţie. O parte din aceşti codoni vor avea mai puţine şanse de a se exprima în ţesuturile
în care ARNt corespunzător este rar. Există numeroşi ARNt a căror anticodoni nu se leagă
specific cu a 3-a bază a codonului. Aceste baze sunt mai puţin recunoscute mai puţin
specifice sau de loc, ceea ce explică degenerarea obişnuită a celei de-a III-a litere.

. Fig. 42 Codul genetic degenerat

Ribozomii la eucariote

Ribozomii din citoplasma celulelor eucariote sunt complexe multienzimatice care

asociază 83 de proteine şi 4 tipuri de acizi ribonucleici.
Aceste molecule sunt asociate între ele pentru a forma 2 particule distincte subunitatea
mare 60S (2800000 daltoni) şi subunitatea mică 40S (1400000 daltoni) care pot disocia uşor.

Acizii ribonucleici ribozomali şi proteinele formează situsuri de fixare pentru:

-secvenţele de ARNm
-ARNt (care transportă aminoacidul de încorporat în situsul A) şi
-ARNt care transportă peptida în cursul sintezei în situsul P,
-un situs catalitic pentru a forma legături peptidice,
-situsuri de fixare pentru cofactorii proteici ai iniţierii elongaţiei (eIF2, eIF3),
-de terminare şi situs de reglare (proteina S6).

Fig. 43. Ribozomul la eucariote

 Poliribozomii

Pe acelaşi mesager mai mulţi ribozomi efectuează transducţia aceloraşi proteine unul
după altul, totul constituind un poliribozom.

Fig. 44. Sinteza proteinelor de către poliribozomi.

Iniţierea permite extremităţii 5′ a unui ARNm să ataşeze ribozomii succesiv câte

unul la 100 nucleotide. Primul aminoacid încorporat constituie extremitatea NH2 terminală a
proteinei.

Fig. Formarea proteinelor.

La extremitatea 3′ soseşte codonul de terminare, subunităţile ribozomului se separă

şi eliberează proteina sintetizată. Ultimul aminoacid încorporat constituie extremitatea COOH
terminală a proteinelor.
Poliribozomii prezintă un aspect diferit în funcţie de reglarea etapelor de transducţie.
Iniţierea este activată pe ARN de numeroşi ribozomi. Dacă elongaţia este lentă ribozomii vor
necesita mai mult timp pentru a citi secvenţa codantă. O activare bruscă a terminării
transducţiei disociază toţi ribozomii de ARNm. Numeroase antibiotice sunt capabile să
interfereze cu fiecare din etapele sintezei proteinelor: streptomicina, cyclohexamide,
puromicine.

ARN de transport sau ARNt (treflă)

ARNm constituie legătura chimică necesară între structura codon recunoscută de

anticodon şi aminoacidul specific purtat prin ARNt. Acesta este pe scurt dicţionarul
transducţiei.
Anticodonul este o secvenţă de 3 nucleotide situate la extremitatea buclei inferioare
din ARNt, complementare şi antiparalele secvenţei din codonul ARNm, a aminoacidului
corespunzător.
Fiecare aminoacid este legat specific (cod genetic) de un amino-acyl-ARNt-sintetaza
la extremitatea 3′ din ARNt a cărui anticodon îi este corespunzător (tARN – încărcat).
Ribozomii leagă ARNt încărcaţi pe situsul A de elongaţie dacă anticodonii lor se potrivesc
codonilor ARNm la acest nivel. În urma elongaţiei are loc transferul peptidului pe un
aminoacid nou, el însuşi purtat de un ARNt.

Fig.45 ARN de transfer, ARNm.

ARN de transfer (panglică)

Analiza cristalografică a ARN de transfer a arătat că extremitatăţile celor două braţe
buclate de dihidroxiuracil şi buclele de GT, CG se reânchid una cu alta prin schimbul
legăturilor de H. Astfel, modelul ARNt ia o formă în L unde braţele anticodon şi braţele
acceptor de aminoacid sunt la extremităţile moleculelor.

.
Fig.46 ARN de transfer.
 Sinteza proteinelor. Activarea unui aminoacid

Aminoacizii liberi din citoplasmă sunt substraturi pentru sinteza proteinelor. Pentru a
participa ei vor fi activaţi. Activarea aminoacizilor este catalizată prin enzime specifice:
aminoacyl-ARNt sintetaza. Există cel puţin una pentru fiecare din cei 20 aminoacizi. Aceste
enzime au o dublă specifictate:
-ele recunosc specific un aminoacid şi
-un ARNt specific, neîncărcat corespondent aminoacidului.

Fig. Activarea aminoacizilor

Aminoacil ARNt-sintetaza hidrolizează un ATP în AMP (legătura bogată în energie)

apoi activează aminoacidul legând fracţiunea acidă la fosfatul AMPc (legătură anhidridă
bogată în energie). Pirofosfatul este imediat distrus în totalitate de o pirofosfatază.
Aminoacidul astfel activat este transferat cu legătura sa bogată în energie, pe una din
funcţiunile alcool secundare ale ribozei AMP3′ terminal al ARNt încărcat. Acesta se leagă,
apoi de ribozomi pentru a sintetiza proteinele (Fig.47).

Fig.47 Activarea unui aminoacid.

Serina ARNt sintetaza

Serina-ARNt sintetaza are dublă specificitate pentru două substraturi: aminoacidul
recunoscut aici serina şi ARNt a căror anticodoni sunt complementari cu codoni
corespunzători a acestor aminoacizi din codul genetic. Exactitatea transducţiei este dată în
întregime de aceasta dublă specifictate: Recunoaşterea ARNt se face de către anticodon în
anumite cazuri (enzimele ţin cont totdeauna de prima bază a anticodonului, ceea ce explică
degenerescenţa codului genetic) sau de alte servicii de ARNt comune, ARNt sinonime.

Fig.48. Serina ARNt sintetaza.

Cisteina ARNt sintetaza

Aminoacyl ARNt sintetazele au dublă specifictate pentru cele două substraturi:
aminoacidul recunoscut aici cisteina şi ARNt a cărui anticodon este complementar codonilor
corespondenţi acestui aminoacid din codul genetic. Exactitatea transducţiei se bazează pe
dubla specificitate. În dicţionarele de transducţie sunt câteva tipuri diferite de Aminoacid-
ARNt-sintetaze.

Fig.49. Cisteina ARNt sintetaza.

Iniţierea transducţiei

Iniţierea este etapa limitantă a transducţiei. Subunităţile ribozomilor sunt disociate în

citoplasmă. O cascadă de evenimente vor forma un complex de iniţiere, ca răspuns la factorul
eIF2 (eucariotic initiation factor 2), purtător a unui GDP, coenzimă care a hidrolizat în cursul
ciclului de iniţiere precedentă. În prezenţa factorului eIF2B un nou GTP este substituit cu un
GDP.
 Fig. Rolul factorului eIF2 în siteza proteinelor.

Factorul eIF2 astfel activat, poate să lege ARNt încărcat cu metionina a cărui
anticodon este complementar cu codonul de iniţiere (AUG) a mesagerului. În prezenţa
cofactorului eIF4C; subunitatea mică va fixa factorul eIF3 şi factorul eIF2 activat care
poartă ARNt încărcat cu metionina iniţială. Energia de formare a acestui complex a fost
furnizată prin hidroliza legăturii bogate în energie a GTP purtat prin factorul eIF2 (Fig. 50).
 Fig. 50. Iniţierea transducţiei

Secvenţa 5′ netradusă de ARNm este recunoscută de cofactorul eIF4A, eIF4B şi

eIF4F pe care se fixează ca urmare a hidrolizei unui ATP pentru furnizarea energiei,
mesagerul este transferat pe subunitatea mică faţă în faţă cu situsul P, pentru a hibrida
nucleotidele codonului de iniţiere cu cele ale anticodonului ARNt a metioninei iniţiale.
În prezenţa ultimului cofactor eIF5, complexul se va lega cu subunitatea mare pentru
a construi ribozomul funcţional. Cofactorii de iniţiere sunt eliberaţi şi începe transducţia în
totalitate. Cofactorul eIF2 totdeauna purtat de GDP-ul său, este eliberat pentru a începe un
nou ciclu de iniţiere.

Cadrul de citire

Poziţionarea mesagerului în raport cu ARNt de la metionina iniţială determină cadrul

de citire a transducţiei. ARNt a metioninei ocupă unul din cele două situsuri de fixaţie a
ARNt pe ribozom: situsul P (el conţine peptide în curs de sinteză).
Codonul AUG a mesagerului se hibridează în sistusul P cu anticodonul CAU din
ARNt al metioninei plasând mesagerului codonii următori (N1, N2, N3) să apară în celelalte
situsuri de fixare (situsul A sau aminoacizi) întrucât va servi la fixarea noilor aminoacizi
încorporaţi, Nucleotidul N1 va fi tot timpul primul al fiecărui codon (Fig. 51).

Fig. 51. Cadru de citire.

Elongaţia transducţiei

Ribozomii iniţiali au situsul A vacant. Factorul de elongaţie eEF1B catalizează

schimbul GTP cu un GDP pe factorul eEF1A. Acesta activat, va primi un ARNt încărcat
care se va fixa pe acest situs A, hidrolizând GTP în GDP (Fig 52).
 Fig. 52 Elongaţia transducţiei.

Din moment ce codonul mesagerului din situsul A a putut să se lege complementar cu

anticodonul din ARNt adus, factorul eEF1A este eliberat cu GDP-ul său.
Ribozomul catalizează atunci transferul peptidelor situate pe ARNt din situsul P pe
funcţiunea amino a aminoacidului ARNt din situsul A. Pentru aceasta utilizează energia de
hidroliză a legăturii ester bogată în energie dintre peptid şi ARNt din situsul P.
În sfârşit datorită factorului eEF2 şi a hidrolizei altui GTP, ARNt din situsul P este
eliberat de pe ARNm, ARNt rămas şi peptidele în cursul sintezei sunt deci deplasate
(translocate) de la situsul A la situsul P, fără ca să aibă loc separarea între codon şi anticodon.
Situsul A este din nou eliberat pentru a primi ARNt a aminoacidului următor.

Încorporarea unui aminoacid

Un ARNt încărcat se va fixa pe situsul A liber. Codonul ARNm, situat la baza

situsului A se va lega complementar cu situsul anticodonului ARNt al noului aminoacid ceea
ce va permite încorporarea acestuia în peptida în curs de sinteză.
 Fig.53 Incorporarea unui aminoacid.

Transferul peptidelor

Ribozomul catalazează transferul peptidelor situate pe ARNt din situsul P pe funcţia

amino a aminoacidului pe ARNt din situsul A. El utilizează energia de hidroliză a legăturii
ester (bogată în energie) dintre peptid şi ARNt din situsul P. Legătura peptidică este formată
prin reacţia a doi aminoacizi, cu eliminarea apei între două grupări vecine –NH2 şi –COOH.
Legătura peptidică este o structură rigidă şi acest fapt are implicaţii importante pentru
structura proteinelor.

Fig. 54 Transferul peptidelor.

ARNt eliberat din situsul peptidic părăseşte ribozomul. Mesagerul, ARNt rămas şi
peptidele în curs de sinteză sunt deci deplasate (translocate) din situsul A în situsul P fără să
se facă hibridarea între codon şi anticodon.
Bilanţul energetic al transducţiei depinde de numărul aminoacizilor proteinei
sintetizate.
Pentru fiecare aminoacid se utilizează un ATP→AMP pentru sinteza ARNt încărcat
(aminoacyl-tARN-sintetaza). AMP produs este reactivat în ADP de către un alt ATP
(nucleozide P2-kinaza). Ansamblul necesită consumul a două legături bogate în energie
ATP→ADP. Pentru încorporarea acestui ARNt încărcat în situsul pentru aminoacizi al
ribozomului factorul eEF1B utilizează un GTP→GDP.
Pentru translocaţia peptidil ARNt din situsul aminoacizi (A) în situsul peptidic (P),
factorul eEF2 utilizează încă un GTP→GDP. În total fiecare aminoacid încărcat încorporat în
proteine consumă celulei 4 legături bogate în energie.

Terminarea transducţiei
Dacă situsul A găseşte în faţă un codon nonsens care anunţă finalul transducţiei,
complexul va disocia de mesager în prezenţa unui ultim cofactor eRF.
 Cele două subunităţi ale ribozomului disciază, proteina sintetizată este eliberată la fel
ca şi ultimul ARNt.

Fig. 56 Terminarea transducţiei.

Peptide semnal
Peptidele semnal sunt lanţuri formate din câţiva aminoacizi (15-20) situaţi la
extremitatea NH2 terminală a proteinelor traduse, semnalând unde trebuie să fie excretată
proteina din celulă. Atunci când o proteină este sintetizată, structura sa secundară sau terţiară
se construieşte din nou şi pe măsura transducţiei este eliberată în citoplasmă.

Dacă această proteină este destinată pentru a fi în membrane sau organite celulare,
partea codantă a ARNm începe printr-o secvenţă de câţiva aminoacizi ca adresă pentru
încorporarea acestei proteine în membrane.
Aceste peptide orientează destinaţia proteinelor; încorporarea în membrană (RE, AG,
plasmalemă, lizozomi) intră în mitocondrii sau sunt exocitate în afara celulelor prin aparatul
Golgi. Pentru că funcţia sa este de a penetra prin membrana RE structura sa este bogată în
aminoacizi hidrofobi (Phe, Leu, Ile, Met, Val).
Fiecare organit prezintă un mecanism de recunoaştere şi încorporare numai a
proteinelor necesare şi specifice lui. Această recunoaştere se realizează datorită unei secvenţe
de aminoacizi pe care o conţine proteina respectivă, secvenţa semnal, şi a unui receptor
specific care recunoaşte proteina şi o internalizează. După ce proteina a ajuns la destinaţie,
secvenţa semnal este eliminată prin digestie proteolitică, iar în cazul receptorului, acesta este
eliberat şi reciclat.
 Poliribozomii şi peptidele semnal
Poliribozomii care se formează pe un mesager conţinând o peptidă semnal, au o
evoluţie uşor diferită. Transducţia se opreşte cu puţin după sinteza peptidei semnal. Se ştie că
peptida semnal interacţionează direct cu membrana reticulului endoplasmatic. Acest lucru
este posibil datorită particulei de recunoaştere a semnalului SRP.
SRP este constituit din diferite proteine şi un ARN 7S.

Fig. Structura particulei de recunoaştere a semnalului.

Imediat ce interacţiunea peptidei semnal cu SRP are loc în afara structurii

ribozomilor, şi se leagă acesta inhibă elongaţia (Fig. 57)
Traducerea se opreşte până când SRP este recunoscut de un receptor al membranei
RE. Imediat ce această legătură este stabilită ribozomul este legat de ribozomii din membrana
RE lângă un complex proteic. Acesta contribuie la formarea unui canal apos de transport al
proteinelor cunoscut sub numele de translocon, prin care proteina nou formată trece în
lumenul, apoi în cisternele RE. Deci canalul se deschide şi elongaţia se reia.
La faţa internă a membranei RE o endopeptidază specifică sau peptidaza semnal va
secţiona peptida semnal şi sinteza se va desfăşura până la terminare. SRP se eliberează în
citosol şi traducerea este încheiată.

Fig. Sinteza proteinelor la nivelul RER.

Proteina în final poate fi încorporată într-o membrană datorită secvenţei semnal de

ancorare (fig. ) sau exportată pentru traversarea AG către exteriorul celulei.
Fig. Proteine sintetizate şi încorporate în membrane datorită secvenţei semnal de ancorare.

Adresarea proteinelor către mitocondrii face apel la un alt tip de peptidă de adresare
care conduce peptidele prin traversul membranei mitocondriale în matrice sau în
endomembrane.
Produşii primari de traducere conţinând peptide semnale sunt denumiţi preproteine, de
exemplu preproinsulina, hormonul preproparotidian, etc.

Modificări posttransducţionale
Numeroase modificări chimice se produc după încorporarea aminoacizilor în structura
primară a proteinei (transducţia); ele se numesc modificări posttransducţionale. Se disting şi
modificări cotransducţionale care se produc atunci când transducţia se desfăşoară şi când
peptidele formate sunt încă ataşate la ribozom în celulă, în organite sau în afara celulei. Astfel
de modificări sunt:
1. Proteoliza: fragmentarea peptidei semnal;
2. Glicozilare: SerO, AsnN
3. Acilare: Fornesil, Miristil, Palmityl;
4. Hidroxilare (OH-Pro; OH-Lys; OH-Asp. Metilare (CH3-His) carboxilare CO2-Glu;
5. Dezaminarea citozinei
6. Fosforilare: P-Sev, P-Thr, P-Tyr, P-His
7. Legarea unui cofactor: Metal, Flavine, Hem
8. Blocajul extremităţilor pyroGlu; carboxihemide.
Se numeşte proteină matură, forma chimică definitivă pe care proteina în momentul în
care îşi îndeplineşte funcţia în organism.

Organizarea structurală a proteinelor

Lanţurile polipeptidice ale proteinelor se pliază în diferite moduri atât în cadrul
propriului lanţ dar şi între lanţurile vecine adică intracatenar şi intercatenar. În funcţie de
plierea lanţurilor se disting proteine cu structură secundară, terţiară şi cuaternară (fig.).
 Fig. Proteine cu structură primară, secundară, terţiară şi cuaternară.

Acest mod de pliere este esenţial pentru activitatea biologică a proteinelor şi această
organizare complicată este cea care trebuie conservată pe parcursul procedurilor implicate în
purificarea proteinelor. Mult timp s-a considerat că modurile de pliere ale lanţurilor
polipeptidice sunt determinate nmai de secvenţa aminoacizilor din lanţ. Astăzi s-a stabilit că
proteinele având aceeaşi secvenţă a aminoacizilor pot exista în forme diferite de împachetare
şi că astfel de plieri pot fi influenţate de prezenţa altor proteine cunoscute sub numele de
molecule supraveghetoare tip scufiţă chaperones.

Fig. Proteine supraveghetoare tip scufiţă chaperones.

 Denaturarea şi renaturarea proteinelor
O proteină care posedă o proprietate biologică proprie, unică, se numeşte proteină
nativă şi ea se deosebeşte de proteina ce şi-a pierdut această proprietate şi pe care o numim de
aceea denaturată. O proteină denaturată şi-a pierdut structura tridimensională sau în alţi
termeni conformaţia sa.

Fig. Denaturarea reversibilă a proteinelor.

Denaturarea poate fi reversibilă sau ireversibilă. Un exemplu de denaturare

ireversibilă este cea termică aplicată la fierberea unui ou; albuşul oului (albumina) se
coagulează astfel ireversibil. De fapt acesta este un eveniment obişnuit în timpul gătitului
care face ca proteinele să fie mult mai uşor atacabile de către enzimele proteolitice după
ingestia mâncărurilor.
Denaturarea reversibilă se poate realiza prin folosirea atentă a unor reactivi ca ureea şi
mercaptoetalonul. Ureea distruge structura apei şi de aceea limitează interacţiunile hidrofobe
ale catenelor laterale R şi a resturile de aminoacizi, ceea ce duce la deplierea şi la disocierea
moleculelor proteice. Mercaptoetanolul reduce legăturile S-S. De aceea la îndepărtarea ureei
şi a mercatoetanolului, proteina s-ar putea renatura.

Fig. Denaturarea reversibilă sub acţiunea mercatoetanolului reduce legăturile S-S.

Renaturarea este interpretată ca o dovadă în sprijinul ipotezei că o proteină având o
structură primară corectă se va plia în mod spontan conducând la structura unică responsabilă
pentru activitatea sa biologică. Acest fenomen este denumit autoansamblare a proteinei.
Astăzi se ştie că renaturarea proteinelor poate fi produsă pe două căi. Una implică
proteina disulfid izomeraza o enzimă care are rolul de a corecta legăturile S-S greşit formate.
A doua cale implică structurile tip chaperone moleculare la care s- a mai făcut deja referire.
Ele se pot defini ca o familie de proteine din clase neânrudite care mediază asamblarea
corectă a altor polipeptide dar care nu sunt componente ale structurilor funcţionale asamblate.
 Degradarea proteinelor
Degradarea intracelulară a proteinelor se realizează prin două sisteme generale:
sistemul lizozomal şi sistemul ubiquitinei.
Sistemul ubiquitinei. Ubiquitina este o polipeptidă acidă de 76 aminoacizi care este
prezentă efectiv în toate tipurile celulare, de unde şi numele său. Ubiquitina este activată prin
interacţiunea ATP cu 2 enzime. Complexul rezultat se ataşează de proteina ţintă ce urmează a
fi degradată. Nu se ştie în totalitate modul cum sunt selectate proteinele-ţintă pentru
degradare, dar s-a constatat o corelaţie strânsă între natura aminoacidului N-terminal şi a
acelora care îl urmează, cu timpul de supravieţuire a unei proteine într-o celulă.
Figura…. arată distrugerea programată a proteinelor citosolice prin sistemul de
reperare al ubiquitinei. Aceste evenimente au loc într-un complex multiproteic numit
proteazom (proteasome), a cărui structură este acum cunoscută.

Fig. Degradarea proteinelor de către ubiquitinei.

Ciclul celular
Toate celulele vii urmează fie un un program de diviziune, fie o moarte programată,
numită apoptoza.
La celulele eucariote se pot distinge două faze în timpul diviziunii celulare, interfaza
perioadă în care celulele cresc şi mitoza, perioada în care nucleul şi restul celulei se divide. În
termeni temporali, mitoza ocupă cam 40% din timpul total al celulelor embrionare timpurii şi
mai puţin de 10% din timpul de viaţă al altor celule.
Viaţa celulei se derulează între 2 mitoze. La mamifere această perioadă este variabilă
(durează mai puţin de 30 de ore); sunt celule a căror viaţă este foarte scurtă sau foarte lungă.
 Pe această durata, celulele traversează 4 faze (Fig.):
- faza G1 unde genomul fiind diploid, fiecare genă este reprezentată în 2 exemplare.
Cromatina este accesibilă ARN polimerazelor care realizează transcripţia genelor în
ARNm care vor fi traduşi.
- la jumătatea ciclului începe replicarea ADN; ADN –polimeraza va acţiona în jur de 8 ore
(faza S) pentru a recopia în dublură ADN fiecărui cromozom. În timpul acestei faze
transcripţia este inhibată. Masa celulară creşte continuu în timp ce conţinutul de ADN
creşte în faza S şi scade brusc după faza S, astfel că ADN din celulele care nu se divid
este constant.
- celula intră în faza G2 unde fiecare genă este reprezentată în 4 exemplare. Cromatina este
din nou accesibilă ARN polimerazei care reâncepe transcripţia;
- survine mitoza care dă naştere la două celule fiice. Fiecare va primi una din copiile
identice din ADN fiecărui cromozom şi fiecare genă va fi reprezentată în două exemplare.

Fig. 59. Ciclu celular.

Ciclul celular are trei puncte de decizie sau restricţie. Proteina CDK a fost identificată
ca principalul reglator al trecerii prin aceste trei puncte. Se cunosc 3 puncte de control al
ciclului celular la eukariote
Celulele eukariote sunt controlate prin cicline dependente de proteikinaze. Aceste
secvenţe sunt specifice etapei G1 (Ciclina D-CDK4, Ciclina D-CDK6, Ciclina E-CDK2 )
fazei S (Ciclina A-CDK2) şi fazei G2 şi mitozei (Ciclina A-CDK1, Ciclina B-XDK1).
 Fig. Punctele de restricţie în cadrul ciclului celular.

În G1 complexul de prereplicare al ADN este defosforilat şi acesta se asamblează în

originea de replicare a cromozomului. Mai târziu în G1, G1CDK este sintetizat. Aceste
kinaze fosforilate activează anumiţi factori de transcripţie. O ţintă a acestor factori de
transcripţie sunt genele care codifică componente ale fazei S a complexului CDK. În acest
punct din faza S funcţia CDK este blocată prin inhibitori specifici. Pentru startul fazei S,
G1CDK fosforilează inhibitorii care degradează SCDK . Acesta eliberat de inhibitori este
activat şi fosforilează complexul de prereplicare inducând iniţierea replicării.

Fiecare cromozom replicat este format din două cromatide surori legate prin cohesine.
Complexul M CDK se formează în timpul fazei S şi G2 dar activitatea acestora este inhibată
până când sinteza ADN este completă. Activitatea MCDK începe în faza M şi este implicată
în fosforilarea unor substraturi multiple (Sic1). Primul este complexul promotor al anfazei
APC care este activat. Acesta are ca ţintă cohesinele reglatoare care degradate permit
segregarea cromatidelor surori. APC degradează complezul MCDK rezultat în finalul
mitozei.

Rolul factorilor de creştere în diviziunea celulară

Creşterea celulară este determinată de legarea proteinelor reglatoare numite factori de
creştere care stimulează diviziunea celulară.
Celula prezintă la suprafaţă receptori specifici care recunosc factorii de creştere.Factorul
de creştere dă startul sistemelor semnal intracelulare.
Legătura factorului de creştere provoacă o mişcare în cascadă a semnalelor intracelulare,
determinând fosforilarea proteinelor care activează proteinele reglatoare nucleare şi se
declanşează diviziunea celulară.
 De exemplu proteina retinoblastoma Rb este o proteină care interacţioneză cu multe
proteine reglatoare cheie ale ciclului celular, dependente de fosforilare. Când Rb este
defosforilată, ea se leagă de proteinele reglatoare cum ar fi myc, care sunt proteine
necesare proliferării celulelor. După fosforilare, proteinele Rb activate, eliberează
proteinele reglatoare myc care pot acţiona ca promotor pentru diviziunea celulară.
Rb libere sunt inhibate, celulele încep să producă proteinkinaze dependente de cicline
care preced diviziunea celulei.

Cromatina şi ADN
În cursul fazelor ciclului celular, cromozomii evoluează pentru a pregăti mitoza. În
timpul G1 cromatina este descompactată şi genele se pot exprima. Fiecare cromozom
nu conţine decât o cromatidă. În timpul S buclele de replicare se deschid şi începe replicarea.
În timpul fazei G2 cele 2 cromatide rezultate din replicări sunt legate prin centromerii lor.
Sunt două cromatide pentru un cromozom. În timpul mitozei centromerul se leagă de fusul
acromatidic şi pregăteşte separarea. Cromatina este compactă la maxim; după mitoză,
cromatina este decompactată şi genele se pot exprima în fiecare din celulele fiice.

Fig. 60 Cromozomi.

REPLICAREA
Replicare semiconservativă in vivo
ADN se replică în celulă printr-un proces care asigură ca una din catenele parentale să fie
prezentă în moleculele fiice, aşa numita replicare semiconservativă.
Replicarea reprezintă sinteza ADN care reproduce exact genomul unei celule în cursul
ciclului celular, cu scopul de a pregăti diviziunea acestei celule. În cursul vieţii celulei ADN
trebuie să fie dedublat pentru că fiecare celulă fiică să capete un genom complet în nucleul
său.
Această sinteză se produce în faza S (în mijlocul ciclului celular) ca urmare a
activităţii ADN polimeraza δ şi α . Alte ADN polimeraza participă la repararea ADN lizat
(ADN polimeraza δ ) sau a replicării ADN mitocondrial (ADN polimeraza γ ).

Replicarea semiconservativă

Cele 2 lanţuri de ADN parental în curs de replicare servesc fiecare ca model pentru
sinteza noului lanţ. În acest mod 2 catene în loc să rămânână ansamblate la fiecare sinteză
(replicarea conservativă) se separă totdeauna la fiecare ciclu (replicare semiconservativă, Fig.
61). La prima generaţie o catenă a fiecărui dublu helix provine din celula mamă. La a II-a
generaţie nu există mai mult de două catene ADN a celulei mame, 4 dublu helixuri.

Fig. 61. Replicarea semi-conservativă.

Enzimele implicate în replicare

ADN este sintetizat de enzime numite ADNpolimeraze, fiecare dintre acestea
utilizând dezoxinucleozid trifosfaţi ca substraturi; polinucleotidul este sintetizat în direcţia 5'-
3'. Matriţa de ADN este utilizată pentru a direcţiona ordinea bazelor azotate în
polinucleotidul nou sintetizat care devine complementar cu ADN parental.
Se cunosc trei tipuri de ADN polimeraze la E. coli.
-ADN polimeraza III ,
-ADN polimeraza I
- ADN ligaza
. Fragmentele de ADN sunt legate prin acţiunea enzimei ADN ligaza. Această enzimă
joacă un rol atât în sinteza in vivo a ADN, cât şi în repararea unor rupturi monocatenare ale
ADN. În celulele animale, se formează ca intermediar un complex covalent enzimă-AMP. În
bacterii, ATP este înlocuit de NAD+.

Replicarea ADN dublu catenar

Pentru a explica creşterea aparentă a ambelor catene a ADN în aceeaşi direcţie în timp
ce enzimele sintetizează noi catene numai într-o direcţie 5'-3', s-a postulat că una dintre
catene a fost întâi sintetizată în fragmente. Când ADN a fost examinat la scurt timp după
startul sitezei, au fost găsite mici fragmente numite Okazaki după numele celui care le-a
descoperit.
 Rolul ARN în biosinteza ADN
Sinteza oricărei molecule de ADN este iniţiată prin sinteza unui lanţ scurt de ARN,
din nou în direcţia 5'-3', folosind nucleozid trifosfaţi (NTPs) ca substrat, prin intermediul
unei enzime numită ARN primaza. Enzima este selectivă privind situsul de iniţiere a
sintezei. În catena conducătoare numai o amorsă este sintetizată. În catena întârziată,
sunt implicate multe locuri de iniţiere pe măsură ce catenele de ADN parental se separă.
Amorsa ARN este eliminată de ARN polimeraza I şi spaţiile lipsă sunt completate prin
acţiunea acestei enzime. Fragmentele sunt unite de ADN ligază. Acest mecanism duce la
probleme legate de replicarea capetelor cromozomiale, numite telomere. Telomeraza rezolvă
această problemă.

Sistemul multienzimatic pentru sinteza ADN la procariote

Replicarea este iniţiată în zona numită originea replicării şi debutează prin formarea
furcii de replicare.
Cel puţin 15 enzime şi proteine acţionează în furca de replicare bidirecţională a ADN
la E.coli corespunzând la peste 30 de polipeptide. Proteina dnaA se leagă la ADN după care
se ataşează la complex proteinele dnaB şi dnaC.
DnaB este o helicază care catalizează dezrăsucirea lanţului dublu catenar,
dependent de energia ATP. Porţiunea monocatenară liberă a ADN este apoi stabilizată de
proteinele de legare SSB (Single Stranded Binding protein). O amorsă ARN este sintetizată
de către ARN primază într-un ansamblu multisubunitar numit primozom. La terminarea
replicării amorsa va fi eliminată de către ADN prin polimeraza I. Un nou ADN este
sintetizat de către polimerazaIII, holoenzimă formată din opt lanţuri polipeptidice. ADN aflat
în faţa polimerazei pe catena conducătoare nu este afectat de helicază (proteina Rep). Pe
lanţul întârziat, spaţiile lipsă dintre fragmentele de ADN sunt umplute de ADNpolimeraza I şi
fragmentele sunt unite de ADNligaze.
Dacă genomul unui virus este format din ADN, replicarea are loc în mod similar cu
cel descris la o celulă normală. Virusurile au capacitatea de a dirija şi utiliza metabolismul
normal al unei celule astfel încât în cazul fagilor de liză, de exemplu, infecţia cauzează
înlocuirea replicării ADN cu replicarea ADN fagic.

Bucla de replicare la eukariote

Cel puţin 4 ADN polimeraze au fost identificate la eucariote. Acestea sunt
denumite prin litere greceşti α şi β sunt implicate în sinteza ADN nuclear, β în reparare şi γ în
replicarea ADN mitocondrial.
ADN polimerazele încep sinteza în numeroase puncte de iniţiere.
În urma legării proteinelor specifice, dublul helix se deschide pentru a permite
demarajul. Sinteza ADN începe pe amorsa ADN/ARN constituită de ARNprimază şi
ADN polimeraza. Replicarea se desfăşoară într-o direcţie – în acest sens unul din cele 2
lanţuri de ADN (lanţul sens) este parcurs de enzimă în sensul 3′ -5′ (pe catena antisens), ceea
ce permite sinteza unui alt lanţ în direcţia 5′ -3′ . ADN ligazele asigură apoi legarea între
diferitele fragmente ale ADN nou.
 Fig. 65. Furca de replicare
.
Sinteza celeilalte catene (lanţul întârziat) este mult mai complexă deoarece enzima
parcurge acest lanţ de la 5′ -3′ . Primaza şi ADN polimeraza α sintetizează o amorsă de 30
nucletoide înainte de zona de replicare şi ADN polimeraza construieşte secvenţe mici de
fragmente de ADN în sensul 5′ -3′ (în jur de 200 nucleotide- fragmentele Okazaki).
Ribonucleazele distrug amorsele ARN (fragmentele Okazaki sunt unite între ele prin ADN
ligaze).

Furca de replicare
Replicarea începe prin separarea celor două catene ale ADN prin helicaze. Fiecare din
cele două lanţuri sunt stabilizate prin SSB (single strand baund).
Pe catena directă, urcând de la 3′ la 5′ , o ADN polimeraza δ şi ARN primaza
sintetizează un lanţ complementar adăugând dezoxiribonucleotide trifosfat la extremitatea
3′ OH liberă. Un nou dublu helix se formează între lanţul matriţă directă şi noua catenă
sintetizată.
Pe lanţul întârziat o polimerază, ADN polimeraza δ şi ARNprimaza progresează de
la 5′→3’. Pentru a putea sintetiza un lanţ complementar, trebuie ca ARNprimaza şi ADN
polimerazei α , să fabrice amorse destul de apropiate (amorsa 3 în fig. 65) la câteva sute de
nucleotide distanţa pe lanţul matriţă. Începând de la 3′ OH a unei amorse ADN polimeraza α
sintetizează un fragment Okazaki până când întâlneşte extremitatea 5′ trifosfat a amorsei
precedente.
 Fig.67. Enzimele implicate în replicare.

Amorsa este hidrolizată de o nuclează ceea ce permite ADN polimerazei δ să

realizeze sinteza unui fragment Okazaki, pe care ADN ligaza îl va lega definitiv pe ADN în
fragmentul definitiv. Un nou dublu helix se formează între catena matriţă directă şi noul lanţ
sintetizat. Toate aceste proteine sunt asociate într-o structură a nucleului (uzina de replicare)
care traversează moleculele de ADN. Această uzină de replicare conţine enzime de preparare
a substratului, nucleotid kinaze, ribonucleaze, reductaze etc.
Topoizomeraza I şi helicaza
Replicarea ADN necesită o fuziune parţială în dublu helix care modifică înrularea
celor 2 catene. Pentru a permite această reacţie, topoizomeraza este capabilă să modifice
rularea hidrolizând o catenă de ADN şi reconstituind-o după ce a fost derăsucită local, pasul
helixului ajunge la 10 perechi de nucleotide pe tură. În cursul replicării şi al transducţiei pasul
helixului diminuează. Polimerază şi helicaza (topoizomeraza) lucrează pentru creşterea
pasului. Înapoia polimerazelor şi topoizomerazelor, are loc reconstituirea dublului helix
(împachetarea).

Fig. Helicaza şi topoizomeraza I.

Primaza. Demararea acţiunii sale are loc la extremitatea 3′ OH terminală a lanţului

ADN Ultima ribonucleotidă a amorsei, legată de catena ADN care serveşte ca model, va
constitui punctul de iniţiere a activităţii ADN polimeraza α .
Dacă această nucleotidă nu este împerecheată ea se va hidroliza împiedicând sinteza
ADN.
Amorsa este creată pornind de la o polimerază ARN paticulară (fără legătură cu cele
de transcripţie), care poate începe prin a sintetiza 10 nucleotide a unui ARN hibrid, folosind
un ADN model. Prima nucleotidă a acestei amorse se păstrează, cei 3 fosfaţi se prind la
capătul celei de-a10-a ribonucleotide a ADN polimeraza α şi începe condensarea a 20
dezoxiribonucleotide.
Amorsa va fi construită deci dintr-o catenă mixtă ARN – ADN, din circa 30
nucleotide.
 Fig.68 Primaza.

ADN ligazele
ADN ligazele sunt enzime care sunt capabile de reconstituirea legăturilor fosfodiester
între 3′ OH şi fosfatul 5′ a două nucleotide vecine dintr-un lanţ de ADN.
Ele intervin în replicare pentru a lega ansamblul lanţului ADN sau fragmentelor
Okazaki sintetizate de ADN polimeraze.
Intervin de asemenea în numeroase procese de repararea a ADN genomic.

Fig. Ligaza.

Telomerazele

Sinteza lanţului întârziat a ADN, nu se poate face dacă ADN polimeraza atinge
extremitatea 3′ a catenei matrice. Dacă n-ar avea mecanisme particulare, la fiecare replicare
ADN cromozomial ar fi scurtat.
Telomerul sau secvenţa de ADN a extremităţilor cromozomilor, este o secvenţă
5′ TTAGGG-3′ repetat de sute de ori înainte de 3′ OH final.
 Fig. 69. Telomerazele

Teleomeraza este o ADN polimerază care poate continua sinteza unui ADN
monocatenar. Această enzimă conţine un ARN a cărei extremitate 5′ terminală este 5′
CUAAGCCUAAC 3’. Această extremitate serveşte ca model pentru enzimă în vederea
sintezei câtorva unităţi de repetiţie TTAGGG. După această sinteză enzima glisează în lungul
lanţului ADN şi reâncep noi unităţi. Extremitatea 3′ a catenei matriţă astfel alungită poate
servi pentru ataşarea unei amorse noi; extremitatea 3′ OH a acestei amorse serveşte deci ca
punct de pornire pentru ADN polimeraza δ pentru sinteza acestui lanţ.

Reparaţiile ADN

Corectarea unei împerecheri greşite, sau a lipsei de complementaritate între

nucleotidele celor două catene, ale unui fragment de ADN, sunt denumite reparaţii ADN.
Replicarea sau conservarea structurii primare ADN poate să nu fie perfectă. Dacă
ADN este lezat, sau replicat incorect rezultă că nuclotidele situate pe cele 2 catene nu mai
sunt complementare (AT sau CG).
Se spune că are loc o împerechere greşită între nucleotide. Repararea vizează
înlocuirea unei baze azotate, sau a unei nucleotide, sau a unui fragment de acid nucleic, de
către nucleotide complementare secvenţei celeilalte catene.
Replicarea fiind semiconservativă una din cele două catene este independentă ca
matrice şi cealaltă catenă va fi reparată. Mai multe mecanisme de reparaţie permit înlocuirea
unei baze, unei nucleotide sau a unui fragment mai puţin lung de ADN.
Bazele greşite, lezate
Natura chimică a bazelor azotate este esenţială pentru mesajul genetic. Numeroase
modificări ale acestor baze pot antrena mutaţii.
Modificările chimice sunt reprezentate de:
- dezaminarea adeninei şi hipoxantinei, în care hipoxantina este preferenţial complementară
cu C mai mult decât cu timina;
- metilarea citozinei, în 5 metil citozină, o face mai complementară pe A decât G.
Mutaţia, rezultă din legături anormale între baze nucleotidice vecine precum dimerii
timinei. Căldură angajată în reacţia de hidroliză a bazelor adesea a purinelor, conduce la
situsuri apurinice (fără purine). Agenţii chimici din mediu pot fi mutageni. Astfel, există
analogi ai structurii bazelor, care dau nucleotide anormale, precum 5-bromuracilul care se
hibridează preferenţial cu guanina, sau două aminopurine care se leagă de citozină. Unii
agenţi mutageni ca 2 metilnitrosamină reacţionează între baze, sau în interiorul dublului helix
ca bromura de etidiu.

Excizia bazelor lezate

Înaintea unei baze deteriorate reparaţia se poate face prin simpla excizie a bazei
urmată de înlocuirea cu o bază a nucleotidei normale.
Excizia se face printr-o ADN glicozilaza care deschide dublul helix, apoi hidrolizează
legătura N glicozidică a bazei lezate şi lasă o nucleotidă apurinică (lipsită de baze- Fig. 70).

Fig.70 Excizia de baze.

Reparaţia se va face printr-o ADN polimeraza de reparare, sau ADN polimeraza β ,

care hidrolizează nucleotida apurinică, apoi înlocuieşte nucleotida ataşată la extremitatea
3′ OH liberă şi breşa va fi închisă de ADN ligaza. Aceasta reconstituie legătura fosfodiester
în poziţia 3′ a nucleotidei adăugate.

Repararea, corectarea împerecherilor greşite

Unele baze azotate din ADN existent, sub mai multe forme tautomere, rezultă prin
deplasarea inconstantă a hidrolizei şi trecerea fracţiunii amino în enol. Aceste forme sunt mai
rare într-un ADN matriţă în curs de replicare; unele baze pot fi momentan sub formă
tautomeră.
Forma tautomeră a adeninei este imino-adenina, care nu se hibridează cu timina ci cu
citozina. La fel enol timina se hibrideaza mai bine cu guanina, decît cu adenina şi enol
guanina se leagă cu timina mai bine decât cu citozina.
Astfel ADN polimeraza, va condensa pe ADN-ul pe care-l construieşte, baze azotate
diferite faţă de cele normale (aşteptate). Dacă bazele azotate ale catenei model vor lua forma
obişnuită, ele nu se vor putea hibrida cu bazele catenei noi şi vor rezulta împerecheri greşite
(Fig 71).
 Fig.71 Imperecheri greşite.

Transmiterea împerecherilor greşite

O împerechere greşită face să apară 2 nucleotide necomplementare în aceeaşi poziţie a
catenelor de ADN. Fiecare din cele 2 catene în cursul mitozei următoare se vor replica
producând o nucleotidă complementară. Nucleotida anormală, va angaja o tranziţie
permanentă într-una din cele 2 celule fiice. In fig. 72, se află pe lanţurile parentale o pereche
de nucleotide A=T. La generaţia următoare, lanţul care posedă A, în urma unei iminizări,
produce o catenă complementară cu citozina, în loc de timina aşteptată (C=A). În altă celulă
secvenţa este normală T=A. Începând de aici toate celulele în care ADN a fost replicat de la
catena purtătoare de substituţie, vor avea la acest nivel o pereche G=C. Substituţia a devenit
permanentă. Dacă ea este situată într-o genă poate determina o mutaţie (Fig 72).
 Fig 72.Transmiterea împerecherilor greşite

Excizia unui fragment lung de ADN

Dacă un fragment de ADN este lezat, simpla excizie a unei baze nu este suficientă
pentru reparaţie (în special împerecherile greşite de transcriere care nu vor fi reparate de
ADN polimeraza gama) şi în cursul replicării sunt imediat repetate, deoarece dublul helix nu
se formează normal.

Fig. 73. Excizia unui fragment lung.

O endonuclează secţionează catena purtătoare a leziunii, la o distanţă de 5 nucleotide.

Apoi sub efectul unei topoizomeraze şi a unei helicaze (sau factorul TFIIH), catena lezată
este separată de catenele normale. Începând de la extremitatea 3′ OH a breşei astfel creată, o
ADN polimeraza β reconstituie fragmentul complementar şi ultima legătură va fi inclusă
prin ADN ligaza.

Modelul Holliday
Deschiderea unei breşe într-o catenă ADN şi derularea dublului helix, permit unor
fragmente de ADN monocatenar să se hibrideze cu secvenţele complementare ale
cromozomului omolog. În cazul unor greşeli capetele celor 2 catene schimbate, vor putea fi
reânchise prin ADN ligaza. O asemenea structură cu intercreşterea celor două catene ADN
omoloage se numeşte structură Holliday de la numele cercetătorului (1964). Această structură
este mobilă şi schimbul se poate propaga prin glisarea structurii de-a lungul celor două
helixuri mergând în acelaşi sens (Fig 74).
 Fig.74 Model Holliday.

Se poate reprezenta structura Holliday separând helixurile în formă de cruce. Aceasta

permite să se observe că există două moduri de separare a celor două helixuri, fie secţionând
orizontal şi obţinând o schimbare a fragmentelor de ADN între 2 cromozomi, fie secţionând
vertical şi ajungând la un schimb complet de ADN între cei doi cromozomi, deasupra
punctului de încrucişare.

Crossing-over

Schimburile între cromozomii omologi pot duce la schimbul de fragmente, sau de

catene întregi de ADN. În meioză, în special, aceste schimburi se produc frecvent între
cromozomul de origine maternă şi paternă, astfel încât genele cromozomilor din celulele fiice
(gameţi), sunt recombinări heterogene ale fragmentelor (Fig. 75).
Rezultatul implică un amestec de caractere ereditare ale celor doi părinţi şi constituie
patrimoniul noului individ. Schimburile garantează menţinerea fiecărei gene, a fiecui locus
sub formă de alelă homozigotă, sau heterozigotă.
 Fig. 75. Crossing –over

Mutaţii cromozomiale –macroleziuni

Căile de producere cunoscute sunt prin: mutaţie, inversie, translocaţie în interiorul

cromozomului.
Mutaţia, rezultă din legături anormale între baze nucleotidice vecine precum dimerii
timinei. Prin mutaţii cromozomiale se produc modificări substanţiale în structura acestora.
Dacă o regiune a cromozomului suferă deleţie, aceasta determină scăderea
materialului genetic în cromozomul mutant.
În duplicaţie are loc copierea unei regiuni existentă a cromozomului.
Ambele, duplicaţiile şi deleţiile pot fi create printr-un crossing-over anormal în timpul
meiozei.
Căldură degajată în reacţia de hidroliză a bazelor adesea a purinelor, conduce la
situsuri apurinice (fără purine).
Agenţii chimici din mediu pot fi mutageni. Astfel, există analogi ai bazelor, care dau
nucleotide anormale, precum 5-bromuracilul care se hibridează preferenţial cu guanina,
sau două aminopurine care se leagă de citozină.
Unii agenţi mutageni ca 2 metilnitrosamina reacţionează între baze, sau în interiorul
dublului helix similar bromurii de etidiu.

Inversia
Inversia reprezintă schimbarea orientării unei secvenţe ADN.
Se desfăşoară când cromozomul este fragmentat şi reconectat în două regiuni.
Regiunea desprinsă suferă o buclă internă, o întoarcere inversă, pierde succesiunea
normală, apoi este reconectată.
In inversie nu se schimbă cantitatea de material genetic din cromozom.
Inversia nu alterează expresia genelor numai dacă capătul inversiei se află în interiorul
genei.
 Translocaţia implică 2 cromozomi. Într-o translocaţie simplă o singură regiune a
unui cromozom se desprinde şi se ataşează la alt cromozom. Translocaţia poate fi şi
reciprocă. Inversia şi translocaţia pot conduce la deficienţe totale şi la duplicarea
materialului genetic după meioză.

Fig. Translocatia cromozomilor.

Modificări structurale ale genelor sau microleziuni

Căile de producere cunoscute sunt prin: duplicaţie, amplificarea, fuziunea genelor

deleţie, inserţia, mutaţii punctuale în interiorul cromozomului.
Duplicaţia, multiplicarea, repetiţia unui fragment de ADN poate cuprinde o genă în
întregime sau un fragment, se poate realiza în acelaşi sens sau în sens invers faţă de gena
duplicată.
Amplificarea este multiplicarea în tandem a secvenţelor obişnuit unice (mărimea
tandemului fiind considerabilă).
Fuziunea genelor este rezultatul unui rearanjament cu dublă rupere a două gene
diferite şi transpoziţia de la una la alta.
Inserţia reprezintă introducerea unei secvenţe de transpozoni sau secvenţe virale într-
o genă. Se face prin mecanisme complexe: recombinare inegală, translocaţie, conversie
genică, bucle cromatidice.
-
Substituţia
Reamplasarea, sau înlocuirea unei nucleotide prin alta, în structura primară a unui
acid nucleic poartă denumirea de substituţie.
O substituţie poate conduce la rezultate foarte diferite după transducţie. Aceasta depinde
de poziţie în raport cu cadrul lecturii. Într-un codon, se poate traduce prin acelaşi aminoacid
se spune că substituţia este sinonimă sau silenţioasă. Nu va avea loc modificarea
aminoacidului tradus, deci nici a proteinei rezultate prin transducţie.
Substituţie missens, tip de mutaţie prin substituţia nucleotidelor care determină
modificarea unui anumit codon astfel încât el codifică alt aminoacid decât acela pe care-l
codifica normal. În cadrul substituţiei pot avea loc tranziţii şi transversii ale nucleotidelor.
Tranziţia sau mutaţia punctuală în care o bază purinică este transformată în alta
purinică G-A sau pirimidinică în alta pirimidinică C-T.
Transversia este mutaţia punctuală în care o bază purinică este transformată în
pirimidinică G-T sau pirimidinică în purinică C-A.
Substituţia non sens se produce în molecula de ADN, şi determină înlocuirea într-un
ARNm al unui codon sens, cu unul non-sens, care codifică un aminoacid diferit.
Prin traducerea acestui ARNm rezultă un polipeptid trunchiat.
O substituţie într-un codon poate fi tradusă printr-un codon de terminare: se spune că este
non-sens. Proteina tradusă va fi întreruptă în acest loc.
 Polimorfismul Xba al lipoproteinei apoB

Polimorfismul de restricţie Xba I a apolipoproteinei B rezultă dintr-o substituţie T-C

sinonimă, care face să dispară un situs de restricţie Xba I (TCTAGA) de pe ADN-ul unor
subiecţi. Această substituţie nu antrenează mutaţii apoB şi nu are deci, nici o consecinţă
directă asupra sănătăţii subiectului. Totuşi subiecţii purtători ai genomului X2 pe cele 2 gene
apoB (homozigote) au o concentraţie mai mare de apoB. Lipidele sanguine sunt mai scăzute
decât la subiecţii genotipului X1 şi în consecinţă au un risc mai redus de a suferi formarea de
ateroame şi boli cardiovasculare. Legătura între acest polimorfism şi lipidele sanguine este
încă necunoscută.

Fig. 77 Polimorfismul Xba al lipoproteinei apo B

Schimbarea permanentă a structurii ADN conduce la o structură primară diferită şi

devenită permanentă în proteina exprimată.

Mutaţia
Mutaţii punctuale constau în substituţie, supresie (lipsă) sau adiţia de baze. Se
realizează prin:
- depurinare (pierderea purinelor)
- dezaminare (citozina metilată trece în timină pe catena sens şi G-A pe catena
antisens)
- erori de replicare sau de reparaţie.
Mutaţii în regiunile codante determină schimbarea unui aminoacid din proteină şi a
funcţiei proteinei.
Mutaţiile silenţioase liniştite modifică codonul dar nu şi aminoacidul. Foarte rar
determină eliminarea exonului (episajul).
Mutaţiile non-sens duc la formarea unui codon STOP, UAA, UAG, UGA şi proteina
este astfel întreruptă adesea nefuncţională sau cu activitate reziduală redusă. Uneori
determină şi episajul exonilor.
Atunci când o substituţie nesinonimă se produce în ADN -ul unui subiect (genotip) şi
conduce la încorporarea unui aminoacid diferit în structura primară a unei proteine are ca
rezultat apariţia unor caractere diferite (mutaţie), în fenotipul individului.
 Fig. Tipuri de mutaţii.

Orice altă modificare antrenând o proteină tradusă mai lungă, sau foarte scurtă, sau un
decalaj în citirea codonilor se traduce printr-o secvenţă primară diferită şi deci în majoritatea
cazurilor o mutaţie în fenotipul individului.

Fig. Mutaţia

Mutaţia Arg 3500 →Gln apoB

Mutaţia 3500 a apolipoproteinei B-100 rezultă dintr-o substituţie nesinonimă G-A.

Astfel prin transducţie se înlocuieşte în poziţia 3500 aminoacidul; arginina va fi glutamina
din proteina apoB-100.
Astfel în locul argininei va fi glutamina (Fig. 78).
Prezenţa acestei mutaţii nu antrenează modificări ale situsului de restricţie şi ele nu
pot fi detectate direct printr-un polimorfism a lungimii fragmentelor de restricţie (RFLP).
Prezenţa acestei mutaţii regăsită în Franţa la o persoană din 500, este un factor de risc vis-a-
vis de ateroame şi boli cardiovasculare, deoarece ea perturbă legătura apolipoproteinei B-100
cu receptori celulari ai lipoproteinelor cu densitate mică (LDL).
 Fig 78. Mutaţia Arg 3500 →Gln apoB

Mutaţii prin adiţie şi deleţie

Segmente mari sunt inserate sau pierdute de către genom. Cauzează achiziţionarea sau
pierderea uneea sau mai multor gene.
Proporţia erorilor dată de ADN polimeraza este de 1 până la 5 mutaţii per replicare. ADN
polimeraza ar trebui să fie capabilă să găsească mutaţia uşor.
Mutagenii
Agenţi care induc mutaţii. Multe survin natural.
Pot fi utilizate în laborator pentru a creşte rata mutaţiilor şi şansele izolării mutantelor de
interes
Mutaţiile care perturbă citirea
Inserţia sau deleţia unei baze în regiunea codantă decalează cadrul de citire şi
determină apariţia unui codon stop după mai multe baze (10-100 de la mutaţie).

Mutaţii care controlează expresia unei gene

Sunt situate în zona reglatoare a genei de exemplu:
- în promotor la nivelul codonului de iniţiere a transcripţiei sau la nivelul situsului de
poliadenilare. Pot fi situate pe gene codante pentru proteine care intervin în reglarea
expresiei, exemplu gene codante pentru factori de transcripţie.
Mutaţii de replicare sau dinamice
Sunt erori ale replicării mitotice sau premeiotice care determină o alunecare a unor
zone presupuse instabile ale genomului. Ele determină o amplificare (mutaţie dinamică) sau o
reducere a zonelor repetate. Persistă mai multe generaţii şi cresc în cursul generaţiilor. Se
regăsesc în anumite maladii genetice pentru care s-au observat fenomenul de anticipare şi
rezultatul instabilităţii repetiţiei di sau trinucleotidice. Exemplu, numărul de repetiţii de
trinucleotide este foarte variabil în genom de la un subiect la altul (polimorfism multialelic).
Aceste repetiţii de trinucleotide sunt utilizate ca markeri genetici. Totuşi când se depăşeşte un
anumit număr de repetiţii pe locus au efect patologic.
Mutaţiile genetice sunt responsabile de expansiunea secvenţelor scurte (CGG) în
boala X fragil (cu număr de repetiţii peste 50). Într-o primă generaţie se observă o premutaţie
care conţine un număr de repetiţii peste normal. În generaţia următoare creşte numărul
premutaţia devine mutaţie şi apare boala la o vârstă precoce. Aceste expansiuni îşi schimbă
talia mărimea în timpul transmiterii bolii de la părinţi la copii (cromozomul X).
Aceste mutaţii sunt dinamice şi explică variabilitatea fenotipului, penetranţa şi
variabilitatea bolilor genetice în care apar.
Mutaţiile prin inserţia de elemente mobile
 Inserţia de transpozoni secvenţe LINE sau Alu se poate produce într-o genă prin
retrotranspoziţie.
Amprenta parentală
Se poate determina originea maternă sau paternă a unei gene prin markeri polimorfi.
Expresia fenotipică a unor mutaţii diferă dacă afectează un cromozom de origine
maternă sau paternă fenomen numit amprentă parentală. S-a studiat unul dintre
mecanisme, metilarea unor gene, care se face diferit pe cromozomii materni şi paterni în
timpul gametogenezei.
Mutaţii în mitocondrie
Sunt transmise de mamă şi se pot observa toate tipurile întâlnite şi la ADN nuclear.

Mutagenii chimici
Ei determină citirea greşită a ADN în timpul replicării determinând -mutaţie-
principiul care stă la baza acţiunii unor citostace
-baze analoage

Radiaţiile ca factori mutageni

Razele UV (260 nm) şi radiaţiile solare cu lungime de undă mică determină formarea
de dimeri de pirimidină prin legături
– C=C; T=T. ADN pol citeşte greşit rezultând mutaţii
Radiaţii Ionizante
Se caracterizează prin: energie mare, fragmentează ADN, având efect letal.
5-Bromouracil seamănă cu T din ADN şi se împerechează cu G-intercalată.
Bromura de Ethidium - distorsionează topografia DNA.
Agenţi Alkilanţi- introduc grupări alkil (metil, etil) în bazele componente ale ADN şi
perturbă citirea.

Testul Ames pentru Carcinogeneză

Foloseşte Salmonella enterica: o tulpină care nu sintetizează histidina. Se cultivă pe
mediu fără histidină. Substanţa chimică de testat (medicament) se introduce în mediu în
microcomprimat (ca pentru antibiogramă).
Dacă substanţa este mutagenă în jurul microcomprimatului se dezvoltă un nr. mare de
colonii (mutante, revertante). Dacă substanţa nu este mutagenă în mediu se dezvoltă un nr.
mic de colonii (mutante, revertante). Pentru a testa dacă substanţa devine cancerigenă după
metabolizare în ficat se pretratează mediul de cultură cu extract de ficat
Fig. Test Ames . a.Negative nemutagen; b. pozitiv- mutagen
Mediile conţin substanţe carcinogene

Mutaţii somatice şi germinative

Efectul unei mutaţii este diferit atunci când această mutaţie afectează ADN unei
celule somatice sau a unei celule din linia germinală (Fig. 79).
Fig. 79. Mutaţii somatice şi germinative.

Atunci când ADN-ul unei celule somatice este modificat şi când rezultă o mutaţie,
celulele care iau naştere din aceste celule mutante formează o clonă celulară, care prezintă
caractere diferenţiate de cele ale ţesutului de origine. Astfel, de clone structurează adesea
tumorile canceroase. Mutaţiile somatice nu sunt transmise la descendenţi.
Dacă ADN unor celule germinative este modificat şi rezultă o mutaţie aceasta se va
transmite la gameţi şi va apare la descendenţi: mutaţia este deci ereditară.

Mutaţia unui situs de matisare

Activitatea unui situs criptic de episaj

În afara zonelor de episaj normal există situsuri criptice care pot fi active. Pot fi
situate în exon producându-se episaj anormal al exonului sau în intron, o porţiune din intron,
regăsindu-se în paralel, în produsul transcris matur. Cel mai adesea apare un codon STOP în
aval.
O substituţie, poate altera un situs de legare. Astfel, situsul donator a intronului 3 a
apoAII este transformat din GT în AT într-o familie de bolnavi, ceea ce-l face inactiv pentru
excizia acestui intron.
Există în mijlocul exonului 3, o secvenţă care poate servi ca situs donator alternativ
dar, care este normal inactiv (situs donor criptic). În absenţa situsului donator normal, acest
situs criptic va servi la excizia intronului 3. Dar cum acest situs criptic este situat la 65
nucleotide în amonte de acest situs normal, vor exista 22 aminoacizi ai exonului 3 care nu vor
fi traduşi. Pe de altă parte numărul de nucleotide pierdute nefiind un nultimplu de 3, va avea
loc un decalaj al cadrului de citire, cel care antrenează o traducere falsă a primilor 10
aminoacizi ai exonului 4 şi întâlnirea unui codon STOP prematur (Fig. 80).
Proteinele întrerupte nu se exprimă şi apolipoproteinemia AII este absentă din plasma
acestor bolnavi.
Fig 80. Mutaţia unui situs de episaj sau matisare.