Sunteți pe pagina 1din 18

Protocol de cercetare

Modularea răspunsului la radioterapie în cancerul de col uterin prin compuşi


biologici cu acţiune asupra mecanismelor moleculare ale cancerogenezei
- ANGIOCOL –
-
Proiect CNCSIS multianual de cercetare ştiinţifică ( PN-II- IDEI-PCE-2008-2).
Cod: 1532
Perioada de derulare: 2009-2011

Director proiect: NAGY VIORICA MAGDALENA

Echipa de cercetare

BALACESCU OVIDIU
BUIGA RARES POTCOAVA
BRIE IOANA CARMEN
LELUTIU LUMINITA
TODOR NICOLAE
TUDORAN OANA

Universitatea de Medicină şi Farmacie “Iuliu Haţieganu”


Institutul Oncologic “Prof.I.Chiricuţă”
Cluj-Napoca
2009

1
CUPRINS

1. INTRODUCERE

2. OBIECTIVELE STUDIULUI

3. METODOLOGIA CERCETǍRII

3.1. Includerea în studiu a pacientelor cu cancer de col uterin

3.2. Includerea în studiu a pacientelor cu afecţiuni benigne ale colului uterin

3.3. Înregistrarea în baza de date

3.4. Protocol de recoltare probe biologice

3.5. Protocol experimental de anatomie patologică

3.6. Protocol experimental de genomică funcţională

3.7. Determinarea nivelului seric si din piesele tumorale de exereză chirurgicala a


EGFR, VEGFR SI COX -2

3.8. Protocolul cercetării clinice

4. ANEXE
4.1. Consimţământ informat
4.2. Schemă Angiocol

2
1. INTRODUCERE

Cancerul de col uterin pe plan mondial se află pe locul doi în rândul tumorilor
maligne la femei, anual înregistrându-se aproximativ 500 000 cazuri noi şi 250 000 de
decese. 45% din femeile diagnosticate cu cancer de col uterin au vârsta între 40-50 ani.
Deşi cancerul de col uterin este o boală prevenibilă, în România reprezintă o problemă de
sănătate publică, anual fiind înregistrate cca 3500 cazuri noi şi 1900 decese, situându-ne
pe primul loc în Europa în privinţa incidenţei şi mortalităţii prin cancer de col uterin. Din
cazurile noi diagnosticate cca 70% sunt în stadii avansate, în care rezultatele
tratamentelor clasice (chirurgia, radioterapia, şi mai nou chimioterapia) sunt modeste: în
stadiul IIB 70% supravieţuire la 5 ani, în stadiul IIIA 50%, în stadiul IIIB 40-30%, iar în
stadiul IVA 10%.
Tratamentul clasic al cancerului de col uterin este chirurgia şi radioterapia (RT), iar
ca rezultat al cercetărilor din ultimii zece ani standardul de aur al stadiilor avansate sau a
stadiilor incipiente dar cu risc crecut de eşec a devenit radio-chimioterapia (RCT)
concomitentă, care s-a dovedit superioară radioterapiei singure, ducând la o îmbunătăţire
semnificativă, cu 15% a supravieţuirii generale. Cu toate acestea aproximativ 50% din
paciente prezintă recidivă locală sau metastaze la distanţă în primii doi ani după
tratamentul iniţial. Deoarece valorificarea factorilor de prognostic clinici şi histologici
validaţi, precum şi eficacitatea tratmentelor clasice a ajuns la un platou, se impune
intensificarea tratamentelor actuale pe baza unor noi factori de prognostic şi introducerea
de noi strategii terapeutice.

Angiogeneza reprezintă o treaptă importantă în creşterea tumorală, motiv pentru care


este mult studiată prin investigarea unor biomarkeri, rezultatele studiilor publicate însă
sunt contradictorii şi în parte incomplete. Totusi, pe lângă valoarea lor prognostică,
inhibarea acestor biomarkeri ar putea avea efect terapeutic în mai multe situaţii.
Neovascularizaţia este o etapă importantă a progresiei tumorale de la leziunile in situ
la boala extinsă şi metastatică, de aceea pe baza unor modele preclinice, ţintirea vaselor
sanguine tumorale pare să fie o strategie anticanceroasă atractivă. În principiu tratamentul
antiangiogenic poate determina, pe lângă prevenirea formării de noi vase, sensibilizarea
celulelor endoteliale la efectul tratamentului citotoxic. Acest efect poate fi direct prin
blocarea moleculelor angiogenice care cresc supravieţuirea celulelor endoteliale (ex.
factorul de creştere endotelial vascular -VEGF) sau indirect, interferând cu recrutarea de
către factorii angiogenici a celulelor derivate din măduva osoasă la nivelul ţesutului
tumoral în vederea neovascularizaţiei. Astfel, deşi în fază incipientă de cercetare clinică,
combinarea tratamentelor ţintite angiogenice cu radio-chimioterapia actuală pare să
reprezinte o nouă modalitate de abordare fezabilă şi promiţătoare în mai multe cancere,
inclusiv în cancerul de col uterin.
Câteva din provocările combinării tratamentelor antiangiogenice cu radio-
chimioterapia sunt: monitorizarea răspunsului tumoral la substanţe antiangiogene,
utilizând biomarkeri pentru identificarea pacienţilor responsivi şi stabilirea dozelor
optimale; estimarea eficacităţii acestor noi regimuri care includ compuşi antiangiogenici;
prevenirea lipsei de răspuns la acest tip de tratament.

3
Densitatea microvascularizaiei (MVD – microvessel density) este studiată şi
considerată ca fiind o masură de evaluare a angiogenezei, luând în considerare posibila
influenţă negativă asupra supravieţuirii în cancerul de col uterin.

Expresia receptorului factorului de creştere epidermal (EGFR – epidermal growth


factor receptor) s-a dovedit în unele studii a fi un factor independent de prognostic
nefavorabil pentru cancerul de col uterin, în timp ce alte studii nu au confirmat acest
rezultat. Inhibarea EGFR în cursul RT pare a fi o strategie terapeutică promiţătoare în
unele carcinoame scuamoase. Astfel asocierea radioterapiei cu anticorpii EGFR (ex.
Cetuximab) în cancerele ORL poate duce la îmbunătăţirea controlului loco-regional şi a
supravieţuirii, în comparaţie cu radioterapia singură. Mecanismele care stau la baza
acestei asocieri încă nu sunt bine cunoscute, ele putând fi multiple: moartea celulelor
stem canceroase produsă direct de inhibitorii EGFR, radiosensibilizarea celulară produsă
de modificarea transducţiei semnalului, inhibarea reparării leziunilor ADN, reducerea
repopulării în cursul RT, etc. Aceste ipoteze impun studiul inhibitorilor EGFR şi a
eficacităţii lor in combinaţie cu alte tratamente, ca RT sau CT, precum şi studiul efectelor
secundare la nivelul ţesuturilor normale.

Factorul de creştere endotelial vascular (VEGF – vascular endothelial growth factor)


este o citokină cu funcţie centrală în angiogeneză. Acest factor este eliberat de celula
tumorală şi induce formarea reţelei capilare din jurul tumorii. Corelarea angiogenezei cu
prognosticul, respectiv răspunsul terapeutic, arată că expresia preterapeutică crescută a
VEGF tumoral, determinat imunohistochimic, pare să aibă impact nefavorabil asupra
prognosticului pacientelor cu cancer de col uterin, atât în ce priveşte supravieţuirea
generală, cât şi supravieţuirea fără semne de boală. Analiza imunohistochimică a
expresiei VEGF este o metodă rapidă de identificare a pacientelor cu risc crescut de
recidivă după RCT şi poate fi utilizată pentru identificarea pacientelor care pot beneficia
de alte metode terapeutice noi. VEGF a fost identificat în numeroase studii ca un factor
de prognostic independent pentru supravieţuire, în timp ce în alte studii nu s-a dovedit
influenţa sa asupra supravieţuirii. Mai mulţi investigatori au raportat corelarea expresiei
VEGF cu invazia tumorală sau metastazarea ganglionară. Ţintirea VEGF ca o nouă
strategie terapeutică este larg explorată în mai multe localizări tumorale.

Expresia Ciclooxygenazei-2 (COX-2) s-a observat a fi corelată cu invazia ganglionară


şi invazia parametrială în cancerul de col uterin. Expresia crescută a COX-2 la paciente
cu cancer de col uterin pare să fie un predictor al răspunsului slab la chimioterpia
neoadjuvantă şi al mortalităţii ridicate. Inhibarea COX-2 poate să crească
radiosensibilitatea tumorală fără să afecteze semnificativ răspunsul ţesuturilor normale la
iradiere].

Deşi s-au realizat numeroase cercetări, până la ora actuală sunt doar foarte puţine
studii care să investigheze concomitent mai mulţi biomarkeri la acelaşi lot de pacienţi
trataţi omogen. Câteva studii au descris impactul negativ al markerilor angiogenici în
cancerul de col uterin, dar cuantificarea angiogenezei este dificilă. Până la ora actuală
studiile publicate au fost retrospective, cuprinzând populaţii neomogene în ce priveşte
caracteristicile tumorale şi tratamentul aplicat. Rezultatele sunt contradictorii, neexistând

4
o concepţie unitară asupra utilităţii prognostice şi terapeutice a acestor biomarkeri în nici
o localizare tumorală, ceea ce impune noi cercetări în acest domeniu.
Validarea semnificaţiei prognostice a acestor biomarkeri ai angiogenezei tumorale,
corelarea acestora cu factorii de prognostici clinici (stadiu, volum tumoral, valoarea
preterapeutică a hemoglobinei, doza de iradiere), stabilirea impactului lor asupra
supravieţuirii în cancerul de col uterin poate deschide noi perspective în identificarea
pacientelor cu risc crescut de recidivă şi introducerea de noi strategii terapeutice ţintite,
cu scopul imbunătăţăirii rezultatelor actuale.
Pentru aceasta propunem un studiu prospectiv, care să cuprindă un grup omogen de
paciente, cu cancer de col uterin, stadiile IB-IIIB, incluse în două braţe terapeutice:
chirurgie primară (pentru stadiile incipiente), respectiv radio-chimioterapie concomitentă
(stadiile avansate), la care să fie evaluat un set de factori angiogenetici tumorali şi serici,
care vor fi analizaţi din punctul de vedere al valorii prognostice, a corelării cu factorii de
prognostici clinici cunoscuţi şi a capacităţii de a identifica pacientele cu risc crescut de
deces.

2. OBIECTIVELE STUDIULUI

Studiul de faţă propune examinarea unui pachet de biomarkeri ai angiogenezei în


cancerul de col uterin având mai multe scopuri:
- Cunoaşterea mai exactă a mecanismelor moleculare şi a istoriei naturale a bolii
- Identificarea şi validarea unor noi factori de prognostic
- Validarea unor factori predictivi ai răspunsului la radiochimioterapie
- Conturarea şi introducerea de noi strategii terapeutice cu potenţial curativ superior
celor clasice

Deşi în fază incipientă de cercetare clinică, combinarea tratamentelor ţintite


angiogenice cu radiochimioterapia actuală pare să reprezinte o nouă modalitate de
abordare fezabilă şi promiţătoare în mai multe cancere, inclusiv în cancerul de col uterin.
De interes deosebit în acest sens sunt:
- Factorul de creştere al endoteliului vascular (VEGF), în prezent considerat cel mai
important factor angiogenic, a cărui supraexpresie a fost observată în mai multe tipuri de
tumori. Totuşi valoarea prognostică a VEGF este încă controversată: unele studii au găsit
că valoarea preterapeutică crescută a VEGF este asociată cu risc crescut de eşec şi susţin
că VEGF este cel mai puternic factor de prognostic, în timp ce altele nu confirmă această
semnificaţie prognostică.
- Receptorii factorului de creştere epidermal (EGFR) sunt supraexprimaţi într-o
varietate de tumori solide, corelându-se cu un prognostic rezervat. Studii preclinice şi
clinice au arătat că supraexpresia EGFR este corelată cu control tumoral redus după
radioterapie. Este interesantă teoria că iradierea poate activa EGFR care la rândul său
poate induce radiorezistenţă şi repopularea în cursul RT. Aceste observaţii pot sta la baza
asocierii RT sau RT-CT-ei cu inhibitori ai EGFR, reprezentând o cale promiţătoare de
studiu în oncologie. O modalitate optimă terapeutică poate fi integrarea tratamentelor
moleculare ţintite în cursul radioterapiei.

5
- Printre factorii de prognostic nou studiaţi ai cancerului de col uterin se numără şi
supraexpresia Ciclooxygenazei-2 (COX-2), considerată factor de prognostic nefavorabil,
dar la ora actuală sunt doar puţine studii, şi acestea preclinice.
- Densitatea microvascularizaţiei (MVD) este unul din factorii prognostici
histopatologici cei mai studiaţi şi este considerată o masură a angiogenezei tumorale şi
factor prognostic semnificativ în multe tipuri tumorale, fără însă a fi unanim acceptat ca
factor de prognostic stabil.
La ora actuală valoarea prognostică a acestor factori biologici şi implicarea lor în
tratamentul cancerului de col uterin nu este încă confirmată, fiind chiar controverseată şi
constituind obiectul unei intense activităţi de cercetare.
- Reactia de PCR cantitativ (Real Time PCR) este o metodă de evaluare a nivelului de
expresie a genelor implicate in aparitia si progresia cancerului de col uterin.

Obiectivele studiului constau în:


- evaluarea conţinutului intratumoral şi a nivelului seric al EGFR, VEGF şi COX-2 la
pacientele cu cancer de col uterin st. IB-IIIB şi la paciente cu afecţuni benigne ale colului
uterin
- determinarea MVD în tumorile colului uterin şi evaluarea semnificaţiei ei prognostice,
atât în sine cât şi în relaţie cu factorii angiogenici menţionaţi
- corelarea factorilor angiogenetici evaluaţi cu factorii de prognostic clasici şi cu
rezultatele terapeutice, respectiv controlul tumoral local şi eşecurile terapeutice
- identificarea unor eventuale corelaţii între aceşti biomarkeri
- evaluarea nivelelor de expresie genică prin qRT-PCR sau PCR array pentru genele de
interes

Obiectivul final este ca, în urma derulării studiului să propunem strategii de


îmbunătaăţire a rezultatelor terapeutice la pacientele cu cancer de col uterin, prin
posibilitatea individualizării tratamentelor clasice şi introducerea de noi modalităţi
terapeutice (terapii ţintite), astfel:
o în cancerul de col uterin incipient (în care tratamentul clasic este
chirurgia), dacă prin determinarea factorilor angiogenici se estimează un
prognostic nefavorabil, se va recomanda tratament adjuvant radio-
chimioterapic
o în stadiile avansate, validarea acestor biomarkeri va crea posibilitatea
asocierii la tratamentul clasic radiochimioterapic a tratamentelor
moleculare ţintite.

Acest studiu este deosebit de complex şi totodată complet, adresându-se tuturor


aspectelor patogenetice şi investigând toate planurile relevante pentru această
problematică, de la cel clinic la cel histologic şi până la nivel molecular şi genetic. În
cazul unor rezultate pozitive, intenţionăm continuarea acestui studiu pentru evaluarea
corelaţiei dintre biomarkerii de angiogeneză şi supravieţuire în cancerul colului uterin.

6
3. METODOLOGIA CERCETǍRII

Este un studiu prospectiv care va include:


- un lot de 100 paciente cu cancer de col uterin stadiile IB-IIIB care vor fi recrutate
într-o perioadă de 2 ani: 30 în stadiile IB-IIA (operate în prim timp) şi 70 în
stadiile IIB-IIIB (radio-chimioterapie primară)
- un lot mai mic (cca 20) de paciente cu afecţiuni benigne ale colului uterin.

Cercetarea se va desfăşura pe două planuri simultane: clinic si experimental.

3.1. Includerea în studiu a pacientelor cu cancer de col uterin

Pacientele cu carcinom epidermoid de col uterin confirmat histologic vor fi incluse în


două categorii terapeutice:
- stadii incipiente (IB-IIA) care vor efectua în prim timp tratament chirurgical
- stadii avansate (IIB-IIIB) care vor efectua radio-chimioterapie concomitentă
conform protocoalelor terapeutice standard în vigoare.

Diagnostic, bilanţ preterapeutic şi stadializare


- examen clinic efectuat de către 2 examinatori
- biopsia tumorii pentru confirmare histopatologică
- radioscopie toracică
- computer tomografie abdomino-pelvină cu substanţă de contrast iv
- cistoscopie
- ex. de laborator: hemoleucogramă, uree, creatinină, glicemie, transaminaze
- stadializare conform clasificării FIGO
-
Criterii de includere
1. Carcinom epidermoid de col uterin confirmat histologic
2. Stadiile clinice FIGO IB-IIIB
3. Vârsta pacientelor: 20-70 ani
4. Indice de performanţă Zubrod ≤ 2.
5. Probe hematologice: Hb ≥ 9 g/l, L ≥ 3000, Tr ≥ 100.000
6. Probe renale: creatinina < 1,2 mg/l, azot < 80 mg/l

Criterii de excludere
1. Prezenţa unei alte tumori maligne în antecedente
2. Cancer de col uterin tratat anterior (prin chirurgie, radioterapie sau
chimioterapie)
3. Indice de performanţă 3 sau 4
4. Tratament întrerupt
5. Contraindicaţii cardio-vasculare sau renale pentru administrarea de
cisplatin

7
3.2. Includerea în studiu a pacientelor cu afecţiuni benigne uterine

In studiu vor fi incluse şi paciente cu col uterin normal, operate (histerectomie


totală) pentru afecţiuni benigne ale organelor genitale.

3.3. Înregistrarea în baza de date

Înaintea includerii în studiu pacientele vor fi informate despre metodologia


studiului, probele biologice care vor fi recoltate şi tratamentul indicat. Fiecare pacientă va
semna consimţământul informat (Anexa 4.1.), respectându-se condiţiile de etică
medicală.

Dacă pacienta îndeplineşte criteriile de includere în studiu, foaia de observaţie se


trimite pentru înregistrarea în baza de date a studiului (Mihaela Todor, etaj IV, tel:
214) şi eliberarea dosarului de studiu a pacientei. Cu această ocazie se va elibera şi
eticheta specială a studiului cu numele bolnavei şi numărul de înregistrare în studiu, care
va însoţi atăt foaia de observaţie clinică cât şi probele biologice recoltate de la pacienta
respectivă. Consimţământul informat semnat de pacientă este inclus în dosarul de studiu.

După includerea în studiu fiecare pacientă va completa un chestionar de


evaluare a factorilor de risc pentru cancerul cervical (Anexa 4.2.).

3. 4. Protocol de recoltare probe biologice

Recoltarea de citologie cervico-vaginală

Recoltarea se va face preterapeutic la toate pacientele incluse în studiu de către


clinician cu un recoltor de tip perie (cito brush) printr-o miscare circulara insistand pe
zona de interes. Capatul periei se va detasa si se va introduce in solutia de fixare in vase
speciale etichetate. Dupa inchiderea capacului se va agita bine vasul pentru desprinderea
celulelor de pe perie, pentru buna fixare a acestora in lichid. Vasul (etichetat cu eticheta
specială a studiului) se va trimite Laboratorului de Genomică (unde va fi preluat de
către Nuţi Rechită sau Oana Tudoran, tel: 144). Din solutia obtinuta se va face un
examen citologic monostrat (frotiu) si evaluare incarcatura HPV (33 subtipuri) prin
reactia PCR.

Recoltarea de sânge (pentru obţinere ser) (dimineaţa între orele 8-10)

De la fiecare pacientă se vor recolta în secţia clinică 12 ml sânge (in 2 eprubete a 6 ml


nepreparate special) pentru evaluarea în dinamică a factorilor serici:
● preterapeutic: înaintea intervenţiei chirurgicale sau biopsiei (toate cazurile
incluse în studiu)
● în ultima zi a radio-chimioterapiei
● la 2 luni de la încheierea radio-chimioterapiei

8
Eprubetele se trimit la Laboratorul de Genomică (unde vor fi preluat de către Nuţi
Rechită sau Oana Tudoran, tel: 144). Din aceste eprubete o parte din sânge va fi trimis
Laboratorului de Radiobiologie (Dr. Ioana Brie).

Recoltarea de sânge (pt extracţia de ARN) (dimineaţa intre orele 8-10)

Pentru extractia de ARN se recoltează preterapeutic de la toate pacientele incluse


în studiu 2,5 ml sânge in eprubetă specială (PaxGene) care contine o solutie
stabilizatoare pentru ARN. Eprubetele sunt furnizate de Laboratorul de Genomică (Nuţi
Rechită sau Oana Tudoran, tel: 144).
Post recoltare eprubeta trebuie agitata prin rotire stanga-dreapta de 10 ori ,
conform specificatiilor producatorului, pentru a inactiva cat mai eficinet RN-azele si a
diminua efectul de degradare al ARN-ului.
Eprubeta etichetată va fi trimisa fara conditii speciale de transport in Laboratorul de
Genomica in vederea extractiei de ARN (unde vor fi preluat de către Nuţi Rechită sau
Oana Tudoran, tel: 144).

Recoltarea de ţesut de col uterin - la pacientele cu radio-chimioterapie primară


(între orele 10-13)

Recoltarea preterapeutică si postterapeutică (la 2 luni după terminarea RT&CT)


a fragmentelor biopsice se realizează in conditii metodologice identice:
Medicul clinician va recolta 2 fragmente biopsice (minim 5x5 mm) de calitate egala
(dimensiune, viabilitate) din tumora de col uterin evitand zonele necrotice ale acesteia.
- Primul fragment se va imersiona intr-un flacon etichetat continand formol
tamponat 5%
- Al doilea fragment se va introduce intr-un criotub etichetat care va fi introdus
imediat intr-un vas cu azot lichid (-1960)
Ambele flacoane se obţin de la Laboratorul de Anatomie Patologică, Camera 1
(primire piese, Gabi Tanu, tel 158) si sunt trimise cu piesa recoltată la Laboratorul de
Anatomie Patologica pentru evaluare histopatologica (vor fi preluate sub semnătură de
către asistentul de serviciu la camera 1- de primire Piese).

Recoltarea de piesă operatorie (paciente operate în prim timp).

După semnarea consimţământului informat şi includerea pacientei în baza de date


a studiului, eliberarea dosarului şi etichetelor (Mihaela Todor, tel 214), Laboratorul de
Anatomie Patologica va fi notificat la inceputul programului operator. Piesa operatorie
recoltata va fi ambalata imediat intr-o punga de plastic etichetata si introdusa intr-o cutie
frigorifica pe unitati de racire şi se va transporta la Laboratorul de Anatomie Patologica
(va fi preluată sub semnătură de către asistentul de serviciu la camera 1- de primire
Piese) unde va fi examinata pentru diagnostic si includere in Biobanca.

9
Se aplică protocol identic si pentru piesele de histerectomie utilizate pentru
recoltarea de tesut normal in vederea stabilirii lotului control (martor).

Când probele ajung în Biobancă fiecare piesă va primi un cod specific biobăncii şi
tipului de probă biologică recoltată.

3.5. Protocol experimental de anatomie patologică

Va consta în determinări de laborator la toate persoanele incluse în studiu:


- evaluarea serică şi intratumorală a unor biomarkeri de angiogeneză (EGFR,
VEGF, COX-2),
- cuantificarea microdensităţii neovascularizaţiei (MVD)
- evaluarea nivelului de expresie a genelor implicate in apariţia şi progresia
cancerului de col uterin prin tehnica de PCR cantitativ (real-time PCR)

Pe măsura includerii în studiu a cazurilor se va efectua:


- evaluarea iniţială a materialului tisular disponibil (re-evaluarea diagnosticului de
trimitere de către doi anatomopatologi)
- evaluarea existenţei de material histologic suficient şi de bună calitate în blocurile
de parafină corespunztăoare, din care se vor executa secţiuni la 5 microni ce se
vor etala pe lame silanate
- se va crea o bancă de materiale biologice congelate (biobancă) care va fi utilizată
în realizarea studiilor de biologie moleculaă care au ca finalitate stabilirea de
semnături moleculare la nivelul eşantioanelor analizate. Pe de alta parte, biobanca
va permite deschiderea de oportunităţi de cercetare translaţonală atât la nivel
naţîonal cât şi internaional.

Determinarea expresiei EGFR, VEGF si COX-2 în ţesutul tumoral


Se va face prin tehnici specifice de imunohistochimie, utilizând anticorpi primari anti-
R-EGFR, anti-R-VEGF şi respectiv anti-COX-2. După deparafinare, secţiunile
histologice se vor trata termic timp de 20 de minute în tampon citrat pentru demascarea
antigenică a secţiunilor. Secţiunile histologice se vor incuba cu anticorpul primar folosind
timpii de incubare şi respectiv diluţiile cele mai potrivite, conform specificaţiilor tehnice
ale producătorului. Coloraţiile se vor aprecia cantitativ pentru compartimentul epitelial al
tumorii utilizând grila Weibel de 42 puncte montată în piesa oculară a microscopului.
Aceasta va permite evaluarea procentului de celule epiteliale pozitive pe 10 câmpuri
microscopice de mărire mare (x 400) pentru fiecare lamă. Folosind valoarea mediană a
expresiei EGFR în componenta epitelială, tumorile vor fi clasificate în tumori cu expresie
ridicată a EGFR şi în tumori cu expresie scăzută a EGFR. In mod similar se va proceda
şi în cazul VEGF şi COX-2.

Determinarea densităţii microvascularizaţiei tumorale (MVD)


Se va face prin marcarea endoteliului vascular cu anticorpul monoclonal CD34 (clona
QBEnd 10) şi încubare 30 minute la o dilutie de 1:200. Densitatea microvascularizaţiei
tumorale se va aprecia prin tehnica “hot spot”, ce constă în scanarea ariei tumorale

10
pentru identificarea zonelor celor mai dens vascularizate, la nivelul cărora se număra şi se
insumează elementele (profilele) vasculare identificate după criteriile general acceptate
ale lui Weidner. Folosind valoarea mediană a DMV ca valoare prag, cazuistica se va
diviza în tumori slab vascularizate, respectiv tumori intens vascularizate. In rarele cazuri
care exprimă difuz CD34 la nivelul stromei, impiedicând astfel numărarea corectă a
profilelor vasculare, se va utiliza CD31 ca metodă alternativă de colorare.

Rezultatele obţinute vor fi introduse în baza de date a studiului şi în dosarul de studiu


a pacientei.

3.6. Protocol experimental de genomică funcţională

Reacţia de PCR cantitativ (Real Time PCR) se va utiliza pentru evaluarea nivelului
de expresie al genelor implicate în apariţia şi progresia cancerului de col uterin. Aceasta
se va realiza cu ajutorul aparatului Light Cycler 2 (Hoffman la Roche) cu ajutorul
sondelor taqman specifice fiecarei gene. Cuantificarea transcriptiei genice se va face prin
reacţia PCR care foloseşte activitatea 5’-3' exonucleazică a enzimei taq-polimerază,
pentru a îndepărta o sondă fluorescentă care se hibridizează specific pe produsul de
transcripţie. Pentru normalizarea nivelelor de expresie a genelor de interes vor fi utilizate
gene de referinţă precum: RPLPO (Large Ribosomal Protein PO), β -globină, GAPDH
(Glyceraldehide-3phosphate dehydrogenase). Genele de referinţă au o expresie
cvasiconstantă la nivel celular fiind denumite şi gene housekeeping. Designul primerilor
şi sondelor UPL (Universal Probe Library) se va face prin studii in silico. Aparatul
utilizat pentru determinarile de expresie cantitativa va fi Light Cycler 480 (Hofmann la
Roche).

Rezultatele obţinute vor fi introduse în baza de date a studiului şi în dosarul de studiu


a pacientei.

3.7. Protocol de determinare a nivelului seric si din piesele tumorale de exereză


chirurgicala a EGFR, VEGFR SI COX -2 (Laboratorul de Radiobiologie)

Concentratiile serice şi intratumorale ale receptorilor solubili ai VEGF si EGF si


ale COX-2 vor fi cuantificate prin kituri ELISA (enzyme-linked immunoassay) cu
ajutorul unui cititor ELISA de microplaci Tecan Sunrise

Prelucrarea probelor
Probele de sange:
Sange periferic recoltat se lasă 3- minute la temperatura camerei, timp in care are
loc coagularea, după care se centrifughează 15 min la 1000 x g. Serul colectat se
portioneaza în trei microtuburi care se păstrează la ≤- 200 C in Biobanca.
Inainte de analiza, serurile vor fi decongelate lent si aduse la temperatura camerei.

11
Probele de ser cu precipitate vizibile vor fi clarificate inainte de analiza, iar
probele intens hemolizate sau lipemice vor fi excluse

Lizatele tisulare din piesele de histerectomie (tumoră şi ţesut cervical normal)


Celule aderente
Pentru determinari este necesar un numar mediu de 107 celule aderente cultivate pe placi
Petri de 90 mm diametru.
Supernatantul este aruncat si se adauga 1 ml de de solutie de extractie a receptorului.
Celulele sunt apoi desprinse cu ajutorul unui scrapper si transferate intr-un tub de
microcentrifuga de 1,5 ml, si se centrifugheaza la 10000 x g. timp de 5 minute la
temperatura de 40C. Supernatantul se colecteaza, se portioneaza si se pastreaza la -800C.
Celule neaderente
Celulele neaderente se transfera in tuburi de microcentrifuga si se centrifugheaza la 300 x
g. Dupa ce supernatantul este indepartat se va adauga 1 ml de de solutie de extractie a
receptorului in care se vor resuspenda bland celulele. Suspensia celulara este apoi
centrifugata la 10000 x g. timp de 5 min la temperatura de 40C. Stocarea se va face prin
inghetare la, -800C.

Probele de lizate tumorale vor fi diluate de 10-50 ori, probele de ser vor fi analizate
nediluate sau diluate de 2 ori.

Principiul metodei
Probele si standardele se pipeteaza in godeurile placii. Moleculele solubile de
VEGF-R, EGF-R si COX-2, prezente in serul de analizat şi/sau în lizatele tumorale vor
fi legate de anticorpii ce tapeteaza godeul.
Substantele ramase nelegate in godeuri vor fi indepartate prin spalare, dupa care
se adauga anticorpii policlonali specifici pentru VEGFR sau EGFR sau COX, legati la
sistemul enzimatic.
Dupa o noua spalare pentru indepartarea reactivului anticorp-enzima nelegat, se
adauga substratul enzymatic. Virarea culorii este stopata si apoi se va masura intensitatea
culorii la cititorul de microplaci, absorbtia la o lungime de unda indicata de producatorul
kitului. Fiecare proba va fi analizata in duplicat.
Cu ajutorul programului Magellan se creeaza o curba standard si se va calcula
valoarea medie pentru fiecare standard, control sau proba a pacientului.

Tehnica de lucru
Va fi folosita cea din manualul tehnic al fiecarui kit folosit, conform indicatiilor
producatorului.
Indiferent de kitul folosit, principalele etape sunt urmatoarele:
1. Prepararea reactivilor, solutiilor standard si solutiilor de lucru
2. Se adauga 100 μl din solutia standard/control/solutia de lucru in fiecare godeu
si se incubeaza 2 ore la 37C
3. Se indeparteaza lichidul din fiecare godeu, prin aspirare cu pipeta
4. Se adauga 100 μl din reactivul A de detectare in fiecare godeu si se incubeaza
1 ora la 37C.

12
5. Se aspira si se spala de 3 ori fiecare godeu. Spalarea se face prin umplerea
fiecarui godeu cu tampon de spalare (350 μl). Indepartarea completa a
lichidului in fiecare din aceste trepte este esentiala pentru corectitudinea
rezultatelor. Dupa ultima spalare, se indeparteaza orice urma de tampon de
spalare restant, prin aspirare sau decantare. Se inverseaza placa cu godeuri pe
un tampon absorbant.
6. Se adauga 100 μl de reactiv B de detectare in fiecare godeu. Se acopera si se
incubeaza 1 ora la 37C.
7. Se repeta aspirarea/spalarea ca in treapta 5.
8. Se adauga 90 μl de solutie-substrat in fiecare godeu. Se incubeaza 30 de
minute la temperatura camerei, protejat de lumina.
9. Se adauga 50 μl de solutie de stopare in fiecare godeu.
10. Se determina densitatea optica a fiecarui godeu, cu ajutorul unui cititor de
microplaci, la 450nm lungime de unda, in maximum 30 de minute.

Citirile se vor face in duplicat, pentru solutia standard, control si cea de lucru. Se face
media citirilor duplicatelor si se construieste o curba standard.

3.8. Protocolul cercetării clinice

Pacientele vor fi selectate, înrolate şi incluse (pe baza criteriilor de includere) în


două categorii terapeutice:
- stadiile incipiente (IB-IIA), care vor efectua în prim timp tratament chirurgical
- stadiile avansate (IIB-IIIB) care vor efectua radio-chimioterapie concomitentă
conform protocoalelor terapeutice standard în vigoare.
-
Protocol terapeutic

Stadiul IB1
1. Histerectomie radicală cu limfadenectomie pelvină fără iradiere preoperatorie.
Iradiere pelvină postoperatorie (DT=50 Gy) asociată cu chimioterapie bazată pe cisplatin
în caz de ganglioni pelvini pozitivi, margini chirurgicale pozitive, parametre invadate.
2. Radioterapie: iradiere externă pe pelvis asociată cu 2 sau mai multe aplicaţii de
brahiterapie intracavitară.
3. Iradierea ganglionilor paraaortici (DT= 44-46 Gy) - dacă la intervenţia
chirurgicală se evidenţiază ganglioni paraaortici pozitivi (extirpabili sau nu) şi tumora
pelvină este controlabilă. Postoperator se indică radioterapie"extended-field" (iradiere
pelvină şi paraaortică) asociată cu chimioterapie bazată pe cisplatin.

Stadiul IB2
1. Radioterapie: iradiere externă pe pelvis asociată cu 2 sau mai multe aplicaţii de
brahiterapie intracavitară, cu reevaluare la doza de 46+10 Gy, în vederea deciderii
conduitei în continuare: radioterapie exclusivă sau intervenţie chirurgicală. (HRLP).
2. Chirurgie: histerectomie radicala cu limfadenectomie pelvină.

13
3. Iradierea ganglionilor paraaortici (DT= 44-46 Gy), dacă la intervenţia
chirurgicală se evidenţiază ganglioni paraaortici pozitivi (extirpabili sau nu) şi tumora
pelvină este controlabilă.

Stadiul II A
Tumori cervicale de dimensiuni < 4 cm
1. Chirurgie: histerectomie radicală cu limfadenectomie pelvină.
2. Radioterapie: radioterapie externă postoperatorie (DT=50 Gy/pelvis, tehnica
“box”) ± brahiterapie intracavitară, asociat cu chimioterapie bazată pe cisplatin, dacă
examenul histologic al piesei operatorii evidenţiază ganglioni pelvini pozitivi, margini de
rezecţie pozitive sau parametre pozitive.

Tumori cervicale de dimensiuni ≥ 4 cm


1. Radioterapie externă pelvină asociată cu cisplatin şi supraimpresiune pe colul
tumoral prin brahiterapie utero-vaginală, urmată la interval de 4-6 săptămâni de chirurgie
(histero-colpectomie lărgită cu limfadenectomie pelvină).
2. Radioterapie exclusivă (externă + brahiterapie intracavitară) + chimioterapie
concomitentă cu cisplatin.
3. Iradierea ganglionilor paraaortici (DT=44-46 Gy) - dacă la intervenţia chirurgicală
se evidenţiază ganglioni paraaortici inextirpabili şi tumora pelvină este controlabilă.
Postoperator se indică radioterapie"extended-field" (iradiere pelvină şi paraaortică)
asociată cu chimioterapie bazată pe cisplatin.
4. Radioterapie"extended-field" (iradiere pelvină şi paraaortică) asociată cu
chimioterapie bazată pe cisplatin - dacă bilanţul preterapeutic evidenţiază ganglioni
paraaortici măriţi de volum.

Stadiul II B
Conduita standard in stadiul IIB este radioterapia. Chirurgia (HRLP) va fi utilizată
numai în cazuri bine selecţionate, evaluate după radioterapie.
Radioterapie: externă: DT=60-64 Gy/pelvis, tehnica"box" + supraimpresiune pe
volumul tumoral central prin brahiterapie intracavitară (până la DT=85 Gy în punctul A)
sau prin iradiere externă tehnica "pendulară" (DT=10-14 Gy) asociat cu chimioterapie
concomitentă (cu cisplatin)

Stadiul III
Standard
Radioterapie: externă (DT=60-64 Gy/pelvis, tehnica"box") + supraimpresiune pe
volumul tumoral central (brahiterapie intracavitară până la DT=85 Gy în punctul A sau
prin iradiere externă tehnica "pendulară" (DT=10-14 Gy).+ Chimioterapie concomitentă
(bazată pe cisplatin)

Opţiuni
1. Reevaluare la doza de iradiere de 44-46 Gy/ pelvis + supraimpresiune pe
tumora centrală (10-14 Gy): în cazul răspunsului favorabil la nivelul parametrelor (=
operabilitate) dar cu relicvat tumoral central care nu poate fi controlat cu radioterapie
exclusivă- intervenţie chirurgicală cu intenţie de radicalitate (HCL cu biopsie ganglionară

14
para-aortică) după un interval de 4-6 săptămâni. Dacă se confirmă histologic invazia
ganglionilor para-aortici: postoperator iradierea ganglionilor para-aortici + chimioterapie.
2. Iradierea ganglionilor paraaortici (44 - 50 Gy) măriţi (> 1 cm) la examenul
computer tomografic: tehnica "extended-field" asociat cu chimioterapie bazată pe
cisplatin - dacă există şansa obţinerii controlului tumorii primare prin radio-chimioterapie

Evaluarea răspunsurilor terapeutice

Evaluarea răspunsului terapeutic pentru cazurile neoperate


La 2 luni şi la 5 luni după terminarea radio-chimioterapiei exclusive:
- remisie completă (RC): dispariţia completă a tumorii la nivelul colului şi a
extinderilor sale (vagin, parametre)
- remisie parţială (RP): diminuarea cu 50% sau mai mult a leziunilor cunoscute
- staţionar (ST): o scădere cu 50% a leziunilor nu a putut fi documentată, dar
nici o creştere a lor cu 25%
- evoluţie (EV): creşterea cu 25% sau mai mult a tumorii de la nivelul colului
sau a extinderilor loco-regionale

Evaluarea răspunsului terapeutic la cazurile operate


Pe baza rezultatului histologic al piesei operatorii:
- RC: piesa sterilă
- RP: relicvat tumoral numai la nivelul colului uterin
- ST: parametru (e) şi/sau ganglion (i) histologic pozitivi

In ultima etapă a studiului se va realiza:


- analiza şi interpretarea datelor clinice şi experimentale
- corelarea datelor experimentale obţinute cu factorii de prognostic clasici şi cu
rezultatele terapeutice (controlul tumoral local şi eşecurile terapeutice).

Întreaga activitate desfăşurată în cadrul acestui proiect se va face respectând normele


elaborate de Comisia de Etică a Universităţii de Medicină şi Farmacie “Iuliu Haţieganu”
Cluj-Napoca şi în concordanţă cu normele internaiţonale din domeniu. Cercetarea clinică
se va desfăşura cu respectarea Declaraţiei de la Helsinki referitoare la studiile pe subiecţi
umani. De la fiecare pacientă se va obţine în prealabil consimţămnântul informat, sub
semnatură. În ce priveşte partea experimentală, toate activităţile depuse pentru realizarea
prezentului studiu se vor desfăşura în acord cu Regulile de bună practică în laborator.
Echipa implicată în desfăşurarea studiului este una multidisciplinară, cuprinzând
clinician radioterapeut, chirurg, tolog, specialist în biologie moleculară, radiobiolog,
activitatea lor necesitând o colaborare perfectă în vederea parcurgerii în lanţ a tuturor
etapelor cercetării.

15
INSTITUTUL ONCOLOGIC “PROF. DR. I. CHIRICUŢĂ” CLUJ NAPOCA
STR. REPUBLICII NR. 34-36, 400015 CLUJ-NAPOCA, ROMÂNIA
TEL: +40-264-598 361/62, 63, 64; 591281/82; 450672;
Fax: +40-264-597673/597692;
e-mail: office@iocn.ro
web: www.iocn.ro

Consimţământ informat

Semnătura dată mai jos confirmă următoarele:


Subsemnata, prin prezenta consimt să particip la studiul în domeniul colului uterin în care voi fi
inclusă.
Am fost informată că pentru aceasta mi se va recolta sânge din venă şi un fragment de tumoră de
la nivelul colului uterin.
Mi s-a explicat că acceptarea sau refuzarea includerii în studiile de cercetare în domeniul colului
uterin nu îmi va modifica conduita trerapeutică stabilită şi relaţia cu doctorul curant.
Accept ca orice date provenite din probele biologice care rezultă din acest studiu de cercetare să
poată fi incluse şi în alte studii de cercetare. Participarea mea este complet voluntară.
Am fost informată că datele (personale, clinice şi ale materialelor biologice) colectate pot fi
folosite pentru cercetarea ştiinţifică in domeniul patologiei colului uterin şi că imi va fi asigurată
confideniţalitatea.
Am înţeles că toate datele (personale, clinice şi ale materialelor biologice) colectate vor fi tratate
în conformitate cu „Directiva Uniunii Europene (Dir /95/46/EC) asupra protecţiei indivizilor cu
privire la procesarea datelor personale” şi cu aplicarea legilor naţionale.
Sunt de acord ca viitoarele studii de cercetare să poată fi realizate pe materialele biologice
rămase, incluse in biobancă, şi că orice dată rezultată din aceste studii să poată fi legată în viitor
de alte date provenite din studii de cercetare.

Nume Pacientă________________________________
Semnatura Pacientă______________________________
Data:________________

Subsemnata/ul, investigator clinic, confirm că am informat în prealabil pacienta cu privire


la realizarea studiilor de cercetare şi că nu am exercitat nici o presiune asupra pacientei de a lua
parte la aceste studii.
Nume Investigator________________________________
Semnatură Investigator:______________________________

16
Nr. paciente: - CH primara: 30
ANGIO - CERVIX - RT&CT primara: 70
- Col normal: 20

Recoltare probe biologice


St. I B – IIA Preterapeutic Prelucrare
(CH primara) - citologie cervico-vaginala (perie) Lab.Genomica; Anat. Patol.
- sânge periferic - 2 eprub. x 6 ml )
Lab.Genomica:tel.144 Radiobiologie
- 1 eprub PaxGene
2,5 ml
Anat. Patolog. tel.158
- piesa operatorie -> cutie frigorifica

Includere
Recoltare probe biologice Prelucrare
Consimtamântul informat Biobanca
Preterapeutic
baza date + dosar + eticheta -citologie cervico-vaginala (perie) Lab.Genomica; tel.144
(Mihaela Todor, tel.214)
-sânge periferic - 2 eprub. x 6 ml ) Lab.Genomica
- 1 eprub PaxGene
2,5 ml
- biopsie tumora 2 fragm. x 5 mm Ø Anat. Patologica: tel.158
1. în flacon cu formol tamponat 5%
2. în criotub -> azot lichid

St. IIB – IIIB Postterapeutic ultima zi de RTE


(RT& CT primara) - sange periferic (3 eprubete) Lab.Genomica:tel.144

Postterapeutic la 2 luni dupa RTE

- sange periferic (3 eprubete) Lab.Genomica


- biopsie col uterin ( 2 fragmente) Anat. Patologica, tel: 158
1. în flacon cu formol tamponat 5%
2. în criotub -> azot lichid

17
18