Sunteți pe pagina 1din 14

Drojdiile. Biotehnologii clasice si moderne.

Ioan Florea-Dumitru, Adrian Vamanu, Ovidiu Popa

CAP 1.5. Ingineria metabolică la drojdii

Saccharomyces cerevisiae este cel mai intens studiat microorganism eucariot, care ajută la
cunoaşterea biologiei celulei eucariote şi, implicit, a biologiei umane.

Vreme de câteva secole Saccharomyces cerevisiae a fost întrebuinţată în producerea de alimente şi


băuturi alcoolice, iar azi acest microorganism este folosit în numeroase procese din cadrul industriei
farmaceutice. Saccharomyces cerevisiae este un organism cu care se lucrează uşor, deoarece este
nepatogen, şi datorită multitudinii de aplicaţii apărute de-a lungul timpului în obţinerea de produse
consumabile, ca etanolul sau drojdia, a fost clasificat ca organism GRAS (generally regarded as seif =
organism considerat sigur, netoxic). De asemenea, fermentaţia şi procesele tehnologice de producţie la
scară largă cu Saccharomyces cerevisiae fac ca acest organism sa fie atractiv, la îndemână, pentru câteva
scopuri biotehnologice, aşa cum va fi ilustrat în continuare. Un alt motiv important pentru a justifica
utilizarea microorganismului Saccharomyces cerevisiae în cadrul biotehnologiei îl reprezintă
susceptibilităţile sale la modificările genetice prin tehnologia ADN recombinant, care a fost mai departe
înlesnite de accesul la secvenţa genomică completă a Saccharomyces cerevisiae, publicată în 1996 [1] .

Îmbunătăţirea tulpinilor de drojdie de bere s-a bazat în mod tradiţional prin mutageneză la
întâmplare şi pe încrucişările genetice a două tulpini, urmate de screening, în funcţie de calităţile de
interes ale mutantelor. Dezvoltările recente ale unor metode sofisticate în domeniul tehnologiei ADN
recombinant au permis să se manipuleze o anumită cale de interes şi de aici să se îmbunătăţească celula
printr-o abordare mai directă. Totuşi, acum este posibil să se introducă anumite perturbări genetice în
sensul de a modifica puterea de iniţiere a unei anumite gene, de a induce deleţii asupra genelor sau de a
introduce gene întregi în celulă [2] .

Îmbunătăţirile propietăţilor celulare obţinute prin combinarea analizelor teoretice bazate pe


informaţiile de biochimie şi pe aplicaţiile ingineriei genetice, au fost oferite de ingineria metabolică [3].
Această abordare constă în mare în două aspecte importante:

1. partea analitică a ingineriei metabolice, care se ocupă cu studiul celulelor pentru identificarea
tintelor cele mai potrivite şi

2. ingineria genetică a celulelor care se ocupă de obţinerea unor celule cu modificările genetice
dorite.

Un mod de a grupa diversele ţinte pentru ingineria metabolică ar cuprinde:

- extensia categoriei substratului;

- îmbunătăţiri ale productivităţii şi producţiei (profitului);

- îmbunătăţirea performanţei procesului biotehnologic;

- îmbunătăţirea propietăţilor celulare.

1.5.1. Noi concepte asupra ingineriei metabolice

După cum s-a menţionat şi în introducere, ingineria metabolică implică o abordare directă asupra
aplicaţiei tehnologiei ADN recombinant pentru îmbunătăţirea tulpinilor, şi a fost definită ca
„îmbunătăţirea directă a formării produsului sau a propietăţilor celulare prin modificarea unor reacţii
biochimice specifice sau introducerea altora noi cu folosirea tehnologiei ADN recombinant” [4]. În
acestă definiţie termenul „reacţii biochimice” trebuie interpretat în sensul lui mai larg. Ceea ce distinge
1
ingineria metabolică de aplicaţiile clasice de biologie moleculară este folosirea unei abordări directe.
Aceasta presupune cunoştinţe bogate despre sistemul folosit şi, după cum a fost menţionat în introducere,
ingineria metabolică conţine două părţi: partea analitică şi partea sintetică. Această situaţie este ilustrată
în Figura 4. În anumite cazuri partea sintetică o precede pe cea analitică, dacă natura substratului are
nevoie de o extindere prin expresia unei enzime heterogene, dar în toate cazurile este important ca părţile
analitică şi sintetică să meargă mână în mână.

Acest lucru este foarte bine ilustrat prin încercările de a extinde natura substratului. Aici, în mod clar,
primii paşi sunt de a introduce gene heteroloage care activează metabolismul substratului de interes, iar în
acest scop este important să luăm în consideraţie două strategii diferite:

a. introducerea unei gene ce codifică o proteină de legătură a membranei, care transportă un anumit
substrat în celulă în combinaţie cu o genă ce codifică o proteină responsabilă pentru scindarea
substratului;
b. introducerea unei gene ce codifică o proteină secretată în mediul extracelular, unde substratul de
interes este transformat sau scindat în substraturi care ar putea fi asimilate direct de organismul
gazdă.

Figura 4. Aspecte variate ale ingineriei metabolice împărţite în partea analitică şi partea sintetică.

2
Indiferent de strategia aleasă, este important să se asigure că genele heterogene sunt exprimate
suficient în noul sistem gazdă. Aceasta poate implica luarea în considerare a unor posibile modificări
postranslaţionale, care pot diminua sau elimina activitatea enzimei de interes, iar aceasta necesită analize
atente ale tulpinii recombinante. După obţinerea unui organism recombinant ce poate folosi un anumit
substrat, deseori se obţin rate scăzute şi producţii în general mici ale produsului din substratul respectiv.
Pentru a identifica problema cea mai importantă şi a direcţiona următorul pas sintetic este necesar să se
detvolte o analiză detaliată a fiziologiei celulei. Aceasta poate fi ilustrată în mod clar în încercarea de a
transforma xiloza la etanol prin fermentaţii anaerobe cu Saccharomyces cerevisiae. Astfel, ingineria
metabolică aproape întotdeauna va implica o strânsă interacţiune între părţile analitică şi sintetică, de
obicei fiind necesare mai multe tipuri de construcţii de tulpini, înainte de obţinerea unei tulpini
recombinante optime.

În ingineria metabolică la Saccharomyces cerevisiae, partea sintetică este relativ devansată de


partea analitică. Aceasta se datorează complexităţii metabolismului celular, ce poate interacţiona cu
exprimarea genelor, ce poate determina niveluri metabolice prin concentraţia de enzime. În multe cazuri
sunt necesare multiple modificări, iar pentru fiecare modificare, pot apărea schimbări neaşteptate ale
metabolismului celular.

Partea analitică se referă în mod clasic la fiziologie, în ultimii ani numeroase tehnici avansate fiind
utilizate pentru o analiză mult mai elaborată a fiziologiei celulare. Aceasta include tehnici ale ADN
pentru analiza transcriptoamelor (cuantificarea simultană a tuturor genelor transcrise într-o celulă), gel
bidimensional de electroforeză pentru analiza proteoamelor (cuantificarea simultană a unui număr mare
de proteine într-o celulă), gaz cromatografie cu sprectrometria de masă (GC – MS) şi lichid cromatografie
cu spectrometrie de masă (LC – MS), pentru analiza nivelurilor metabolice intracelulare, experimente cu
C13 pentru analiza reţelei metabolice, studii avansate de fermentaţie cu monitorizare on – line a
variabilelor de cultivare mai importante şi bioinformatica (modele matematice pentru analiza structurii
căilor şi structurii fluxurilor).

1.5.1.1. Analiza transcriptoamelor şi proteoamelor

Analiza metodologiei ADN în domeniul transcriptoamelor este o tehnică încă nouă în prezent
nefiind exemple despre modul cum a fost folosită tehnica în ramurile ingineriei metabolice. Deoarece
multe provocări în ingineria metabolică implică schimbări genetice multiple, analiza transcriptoamelor va
fi foarte importantă pentru ingineria metabolică în viitor, deoarece această analiză permite studierea
schemei exprimării multor gene.

Ca şi analiza transcriptoamelor, analiza proteoamelor este importantă în ingineria metabolică.


Deseori căile de activitate sunt corelate direct cu concentraţia proteinelor, şi când exprimarea genelor
şi/sau interacţiunile protein㠖 proteină sunt supuse unei regularizări metabolice, este important să se
cuantifice concentraţia proteinelor în diferite tulpini recombinante. În mod clar, o analiză detaliată a
proteomului poate fi valoroasă, deseori fiind suficientă stabilirea concentraţiei de proteine implicate în
căile studiate şi uneori măsurarea unor proteine reglatorii ce afectează exprimarea genelor relevante.

1.5.1.2.Căile de analiză

Căile de analiză sunt folosite deseori pentru a descrie aplicaţia analizei fluxului metabolic (MFA)
şi analiza controlului metabolic. Căile de analiză s-au dovedit a fi un succes, ca instrument ajutător pentru
partea analitică a ingineriei metabolice. MFA este o abordare globală a celulei, unde se ia în calcul
reţeaua completă a reacţiilor intracelulare, unde sunt cuantificate fluxurile, prin ramurile individuale ale
reţelei. Fluxurile metabolice pot fi estimate din balanţele şi măsurătorile de metaboliţi ale câtorva căi, prin
introducerea substraturilor marcate cu C13, urmate de măsurătorile distribuţiei acestora în metaboliţii
intracelulari. În acest caz spectroscopia de rezonanţă magnetică nucleară sau GC – MS poate fi folosită
pentru a măsura tiparul metaboliţilor precursori marcaţi. Aplicarea de substraturi marcate permite
determinări de flux ale reacţiilor reversibile şi cuantificarea raţiilor de flux între căile biosintetice ce duc
3
la acelaşi metabolit. Compararea distribuţiilor fluxului obţinute în diferite condiţii fiziologice poate da
informaţii de preţ despre interacţiile dintre diferite căi sau poate ajuta la identificarea unor posibile reacţii
biochimice, care nu au fost descoperite în prealabil într-un anumit microorganism [5] . Totuşi, MFA poate
fi folosit în alegerea unei strategii bune pentru ingineria metabolică, dar, poate fi folosit şi ca un
instrument pentru caracterizarea fiziologică a unei tulpini, ce a fost manipulată în vederea introducerii
unei propietăţi noi sau modificate. Un domeniu în care MFA este interesat este îmbunătăţirea
productivităţii. Acest lucru este ilustrat în Figura 2, în care se prezintă o cale foarte simplă, în care
substratul A este convertit în produsul B, cu formarea produsului C. Substratul A poate fi glucoza,
produsul B poate fi etanolul şi produsul C poate fi glicerolul. Depăşirea obţinerii produsului de substrat
este determinată de raţia fluxurilor JB şi JA, unde productivitatea este dată de fluxul JB. Intermediarul I nu
se poate acumula în interiorul celulei, fluxul acestui metabolit va fi egal cu fluxul ce iese din polul
metabolitului. (Figura 5).

Fluxurile sunt descrise de ecuaţia: JA = JB + JC, unul din aceşti termeni poate fi calculat, dacă
celelalte două sunt măsurate. Acesta este conceptul balanţei metaboliţilor. O strategie clară pentru a
îmbunătăţi obţinerea totală de JB este de a reduce sau de a elimina fluxul J C şi astfel în mod direct va
ajunge mai mult carbon la produsul JB.

Oricum, formarea lui C joacă de obicei un rol important în metabolismul celular, iar eliminarea J C
de o deleţie a unei gene, va fi letală pentru celulă sau va conduce spre auxotrofie. În unele cazuri fluxurile
pot fi determinate de constrângeri adiţionale, dacă anumiţi cofactori ca NAD(P)H sunt implicaţi în diferite
ramuri. Modularea distribuţiei fluxului în jurul punctului metabolic I, cere bineînţeles analiza completă a
reţelei metabolice şi de aceea conceptul de MFA este foarte important. MFA este în general cel mai
folositor în cazurile în care o fracţiune relativ mărită a lui C este direcţionată spre produs în vederea
obţinerii de metaboliţi primari. Nu în ultimul rând, conceptul de MFA poate, de asemenea, să contribuie
la înţelegerea modului în care producerea de metaboliţi secundari sau proteine heteroloage este legată de
metabolismul central al lui C, prin canalul metaboliţilor precursori.[6]

MFA, de asemenea joacă un rol important în clasificarea ramurilor metabolice. Prin analiza
diferitelor mutante este posibilă obţinerea de informaţii despre reglarea diferitelor fluxuri, dacă o anumită
locaţie a căii metabolice este flexibilă sau nu. Pentru o locaţie metabolică rigidă, enzimele din jurul
punctului metabolic I din Figura 6 pot fi reglate prin regularizarea alosterică. Astfel, implicarea activităţii
uneia dintre enzime, în cascada de reacţii dintre intermediarul I spre produsul B, ar putea să se rezolve
printr-o creştere a fluxului JB şi implicit a randamentului în produs.

Figura 5. Fluxul metabolic JA, JB şi JC prin intermediul I care este un precursor al metaboliţilor B şi C.

Aceasta sugerează un alt aspect important al căilor de analiză, şi anume identificarea enzimei, care
exercită controlul fluxului într-o cale metabolică dată. De fapt, problema cu locul de ţintire al genomului,

4
pentru a obţine o creştere a fluxului printr-o anume cale, este legată de toate categoriile de inginerie
metabolică menţionate în introducere.

Figura 6. Căile metabolice ale glucozei şi xilulozei.

Analiza controlului fluxului este o examinare a bazelor celulare „locale” ce deseori sunt
implicate într-o singură cale metabolică, în contrast cu MFA, unde se considera întreg metabolismul
celular. Studierea controlului fluxului determină efectele perturbărilor în activităţile enzimatice, pentru a
identifica cea mai bună ţintă enzimatică pentru manipularea genetică. Interesul general este de a
supraexprima genele specifice de codificare a enzimelor, care exercită cel mai mare control asupra
fluxului dintr-o cale, deoarece supraexprimarea unei căi întregi poate fi foarte laborioasă şi deseori
imposibilă. Pentru examinarea controlului fluxului printr-o anume cale metabolică, cadrul analizelor de
control metabolic poate servi ca o unealtă folositoare. Există o varietate de metode pentru determinarea
aşa – numiţilor „coeficienţi de control al fluxului”, care determină un flux relativ mărit datorită unei
oarecare creşteri a activităţii enzimelor individuale [7]. La dezvoltarea analizei căilor metabolice este, de
asemenea important să se determine intermediarii ce ar lua parte într-un anumit mecanism metabolic, care
ar putea fi toxici pentru celulă în anumite condiţii. În plus, este important să ştim dacă o anumită cale
intermediară este implicată într-o cale de transducţie – semnal, care regularizează fluxul prin calea
metabolică de interes, prin anumite interacţiuni specifice protein㠖 proteină sau prin influenţă la nivel
transcripţional [8] .

Cea mai bună strategie utilizată în studiile de inginerie metabolică la Saccharomyces cerevisiae
pentru consumul de xiloză a fost introducerea genelor XYL1 şi XYL2 originale din drojdii capabile să
utilizeze xiloza (Candida shehatae, Pichia stipitis). Gena XYL1 codifică xiloz-reductaza (XR) care
reduce xiloza la xilitol cu consum de NAD(P)H. Conversia xilitolului în xiluloză este obţinută de gena
XYL2 care codifică xilitol-dehidrogenaza (XDH) (Figura 6).

1.5.2. Creşterea productivităţii şi producţiei

Aspectele variate ale ingineriei genetice asupra drojdiei de bere au fost revizuite acum câţiva ani.
Este posibil să fie introduse propietăţi noi în drojdia de bere, printr-o puternică conexiune între calea
analitică a ingineriei metabolice şi manipularea genetică a celulei, pentru a ajuta ca procesul să fie mai
5
profitabil. Unul dintre principalele motive pentru cererea unei lungi perioade de folosire a berii este
conversia nonenzimatică şi înceată a α - acetolactatului, la componentul nedorit şi fără arom㠖 diacetilul,
care este convertit enzimatic la acetonă şi subsecvenţial la 2, 3 butan – diol. O cale de a evita pierderea
aromei, cauzată de diacetil, este introducerea unei metode alternative de dereglare a α - acetolactatului,
pentru a se trece peste formarea acetilului.

Totuşi, modificările genetice asupra drojdiei de bere prin introducerea α - acetolactat


decarboxilazei heterogenă, determină tulpinile transformate să producă acetona direct din α - acetolactat,
ceea ce accelerează procesul de creştere prin diminuarea fazei de lag de la săptămâni la ore (Figura 7). α -
Acetolactat decarboxilaza a fost evidenţiată cu succes în drojdii şi provine de la Klebsiella terrigena,
Enterobacter aerogenes şi Acetobacter xilinum.[9] Alte încercări de a minimaliza formarea de diacetil în
drojdiile de bere au fost încununate de succes, prin screening pentru anumite mutante şi supraexprimarea
unor gene specifice, care codifică enzime implicate în procesul de biosinteză a valinei.

Figura 7. Căile biochimice ce conduc la glicerol, piruvat şi etanol.

Prin tehnicile de screening pentru mutante rezistente la erbicidul sulfometuron metil şi expunerea
gradată în mediu deficient în valină şi izoleucină (izoleucină- şi valină-), s-au descoperit tulpini cu
activitate de sinteză a acetolactatului scăzută, ce determină un flux de carbon scăzut, direcţionat spre
formarea de α - acetolactat. Numai jumătate din cantitatea de diacetil a fost produsă de unele din acele
tulpini în comparaţie cu tulpinile parentale.

O altă strategie de succes a fost cea de creştere a fluxului, prin calea biosintetică a valinei, în
scopul de a trece peste formarea diacetilului.

Manipularea căii metabolice centrale la Saccharomyces cerevisiae a fost folosită pentru a se creşte
productivitatea de etanol. Când 8 enzime diferite ale glicolizei au fost exprimate separat în multivectori,
nici una dintre tulpinile transformate nu a determinat o producere mai mare de etanol decât tulpina de tip
sălbatic. Nici chiar supraexprimarea enzimelor ce catalizează reacţiile ireversibile, ca hexochinaza,
fosfofructochinaza şi piruvatchinaza, nu au avut efect asupra producerii de alcool. Aceste rezultate
6
ilustrează rigiditatea controlului fluxului prin metabolismul central al Saccharomyces cerevisiae. Oricum,
alte studii au raportat că folosirea fosfofructazei a îmbunătăţit productivitatea de etanol în cazul resturilor
celulare imobilizate care cresc doar aerob.

O problemă majoră în legătură cu producerea de etanol prin fermentaţia anaerobă la


Saccharomyces cerevisiae este formarea substanţială de glicerol, ca produs secundar. În condiţiile de
creştere aerobă, NADH citosolic format din biomasa poate fi reconvertit la NAD + prin formarea de
glicerol, în concordanţă cu dehidrogenazele NADH mitocondrial extern, codificate de genele NDE1 şi
NDE2 şi alternativ printr-un sistem necunoscut. Anaerob, oxidarea NADH citosolic se poate produce
doar prin formarea de glicerol, deoarece fosforilarea oxidativă nu funcţionează în astfel de condiţii.

Există două gene, GPD1 şi GPD2, amândouă codificând glicerol - 3 - fosfat dehidrogenaza, care
regenerează NAD+din NADH, în timp ce converteşte dihidroxiaceton – fosfatul la glicerol - 3 - fosfat, dar
izoenzima codificată de gena GPD2 s-a demonstrat ca fiind cea mai importantă dintre cele două, în
condiţii de anaerobioză. Conversia totală a glucozei la etanol este redox neutră, deoarece NADH este
format de gliceraldehida - 3 - fosfat -dehidrogenaza şi deoarece conversia acetaldehidei la etanol include
regenerarea NAD- din NADH (Figura 7) de către alcool dehidrogenaza I (codificată de ADH1) [10]. Astfel,
formarea glicerolului este importantă pentru menţinerea echilibrului redox din citosol, pentru a reoxida
NADH format. O posibilă strategie pentru a optimiza producţia de etanol poate fi deducerea formării
glicerolului, prin redirecţionarea fluxului de carbon, prin manipularea metabolismului redox. Când o
mutantă gpd2 a fost crescută în condiţii de anaerobioză a fost obţinută o producţie mai mare de etanol cu
8% în concordanţă cu reducerea de 40% a formării glicerolului, dar creşterea specifică maximă a fost
redusă cu 45% în comparaţie cu tulpina de tip sălbatic, W303 – 1A [11]. Rezultate similare au fost
obţinute cu o mutantă gpd2, provenită de la altă tulpină de tip sălbatic, unde producţia de etanol a fost
mărită doar cu 4,75 fiind observată o reducere a maximului specific de creştere. Cum o tulpină mutantă cu
o dublă deleţie gpd1 şi gpd2 este incapabilă de a creşte în condiţii de anaerobioză, introducerea unei noi
căi pentru a regenera NAD+- a fost realizată prin exprimarea unei transhidrogenaze bacteriene (ce
catalizează NADH + NADP + Ť NAD+ + NADPH), provenite de la Azotobacter vinelandii, într-o mutantă
dublă gpd1gpd2. Din nefericire, unirea NAD+ a devenit limitatoare pentru sinteza biomasei, înainte ca
transhidrogenaza să fie capabilă de a susţine sinteza de NAD+, observându-se de asemenea şi lipsa
creşterii în condiţii de anaerobioză.

Figura 8. Asimilarea NH4+ în Saccharomyces cerevisiae, unde 2 - oxoglutaratul şi NH4+ sunt


transformate în glutamat prin două căi diferite.

Într-o altă abordare asupra implicării ingineriei metabolice în mărirea producţiei de etanol la
Saccharomyces cerevisiae s-a intervenit în metabolismul energetic care a fost condus în sensul schimbării
7
cerinţelor cofactorilor, în asociaţie cu asimilarea de amoniac. Asimilarea de amoniac la Saccharomyces
cerevisiae este descrisă în Figura 8. Amoniacul şi 2 – oxoglutaratul pot fi convertiţi în glutamat, de diferite
izoenzime ale glutamat dehidrogenazei, folosind NADPH (Gdh1) sau NADH(Gdh2) drept cofactori [12].
Amoniacul poate fi asimilat şi de glutamin – sintetaza (Glu1), cu formarea de glutamină, care este
convertită în glutamat prin acţiunea glutamat – sintetazei (Glt1); suma celor două reacţii ale Glu1 şi Glt1
este arătată în Figura 5. Aceste două reacţii cuplate folosesc NADH şi ATP şi au un nivel crescut dacă
formarea de glutamat apare doar pe această cale. Strategia este de a reduce surplusul de NADH format în
asociaţie cu sinteza biomasei în combinaţie cu producerea unei creşteri de consum de ATP, care ar reduce
cerinţele referitoare la producerea de glicerol şi ar creşte formarea de etanol. Deleţia genei GDIII va da o
creştere a producţiei de etanol cu 8% şi o descreştere a producţiei de glicerol, dar maximul ratei specifice
de creştere a fost pe jumătate – în comparaţie cu cel al unei tulpini de tip sălbatic, datorită unei reduceri a
ratei de sinteză a glutamatului. Prin deleţia genei GDIII şi supraexprimarea genelor GLN1 şi GLT1 de
către promotorii PGK, producţia de etanol a fost mărită cu 3%, în comparaţie cu tulpina gdh1,
supraexprimarea acestor două gene reducând maximul ratei specifice de creştere la 90% faţă de tipul
sălbatic. Când GDH2 a fost supraexprimată de un promotor, într-o tulpină mutantă GDH, maximul ratei
specifice de creştere a fost în principal egal cu cel al unei tulpini de tip sălbatic. Oricum scăderea
observată în formaţiunile de glicerol a rezultat nu dintr-o creştere considerabilă a producţiei de etanol, ci,
mai degrabă dintr-o creştere a producerii de biomasă. Totuşi ingineria metabolică care diminuează
formarea de glicerol prin solicitarea unei cantităţi mărite de NADH reoxidat în celulă, nu conduce
neapărat la o mărire a producţiei de etanol. Pentru a servi acestui scop, o reducere a surplusului de NADH
ar trebui combinată cu un consum mai mare de ATP în formarea biomasei, unde celula compensează
pentru cererea energetică mărită, prin creşterea fluxului spre etanol. Acest exemplu ilustrează cum un flux
îmbunătăţit pe una din căi poate fi obţinut prin ingineria unei căi complet diferite şi arată că este
important ca întreaga reţea metabolică să fie luată în consideraţie. În completarea exemplului mai sus
amintit, mărirea ratei de conversie a ATP la ADP poate fi obţinută prin introducerea activităţii unei ATP-
aze unei anumite celule, unde producţia unui anumit component poate fi îmbunătăţită. Recent, au fost
descrise numeroase aplicaţii ale acestei abordări [13] .

În contrast cu drojdiile folosite în industria băuturilor alcoolice, este de dorit să direcţionăm fluxul
de carbon spre glicerol în timpul formării de etanol la drojdiile producătoare de vin, deoarece glicerolul
poate îmbunătăţii calitatea vinului, oferindu-i consistenţă.

1.5.3. Imbunătăţirea performanţelor procesului

Pentru a îmbunătăţi producţia la nivelul produşilor biotehnologici, este foarte important să se


utilizeze disciplinele de inginerie genetică, care se ocupă de designul bioreactorului şi optimizarea
tehnologiilor fermentative, care poate duce la o îmbunătăţire a performanţelor procesului biotehnologic,
obţinându-se supraproducţii.

Problematica dezvoltării unor metode optime, pentru îmbunătăţirea anumitor operaţii ale
procesului tehnic este legată de capacitatea tulpinilor de Saccharomyces cerevisiae de îmbunătăţii
performanţele procesului.

Saccharomyces cerevisiae care poate suferi o creştere pseudohifală, poate forma asociaţii
floculare, proprietate ce este de obicei atribuită drojdiilor de fermentaţie [14].

O tulpină de drojdie de bere potrivită ar trebui să fie în stare de a produce floculare, deoarece
această proprietate este cea mai convenabilă de a limpezi berea în comparaţie cu celelalte metode
convenţionale, cum ar fi filtrarea şi centrifugarea [15] .

Numeroase studii privind flocularea au generat o bază mare de date, dar din nefericire,
compararea acestor date este restricţionată, datorită diferenţelor privitoare la condiţiile de testare şi de
creştere. Două mecanisme de floculare complet diferite au fost observate până acum: fenotipul NewFlo,
găsit în numeroase tulpini de drojdii de bere, şi fenotipul Flo1, găsit în cele mai multe tulpini floculare de
8
laborator.Cele două fenotipuri diferă remarcabil chiar prin felul de a flocula. Fenotipul Flo1 dă naştere la
floculaţie în timpul creşterii, neţinând seama de semnalele pe care le primeşte din mediu, cum ar fi
limitarea nutrienţilor, în timp ce flocularea fenotipului NewFlo se pare a fi lansată la sfârşitul creşterii
exponenţiale, când îşi face apariţia lipsa de glucoză. Ultima apariţie a floculării la fenotipul NewFlo este
un avantaj evident pentru industria băuturilor, ajutând la separarea drojdiilor de băutură, dar genetica
fenotipului NewFlo rămâne a fi descoperită. Totuşi o continuare a muncii este necesară pentru a da o
imagine completă asupra genelor implicate în fenotipul Flo1, deoarece sunt necesare mai multe
cunoştiinţe genetice, decât pentru fenotipul NewFlo. Fenotipul Flo1, conţine una sau mai multe din
genele dominante floculare, din care a fost studiată gena FLO1. Aceasta codifică o proteină a suprafeţei
celulare, care joacă rolul principal în procesul de floculare. Proteina Flo1 este ancorată în peretele celular
unde partea N- terminală este expusă mediului, iar în timpul floculării acest fragment N-terminal se poate
ataşa de manoproteinele din peretele celular vecin. Gena FLO1 a fost integrată cu succes în genomul unei
tulpini de drojdie de bere monofloculară, obţinându-se o tulpină floculară stabilă. Flocularea prin
fermentare cauzează o micşorare a numărului de celule, mărind timpul general de fermentaţie. Gena
FLO1 din tulpinile cu fenotipul Flo1, pare a fi legată la nivel transcripţional de o creştere în transcrierea
FLO1, corelată cu o creştere a floculării. Flocularea constitutivă a fost observată în toate stadiile de
creştere, dar a fost intensificată în fazele de declin şi în faza staţionară a creşterii. Pentru a introduce
flocularea într-o gazdă nefloculantă ar fi necesar să se stabilească un sistem genetic care să exprime gena
pentru floculare doar spre sfârşitul fermentaţiei. Astfel, ingineria metabolică ar trebui să se concentreze
pentru a determina un anumit sistem genetic, care conţine una sau mai multe gene floculare dominante.
Subiectul mecanismului de control care este responsabil pentru apariţia floculării la limitarea nutrienţilor
la tulpinile fenotipului NewFlo este încă necunoscut [[16], [17]].

Deşi, introducerea floculării la drojdiile de bere este o metodă convenabilă de separare a drojdiei
din mediu se utilizează încă filtrarea berii care este o etapă tehnică importantă în industria de băuturi.
Prezenţa β - glucanilor în orz, împiedică filtrarea datorită vâscozităţii mărite, (Saccharomyces cerevisiae
nu poate hidroliza legăturile β 1,4 ale β - glucanilor) şi de aceea este necesară adăugarea unor enzime
comerciale. Alternativ, poate fi introdusă in drojdia de bere o genă heteroloagă care codifică β -
gluconaza de Bacillus subtilis şi Trichoderma yeesei. Ultima opţiune serveşte ca sarcina pentru ingineria
metabolică, deoarece substratul este mărit pentru a include şi β - glucanul şi în consecinţă procesul de
obţinere a berii poate fi îmbunătăţit. [18]

1.5.4. Îmbunătăţirea propietăţilor celulare

Un efort mărit s-a depus pentru a îmbunătăţi propietăţile existente ale Saccharomyces cerevisiae,
legate de exploatarea industrială a acestui organism. Interesante în acest sens sunt cercetările legate de a
obţine o reducere a represiei glucozei, folosită în consumul de sucroză şi maltoză, care sunt prezente în
amestecurile de zahăr din industrie şi care sunt metabolizate în mod natural de Saccharomyces cerevisiae.
Drojdia de bere este produsă aerobic din melase, care conţin 40% până la 50% sucroză. Producţia de
etanol şi produsele de panificaţie sunt procese anaerobe folosite la scară largă, unde Saccharomyces
cerevisiae metabolizează amestecurile de zahăr. Malţul folosit pentru producerea de etanol conţine 50 –
60% maltoză, iar amidonul prezent în aluatul pentru pâine este continuu descompus în oligozaharide prin
acţiunea amilazelor [31] Saccharomyces cerevisiae hidrolizează extracelular sucroza şi intracelular
maltoza prin acţiunea invertazei (Suc2) şi respectiv maltazei (MalS) (Figura 9). Transportorul maltozei
(MalT) joacă un rol esenţial în exprimarea genelor MAL, deoarece maltoza este cerută ca un inductor al
acestor gene, în contrast cu exprimarea genei SUC2, care nu are nevoie de inducere. Gena MAL cuprinde,
de asemenea, gena MALR, care codifică o proteină reglatoare responsabilă pentru inducerea genelor
MALT şi MALS.

9
Figura 9. Metabolismul sucrozei şi maltozei, în concordanţă cu genele respective: Suc2 invertaza, MalT
permeaza, MalS maltaza, MalR responsabilă de reglarea proteinelor pentru inducerea genei MalS şi
MalT.

Când maltoza sau sucroza sunt prezente în mediu împreună cu glucoza, fazele de lag intermitente
sunt situate între consumul glucozei şi consumul iniţial de sucroză sau maltoză, fenomen descris ca fiind
sub controlul glucozei. Acest mecanism reglator poate avea un efect costisitor asupra proceselor
menţionate mai sus, datorită timpului destinat procesului de control al glucozei. Sistemul reglator care
asigură consumarea glucozei înaintea altor zaharuri a fost studiat mai ales la nivel transcripţional, la
nivelul represiei glucozei. Represia glucozei, înlesnită de proteina Mig1, controlează exprimarea ambelor
gene SUC2 şi MAL. Mecanismul molecular al represiei glucozei cu ajutorul Mig1, este o cascadă
reglatorie care poate implica un complex de proteine ce conţine Ssn6, Tup1 şi Mig1, unde Mig1 dirijează
complexul spre un consens specific, spre promotorii genelor ţintă. Genele ţintă ale Mig1 sunt limitate nu
numai de genele ce codifică proteinele implicate în funcţiile periferice ale celulei, cum ar fi gena SUC2,
gena MAL şi gena GAL (ce codifică proteinele responsabile de utilizarea galactozei) şi de genele
metabolismului central al carbonului [[19], [20]].

Pentru a depăşi represia glucozei exercitată de gena SUC2, deleţia MIG1 într-o tulpină de
laborator haploidă (W303 – 1a) s-a dovedit a fi un succes, deoarece s-a observat o creştere a exprimării
genei SUC2, ce a fost obţinută atunci când celulele au crescut pe glucoză. În plus, micşorarea controlului
de glucoză a fost observată la creşterea a 2 mutante mig1 derivate dintr-o altă tulpină de laborator
haploidă şi o tulpină poliploidă industrială, respectiv pe amestecurile sucroz㠖 glucoză. O altă proteină
recent descoperită, Mig2, contribuie de asemenea la controlarea exprimării genei SUC2. Deleţia
adiţională a MIG2 într-o tulpină mutantă mig1 a arătat o depreciere continuă a exprimării genei SUC2.
Studiile fiziologice ale deleţiilor tulpinilor mig1mig2 au indicat că fărămiţarea lui MIG2 a condus la o
continuare a micşorării controlului glucozei şi o mărire a activităţii respiratorii; mai mult, s-a obţinut o
creştere de 12% a ratei specifice de creştere pe glucoză în comparaţie cu tipul sălbatic. Prin urmare,
deleţia concomitentă a lui MIG1 şi MIG2 s-a dovedit a fi un succes în producţia drojdiilor de panificaţie,
deoarece controlul glucozei este micşorat cu succes în metabolismul sucrozei [21].

Rata de consumare a glucozei folosită în procesul industrial poate fi mărită fără a apărea efectul
Crabtree, iar rata specifică de creştere, care serveşte ca un important parametru în producţia drojdiilor de
panificaţie, este mărită prin această abordare.

Strategiile de succes pentru metabolismul energetic al genelor MAL pentru diminuarea extinderii
controlului glucozei exercitată asupra acestor gene este diferită de strategiile mai sus amintite. Transferul
genei MIG1 în tulpina haploidă de tip sălbatic B224 a micşorat încet controlul glucozei exercitat asupra
genelor MAL. Oricum, acest efect nu s-ar fi putut obţine cu mutante mig1 derivate din haploida CEN.
PK113 – 7D şi tulpina poliploidă industrială DG1342.[22] Tulpinile mutante mig1 derivate din ultimele
10
două tulpini de tip sălbatic au început să consume maltoza la niveluri mai scăzute de glucoză, când au fost
cultivate în medii complexe cu glucoz㠖 maltoză, în comparaţie cu tipurile parentale. S-a concluzionat că
aceasta se datorează unei inactivări mai puternice a metaboliţilor permeazei maltozei. Scindări adiţionale
ale genei MIG2 în mutante derivate din tipul sălbatic CEN. PK113 – 7D au arătat un fenotip uşor mai
represat decât mutanta mig1. Desfacerea lui MIG1 (şi MIG2) poate derepresa anumite proteine implicate
în semnalizarea glucozei, iar aceste proteine mediază inactivarea permeazei maltozei. Mai multe raporturi
arată că inactivarea catabolică a permeazei maltozei, are un impact major asupra metabolismului
maltozei, iar analizele de control metabolic indică de asemenea, că permeazele maltozei limitează
metabolismul maltozei [23].

În loc de a ţinti gene reglatoare ca MIG1 şi MIG2, îmbunătăţirea consumului de maltoză din
amestecurile glucoz㠖 maltoză au fost obţinute prin exprimarea constitutivă a genelor structurale MAL.
Exprimarea constitutivă a MALT şi MALS în mutanta mig1 derivată din tipul sălbatic B224, a arătat o
utilizare simultană a glucozei şi maltozei. Când MALT şi MALS au fost supraexprimate în tulpina de tip
sălbatic, maltoza a fost utilizată în defavoarea glucozei. După cât se poate presupune, supraexprimarea
genei MALT contracarează complet efectul de inactivare a catabolismului carbonului în transportorul
maltozei. În sprijinul micşorării controlului glucozei, supraexprimarea celor două gene strcturale MAL a
crescut rata specifică de creştere cu 0,03h-1 şi la glucoză şi la maltoză, comparativ cu cea a tipului sălbatic
[24].

Deci, această strategie pare să fie atractivă pentru micşorarea controlului glucozei în metabolismul
maltozei în cazul drojdiilor de fermentaţie, ceea ce reduce timpul de producere a etanolului. Controlul
redus al glucozei arată, de asemenea, un timp redus al procesului de producere a pâinii, care este mai
departe micşorat deoarece aluatul poate creşte şi mai repede, ca rezultat al măririi ratei specifice de
creştere.

Deleţia genelor ce codifică proteinele represoare de transcripţie sau supraexprimarea genelor ce


codifică activatorii transcripţionali pozitivi, poate fi o strategie de succes pentru ingineria metabolică, în
anumite sisteme metabolice. Această strategie poate rezulta din supraexprimarea mai multor gene, care
sunt subiectul controlului transcripţional implicând proteina represoare de deleţie sau proteina represoare.

În anumite cazuri această abordare va fi favorabilă în comparaţie cu supraexprimarea genelor ce


codifică unele sau toate enzimele unei anumite căi metabolice [25].

1.6. Producerea de proteine heteroloage

De-a lungul studiilor efectuate asupra comportamentului Saccharomyces cerevisiae, ca şi a


importantei capacităţii acestei drojdii de a exprima gene străine în combinaţie cu aparatul ei secretor, face
din Saccharomyces cerevisiae un organism-gazdă atractiv pentru producerea de anumite proteine
heterogene.

Numeroase proteine heterogene care au fost folosite în scopul de a diagnostica sau ca agenţi
terapeutici umani şi vaccinuri au fost produse cu succes de Saccharomyces cerevisiae.

Interferonul uman a fost prima proteină recombinantă produsă de Saccharomyces cerevisiae în


1981, iar în anul următor a fost produs primul vaccin obţinut prin intermediul ingineriei genetice [26].
Producţia industrială de insulină de către Saccharomyces cerevisiae, acoperă aproape jumătate din nevoia
de insulină a 154 de milioane de diabetici din întrega lume [27]. În ultimii ani secreţia de insulină a
Saccharomyces cerevisiae a fost îmbunătăţită prin ingineria proteinelor secvenţei leader, iar de
îmbunătăţirile realizate va beneficia nu numai farmaciile şi diabeticii, ci şi potenţialul de organism-gazdă
al Saccharomyces cerevisiae pentru producerea, de alte proteine heterogene.

Saccharomyces cerevisiae are o cale secretorie multiplă şi este capabilă de a produce modificări
posttranslaţionale ale proteinelor heterogene, cum ar fi maturarea proteolitică a prohormonilor şi formarea
11
legăturilor bisulfidice.[28]Aceste trăsături se aseamănă cu cele ale celulelor mamiferelor, iar unele proteine
ale mamiferelor active biologic pot fi exprimate prin urmare cu succes şi secretate de Saccharomyces
cerevisiae. În plus, transformarea Saccharomyces cerevisiae cu ADN străin şi binecunoscuta tehnologie
de fermentare a acestui organism, face din Saccharomyces cerevisiae o gazdă bună pentru producerea de
proteine heteroloage. Cu toate acestea, Saccharomyces cerevisiae prezintă unele dezavantaje, când este
folosită pentru producerea unor anumite proteine recombinante heterogene. Astfel de probleme au fost
observate ca rezultat al instabilităţii plasmidiale ducând la hiperglicozilarea proteinelor heterogene
secretate, ceea ce poate cauza efecte de imunogenitate nedorite. Pentru a depăşi astfel de modulări
nedorite ale proteinelor recombinante de interes, au fost investigate tulpini alternative, pentru a fi folosite
ca organisme gazdă [[29], [30]].

Celulele haploide de împerechere de tip α ale Saccharomyces cerevisiae, secretă feromonul factor
- α, printr-o combinare eficientă a celulelor haploide a şi α. Factorul - α al Saccharomyces cerevisiae
prepro – leader este cel mai folosit ca sistem de exprimare secretorie pentru proteinele heterogene în
numeroase şi diferite tulpini, incluzând şi Saccharomyces cerevisiae. Fuziunea între secvenţa prepro –
leader cu o genă heterogenă, permite ca Saccharomyces cerevisiae să secrete proteine heterogene,
deoarece secvenţa leader mediază translocarea cotranslaţională (Figura 10) a fuziunii proteinei în eucariote
[31]. Preregiunea secvenţei leader este separată de o peptidaz㠖 semnal, iar în aparatul Golgi
endoproteaza Kex2 separă preregiune în partea C-terminală a maturării dibazice Kex2. Înainte de secreţie,
peptida spaţiatoare a maturării Kex2 de la extremitatea C-terminală este înlăturată prin acţiunea dipeptidil
– aminopeptidazei, codificată de gena STE13 şi proteina heterogenă este eliberată în mediul extracelular
[32].

De-a lungul timpului au fost efectuate studii pentru a îmbunătăţi secreţia de insulină prin folosirea
factorului α prepro – leader al Saccharomyces cerevisiae; întregul α - factor prepro – leader al
Saccharomyces cerevisiae a fost folosit pentru studiile iniţiale în secreţia de insulină cu o peptidă
spaţiatoare având o secvenţă Glu – Ala – Glu – Ala, care rezultă prin fuziunea proteinelor arătate în
Figura 10 [33].

Figura 10. Ilustrarea unui α factor prepro-leader fuzionat cu un precursor al insulinei.

În acest studiu, peptida spaţiatoare a fost îndepărtată cu greu de dipeptidil – aminopeptidaza,


obţinându-se în principal un precursor al insulinei Glu – Ala – Glu – Ala, deci spaţiatorul a fost
îndepărtat prin mutageneza directă asupra locului. Această modificare a factorului α al secvenţei leader a
relevat cu succes exprimarea şi secreţia a numeroşi precursori insulinici. Alte studii au arătat avantajul
unui spaţiator, deoarece poate fi atinsă o îmbunătăţire a procesării Kex2p, ceea ce în cazul insulinei este
de preferat deoarece procesarea insuficientă a Kex2, poate cauza o hiperglicozilare şi o depreciere a
producţiei de insulină.

Când spaţiatorii potriviţi şi creaţi în aşa fel încât să poată fi îndepărtaţi de tripsină sau de
Achromobacter lyticusce cu o protează specifică Lys1, au fost introduşi între Kex2 dibazic şi precursorul
insulinic, producţia de precursor al insulinei a fost îmbunătăţită. Prezenţa unui spaţiator nu numai că s-a
dovedit a fi un succes pentru secreţia secvenţei leader a factorului α fuzionată cu precursorul insulinei, dar
şi glicozilaza N – lincată a celor două părţi a α-factorului propeptidglicozilat, localizate aproape de
12
precursorul insulinei, joacă un rol de pivot în procesul de secreţie, deoarece lipsa acestor două glicozilaze
micşorează semnificativ secreţia precursorului insulinei [34].

O altă exprimare a fost recent demonstrată la Saccharomyces cerevisiae sub designul secvenţelor
prepro – leader obţinute prin combinarea unei abordări raţionale şi a unei optimizări treptate [35]. Dacă
liderii sintetici au fost folosiţi într-un context spaţiator potrivit, producţia de precursor de insulină a
depăşit producţia obţinută cu α - factori prepro – leaderi, şi mai departe liderii sintetici au facilitat secreţia
nu numai a insulinei, dar şi a altor proteine heterogene [36]. Experimentele pulsatorii au arătat un timp de
transmisie prelungit al liderului sintetic al proteinei de fuzionare a precursorului insulinei la Eucariote cu
fuziunea proteinelor ce conţin α - factor prepro – leader, fapt ce oferă o extindere a timpului pentru
împachetarea corectă a precursorului insulinei şi deci producţie mărită. Când prepro – leaderii sintetici
lipsesc din glicozilaza N – lincată, părţile fuzionează cu proteina precursoare a insulinei obţinându-se o
producţie mai mare a precursorului de insulină împachetat corect în comparaţie cu cea obţinută datorită
secvenţelor leader cu α - factori. Totuşi, lipsa de legături N – glicozilate ale prepro – leaderilor, nu a avut
un impact asupra capacităţii de secreţie, ceea ce contrastează cu ceea ce a fost pentru prepro – leaderii α -
factori, după cum s-a menţionat mai sus [37].

Înlocuirea părţii de maturare Kex2, cu o altă parte procesată enzimatic, aparţinând prepro –
leaderilor cu legăturile N – glicozilază lipsă, a dus la o secreţie a precursorului insulinei neprocesat, iar
acest precursor neprocesat ar putea fi purificat din mediul de cultură şi maturat in vitro prin adăugarea de
lysyl – protează specifică produsă de Achromobacter lyticus [38]. Înlocuirea situsului de maturare Kex2 cu
un alt situs proteolitic poate fi potrivită pentru secretarea de proteine heterogene, ce au secvenţa de
maturare Kex2 în structura lor, deoarece o anume proteină poate fi scindată de endoproteaza Kex2, ceea
ce cauzează o descreştere a producţiei de proteine heterogene. Deci, prin alegerea unei enzime
proteolitice a cărei secvenţă de procesare nu este prezentă în proteina heterogenă de interes, această
proteină poate fi secretată ca o proteină de fuziune neprelucrată într-o tulpină mutantă kex2 şi treptat
maturarea se poate induce in vitro. În continuare, secreţia unei proteine heterogene neprelucrate ce are un
pro – leader sintetic poate fi comparată avantajos cu secreţia unei proteine heterogene prelucrate,
deoarece acest pro – leader induce o stabilitate şi o solubilitate a proteinei de fuziune, ceea ce este de
preferat înainte de începerea purificării şi maturării proteinei de fuziune. Noua descoperire a secvenţei
sintetice prepro – leader s-a demonstrat a fi o pârghie extrem de puternică pentru exprimarea şi secreţia de
insulină, iar aceste secvenţe leader pot activa exprimarea şi secreţia proteinelor heterogene, ceea ce nu
este posibil cu factorul α - prepro – leader folosit în mod tradiţional.

Conceptele descrise mai sus relatează câteva exemple de obţinere de tulpini de Saccharomyces
cerevisiae cu propietăţi noi sau îmbunătăţite prin inginerie genetică şi metabolică. Ideea de bază în
utilizările tulpinilor de Saccharomyces cerevisiae este aceea de a satisface din ce în ce mai multe scopuri
biotehnologice. Deoarece secvenţa completă genomică a drojdiei este cunoscută, schimbările genetice
ţintă sunt mai uşor de obţinut prin tehnologia ADN recombinant, ceea ce facilitează şi accelerează studiile
de inginerie metabolică.. Totuşi, rigiditatea Saccharomyces cerevisiae privind alterarea funcţiilor ei
metabolice poate limita anumite abordări ale metabolismului ingineresc, acest microorganism are cu
siguranţă un potenţial mărit pentru căile energetice. Un număr de noi aplicaţii bazate pe Saccharomyces
cerevisiae vor apărea în viitor, iar acestea, împreună cu exemplele menţionate, vor ilustra clar potenţialul
tulpinii Saccharomyces cerevisiae, ca fabrică celulară în procesele biotehnologice.

[1] Lindquist, G., Molecular Psychiatry, 1, 376-379, (1996).


[2] Bailey, J. E., Science, 252, 1668-1675, (1991).
[3] Stephanopoulos, G., Aristodon, A., Nielsen, J., Metabolic engineering, academic Press, Inc. San
Diego, Calif., (1998).
[4] Bailey, J. E., Science, 252, 1668-1675, (1991).
[5] Christensen, B., Nielsen, J., Adv. Biochem. Eng. Biotechnol., 66, 209-231, (1999).
[6] Pedersen, H., Carlsen, M., Nielsen, J., Appl. Environ. Microbiol., 65, 11-19, (1999).
[7] Lindquist, G., Molecular Psychiatry, 1, 376-379, (1996).
[8] Ostergaard, G., Olsson, L., Nielsen, J., Microbiol. Molec. Biol., 64, 34-50, (2000).
13
[9] Yamano, S., Tomizuka, K., Gone, M., Imura, T., Tanaka, J, Inone, T., J. Biotechnol., 39, 20-26,
(1995).
[10] Erikson, P., Andre, L., Ansell, R., Blamberg, A., Adler, L., Mol. Microbiol., 17, 95-107, (1995).
[11] Valadi, H., Larsson, C., Gustafsson, L., Appl. Microbiol. Biotechnol, 50, 434-438, (1998).
[12] Ostergaard, G., Olsson, L., Nielsen, J., Microbiol. Molec. Biol., 64, 34-50, (2000).
[13] Jensen, P. R., Snoep, J. L., Westerhoff, H. V., PCT International publication no WO 98/10089,
(1998).
[14] Stratford, M., A dv. Microb. Physiol., 33, 1-71, (1992).
[15] Teunissen, A., Van der Berg, J. A., Steensma, H. Y., yeast, 11, 1001-1013, (1995).
[16] Teunissen, A., Van der Berg, J. A., Steensma, H. Y., yeast, 11, 1001-1013, (1995).
[17] Teunissen, A., Van der Berg Steensma, H. Y., Yeast, 11, 435-446, (1995).
[18] Olsen, O., Thomsen, K.,K., Carlberg Res. Commun 54, 29-39, (1989).
[19] Hu, Z., Nehlin, J. O., Ronne, H., Michels, C. A., Curr. Genet., 28, 258-266, (1995).
[20] Trumbly, R. J., Mol. Microbiol., 6, 15-21, (1992).
[21] Lutfiyya, L. L., Jonston, M., Mol.Cell.Biol., 16, 4790-4797, (1996).
[22] Klein, C. J. L., Rasmunsen, J. J., Ronnow, B., Olsson, L., Nielsen, J., J. Biotechnol., 68, 197-212,
(1999).
[23] Klein, C. J. L., Olsson, L. L., Nielsen, J., Enzyme Microb. Technol., 23, 91-100, (1998).
[24] Klein, C. J. L., Olsson, L., Ronnow, B., Mikkelsen, D. J., Nielsen, J., Food Technol. Biotechnol., 35,
287-292, (1997).
[25] Ostergaard, G., Olsson, L., Nielsen, J., Microbiol. Molec. Biol., 64, 34-50, (2000).
[26] Hitzeman, R. A., Hagie, F. E., Levine, H. L., Nature, 293, 717-722, (1981).
[27] Velenzuela, P., Medina A., Rutter, W., J., Ammerrer, G., Hall, D., Nature, 298, 347-350, (1982).
[28] Schekman, R., Novick, P., The molecular biology of the yeast Saccharomyces, Cold Spring Harbor
N.Y., 361-393, (1982).
[29] Buckholz, R. G., Gleeson, M. A. S., Appl. Biochem. Biotechnol.,38, 105-140, (1991).
[30] Romanos, M. A., Scorer, C. A., Clare, J. J., Yeast, 8, 423-488, (1992).
[31] Brake, A. I., Yeast Genetic Engineering, P. J. Barr, A. J. Brake and P. Valenzuela, Butterwarths,
Boston, 269-280, (1989).
[32] Zsebo, K. M., Lu, S., Fieschko, J. C., Goldstein I., J. Biol. Chem., 261, 5858-5865, (1987).
[33] Thim, L., Hansen, M. T., Norris, K., Boel, E., Proc. Nat. Acad., Sci USA 83, 6766-6778, (1986).
[34] Corplan, S., Green, R., Rocco, J., Kurjan, J., J. Bacteriol, 173, 627-635, (1991).
[35] Kjeldsen, T., Petterson, A. F., Hach, M., Diers, I., Hansen, P. M., Andersen, A. S., Protein Expr.
Purif, 9, 331-336, (1997).
[36] Kjeldsen, T., Petterson, A. F., Hach, M., Diers, I., Hansen, P. M., Andersen, A. S., Protein Expr.
Purif, 9, 331-336, (1997).
[37] Kjeldsen, T., Hach, M., Petterson, A. F., Markussen, J., Protein Expr. Purif., 14, 309-316, (1998).
[38] Kjeldsen, T., Hach, M., Petterson, A. F., Markussen, J., Protein Expr. Purif., 14, 309-316, (1998).

14