Cod procedură: P-BioCel 4 Întocmit: Dana Constantinescu Data 13 Aprilie 2009

Versiune 1.0 : Verificat/aprobat: Bogdan GRIGORIU 13 Aprilie 2009

Status document: final Număr total de pagini: 1
 
Protocol Cultura linii celulare in suspensie

A. Descriere - Acest protocol se aplica pentru urmatarele linii celulare:

  Linia celulara  Ref ATCC Origine
1  JURKAT  Limfocite T umane  U774 
(23 June 2008)
2  P 388 D1  Mieloide de  U774 
soarece  (23 June 2008)
3  U 937  Monocit/macrofag  U774 
uman  (23 June 2008)
4  THP 1  Monocitoide  U774 
umane  (23 June 2008)
Atentie !: detinerea acestor proteine este supusa unui MTA si laboratorul nu are dreptul de
a distribui aceste linii celulare fara acordul expres al laboratorului de origine

B. Conditii de cultura:
Mediu: RPMI 1640 (cu bicarbonat si L-glutamina) + 10% SVF (= „RPMI complet”)
Antibiotic: se adauga solutie de Ticarcilina sau solutie antibiotic-antimicotic
Conditii de incubare: 37 °C, 5% CO2
C. Recoltare si subcultivare
- Se aspira mediul de cultura din placa/flask-ul de cultura anterior si se centrifugheaza 5
minute la 300g.
- Celulele se resuspenda apoi in mediul sau tamponul in care vor fi utilizate (RPMI 1640
complet daca se subcultiva), se numara la Camera Thoma si se utilizeaza
- Rata de subcultivare este de 1:4 in general iar mediul se schimba o data la 2-3 zile
(x2/sapt); Se poate subcultiva pina la max 1:10.
D. Conditii de congelare:
- Mediu de cultura complet (RPMI + 10% SVF) + 10% DMSO, 106 celule/ml in criotuburi
de 2 ml. Dupa resuspendarea celulelor in mediul de congelare cu DMSO se introduc
rapid criotuburile in dispozitivul de congelare progresiva („Cryo-freezing device”) care
a fost umplut cu Isopropanol LA TEMPERATURA CAMEREI. Apoi se introduc la -
80°C; Dupa 24 de ore se scot si se pun in banca celulara corespunzatoare (-150°C, azot
lichid sau in lipsa chiar congelator la -80 °C).
E. Conditii de decongelare:
- Se prapara un flask de 25 cm2 in care se introdul 5-7 ml de mediu complet;
- Scoate criotubul din banca de celule;
- Apoi se incalzeste in mana tubul; cand continutul acestuia s-a decongelat la periferie se
continua; NU ASTEPTATI DECONGELAREA COMPLETA A CONTINUTULUI !
- Se dezinfecteaza gatul tubului cu alcool 75% (atentie nu alcool absolut );
- Prin rasturnare rapida se pune continutul criotubului in flask-ul de cultura;
- Dupa 3-6 ore (sau a doua zi eventual) se subcultiva celulele (recuperare, centrifugare
resuspendare in mediu „complet”; Acest lucru este necesar deoarece DMSO folosit la
congelare ca anticristalizant este toxic pentru celule.

1