3.1.3.

APLICAŢII ALE CZE

Majbritatea aplicaţiilor CZE sint in zona cercetărilor biologice, mai

ales pentru peptide si proteine. De exemplu, pe lingă cele deja prezentate
in acest capitol, putem da separarea glicoproteinelor. Glicoproteinele sint
de obicei greu de analizat prin metode tradiţionale de electroforeza cu gel,
focalizare izoelectrica sau lichid- cromatografie. In unele cazuri CZE este
avantajos. In figura 15 se prezintă separarea glicoformelor din hormonii
umani recombinaţi de tip eritropoetina. Speciile diferite apar ca rezultat al
heterogenitatii dupa modificarea post-translajjonala. CZE este foarte
potrivita pentru asemenea analize ,deoarece majoritatea modificărilor
post- translationale au impact asupra sarcinii proteinei (adica, apar
modificări N- sau C- terminale, fosforilari, carboxilari si N-glicolizari).
Un succes important a fost obtinut pentru detectarea peptidelor prin
CZE.In detectarea peptidelor o proteina este clivata enzimatic sau chimic
in fragmente peptidice mai mici si care sint ulterior separate .Analiza este
mai ales calitativa si este folosita la detectarea diferentelor foarte mici din
proteine .In figura 16 este prezentata o harta a unei peptide prin CZE.
CZE este folosit si pentru analiza bidimensionala a peptidelor purificate
prin HPLC .(fig.17)
27
 a) CH3C00Na-
CH3C00H

b) CH3C00Na
-H3P0y

c) CH3C
00Na-H2S04

15
5 10

Time [mini Reproducibilit

Figura 15. Influenta y (RSD %)
compoziţiei soluţiei n
tampon asupra separarii Migrationtime
glicoformelor Mobility 20
0 eritropoietinei 89 2.5%
Time
[min]
Figura 16. Harta unui peptid prin
BSA rapid.
m m
A A
U U

1 1
6 6
- 1
1 4
4 1
- 2
1 1
2 0
1
0
-
l
8
6
-
4
-

29
 Figura 17. CZE pentru HPLC
Fract Fracti
cu faze inversate.
ion on 18
15

11 13 15 17 19
Time [min]
10 12 14 16 18
Time [minj
In condiţii optimizate eficienta ridicata este suficienta pentru
detectarea diferentelor mici din structura solutului. Asa cum se vede din
figura 18 se pot analiza doua peptide formate din cite opt aminoacizi care
diferă doar prin substituirea D- tirosinei cu L-tirosina. Exemplul ilustreza
efectul diferentelor conformationale asupra mobilitatii,deoarece CZE nu
poate separa izomeri fara aditivi chirali.
m6 [d-tyr]
AU Neurot
2 neuro-
ensin
- tensin
6 \
0
-
5
6
-
5
2
4
8
4
4
40
H

31
 6 7
Figura 18. Separarea prin CZE a izomerilor neurotensinelor.

Prin CZE s-a reuşit si determinarea medicamentelor sau a

metabolitilor medicamentelor. Figura 19a prezintă analiza cefiximei
(cx) ,un un antibiotic cefalosporinic oral si a metabolitilor sai.
Hidrofilicitatea puternica a acestor metaboliti face dificila extragerea lor
din fluide biologice. Din acelaşi motiv, separarea prin lichid-
cromatografie cu faze inversate este insuficienta chiar si in prezenta
agenţilor de cuplare a ionilor.Identificarea medicamentului in urina
umana este prezentata in figura 19b. Analiza cantitativa a avut eroare in
jur de 3%.

33
M4 CX M5

Mol
,M2

CA
35
C
X
37
 ____J-J 1- •
iwu
-i- -1---1 0 10 20 30 40 50
0 5 10 15 20 25
39
 Migration time [min]

Figura 19
a)CZE pentru cefixima si metabolitii sai; b) analiza urinei umane .

In figura 20 este exemplificata folosirea CZE la analize de mediu. In

acest studiu .condiţiile au fost optimizate pentru a se putea obţine
separarea acizilor sulfonici aromatici si a compuşilor inruditi. Aici 4-
clorbenzinsulfonatul este identificat ca leacat intr-o zona de climat
standard din S.U.A. Identificarea peakurilor a fost confirmata prin
spectrometrie de masa .Alături de cromatografie, CE a fost dovedita ca
avind un potential mare pentru separarea si caracterizarea probelor din
mediupolare si nevolatile.

1 20
Time
0 22.25
[min)
Absorbance
4-chlorobenzenesulfonate

0.0400.;

0.0200
0.0000
0

Figura 20. Analiza leacatelor din mediu prin CZE.

CZE a fost folosita si la separarea ionilor anorganici si a acizilor

organici ,care era facuta de obicei prin ion-cromatografie (fig.21).

41
 Time [min]

Figura 21. Analiza ionilor de la fermentatie utilizind detectia UV indirecta.

Detectia UV indirecta este necesara datorita lipsei cromoforilor din aceste

specii. Detectia indirecta este realizata folosind specii puternic
absorbante, cum ar fi cromatul sau imidazolul in soluţia tampon, si
monitorizind la absorbanta maxima pentru majoritatea speciilor (de
exemplu, 254nm pentru cromat) .Ionii din solut deplaseaza ionii din
cromat si apare o scădere a absorbantei, cind aceste zone trec prin zona
detectorul ui. Pentru a scadea timpul de analiza pentru cationii prezentati
aici, s-a adaugat un surfactant cationic (CTAB) in soluţia tampon pentru a
inversa EOF-ul spre catod. Datorita mobilitatii mari a ionilor mici, totuşi ,
EOF nu e destul de puternic pentru a transporta ionii care migreza in
direcţia opusa, si de aceea anionii nu pot fi analizaţi simultan.In aceste
determinări de ioni mici formele peakurilor sint de obicei modificate
datorita diferentelor dintre conductivitatile soluţiilor tampon si ale
ionilor.

42
/

43
 BIBLIOGRAFIE

1. Ewing, R.A. Wallingford, T.M. Olefirowicz, Cappilary Electrophoresis, Anal.

Chem. 1989, 61, 292A-303A
2. Gordon ,W. Huang ,S.L. Pentoney ,R.N. Zare ,Capillary Electrophoresis,
Science 1988,242, 224-228 .
3. P.D. Grossman, J.C.Colburn eds.,Capillary Electrophoresis-Theory and
Practice, Academic Press Inc.:San Diego, 1992
4. S. Honda, A.Taga, K.Kakehi, S.Koda, Y. Okamoto, Determination of cefixime
and its metabolites by high performance capillary electrophoresis, J. Chromatogr.
1992, 590, 364 ,368
5. X.Huang, W. F. Coleman, R.N. Zare, Analysis of factors causing peak
broadening in capillary zone electrophoresis, J. Chromatogr. 1989,480,95-110
6. P. Jandik, W. R. Jones, A.Weston ,P. R. Brown ,Electrophoretic capillary ion
analysis: origins ,principles, and applications,LC/GC Internat. 1991,5,20-27
7. J.W. Jorgenson ,K.D.Lukacs ,Capillary Zone Electrophoresis, Science 1983,
222,266.
8. J.W. Jorgenson ,Electrophoresis ,Anal. Chem.1986,556 ,743A-758A
9. W.G.Kuhr ,Fundamental Reviews: Capillary Electrophoresis ,Anal. Chem.
1990,62, 403R-414R
10. W.G. Kuhr ,C.A. Monnig ,Fundamental Reviews: Capillary
Electrophoresis ,Anal. Chem. 1992, 64, 389R-407R
11. H.H. Lauer ,D.McManigill ,Capillary Zone electrophoresis of proteins
in untreated fused silica tubing ,Anal. Chem. 1986 ,58 ,166-170
12.S.F.Y. Li, Capillary Electrophoresis-Principles ,practice ,and
applications,Journal of Chromatography Library,Elsevier Scientific Publishers :
Amsterdam ,1992

44
 13. K.D. Lukacs J.W.Jorgenson ,Capillary zone electrophoresis :Effect of
physical parameters on separation efficiency and quantitation ,J«High
Res.Chromatogr.1985, 8, 407-411
14. Y.-F. Maa, K.J.Hyver ,S.A.Swedberg ,Impact of wall modifications on
protein elution in high performance capillary electrophoresis ,J.High
Res.Chromatogr.1991, 14, 65-67
15. D.McManigill ,S.A.Swedberg ,Factors affecting plate height in high
performance zonal capillary electrophoresis ,in Tech. In Protein Chem.,T.Hugli ed
.,Academic Press :San Diego, 1989, 468,477
16,S.A.Swedberg ,Use of non-ionic and zwitterionic surfactants to enhance
selectivity in high performance capillary electrophoresis .An apparent micellar
electrokinetic capillary chromatography mechanism ,J .Chromatogr. 1990 ,
503,449-452
17. Th.P.E.M.Verheggen ,A.C.Schoots ,F.M.Everaerts ,Feasibility of capillary
zone electrophoresis with suppression of electroendosmotic flow in completely
closed systems ,J.Chromatogr.l990 ,503,245-255
18. R.A. Wallingford ,A.G.Ewing ,Capillary Electrophoresis ,Adv.Chrom.l989,
29,1/076

45