UNIVERSITATEA FACULTATEA

Msurarea solveniilor reziduali din probele farmaceutice folosind tehnici rapide de cromatografie de gaze

Student

Cuprins

Cuprins .................................................................................................................................... 2

Capitolul I. Introducere ......................................................................................................... 3

Capitolul II. Determinri experimentale ............................................................................ 4

Capitolul III. Rezultate i discuii ......................................................................................... 7

Concluzii ................................................................................................................................. 10

Bibliografie ............................................................................................................................. 11

Capitolul I - Introducere

Cromatografia de gaze este printre cele mai rspndite i totodata este prima dintre metodele de analiz cromatografic aplicat la scar larg n analizele chimice. Compuii amestecului supus separrii nu trebuie s fie neaprat gaze, ci pot s fie i lichide sau chiar solide volatile. Substanele de analizat se introduc n coloana de separare, la o temperatur potrivit, prin intermediul unui dispozitiv de introducere a probei. Singura restricie este temperatura de vaporizare care uneori poate fi mai mare dect temperatura de descompunere a substanelor de analizat. n aceste cazuri se poate recurge la alte tehnici cromatografice care au ca eluent un lichid sau fluid supracritic. De asemenea, se mai pot realiza, nainte de introducerea probei n cromatograf, niste derivai (compui noi), volatili, utiliznd aumite reacii chimice specifice, procedeu denumit derivatizare. Uurina cu care se pune la punct o analiz nou, sensibilitatea sa, posibilitatea de automatizare precum i largile posibiliti de aplicare sunt avantajele principale ale acestei metode. Printre domeniile n care cromatografia de gaze i-a cucerit un loc de prim rang sunt: petrochimia, industria farmaceutic, protecia mediului, analiza aromelor, igiena i criminalistica.

Scopul lucrarii

Solvenii reziduali realizai din probele farmaceutice sunt monitorizai cu ajutorul cromatografiei de gaze (GC), fie prin detectare de ionizare cu flacr (FID) sau cu spectrometrie de mas. n general, metodele GC au fost elaborate pentru a monitoriza solveni de rutin utilizai n procesul de sintez a medicamentelor. n aceast lucrare, se va discuta despre dezvoltarea i punerea n aplicare a metodelor rapide GC pentru solvenii reziduali de testare. Solveni sunt de obicei folositi n procesul de sintez i de chimie a medicamentelor. Aceti solveni din proces nu pot fi eliminati complet prin bunele practici de fabricaie practicate cum ar fi congelare-uscare i uscarea n vid la temperaturi ridicate. Unii solveni sunt bine cunoscuti de a provoca toxicitate inacceptabil, subliniind importana limitrii prezenei 3

solveniilor reziduali la un nivel minim. Bazat pe o monografie Pharmacopea din Statele Unite de impuriti organice volatile n produsele farmaceutice, solveni cum ar fi benzen, cloroform, 1,4-dioxan, clorur de metilen i tricloretilen sunt plasate sub supraveghere. Coninutul de solveni organici reziduali n farmaceutice este de obicei msurat prin cromatografie n faz gazoas (GC). Aplicaiile de rutin prin GC includ analiza probelor cu ingrediente farmaceutice active i intermediari lor de a se conforma laboratoarelor i bunelor practici de fabricaie, precum i testarea n-proces a solvenilor reziduali la optimizarea procedurilor de uscare.

Capitolul II Determinri experimentale

Aparatura si materialele cromatografiei de gaz

Au fost utilizate cromatografe de gaz de la Agilent Technologies (Palo Alto, CA), modelele 5890 din seria a II-a i 6890, pentru dezvoltarea i validarea metodelor. Cromatografe de gaze au fost echipate cu opiunea cuptor standard pentru creterea temperaturii, mprirea porturilor de injecie i detecia de ionizare prin flacr (FID). Injectarea eantionului de lichid a fost realizat prin intermediul unitii 6890 auto-prelevarea de probe de la Agilent Technologies, folosind o sering de 10 l (numr parte 9301 - 0713) compatibil cu MerlinTM Microseal (numr parte 5182-3444). mprirea injectrii de 1 l a fost realizat n portul de injectare meninut la temperaturi ridicate. O linie-conic cu vat de sticl dezactivat (Agilent Technologies, numrul de component 5183-4711) a fost folosit ca linie port. O coloan RTX502.2 (Restek, Bellafonte, PA, numrul de component RK10915), cu o pelicula de 1.4 m difenil/dimetil polisiloxani n faza staionar, 30m x 0.25mm i.d., a fost utilizat n dezvoltarea unor metode de GC pentru testarea solvenilor reziduali. Acest coloana 0.25mm i.d., cu o faz de polaritate sczut ofer avantajele combinate de nalt rezoluie cu vrfuri analit i capacitatea probelor acceptabile. Heliu de puritate ridicat a fost folosit ca gaz purttor.

Prepararea soluiilor de prob i standard Dimetilacetamid (DMA) a fost selectat ca soluie standard i diluant, bazat pe capacitatea sa de a dizolva o gam larg i variata de substane medicamentoase. De asemenea, DMA este un solvent cu un punct de fierbere nalt care nu interfereaz cu mai multi solveni volatili testati prin GC. Pentru metoda care implic analiza punctului de fierbere ridicat al solventilor, metanolul a fost selectat ca diluant. Soluiile mam standard de la 1,0% (v / v) au fost pregtite prin pipetarea a unui 1 ml din fiecare test solvent ntr-un balon volumetric de 100 ml i se dilueaz la volum cu solventul adecvat. Concentratia soluiilor etalon de lucru variaza de la 0.0004 - 0.04% (v / v) si au fost utilizate pentru a valida metodele generale, utilizand instrumente convenionale de GC. Pentru metoda care implic tehnologia Flash GC, concentratia standard de lucru variaza de la 0.001 la 0.1% (v / v). Probele intermediare a noilor substane medicamentoase au fost obinute de Grupul de Proces Cercetare Dezvoltare al Institutului de Cercetare Farmaceutica BristolMyers Squibb situat n Candiac, Qubec, Canada. Solutiile standard au fost pregtite prin transferul de greutate corespunztoare probei,de la 25 la 100 mg, n funcie de solubilitatea n diluant, ntr-un flacon. Fiecare prob a fost dizolvat ntr-un 1 ml de diluant ntr-un flacon plafonate, care au fost agitate pentru a realiza dizolvarea. Cromatografia de gaz EZ FlashTM

Tehnologia, cromatografia de gaz Flash, folosete nclzirea rezistiv a unui capilar din coloana pentru a realiza separarea rapid a analiilor cu o gam larg a punctului de fierbere. nclzire rezistiv se bazeaz pe principiul c temperatura unui metal crete atunci cnd un curent electric trece prin el, i rezistena la metale crete, prin urmare, ntr-o manier care poate fi prezis. Temperatura metalului poate fi determinat prin msurtori de rezisten i poate fi ajustat prin controlul cantitii de energie aplicat pentru a ajunge la setarea temperaturii definite. Cu tehnologia EZ FlashTM a lui ThermoOrion, asamblarea coloanei se realizeaza prin introducerea unui capilar standard de coloan ntr-o mant metalic fiind folosit pentru a nclzii coloana. Avnd n vedere c masa termic a boilerului este redus la minimum, timpul 5

de inclzire i de rcire a unui coloane capilare EZ FlashTM este mai mic, spre deosebire de cromatograme de gaze convenionale, care impun ca ntreagul cuptor a cromatogramei de gaze s se nclzeasc i s se rcesc. Utilizarea cromatogramei de gaz FlashTM este simpl i nu necesit extra-training, cu excepia asamblrii coloanei care necesit unele cunotine. Accesoriile cromatografiei de gaz EZ FlashTM (ThermoOrion, Beverly, MA), inclusiv adaptoarele injectorului i detectorului, au fost instalate pe un cromatograf de gaz conventional 5890 din a II-a serie de la Agilent Technologies (Palo Alto, CA). Asamblarile corespunztoare coloanei capilare 10 m EZ FlashTM au fost obinute de la ATS Stiinific Inc (Burlington, Ontario, Canada), distribuitor canadian de produse ThermoOrion.

Metodele de cromatografie de gaz Flash pentru solvenii de testare reziduali A fost folosita o coloana EZ FlashTM ansamblata cu o coloan RTX-624 10m x 0.18mm i.d. (ATS Scientific, numrul de component C420011550). Metoda generala a cromatografiei de gaz Flash implic injecii cu lichid de 1 l n mprirea instrumental a portului. Temperatura injectrii a fost meninut la 250 oC, i divizarea injectiilor au fost efectuate cu un raport de 100:1 datorit capacitii limitate a eantionului a sondei (bore) coloanei nguste.

Transportatorul sub presiune de heliu a fost setat la 9,5 psi pentru un flux de 0,6 ml / min. Temperatura detectorului de ionizare cu flacr a fost setat la 280 oC. Gradientul termic EZ FlashTM a meninut temperatura iniiala la 38 oC timp de 30 s, apoi a crescut de la o rat de 48
o

C / min la 110 oC, apoi la 130 oC / min pentru a ajunge la o temperatur final de 240 oC, timp Pentru metoda Flash GC implic analiza punctului de fierbere ridicat al solvenilor,

de 1 min. Gradientul termic total a fost atins n 4 min. urmtoarele condiii experimentale au fost utilizate: 1 l de standard a fost injectat soluia de prob n portul de injectare a GC, care a fost meninut la 250 oC. Au fost efectuate injecii cu un raport de 100:1. Transportatorul sub presiune cu heliu a fost setat la 16 psi pentru un flux ateptat de 1,0 ml / min. Temperatura gradientului EZ FlashTM menine temperatura iniial la 100 oC timp de 45 s. Temperatura EZ FlashTM a fost apoi crescuta la 180 oC n 30 s, pentru a ajunge la o temperatura final de 230 oC n 90 s, care a mentinut timp de 15 s, pentru o functionare total de 3 min. 6

Capitolul III - Rezultate i discuii

Metoda rapid folosind cromatograme de gaz Flash a derivat dintr-o aplicaie a ThermoOrion, sugernd folosirea unei foraje (bore) a coloanei mai scurte i mai nguste, 10m x 0,1 mm i.d, cu un film de 0.4 m din 6% cianopropil/94% siloxan polidimetil. Cu toate acestea, datorit capacitii limitate a eantionului i a dificultii n obinerea cromatografiei fiabile i reproductibile, utilizarea unei foraje nguste cu un film de 0,4 m din 6% cianopropil i 94% siloxan polidimetil a fost abandonat.

Fig. 1. Cromatograma cu 20 de solveni de interes farmaceutice de ctre Flash GC. Concentraia probei strandard este de 0,01% (v / v). Dizolvarea solventului angajat, N, N-dimetilacetamid, se dizolv n mai puin de 3 min. Impuritile dizolvate cu solvent sunt indicate pe cromatograma printr-un "I".

Tabelul 1. Validarea rezultatelor pentru metoda Flash GC pentru solvenii reziduali de testare

Coloana de 10m x 0.18mm i.d., cu un film de 1 m din 6% cianopropil/94% siloxan polidimetil n faza staionar avut mai mult succes n produsele farmaceutice n realizarea analizei de solveni reziduali. Un exemplu de cromatografie de gaz, cromatograma de solveni volatili folosind tehnologia EZ FlashTM fiind prezentate n Fig. 1. Aceast metod are avantajul de a utiliza un foraj scurt i ngust a coloanei i o temperatura rapida a rampei pentru a realiza separarea celor 20 de solveni volatili n 4 min. Aceasta nsemnand o mbuntire semnificativ a productivitii n procesul de testare al solvenilor reziduali, deoarece fiecare analiz necesit mai puin de 7 min, inclusiv injecia de rutin, analiza, i timpul de rcire. Solveni testati prin metoda de cromatografie de gaz Flash sunt enumerati n Tabelul 1. n aceasta metod, toluenul i iso-butilacetatul nu sunt substantele de baza analizate. Se extrag acetonitril i diclormetan, ins, doar diclormetanului a fost inclus n lista de testare a solvenilor prin metoda de cromatografie de gaz Flash.

Dac ambii solveni sunt folositi ntr-un proces sintetic de o substan de medicamente sau intermediarii si, metoda convenionala GC, care poate realiza separarea de acetonitril i diclormetan, ar trebui mai degrab folosit dect metoda GC Flash. S-a folosit un gradient de la 35 oC, meninut timp de 30 s, consolidat la 85 oC, n 2 min, avnd loc n timp de 1,5 min. Acest gradient aproximeaz creterea temperaturii ca urmare a cldurii disipersate creat de temperatura gradientului EZ FlashTM n cuptorul GC.

Fig. 2. Cromatograma punctului de fierbere ridicat al solvenilor prin GC Flash. Concentraia probei standard este de 0,01% (v / v). Metanolul, solventul dizolvat, se extrage primul n primele 60 de secunde. Extragerea metanolului este urmat de DMF, DMSO i NMP. Cu coloana de asamblare EZ FlashTM, o combinaie cu garnituri drepte, cu vat de sticl i split mai mare, rezervele par a fi ideale pentru a evita suprancrcarea coloanei i pentru a optimiza cromatografia. Utilizarea preparatelor injectabile split la raii mai mici dect 50:1 cauzeaz decantarea i pierderi ale rezoluiei. Mai mult dect att, injeciile splitless par foarte dificile cu tehnologie de EZ FlashTM din aceleai motive. Dimetilacetamida (DMA), un solvent cu punctul de fierbere ridicat, care se extrage la sfritul cromatografiei, a fost selectat ca solvent ideal pentru probele farmaceutice de analizat. Un avantaj suplimentar, multe substane medicamentoase sunt solubile n DMA. Dimetilsulfoxid i dimetilformamida au mai multe impuriti care interfereaz cu analiza unor solventi organici frecvent utilizati in proces. 9

Liniaritatea, precizia i sensibilitatea metodei GC Flash au fost evaluate. Liniaritate pentru fiecare solvent testat a fost stabilit la concentraii cuprinse ntre 0.001 la 0,1% (v / v). Analiza regresiei liniare a fost aplicat i a fost obinut un coeficient de corelatie 0.999 pentru fiecare solvent. Deviaia relativ standard obinut din rezultatele a ase injecii consecutive a soluiilor standard la 0,005% (v / v) i 0,01% (v / v) au fost <10%. Limita minim de cuantificare a fost stabilit la 350 ppm sau mai bine, pe baza unui eantion de concentrare int de 0,1 g / ml. Rezultatele sunt prezentate n tabelul 1.

Tabelul 2 Validarea rezultatelor pentru metoda GC Flash pentru punctele de fierbere a solventilor

Solveni non-volatili sunt utilizai ocazional ca solveni de proces. Folosind coloana EZ Flash
TM

RTX-624 de 10m i o ramp rapid, N, N-dimetilformamida (DMF), sulfoxid de metil

(DMSO) i 1-metil-2-pirolidinone (NMP) pot fi analizate n mai puin de 3 min. Un exemplu de astfel de cromatogram este ilustrat n Fig. 2. GC Flash, ca i n alte metode pentru a monitoriza solveni volatili reziduali, liniaritatea, precizia, i limitele de sensibilitate au fost stabilite cu succes prin aceast metod. Sunt prezentate rezultatele de validare n tabelul 2. Bazat pe concentraia unui eantion de prob de 0,1 g / ml, limitele de cuantificare stabilite au fost 146, 227, i 234 ppm pentru DMF, DMSO, i respectiv NMP.

10

Concluzii
Acum este posibil s profitm de tehnologia mbuntit a cromatografiei de gaz pentru a realiza separri rapide i analize ale solventilor reziduali solveni din probele farmaceutice. Utilizarea tehnicilor rapide de GC, cum ar fi tehnologia rezistent la nclzire EZ FlashTM, poate accelera n continuare analiza solveniilor reziduali. Procesul de separe a 20 de solventi a fost realizat n mai puin de 4 minute folosind tehnologia EZ FlashTM. Tehnologia GC Flash ofera avantajul suplimentar de un timp de rcire mai scurt. Dei mai puin sensibil, metoda GC Flash poate fi aplicat nc avantajos la monitorizarea solventului n proces atunci cnd rspunsul unei probe este necesar ntr-un timp mai rapid. O analiz complet inclusiv o injecie martor, urmat de teste de calibrare cu un standard i testarea n timpul procesului a unei soluii de prob farmaceutic, pot fi atinse n aproximativ 20 min. De asemenea, tehnologia GC Flash poate transforma din punct de vedere economic o cromatograma de gaz nvechit ntr-un instrument care poate realiza separri cromatografice de gaz foarte rapide.

11

Bibliografie
[1] U.S. Pharmacopeia, _4 6 7_ Organic Volatile Impurities, USP25-NF20, 2002. [2] ICH Harmonized Tripartite Guideline for Residual Solvents, Step 4, 17 July 1997. [3] A.M. Dwivedi, Pharma. Technol. 26 (11) (2002) 42. [4] European-Pharmacopoeia Commission, Pharmeuropa 5 (1993) 145. [5] M.V. Russo, Chromatographia 39 (1112) (1994) 645. [6] R.B. George, P.D. Wright, Anal. Chem. 69 (1997) 2221. [7] Q.C. Li, K.A. Cohen, G. Zhuang, J. Chromatogr. Sci. 36 (3) (1998) 119. [8] T.K. Chen, J.G. Phillips, W. Durr, J. Chromatogr. A 811 (1998) 145. [9] Z. Li, Y.H. Han, G.P. Martin, J. Pharm. Biomed. Anal. 28 (2002) 673. [10] C.C. Camarasu, Chromatographia 56 (2002) S137. [11] C.A. Cramers, J.G.M. Janssen, M.M. van Deursen, J. Beens, in: A.J. Handley, E.R. Adlard (Eds.), Gas Chromatographic Techniques and Applications, CRC Press, Boca Raton, FL, 2001, p. 207. [12] W. Jennings, Analytical Gas Chromatography, Academic Press, San Diego, CA, 1987, p. 80. [13] D. Rounbehler, S. MacDonald, D. Lieb, D. Fine, in: Proceedings of the First International Symposium on Explosive Detection Techniques, vol. 1, 1991, p. 703. [14] S.J. MacDonald, D. Wheeler, Int. Lab. 28 (6) (1998) 20. [15] S.J. MacDonald, D. Wheeler, Int. Lab. News 28 (5A) (1998) 13. [16] J. Dalluge, R. Ou-Aissa, J.J. Vreuls, U.A.Th. Brinkman, J.R. Veraart, J. High Resolut. Chromatogr. 22 (1999) 459. [17] ThermoOrion Application Note, CHEM-017.

12