STRUCTUR ACIZI NUCLEICI Curs general

Moleculele vie ii
Viata depinde de stocarea stabila i compacta a informa iei genetice ; Activitatile moleculelor celulare sunt guvernate de principiile de baza ale chimiei; Apa celular , ionii anorganici, i mici molecule organice reprezint aproximativ 75-80% din greutatea celulei vii; Macromoleculele (proteine, polizaharide, ADN) reprezinta restul.

Celule Procariote
Organisme unicelulare Dou tipuri pricipale: bacterii i archaea Rela ii structurale simple

Celule eucariote
Organisme unicelulare i multicelulare Plante i animale Structural mult mai complexe: organite, citoschelet...

Structura celulei animale

Structura celulei vegetale

Complexitatea structural a organismului uman

Nucleul
Separ : ADN de citosol; transcriptia de transla ie Caracteristici: - membrana extern ; membrana intern ; porii nucleari; nucleoli

La Eucariote ADN este mpachetat n cromozomi

Fiecare cromozom con ine o singur molecul linear de ADN asociat cu proteinele. Intregul ADN compactat n cromozomii unui organism este localizat n genom. Secven ierea i alte tehnici au eviden iat c peste 90% din genomul vertebratelor nu codific pentru ARNm sau alte tipuri de ARN. La organismele multicelulare acest ADN con ine multe regiuni care sunt similare dar nu identice. Imagine de cromozomi n metafaz eviden ia i prin tehnica fluorescent de hibridizare in situ (FISH)

Acizii nucleici
Acizii nucleici sunt substan e care au fost pentru prima dat izolate din nucleii celulelor. Exist acizi nucleici i n citoplasma celulelor. Dou tipuri de acizi nucleici: ADN (acid dezoxiribonucleic) localizat n principal n nucleul celulelor (cnd acesta este individualizat) ca n cazul eucariotelor); ARN (acizi ribonucleici), prezen i n principal n citoplasma celulelor dar i n nucleu. Acizii nucleici ADN i ARN au rol esen ial n sinteza proteinelor, compu i fundamentali ai celulei, suportul marii majorit i a activit ilor biologice. ADN este suportul eredit ii; ARN reprezint acidul nucleic care permite sinteza proteic

Structuri generale macromolecule

To i acizii nucleici au o structur general comun

Principalele cinci baze din structura acizilor nucleici

A, G, T, C sunt prezente n ADN A, G, U, C sunt prezente n ARN

Structurile ceto-enol ale bazelor azotate

For ele de stivuire

Stivuirea inelelor de adenin din cristalul 9-metiladenin . Suprapunerea par ial a inelelor reprezint o asociere tipic a bazelor n structuri cristaline i n dubla elice a acizilor nucleici

Terminologie nucleozide

Baze azotate
Nume Baze Pirimidinice Citozin Uracil Timin Baze Purinice Adenina Guanina Xantina Hipoxantina S/3L Pyr Cyt Ura Thy Pur Ade Gua Xan Hyp

Ribonucleozide
Nume nuclozide Pirimidinice Citidin Uridin Ribozil-timin nucleozide Purinice Adenozina Guanozina Xantozina Inozina S/3L Pyd Cyd Urd Thd Puo Ado Guo Xao Ino Y C U T R A G X I

Dezoxiribonucleozide
S/1L Nume 2dezoxiribonucleozide pirimidinice 2.dezoxicitidina 2-dezoxiuridina (2-dezoxi)timina 2dezoxiribonucleozide purinice 2-dezoxiadenozina 2-dezoxiguanozina 2-dezoxixantozina S/3L dPyd dCyd dUrd dThd dPuo dAdo dGuo dXao S/1L dY/Yd dC/Cd dU/Ud dT/Td dR/Rd dA/Ad dG/Gd dX/Xd

Conforma ia nucleozidelor
conforma ie envelope Conforma ie C3-endo

conforma ie twist

Conforma ie C2-endo

Izomeri de rota ie n jurul leg turii glicozidice

Orient rile sterice permise bazelor purinice i pirimidinice n raport cu ata area lor la unitatea ribozic

Terminologie general nucleotide

Nume Nucleozid x- fosfat x- difosfat x- trifosfat Citidin 5- fosfat 5- difosfat 5- trifosfat Uridin 5- fosfat 5- difosfat 5- trifosfat dtimin 5- fosfat 5- difosfat 5- trifosfat Adenozin 5- fosfat 5- difosfat 5- trifosfat Guanozin 5- fosfat 5- difosfat 5- trifosfat Simboluri Nuc-5P Nuc-5PP Nuc-5PPP Cyd 5.P Cyd - 5PP Cyd - 5PPP Urd - 5P Urd - 5PP Urd - 5PPP dThd - 5P dThd - 5PP dThd - 5PPP Ado 5 P Ado - 5PP Ado - 5PPP Guo - 5P Guo - 5PP Guo - 5PPP NMP NDP NTP CMP CDP CTP UMP UDP UTP dTMP dTDP dTTP AMP ADP ATP GMP GDP GTP

Structura general nucleotide

Conforma ia unei unit i nucleotidice este determinat de apte unghiuri de torsiune

Structura ATP

Complexul ATP-magneziu

Complexul ATP-magneziu

cAMP

UDP-glucoza

S-adenozilmetionina (SAM)

Reactii de transfer de grupari metil

Acetil-CoA

Acetil CoA

+ NAD(P)

NAD+ NADP+

FAD

Constituen ii ADN i ARN

Acid nucleic

NMP majore Pentoza Pyr D-riboza U C Pur A G dA dG NMP minore Foarte diverse ARNt Deriva i metila i ai A iC

ARN

ADN

2-deoxi D-riboza

dT dC

Structura general a acizilor nucleici

Formarea leg turilor fosfodiester

ADN-dublu helix format din catene complementare

Informa ia purtat

genetic

este

de molecule de ADN foarte

lungi, i codificat n secven a linear de nucleotide A, T, C i G ; Molecula de ADN, n form de dubl elice, compus dintr-o pereche de catene complementare formate din nucleotide care sunt men inute mpreun prin leg turi de ntre hidrogen care se realizeaz perechile de baze G-C i A-T ;

Tipuri de leg turi de hidrogen (I)

mprechere de adenine n structura cristalului de 9metil-adenin

mperecheri Hoogsteen ntre A i T

mperechere ipotetic ntre C i T

mperecheri tip Watson-Crick

Alte tipuri de mperecheri

Tipuri de leg turi de hidrogen (II)

Tipuri de leg turi de hidrogen (III)

Tipuri de leg turi de hidrogen (IV)

ADN - dublu helix format din catene antiparalele

Fiecare caten de ADN posed o polaritate chimic datorat leg turii dintre glucide i grup rile fosfat, care alterneaz la nivelul scheletului. Cele dou catene ale unei molecule de ADN sunt antiparalele, adic orientare invers ; Fiecare din cele dou servi ca matri catene. Astfel, aceea i informa ie genetic este purtata de cele dou formeaz dubla elice. catene care catene pot pentru sinteza celeilalte posed

Dublul Helix caracteistici structurale

Structura ADN B
Imaginea se bazeaz pe studiile cu raze X realizate pe dodecamerul d(CGCGAATTCGCG)

Structura ADN B

Vedere pertenticular pe axa helixului. n schem leg turile fosforice sunt marcate n albastru iar bazele n ro u. Sint marcate n alb bazele, leg turile fosfodiester i leg turile de hidrogen dintre dou baze. Vedere de-a lungul axei helixului

Caracteristicile conforma iilor elicei ADN

Caracteristici
Sens de r sucire Num r pb/tur Pasul (n l inea pe ax)/pe plan de baze nclinare baze fa de ax/rota ia planului bazelor Diametru dPyd:pentoz leg tura glicozidic dPuo: pentoz leg tura glicozidic Fosa: mare mic

Conforma ie B Conforma ie A
drept 10,4 (10,0-10,7) 3,4nm 0,34 nm 10 360 2 nm conforma ii
2E 3E

Conforma ie Z
stng 12 (6 dinucleotide) 4,5 nm 0,37 nm 90 -600/dinucleotid 1,8 nm
2E

drept 11 2,8 nm 0,26 nm 200 330 2,3 nm

anti 2E anti Mare i profund ngust i profund

anti 3E anti ngust i profund Mare i profund

anti 2E syn ngust i profund

Structura ADN A

Vedere de-a lungul axei helixului

Structura ADN A

Vedere perpenticular pe axa helixului

Structura ADN Z

Vedere de-a lungul axei helixului

Structura ADN Z

Vedere perpenticular pe axa helixului

Trecerea ADN B n ADN Z

Trecerea ADN-B n ADN Z, reprezentat la nivelul unui fragment de 4 pb, implic r sucirea cu 1800 a fiec rei perechi de baze n raport cu lan ul oz -fosfat

ADN sufer separ ri reversibile ale catenelor

Metode de determinare a m rimii acizilor nucleici

Metodele de determinare a dimensiunilor acestor macromolecule se bazeaz pe diferite caracteristici. M rimea poate fi determinat prin mai multe metode: Microscopie electronic : datorit dimensiunilor lor acizii nucleici pot vizualiza i prin aceast tehnic . Metoda se potrive te foarte bine moleculelor de ADN de m rime medie (cteva mii la 200 000 pb)

Electroforeza n gel:
Este o tehnic de separare a moleculelor n func ie de masa lor molecular . Condi iile de densitate de sarcin asem n toare sunt realizate n mod natural, de c tre scheletul oz -fosfat. De asemenea, dependen a logaritmic , distan de migrare n func ie de m rime, este bine respectat . Pentru separarea moleculelor de acizi nucleici de diferite dimensiuni sunt folosite geluri de agaroz cu porozit i variate (Figura 2.2). Pentru facilitarea estim rilor cantitative exist colec ii de polimeri marcheri de mas molecular utiliza i pentru etalonarea separ rilor. De altfel, aceast metod de separare este omniprezent n manipul rile de biologie molecular . Electroforeza se poate realiza i n geluri de poliacrilamid pentru situa iile n care este necesar separarea moleculelor polinucleotidice mici sau oligonucleotidelor. Prin electroforeza n gel de poliacrilamid este posibil identificarea unor fragmente care difer numai printr-un singur nucleotid. Din acest motiv tehnica este foarte util n secven ializarea acizilor nucleici i n determinarea regiunilor de polimorfism normal sau patologic determinat de existen a unor muta ii.

M rimea unor molecule de ADN din diferite surse, comparat cu cea a unei proteine fibroase, colagenul, i celulele procariote i eucariote.
ADN/particule/ organisme Virusuri ADN SV40 fag *X174 fag P Procariote E. coli Eucariote Drosofila Om Colagen n de baze (kb) 5,2 5,4 48 4000 62 000 125 000 3x1000 amino acizi Mas (MDa) 3,2 3,6 32 2600 41000 80 000 0,33 Lungime (nm) 1,7x10-3 (1,7Qm) 1,8x10-3 (1,8 Qm) 17x10-3 (17 Qm) 1,36 21 41 0,3x10-3 (0,3 Qm)
J (nm)

num r de cromoz omi

2 2 2 2 2 2 1,5 1 2x4 2x23

Celule Bacteria E. coli Mamifere

2x10-3 (0,5x2 Qm) aprox 10x10-3 (10 Qm)

Moleculele ADN de m rime mare sunt analizate i prin:

a) metoda clasic de ultracentrifugare cu toate c for ele de frecare existente ntre aceste molecule limiteaz cmpul aplica iilor (molecule de pn la 1,5 x 106 pb); Prin aceast tehnic pot fi separate, n gradient de densitate de clorur de cesiu, urm toarele: i) fragmente de ADN care au un con inut diferit n guanin i citozin ; ii) ADN genomic bacterian; iii) ADN plasmidial; iv) ARN total, etc. Diferitele tipuri de ARN ribozomal de la eucariote i procariote poate fi separat foarte simplu prin ultracentrifugare n gradient de zaharoz

Separarea acizilor nucleici prin ultracentrifugare: a) Separare ADN prin ultracentrifugare n gradient de CsCl; b) separare ARN prin ultracentrifugare n gradient de zaharoz

Electroforez n cmp pulsatoriu. a) principiu de separare; b) electroforegram ob inut n urma separ rii unor fragmente mari de ADN. Vizualizarea a fost realizat n urma color rii cu bromur de etidium.

Polimerizarea nucleotidic

Structura unei molecule ARN: a) eviden ierea nl n uirii nucleotidelor i vectorizarea catenei; b) reprezent rile prescurtat i simbolic .

Hidroliza acizilor nucleici

Degradarea unui polinucleotid poate s se refere la: i) leg tura fosfodiester atunci cnd se produce o depolimerizare; ii) unit ile nucleotidice dac se rupe leg tura glicozidic i se degradeaz componentele. n ambele cazuri hidroliza poate fi de natur chimic sau enzimatic .

Hidroliza chimic a acizilor nucleici

Tratamentul acid afecteaz la fel ARN i ADN: Comportamentul ARN i ADN la hidroliz bazic este foarte diferit: Condi ii ARN Acide pH 1,0 + nc lzire pH 4,0 Alcaline Produ i de hidroliz ADN pentoze + fosfa i + baze baze purinice + AN apurinici NMP (2 sau 3) -

Produ ii de degradare chimic a acizilor nucleici

Schema mecanismului de hidroliza ARN prin cataliza bazic : 1. Hidroxilul din 2 este deprotonat de c tre ionul hidroxid; 2. Alcoxidul, nucleofil, atac gruparea fosfodiester cu formarea unui diester ciclic 2: 3; 3. Un al doilea hidroxid provoac hidroliza uneia sau alteia dintre leg turile ester: se ob in izomeri 2 i 3 fosfat.

Scindarea enzimatic
Enzimele care catalizeaz hidroliza leg turii fosfodiester din structura acizilor nucleici, fosfodiesterazele, sunt numite i nucleaze. Acestea sunt prezente n toate celulele i sunt foarte utile n metabolismul acizilor nucleici i proteinelor. O parte dintre a ceste nucleaze sunt secretate de c tre pancreasul exocrin, n intestin, i particip direct la digestie hranei. Aceste enzime prezint niveluri de specificitate comparabile cu cele ale peptidazelor i proteazelor. Ele se pot clasifica n func ie de: a) modul lor de atac al catenei: i) exonucleaze, enzimele care ac ioneaz la nivelul extremit ii catenelor; ii) endonucleaze, enzimele care atac n interiorul catenelor; b) specificitatea lor fa de substrat: i) pentru tipul de acid nucleic: ribonucleaze pentru ARN, deoxiribonucleaze pentru ADN i nucleaze pentru ambele; ii) pentru tipul de structur : mono- sau dublu catenar ; c) specificitatea lor de recunoa tere a situsurilor: i) specificitate pentru baze; ii) specificitate pentru secven e; d) tipul de rupere a leg turii fosfodiester: i) exonucleazele i endonucleazele de tip d scindeaz extremitatea 5 i duc la formarea de 3NMP; ii) exonucleazele i endonucleazele de tip p scindeaz extremitatea 3 i determin formarea 5NMP (Figura 2.8);

Scindarea enzimatic

Nucleaze Exonucleaze fosfodiesteraza (venin de arpe) fosfodiesteraza (splin ) exonucleaza I (E. coli) exonucleaza III (E. coli) Endonucleaze endonucleaza S1 (Aspergillus oryzae) ribonucleaz T1 (Aspergillus oryzae) ribonucleaza A (pancreas) Deoxiribonucleaza II (timus)

Substrate1

T ietur tip2; specificitate p extremitatea 3 d extremitatea 5 p extremitatea 3 p extremitatea 3 p aleatoare p G/N d-Pyr/N d sPyr/dPur

Produ i

ARN, ADN s ARN, ADN s AND AND

5-NMP 3-NMP 5-NMP 5NMP+ADNs

ARN,ADN s,d ARN s ARN s ADN s

5-NMP +ON n 5 P 5-NMP +ON n 3 P 3-NMP +ON n 3 P ON n 3 P

Exemple de enzime de restric ie i situsurile recunoscute de acestea

Exemple de enzime de restric ie i palindroamele recunoscute de acestea cu marcarea situsurilor de clivare i a axei de simetrie: a) ob inerea de capete coezive; b) ob inerea de capete drepte

Endonucleaza (sursa) EcoRI (E. coli RY13) BamHI (Bacillus amyloliquefaciens H) HaeIII (Haemophilus aegypticus)

Num r de situsuri de t iere Virus SV40 fag *X174 1 0 1 0 19 11

fag P 5 5 >50

Metode spectrofotometrice
Determinarea absorb iei n ultraviolet cu ajutorul unui spectrofotometru permite verificarea purit ii unei solu ii de ADN sau ARN. n urma determin rii densit ii optice se va ob ine un pic la 260 nm. Pentru estimarea purit ii este necesar calcularea raportului densit ilor optice la 260 nm/280 nm care, n mod normal, trebuie s fie apropiat de valoarea 1,8-2,0. n cazul ADN, un raport mai ridicat indic o contaminare cu ARN. Dac exist o contaminare cu proteine (280 nm) sau fenol (270 nm), raportul va fi net inferior valorii de 1,8. Dac ADN i ARN sunt puri, cantitatea poate fi apreciat astfel:

unitatea DO (260 nm) = 50 ng/Ql pentru ADN dublu-catenar unitatea DO (260 nm) = 33 ng/Ql pentru ADN monocatenar unitatea DO (260 nm) = 40 ng/Ql pentru ARN

Utilizarea de mini-gelulri

Determinarea secven ei primare a acizilor nucleici Metoda chimic Maxam W. Gilbert

Metoda dideoxi a lui F. Sanger

Sinteza n faz solid a catenelor unui polinucleotid prin metoda fosforamidi ilor

Denaturarea ADN

M surarea absorb iei moleculelor denaturate

Determinarea Tm

Analiza denatur rii ADN

Renaturarea ADN

Estimarea absorban ei n func ie de structur temperatur

Absorban a relativ a ADN monocatenar i bicatenar

Estimarea denaturarii termice

Electroforeza i autoradiografia ADN

Ultracentrifugarea

Ecua iile Svedberg

Ultracentrifugarea ADN n gradient de CsCl

Ultracentrifugarea ARN n gradient de sucroz

Enzime de restric ie

Super-helixurile ADN

Linking number

Writhing number

Forme suprar sucite

Structuri topoizomere

Topoizomeri i topoizomeraze

Separarea topoizomerilor ADN SV40 DNA eviden iaz existen a mai multor topoizomeri cu un num r diferit de suprar suciri

Rolul topoizomerazelor n replicarea ADN Moleculele de ADN se pot ndoi i ncol ci n spa iu conducnd la modific ri de topologie cum ar fi formarea supra-r sucirilor Topoizomerazele sunt enzime care controleaz topologia ADN i realizeaz etape esen iale n diferite etape ale replic rii avnd drept rezultat nl turarea constrngerilor.

Topoizomeraze

Topoizomeraza de tip I relaxeaz ADN prin inducerea de t ieturi la nivelul unei singure catene a duplexului ADN

Topoizomeraza de tip II modific topologia ADN prin scindarea si resudarea ambelor catene

Mecanism topoizomeraze

Modelul activit ii catalitice a topoizomerazei II (ADN giraza) din E. coli

ADN giraza nl tur super-r suricirile pozitive care apar n mod normal la nivelul furcii de replicare

Separarea moleculelor de de ADN circular replicate este realizat de topoizomeraza de tip II

Topoizomeraza de tip II separ cromatidele lineare surori

Discu ii
De ce T n ADN i U n ARN De ce deoxiriboz n ADN i riboz n ARN De ce 2 helixuri (catene ) n ADN i una n ARN

ADN de la diferite organisme: Virusurile Procariotele Eucariotele ADN din mitocondrii (ADNmt)

Tipuri de leg turi de hidrogen care sunt specifice structurii secundare a ARN

Tipuri de baze modificate prezente n structura acizilor nucleici

Structura ARN de transport: a) Motivele elementare de structur 2-D; b) Structura ter iar n form de L.

Tipuri de structuri secundare posibile ale ARNr de tip 16S: a) la archebacterii; b) eucariote, drojdii; c) mitocondrie de mamifer (bovine)

Structura ARNr de 16 S de la E. Coli de 1542 nucleotide bazat pe compararea secven elor de la diferite tulpini (se presupune ca aceasta structura este conservata evolutiv)

Sinteza moleculelor de ARNm: a) transcrip ia ARNm policistronic la procariote; b) transcrip ia i maturarea ARNm la eucariote; ARN transcris de la nivelul unei unit i complexe (albastru) poate fi procesat pe mai multe c i pentru a conduce la unul sau la mai multe unit i ARNm monocistronice func ionale. Liniile punctate marchez nl turarea intronilor.

Moleculele de ADN ARN posed conforma ii diferite

Inversiunile repetitive formeaz structuri foldback

Schema unei molecule de ARNt nc rcat : a) schema general a structurii secundare a moleculei; b) modul de formare a leg turii ntre ARNt i aminoacil

Recunoasterea codon anticodon

Tipuri de molecule de ARNt. Sunt marcate elementele de identitate majore n cele patru tipuri. Fiecare baz din structura ARNt este reprezentat de cercuri pline. Cercurile ro ii indic pozi iile identice pentru recunoa terea ARNt de c tre aminoacil-ARNt sintetaz . Bazele din structura anticodonului care reprezint elemente de identificare sunt subliniate.

Diferitele tipuri de ARN

Moleculele de ARN mesager Moleculele de ARN de transfer: structura secundar sub form de frunz de trefl ; structura ter iar 3-D n L a moleculelor ARNt Moleculele de ARN ribozomal; particulele ribozomale Ribozimele Moleculele snARN

Compara ie ARNm la procariote i eucariote

Procariote: operonii bacterieni ARNm este policistronic; Eucariote: ARNm este monocistronic i con ine exoni i introni.

Exemple de structuri adoptate de ARNr

Structura ribozomilor la procariote & eucariote

Structura general a ARNt

Exemple de molecule ARNsn

Structura cap de ciocan a unei ribozime

ADN mitocondrial i din cloroplaste

Se consider c mitocondriile au evoluat din bacterii care prezint o rela ie simbiotic cu celulele ancestrale care con in un nucleu eucariot. Majoritatea genelor originale din aceste organite au fost transferate genomului nuclear n timpul evolu iei, p strnd diferite gene n organitele diferitelor organisme; ADNmt de la mamifere con ine numai aprox 16 kb; acesta nu con ine introni i prezint numai o mic regiune necodant . ADNmt de la plante i drojdii este mult mai mare. Toate tipurile de ADNmt codific pentru ARNr, ARNt i pentru cteva proteine implicate n transportul mitocondrial al electronilor i n sinteza ATP; Majoritatea ADNmt este mo tenit mai degrab din ou (ovul) dect din sperm , muta iile n ADNmt fiind mo tenite pe linie matern ; Ribozomii mitocondriali se aseam n cu ribozomii bacterieni ca structur , sensibilitate la cloramfenicol i rezisten la cicloheximid ; Codul genetic pentru ADNmt de la animale i fungi difer de cel bacterian i de cel al genomului nuclear prin aceea c numero i codoni codific pentru aminoacizi sau semnale STOP alternative; Mitocondriile plantelor par s foloseasc codul standard nuclear i bacterian; Muta iile ADNmt pot determina maladii neuromusculare umane, probabil datorit necesit ii crescute de ATP a acestor esuturi. n general pacien ii prezint un amestec de mitocondrii care con in ADNmt normal i mutant n celule (heteroplasmie). Severitatea fenotipic este mai mare cu ct propor ia de ADNmt este mai mare; ADN din cloroplaste este circular i con ine aproximativ 120-160 kb, n func ie de speciile de plante. Acestea codific pentru aproximativ 120 de proteine i folosesc codul genetic standard.

ADN mitocondrial uman