El 1,3 Propanodiol (C3H8O2) tambin conocido como trimetil glicol propilen glicol es un compuesto orgnico lineal, con dos

s grupos hidroxilo. Se trata de un lquido viscoso e incoloro miscible con el agua.

Fig. 1.3.15 1,3 Propanodiol (PDO)

Se observ por primera vez en 1881 y a pesar de ser uno de los productos de fermentacin ms antiguos conocidos, no se prest atencin a su ruta microbiana de transformacin durante ms de un siglo. Presenta interesantes aplicaciones: puede utilizarse como monmero en

policondensaciones, para producir plsticos con propiedades especiales mejorando su estabilidad trmica e hidroltica, como polisteres, politeres y poliuretanos y tambin como disolvente. Otras de sus aplicaciones frecuentes es el diseo de refrigerantes y tintas acuosas. La amplia variedad de aplicaciones ha permitido estimar que para el ao 2020 el PDO tendr un mercado potencial de 230.000 toneladas mtricas por ao. Actualmente se producen ms de 120.0000 toneladas de PDO al ao, la mayora a travs de sntesis qumica. Existe dos procesos de produccin va qumica del PDO: hidratacin de acrolena y hidroformilacin de xido de etileno. La sntesis qumica requiere altas temperaturas y presiones y catalizadores caros, adems de generar subproductos txicos, por lo que es costosa. En ambos casos generan rendimientos inferiores al 43%. Esa es la razn por la que el PDO an tiene un bajo volumen de produccin en el mercado. Gracias a los beneficios medioambientales, y el uso de un subproducto proveniente de una energa renovable, la biosntesis se convierte en una gran alternativa a la sntesis qumica.

Para el desarrollo sostenible es importante la produccin verde de polister plstico. Se ha trabajado en el campo de los polisteres a partir del 1,4 butanodiol ms que en los formados a partir del 1,3 propanodiol, a pesar que estos son ms biodegradables debido a la escasez de PDO de calidad. El polister formado a partir de PDO microbiolgico puede conseguirse con un proceso benigno para el medio ambiente. La produccin del PDO es ms eficiente cuando se utiliza glicerina como base de la fermentacin en lugar de glucosa, logrndose conversiones mucho mayores, dado el estado altamente reducido que presenta el carbono. Teniendo en cuenta este potencial, sin embargo, hay que asegurar la fermentacin anaerbica de la glicerina en ausencia de captadores externos de electrones. El PDO es un qumico emergente y se ha renovado el inters en su produccin biotecnolgica. El descubrimiento de un nuevo polister, el polipropilen tereftalato (PPT) a partir del PDO, requiere un incremento drstico en su produccin. El PPT es un polister biodegradable, fue descubierto y patentado en 1941 pero su aplicacin era muy limitada debido a que el PDO era demasiado caro. Presenta un gran potencial en la industria textil dada su alta elasticidad, que lo hace idneo para desarrollar fibras con propiedades como la suavidad, adaptacin, facilidad de tincin y resistencia, que han superado fcilmente al nylon en el desarrollo de cierres, sellos, conectores, cubiertas de extrusin y empaques tipo blister. El impacto del desarrollo de aplicaciones y procesos relacionados con el PDO se refleja en las ms de 500 patentes generadas entre 1970 y el 2006, estando ms de 50 relacionadas con su produccin por vas biotecnolgicas. Las grandes compaas qumicas, tienen varias patentes relacionadas, como Corterra de Shell y Sorona y Hytrel de DuPont. Se genera un gran volumen de glicerina como subproducto en la produccin de biodisel por transesterificacin. Existen varias opciones para transformar ese residuo en producto y una de ellas es la transformacin microbiana en PDO. Al aprovechar un subproducto, la produccin de PDO se vuelve atractiva no solo medioambientalmente sino tambin econmicamente.

La comparacin entre la glucosa la glicerina como sustratos, favoreca a la glucosa por su bajo precio. Sin embargo dada la abundancia actual de glicerina, la produccin con glucosa es ms costosa, y es preferible reservarla para otras aplicaciones como la fermentacin alcohlica. Varias compaas han intentado desarrollar tecnologas nuevas y ms eficientes para la produccin de PDO. En el nuevo proceso de Shell, el PDO se obtiene haciendo reaccionar xido de etileno con monxido de carbono e hidrgeno. En el de DuPont se produce por fermentacin con microorganismos recombinados. Este nuevo proceso implica un ahorro energtico del 40% frente al proceso convencional, disminuyendo adems en un 20% las emisiones de gases que afectan al efecto invernadero. Por su desarrollo, el equipo de DuPont y Tate & Lyle fueron merecedores en 2007 del premio Heroes of Chemistry concedido por la American Chemical Society. Para conseguir que la va microbiolgica sea econmicamente competitiva se requiere tanto de cepas de alto rendimiento como de sustratos econmicos, lo cual ha motivado la bsqueda de nuevas cepas capaces de emplear subproductos con alto contenido de glicerina como fuentes de carbono para la fermentacin. La conversin biotecnolgica de glicerina en PDO se consigue con microorganismos en condiciones anaerobias o microanaerobias. Las bacterias productoras ms estudiadas pertenecen a los grupos Clostridia y Enterobacteria. Ambas familias siguen la ruta de regeneracin del NADH pero presentan diferencias en algunos metabolismos que son esenciales econmicamente a la hora de una produccin a escala industrial. La conversin completa no es posible dado al requerimiento de un equivalente adicional reducido
Clostridia
Riesgo biolgico Clase 1 (Reconocido generalmente como seguro) Estrictamente anaerobio. Dificultades en el manejo S cido actico y cido butrico 0,5 0,72

Enterobacteria
Clase 2 (Potencialmente patgeno) Potencialmente aerobio. Organismos robustos de fcil manejo No cido actico y etanol 0,4 0,72

Aerobio/Anaerobio Produccin de esporas Subproductos principales Rendimiento (Kg PDO/Kg glicerina) Mximo rendimiento terico (mol/mol)

Fig. 1.3.16 Principales diferencias entre los grupos Clostridia y Enterobacteria.

Los estudios de produccin de PDO a partir de glicerina con cepas de Clostridia son numerosos. La variedad ms estudiada es el Clostridium butyricum, seguida del C. acetobutylicum y C. pasteurianum. Actualmente se trabaja en el campo de la ingeniera gentica para modificar el C. butyricum combinando las propiedades con otras especias con el objetivo de desarrollar un microorganismo ms eficiente. La fermentacin con enterobacteria lleva a la acumulacin de dos productos principales, PDO y cido actico, mientras que los productos secundarios como cido butrico, lactato, formato, succinato y etanol se producen en cantidades variables dependiendo de las condiciones del cultivo. Con C. butyricum, PDO es el producto principal, con cido butrico y actico como subproductos, adems de CO2 y H2. La bacteria C. pasteurianum produce gran variedad de productos en la metabolizacin adems del PDO, como n-butanol, etanol, cidos actico, butrico y lctico. De acuerdo con Bibl (1991) las concentraciones que inhiben la fermentacin de la glicerina con C. butyricum son de 60 g/L para el PDO, 27 g/L para el acetato y 19 g/L para el butirato, y se aceptan concentraciones de glicerina de hasta 80 g/L. Barbirato (1998) demostr que en fermentaciones por cargas, usando C. butyricum, con 112 g/L de glicerina se obtienen concentraciones finales de PDO de 63,4 g/L que es cercano a la mxima concentracin tolerada para ese microorganismo. El rendimiento fue de 0,69 mol/mol y la mxima produccin de 1,85 g/Lh obteniendo como subproductos 8,1 g/L de cido actico y 7,5 g/L de cido butrico. Papanicolau (2000) investig la produccin la produccin de PDO con una cepa aislada de C. butyricum. La mxima concentracin obtenida en continuo fue de 31-38 g/L con un rendimiento de 0,55 mol/mol. Utilizando dos etapas, se llegaba a 41-46 g/L con una produccin mxima de 3,4 g/Lh. Dentro del grupo de las Enterobacterias, existen numerosas especies capaces de convertir la glicerina en PDO, siendo las ms prometedoras Klebsiella pneumoniae, Citrobacter freundii y Escherichia coli Otras especies como K. oxytoca y K. planticola tambin son vlidas, pero presentan conversiones y productividades bastante menores.

Las conversiones alcanzadas, dependern en gran medida del tipo y cantidad de subproductos generados. Mu (2006) utiliz K. pneumoniae para fermentar glicerina cruda, obteniendo concentraciones de 61,9 g/L y una produccin de 2 g/Lh. El uso de glicerina cruda, simplifica el proceso y reduce los costes de operacin. A parte de los grupos mencionados, las cepas de la familia Lactobacillus: Lactobacillus brevis y Lactobacillus buchneri son capaces de producir PDO a partir de glicerina en presencia de glucosa, que es fermentada convirtindose en cido actico, etanol y cido lctico. Otras variedades como Lactobacillus collinoides, aislada a partir de sidra, o Pediococcus pentosaceus, procedente de cerveza, pueden degradar la glicerina a PDO en presencia de azcares. El Lactobacillus reuteri, ha llamado la atencin dentro de este grupo ya que produce un agente antimicrobiano denominado reuterin que contiene 3HPA, un intermedio valioso para la industria qumica. Una va en desarrollo es la de los microorganismos termoflicos productores de PDO, aunque an existen pocos estudios sobre el tema, pero el uso de dichas bacterias puede ser ventajoso, consiguiendo un proceso ms eficiente econmicamente. En las fermentaciones termoflicas, pueden utilizarse corrientes calientes procedentes de etapas anteriores del proceso sin la necesidad de consumir energa en el enfriamiento antes del fermentador. Adems, la separacin posterior por destilacin tambin ahorra una cantidad importante de energa. Entre estos microorganismos, destaca el Caloramator viterbensis, que con una temperatura ptima de 60,7 C, es capaz de producir PDO con un rendimiento de 0,69 mol/mol generando nicamente como subproducto orgnico cido actico. La produccin biolgica de la glicerina y del PDO es conocida, pero no se ha demostrado an, que un nico microorganismo pueda llevar a cabo el proceso completo. Tampoco se han encontrado microorganismos naturales que conviertan directamente la glucosa en PDO. La ingeniera metablica puede usarse para manipular los caminos de fermentacin de manera que se reduzca o incluso se elimine la formacin de subproductos. La

manipulacin gentica de los microorganismos, tambin puede conseguir aumentar la produccin del producto o los metabolitos deseados. Algunos estudios han desarrollado microorganismos recombinados para producir PDO a partir de glucosa. Hartlep (2002) presento una estrategia en dos fases para la conversin. En la primera, un E. coli recombinado produce glicerina a partir de D-glucosa, que despus se convierte en PDO con K. pneumoniae. Se consiguen concentraciones de PDO de 86,6 g/L. En un proceso de DuPont, usan un E. coli recombinado que contiene genes de S. cervisiae para la produccin de glicerina, y de K. pneumoniae para la de PDO. As se obtienen concentraciones de 135 g/L utilizando glucosa como sustrato. La produccin que se alcanza es de 3,5 g/Lh, con conversiones de 0,51 (Sanford 2004). La necesidad de grandes cantidades de vitamina B12 y su elevado precio es la mayor limitacin para la produccin de PDO a gran escala, utilizando este proceso. Cultivos de E. coli que son capaces de convertir glicerina a PDO se han basado en genes del dharegulon, de K. pneumoniae o C. freundii. Sin embargo el rendimiento es bajo. La razn principal son los subproductos txicos que se forman, con el glicerol-3-fosfato. Gonzlez- Pajuelo (2005) desarroll un C. acetobutylicum recombinado introduciendo un plasma (pSPD5) que es capaz de producir 1104 mM de PDO en cultivo por cargas con un rendimiento de hasta 0,65 y produccin de 1,70 g/Lh. Los autores concluyeron que el C. acetobutylicum puede utilizarse para la produccin industrial continua a partir de glicerina cruda proveniente del biodisel. Zhang et al. (2006) ensay un E. coli JM109 recombinado (pHsh-dhaB-yqhD) que contiene genes yqhD de un tipo salvaje de E. coli y dhaB de C. freundii. Esta recombinacin llega a producir 41,1g/L en un cultivo optimizado que contiene 61,8 g/l de glicerina. En fermentaciones por cargas con azcares como co-sustrato, Yang (2007) consigui hasta 83,56 g/L con un rendimiento de 0,62 mol/mol y una productividad de 1,40 g/Lh utilizando K. oxytoca M5al, un cultivo mutado deficiente en biosntesis de cido lctico.

En el primer estudio piloto a escala de produccin usando K. pneumoniae M5al Cheng (2007) obtuvo 58,8 g/L, rendimiento de 0,53 y productividad de 0,92 g/Lh.
C o n ce n traci n e n d imie n toP ro d u cci n R R e fe re n cia CP D O(g /L ) YP D O(mo l/mo l) PP D O(g /L h )
6 3 ,4 3 1 -3 8 4 1 -4 6 8 3 ,9 6 1 ,9 8 6 ,6 5 8 ,8 8 3 ,6 1 3 5 ,0 4 1 ,1 --0 ,6 9 0 ,5 5 --0 ,6 5 0 ,4 9 --0 ,5 3 0 ,6 2 0 ,5 1 --0 ,6 9 1 ,8 5 --3 ,4 0 1 ,7 0 2 ,0 0 --0 ,9 2 1 ,4 0 3 ,5 0 ----B a rb ira to (1 9 9 8 ) P a p a n ik o la o u (2 0 0 0 ) P a p a n ik o la o u (2 0 0 0 ) G o n z le z (2 0 0 5 ) Mu (2 0 0 6 ) H a rte le p (2 0 0 2 ) C h e n g (2 0 0 2 ) Ya n g (2 0 0 7 ) S a n fo rd (2 0 0 4 ) D u P o n t Z h a n g (2 0 0 6 ) S e yfrie d (2 0 0 2 )

M icr o o r g an ismo o d . M
C . b u tyric u m C . b u tyric u m C . b u tyric u m C . a c e to b u tylicu m K . p n e u m o n ia e K . p n e u m o n ia e K . p n e u m o n ia e K . o xyto c a E . c o li E . c o li C a lo ra m a to r No No No Si No Si Si Si Si Si No

P r o ce so

B a tch C o n tin u o 1 e ta p a C o n tin u o 2 e ta p a s F e d -B a tch F e d -B a tch F e d -B a tch F e d -B a tch F e d -B a tch ----B a tch

Fig. 1.3.17. Resumen estudios microorganismos productores PDO

Las rutas metablicas de produccin del PDO han sido ampliamente estudiadas aunque no del todo comprendidas, y a menudo las conversiones tericas, no corresponden a los datos experimentales. Bajo condiciones anaerbicas, una parte de la glicerina se oxida va DHA hasta el piruvato (gliclisis) y otra se reduce va 3HPA hasta PDO. Una pequea cantidad de la glicerina, en torno a un 5% se utiliza para biomasa y produccin de energa si no existe otra fuente de carbono. En condiciones de anoxia, la NADH2 que se produce durante la gliclisis y la produccin de biomasa, se regenera mayoritariamente en la reduccin hasta PDO, pero tambin en otras fermentaciones simples a partir del piruvato hasta acetato, H2, nbutirato, lactato, etanol, En las ocasiones que se alcanzan conversiones mayores que las esperadas, se postulan reacciones adicionales. En presencia de oxgeno, por ejemplo puede existir una influencia del cido tricarbnico cclico, que genera ms equivalentes de reduccin.

Fig. 1.3.18 Ruta metablica de transformacin de glicerina en PDO

La cantidad y composicin de los distintos subproductos, difiere entre los distintos microorganismos, y es funcin adems de las condiciones del proceso. Para conseguir elevadas conversiones de PDO es importante que la formacin de derivados de la reduccin del piruvato sea mnima. Las mejores conversiones se obtienen cuando slo se forma acetato y PDO, y pueden llegar a 0,72 mol/mol. Si se utilizara glucosa como sustrato en la fermentacin, las conversiones obtenidas son menores, alcanzado como mximo valores de 0,51 mol/mol al tratarse de un compuesto en un estado menos reducido que la glicerina. Para que la produccin biolgica de PDO sea econmicamente viable, es necesaria una estrategia eficiente de ahorro de energa en las etapas de separacin y purificacin del producto. Ya que el PDO se usar mayoritariamente en la industria qumica de los polmeros, el grado de pureza a obtener debe estar comprendido entre un 95-98%,

dependiendo del tipo de impurezas que contenga y las propiedades especficas demandadas. Como la concentracin del producto en el caldo de fermentacin es slo en torno a un 10%, todas las opciones de recuperacin necesitan incluir una primera etapa de eliminacin de agua, por ejemplo por evaporacin. Esta etapa se resulta ser la que ms energa consume de todo el proceso de recuperacin. Existen numerosos enfoques para la recuperacin del PDO. En ocasiones es necesaria la eliminacin de la biomasa en primer lugar por centrifugacin o microfiltracin. Se ha comprobado que el tratamiento del caldo de fermentacin de C. butyricum con una floculacin con chitosan y poliacrilamida, seguido de una extraccin reactiva con butiraldehdo y una destilacin reactiva sobre una resina de intercambio cida catinica, separa la biomasa y las protenas solubles. Se obtiene como resultado una mezcla de PDO, 2,3 butanodiol, glicerina y acetales de glicerol. Se ha experimentado con la extraccin lquido-lquido con varios disolventes, como el polipropilen glicol, cido oleico y otros compuestos orgnicos, pero el coeficiente de distribucin que presenta el PDO en estos disolventes no es lo suficientemente alto para que una extraccin simple sea eficiente. Un proceso bastante simple y barato consiste en el uso de zeolitas en un mdulo de filtracin con flujo cruzado que separa la biomasa y enriquece el caldo de fermentacin en PDO. Se ha ensayado tambin con la separacin cromatogrfica en un intercambiador catinico, pero no se han conseguido resultados econmicamente viables an.