UNIVERSITATEA DE MEDICINA SI FARMACIE GRIGORE T.

POPA IASI FACULTATEA DE FARMACIE

IBRAHIM KHALAF

REZUMAT TEZA DE DOCTORAT

CONDUCATOR STIINTIFIC PROF. DR. MIHAI IOAN LAZAR

IASI 2O10

CERCETAREA PRINCIPIILOR ACTIVE DIN GLYCYRHHIZA GLABRA DE ORIGINE SIRIANA

CUPRINS

INTRODUCERE

STADIUL CUNOATERII

CAPITOLUL 1. PROFILUL GLYCYRRHIZA GLABRA 1. 1. NCADRARE SISTEMATIC

BOTANIC

SI

CHIMIC

AL

SPECIEI

1 1 3 5 5 6 6 6 6 7 8 9 10 11 11 12 12

1. 2. RSPNDIREA SPECIILOR DE GLYCYRRHIZA PE GLOB 1. 3. VARIETILE COMERCIALE DE LICVIRIIE 1. 4. CARACTERE ORGANOLEPTICE, RECOLTARE, CONDIIONARE 1. 5. CARACTERE MICROSCOPICE 1. 6. COMPOZITIA CHIMIC A SPECIILOR DE GLYCYRRHIZA 1. 6.1. COMPUSII FENOLICI DIN SPECIILE DE GLYCYRRHIZA 1. 6. 1. 1. Fenoli izoprenoid substituii din Glycyrrhiza glabra 1. 6. 1. 2. Fenoli izoprenoid substituii din Glycyrrhiza uralensis 1. 6. 1. 3. Fenoli izoprenoid substituii din Glycyrrhiza inflata 1. 6. 1. 4. Fenoli izoprenoid substituii din Glycyrrhiza eurycarpa 1. 6. 1. 5. Fenoli izoprenoid substituii din Glycyrrhiza aspera 1. 6. 2. COMPUI CU STRUCTUR TRITERPENIC 1. 6. 3. FLAVONOIDE, ISOFLAVONOIDE, CALCONE 1. 6. 4. CUMARINE 1. 6. 5. ALI COMPUI

CAPITOLUL 2. ASPECTE FARMACOLOGICE I TOXICOLOGICE 2. 1. DATE FARMACOCINETICE I FARMACOLOGICE 2. 1. 1. FARMACOCINETIC 2. 1. 2. FARMACOLOGIA EXPERIMENTAL 2. 1. 2. 1. Aciune antiinflamatoare 2. 1. 2. 2. Aciune antimicrobian i antiviral 2. 1. 2. 3. Aciune antiprotozoaric 2. 1. 2. 4. Aciune antioxidant 2. 1. 2. 5. Aciune asupra aparatului digestiv 2. 1. 2. 6. Aciune antitumoral 2. 1. 2. 7. Studii asupra sistemului nervos central 2. 1. 2. 8. Studii cardiovasculare 2. 1. 2. 9. Studii imunologice 2. 1. 2. 10. Studii renale 2. 1. 2. 11. Activiti citotoxice 2. 1. 2. 12. Studii respiratorii 2. 1. 2. 13. Efecte asupra diferenelor de jonciune ale canalelor 2. 1. 2. 14. Studii endocrinologice 2. 1. 3. FARMACOLOGIA CLINIC 2. 1. 3. 1. Efecte gastrointestinale 2. 1. 3. 2. Efecte anticanceroase 2. 1. 3. 3. Efecte antioxidative 2. 1. 3. 4. Efecte antivirale i hepatoprotectoare

14 14 14 16 16 17 18 18 19 20 20 21 21 23 23 23 24 24 24 24 25 25 25
2

2. 1. 3. 5. Studii dermatologice 2. 1. 3. 6. Efecte endocrinologice 2. 1. 3. 7. Boli respiratorii 2. 1. 3. 8. Alte efecte 2. 1. 4. UTILIZRI INDUSTRIALE 2. 1. 5. CONTRAINDICAII. AVERTISMENTE. PRECAUII 2. 1. 6. INTERACIUNI CU MEDICAMENTELE 2. 2. EFECTE SECUNDARE I TOXICITATE 2. 2. 1. UTILIZRI/CIRCUMSTANTE DE INTOXICARE 2. 2. 2. TOXICOCINETICA 2. 2. 3. ASPECTE TOXICOLOGICE 2. 2. 4. TOXICITATE 2. 2. 5. ANALIZA TOXICOLOGIC SI EXAMINARE BIOCHIMIC 2. 2. 6. SEMNE CLINICE DE INTOXICATIE 2. 2. 7. TRATAMENT 2. 2. 8. CARCINOGENEZ, MUTAGENEZ, SCDEREA FERTILITII 2. 2. 9. NTREBUINAREA PEDIATRIC 2. 3. MODIFICAREA CHIMIC A ACIDULUI GLICIRIZIC PENTRU OBINEREA DE NOI SUBSTANE ACTIVE 2. 3. 1. IZOLAREA ACIDULUI GLICIRIZIC DIN MATERII PRIME STRUCTURA SA 2. 3. 2. IZOMERIZAREA ACIDULUI GLICIRIZIC 2. 3. 3. SRURILE ACIULUI GLICIRIZIC 2. 3. 4. TRANSFORMRILE ACIDULUI GLICIRIZIC 2. 3. 4. 1. Sinteza de esteri ai acidului glicirizic 2. 3. 4. 2. Sinteza amidelor acidului glicirizic 2. 3. 4. 3. Sinteza de acetiltiouree i semicarbazide 2. 3. 4. 4. Sinteza homoderivailor acidului glicirizic I

25 26 27 27 27 28 28 29 31 31 32 33 33 34 35 35 36 36 38 39 39 40 40 41 43 45
3

2. 3. 4. 5. Sinteza de glicopeptide ale acidului glicirizic 2. 3. 4. 6. Sinteza triterpenelor ureide i a carbamailor 2. 3. 4. 7. Sinteza 4-dezoxi-4-nitroglicozidei acidului glicirizic 2. 3. 4. 8. Reducerea acidului glicirizic 2. 3. 4. 9. Sinteza triterpenei 2-dezoxi--glicozida acidului glicirizic 2. 3. 5. Proprietile farmacologice ale derivailor acidului glicirizic

46 46 48 50 51 52

CAPITOLUL 3. METODE DE ANALIZA A PRINCIPIILOR ACTIVE DIN SPECIILE DE GLYCYRRHIZA 3. 1. METODE CROMATOGRAFICE 3. 1. 1. CROMATOGRAFIA PE STRAT SUBIRE 3. 1. 2. TESTE IMUNOCROMATOGRAFICE 3. 1. 3. CROMATOGRAFIE DE LICHIDE DE NALT PERFORMAN 3. 2. METODE SPECTRALE 3. 2. 1. METODE SPECTRALE UV 3. 2. 2. METODE SPECTRALE IR SI RMN 3. 3. METODE ELECTROCHIMICE 3. 3. 1. ELECTROFOREZA 3. 3. 2. POLAROGRAFIE CONTRIBUII PROPRII CAPITOLUL 4. CARACTERIZAREA MACROSCOPIC I MICROSCOPIC A RDCINILOR DE GLYCYRRHIZA GLABRA RECOLTATE DIN SIRIA 4. 1. ASPECTUL MACROSCOPIC AL SORTURILOR DE GLYCYRHIZA GLABRA 4. 2. STUDIUL HISTO-ANATOMIC AL RDCINII DE GLYCYRHIZA

54 54 54 54 55 58 58 60 60 60 60

61 61 65
4

GLABRA

CAPITOLUL 5. ANALIZA CROMATOGRAFICA A EXTRACTELOR ALCOOLICE OBTINUTE DIN RADACINILE SI RIZOMII DE GLYCYRRHIZA GLAABRA DE ORIGINE SIRIANA 5.1. ANALIZA CROMATOGRAFIC PE STRAT SUBTIRE 5.2. DETERMINAREA HPLC A ACIDULUI GLICIRIZINIC (GLICIRETIC)

88

88 101

CAPITOLUL 6. ANALIZA GLYCYRRHIZA GLABRA

COMPUILOR

POLIFENOLICI

DIN

109 134 161 179

CAPITOLUL 7. ANALIZA FITOESTROGENILOR DIN GLYCYRRHIZA GLABRA CAPITOLUL 8. ANALIZA COMPUILOR STEROLICI DIN GLYCYRRHIZA GLABRA CAPITOLUL 9. ANALIZA COMPUILOR POLIFENOLICI, FITOESTROGENICI I STEROLICI DIN TINCTURA DE GLYCYRRHIZA GLABRA CONCLUZII GENERALE CONTRIBUII ORIGINALE. PERSPECTIVE DE CERCETARE BIBLIOGRAFIA CONSULTAT

190 193

INTRODUCERE

Motto: Plantele medicinale fie c se exprim prin rdcini, rizomi, bulbi, tije, ramuri, frunze, flori sau fructe reprezint n esen forele benefice ale cosmosului. Dr. Arcadie Percek Numeroase plante sunt folosite din negura timpului pentru proprietile lor curative n ngrijirea i meninerea sntii individului. Universalitatea lor este astfel recunoscuta i fiecare civilizaie, fiecare popor, posed n acest domeniu tradiia sa proprie. Exist argumente arheologice c mesopotamienii utilizau plantele, ca leac, n urm cu mai bine de 6000 de ani. Cunoatem c, n China, oamenii se foloseau de plante pentru a se menine sntoi cu 27 de veacuri nainte de Hristos, dei referiri cu privire la vindecarea cu ajutorul plantelor, pe acele meleaguri, sunt i mai vechi. Egiptenii foloseau plantele ca aliment, ca medicament i ca ingrediente n cosmetice, parfumuri i chiar uleiuri pentru alinarea durerilor, ca aromatizant pentru bi i pentru ncperile n care i petreceau cea mai mare parte din timp. Vechiul Testament face meniuni privind sntatea pe care o pot avea oamenii foosindu-se de plante. Vindectorii de demult obineau din plante extracte sub form de tincturi, uleiuri, creme, cataplasme, tot felul de ceaiuri, prafuri, balsamuri. Ei sunt predecesorii medicilor de azi, fie c li se zicea vraci sau ,, oameni care vindecau cu buruieni, iar plantele pe care le foloseau la uurarea suferinelor reprezint o surs important de materie prim pentru industria medicamentelor de azi. Avantajele fitoterapiei sunt: accesibilitatea ( plantele sunt uor de procurat i ieftine; culegerea lor din natur ajut la armonizarea organismului, eliberarea de stres etc.), aciunea blnd i lipsa efectelor adverse (cnd se respect dozele adecvate), tratarea bolnavului ca ntreg (plantele au efecte fizice i psiho-emoionale i echilibreaz organismul la toate nivelele), se poate folosi n paralel cu medicamentele alopate (cu cteva mici excepii, la care trebuie s se in seama de antagonismul dintre unele medicamente i unele plante). n acest context, ne-am propus studierea speciei de Glycyrrhiza glabra, plant originar din China, n India i China fiind cultivat n scopuri medicinale. n majoritatea rilor n care aceast plant se industrializeaz, se recolteaz din flora spontan (Rusia, Spania, Iran, Irak). n ara noastr cele mai multe caliti se obin din bazinele de flor spontan situate n zonele Vrancea, Galai, Suceava, Dobrogea, iar n ultimii ani s-a luat msura introducerii i extinderii speciei n cultura mare.
6

Lemnul dulce este o veche plant medicinal, descris n lucrarea Erbolario Bergomense n anul 1441 de Guarnerius de Padua. Denumirea engleza licorice provine din grecescul glykeia rhiza (rdcin dulce); n greaca contemporan denumirea este glikoriza. Primul element, glykys nseamn dulce, cel de-al doilea, rhiza, nseamn rdcin. In latin, denumirea mprumutat din greac era liquiritia, influenata de liquere (curgere), care se referea la sucul de lemn dulce. Nu numai denumirea englez are aceast surs. Alte limbi au denumiri provenite similar: Lakritze n german, lekorice n ceh, lokrytsya n ucrainean. In majoritatea limbilor romanice cuvntul s-a schimbat prin metateza ntre sunetele L i R: recalice n provensal, reglisse n francez, ragaliz n spaniol. Alte denumiri altur epitetul dulce substantivului lemn, sau rdcin: Sussholz n german, zoethout n olandez, lemn dulce n romn. Gustul dulce, caracteristic, se reflect n denumirile indiene. Madhu (dulce, plcut) n limba sanskrita este mprumutat n denumirile moderne: jestamadha n marathi, yashtimodhu n bengali, atimadhuramu n telugu i yashtimadhu n kannada. Inrudite, dar n afara Indiei, sunt: saldymedis n lituanian, madudag n armean. Alte exemple de denumiri, dominate i motivate de gustul dulce al condimentului sunt: solodkyj n ucrainean, magusjuur n estonian, edesgyoker n maghiar, dladuk koren n bulgar, toate nsemnnd rdcin dulce. Denumirea chinezeasc a unei specii nrudite, Glycyrrhiza uralensis este gan cao, care nseamn paie dulci, sau iarb dulce. Numele a fost mprumutat n vietnamez cam thao, n coreeana kamcho i n japoneza kanzo. Lemnul dulce este una dintre cele mai valoroase plante medicinale, un puternic antiinflamator eficient n afeciuni diverse, de la artrite, pn la ulceraii bucale. Se numr printre plantele cele mai utilizate n medicina european i a fost folosit n scopuri medicale de mii de ani. Datorit compoziiei foarte complexe, rdcinile i stolonii se utilizeaz pe scar larg n tratamentul bronitelor i faringitelor. n tradiia popular: rizomul se fcea decoct i se bea contra tusei i durerilor de piept. Tradiional, lemnul dulce a fost utilizat de ctre grecii antici pentru a trata astmul, problemele de piept i ulceraiile bucale. n scopuri medicinale se folosesc rdcinile, are aciune uor diuretic, expectorant, ajutnd la fluidificarea secreiilor traheo-bronice, calmnd tusea. Este un uor laxativ. Datorit proprietilor sale antiinflamatoare, antiulceroase i cicatrizante se folosete cu succes n afeciunile de mai jos. Cu rdcin de lemn dulce se pot ndulci ceaiurile i n acelai timp ajut la ameliorarea gustului neplcut al unor medicamente. Se evit fierberea rdcinilor (decoct) pentru a nu trece n ceaiul respectiv rezinele i substanele amare. n dispepsiile de fermentaie se prefer ndulcirea ceaiurilor cu lemn dulce pentru c acesta nu produce fermentaie ca zahrul. Antispasmodic, slab diuretic, uor expectorant prin fluidificarea secreiilor bronhice, antispastic, antihistaminic, antiacetilcolinic, aciune tampon a aciditii gastrice, aciune antitusiv, aciune asupra metabolismului hidric-salin, aciune anorexic, aciune antiestrogen, cardiovascular, bacteriostatic, antitoxic fa de toxina tetanic, aciune difteric i asupra stricninei, antihemoroidal, uor laxativ, estrogen, antiinflamatoare, antiulceroas i antidismenoreic. Este un hormon natural de excepie. Reduce inflamaiile gastrice, protector al mucoasei gastrice. Nu este indicat s se foloseasc de ctre cei care au hipertensiune pentru c reine sodiul n organism i prin aceasta face s creasc tensiunea arterial. Ajut la inflamaiile
7

articulare. Este febrifug. Aciune uoar antiulceroas, antitusiv, anorexic, antiflogistic. Se folosete n special n tratarea tusei, ulcerului gastric. Este un antioxidant foarte puternic i are aciune antiviral i antimicrobian, ajutnd la refacerea sistemului imunitar. Previne i combate osteoporoza. Restabilete funcionarea normal a esuturilor i membranelor, echilibreaz balana hormonal i este un stimulent al secreiilor intestinale i al respiraiei i are de asemenea efect laxativ. Se folosete sub form de pulbere, comprimate, supozitoare, ulei, tinctur n urmtoarele afeciuni: afeciuni respiratorii, afrodiziac feminin, alergii, amenoree, anemie, angin, artrite, ascaridoze, astm, balonare, boli de stomac i ficat, bronit (fluidific sputa), bufeuri, buze crpate, calculoz renal i biliar, cancer adjuvant indiferent de localizare, cancer hepatic, colici hepatobiliare, colecistit dischinezic, colici hepato-biliare, constipaie, convalescen, degerturi, dereglri hormonale, dischinezie biliar, dismenoree, dispepsie de fermentaie, dureri de ochi, dureri de dini, dureri de picioare, dureri de piept, edeme, epuizare nervoas, faringit, frigiditate, gangren, gastrite hiperacide, grip, hemoroizi, hepatit cronic, hirsutism, inapeten, infertilitate la femei, infestri cu giardia, infecii urinare, insomnie, nepturi de insecte, intoxicaii cu ciuperci i plante otrvitoare (adjuvant), iritabilitate, junghiuri, malarie, menstruaii dureroase, meteorism, migren, natere (pentru uurarea travaliului), oboseal, osteoporoz, oxiuraz, parazitoze intestinale, plgi vechi sau ulcerate, rceli, rni, rni ulcerate, reumatism chiar i degenerativ, slbiciune exagerat, stimularea creterii prului, stomatit, stres, traheit, transpiraia picioarelor cu miros neplcut, tulburri de premenopauz, tuse (fluidific secreiile) uscat i iritativ, ulcer stomacal, ulcer gastric i duodenal, uurarea durerilor la natere. Lemnul dulce a fost dintotdeauna folosit mai puin ca mirodenie i mai mult ca medicament. La o cercetare superficiala, dulceaa puternic i dominant a lemnului dulce nu este potrivit nici mncrurilor dulci i nici celor picante. Totui, mici cantiti de lemn dulce mbogesc semnificativ gustul amestecului chinezesc 5 arome. Lemnul dulce este un ingredient de baz la prepararea bomboanelor n nordul Europei, mai ales n Germania (numite Lakritz) i Scandinavia. (numite salmiaki). Aceste bomboane sunt suc de lemn dulce concentrat, la care se adaug diferite arome (cum ar fi lamia), dar nu i zahr. Lemnul dulce mai este folosit i la prepararea bomboanelor, dar acestea conin doar maxim 2 % extract de lemn dulce, restul aromei i gustului fiind dat, de obicei, de anason. 90 % din lemnul dulce folosit ca agent de ndulcire merge ctre industria tutunului (igri, trabucuri, tutun de pip). Bucile de esen de lemn dulce pot fi dizolvate n ap fierbinte pentru a obine ceaiuri, iar condimentul mai este folosit i ca adaus la prepararea de sucuri de fructe, siropuri i buturi alcoolice aromate, ca sambuca i berea Guiness. Condimentul este disponibil uscat, fie ntreg, fie pulbere i ca batonae solide de esen concentrat, de culoare neagr, lucioase, dulci i parial solubile n ap. Aroma de lemn dulce este asemntoare cu cea a feniculului, dar considerabil mai puternic. Gustul este dominant dulce, asemntor cu cel al anasonului, dar cu o mic tenta remanent amruie i un pic srat. Dac este mestecat, pare s devina din ce n ce mai dulce. Motivaia cercetrii
8

n ultimii ani se constat o reorientare spre obinerea de medicamente prornind de la produse vegetale deoarece nlocuind medicamentele cu remedii naturale nu facem altceva dect s punem n practic un principiu hipocratic, din pcate uitat, dar care nu i-a pierdut niciodat valabilitatea: a dobndi vindecarea este mai presus de toate tiina medical; mai multe ci, ns, dac duc spre aceast int trebuie s o alegem pe cea mai puin vtmtoare. Deoarece speciile de Glycyrrhiza glabra sunt ntnite n flora Siriei i sunt larg utilizate att datorit aciunilor farmacologice ct i ca ingredient la obinerea sucurilor i buturilor racoritoare, am ales pentru analiz patru eantioane recoltate din diferite zone ale Siriei: Bilekh, Rakka, Alepo-Azaz, Rass-Aenn.

Obiectivele tezei de doctorat Datorit utilizrii Glycyrrhizei glabra att n medicina tradiional ct i datorit importanei acestei plante att n medicin ct i ca mirodenie ne-am propus analiza plantei provenite din patru regiuni din Siria. Lucrarea cuprinde studiul botanic al celor patru eantioane, att macroscopic ct i microscopic, studiul fitochimic comparativ al principalelor grupe de compui cu aciune

terapeutic: estrogeni, compui polifenolici i fitosteroli. De asemenea, aceti compui au fost analizai i dintr-o form farmaceutic larg utilizat tinctura.

Teza de doctorat cuprinde 9 capitole, include 206 pagini (partea general 60 pagini, partea personal 146 pagini), 134 figuri, 44 tabele i 174 indicaii bibliografice.

STADIUL CUNOASTERII CAPITOLUL 1 PROFILUL BOTANIC SI CHIMIC AL SPECIEI GLYCYRRHIZA GLABRA CAPITOLUL 2 ASPECTE FARMACOLOGICE I TOXICOLOGICE CAPITOLUL 3 METODE DE ANALIZA A PRINCIPIILOR ACTIVE DIN SPECIILE DE GLYCYRRHIZA CONTRIBUTII PROPRII CAPITOLUL 4 CARACTERIZAREA MACROSCOPIC I MICROSCOPIC A RDCINILOR DE GLYCYRRHIZA GLABRA RECOLTATE DIN SIRIA n acest capitol au fost caracterizate din punct de vedere macroscopic i microscopic eantioane de Glycyrrhiza glabra recoltate din flora Siriei, din patru zone diferite: Bilekh, Rakka, Alepo-Azaz, Rass-Aenn. n cadrul analizei microscopice s-au urmrit drept caractere histo-anatomice de difereniere n caracterizarea celor 4 eantioane.

10

Rizom de Glycyrrhiza glabra recoltat din Rakka aspecte macroscopice Eantioanele recoltate se prezint sub forma unor buci cilindrice, drepte sau unor curbate, lungi de 4-15 cm, goase de 1,5 cm, cu suprafaa extern brun-cenuie, strbtut de numeroase striuri longitudinale. Fragmentele sunt dure, compacte, iar fractura este fibroas i colorat n galben. Culoarea la exterior este brun cenuie. Miros slab caracteristic, gust dulceag, neptor i amrui. 4. 2. STUDIUL HISTO-ANATOMIC AL RDCINII DE GLYCYRHIZA GLABRA n vederea realizrii cercetrilor histo-anatomice materialul vegetal a fost reprezentat de fragmente de rizom de la 4 eantioane de Glycyrhiza glabra: Bilekh, Rakka , Alepo-Azaz, RassAenn. Bilekh

11

Concluzii: La toate eantioanele razele medulare (principale i secundare) fragmenteaz inelul iniial de liber secundar n trapeze foarte nguste. In urma analizei microscopice putem spune ca exist diferene n caracterele histoanatomice de tip periderm, fibre sclerenchimatice, raze medulare i mduv ale celor patru eantioane de Glycyrrhiza glabra, dar i asemnri dup cum urmeaz: periderma eantioanelor din Alepo-Azaz i Rass-Aenn este asemntoare cu cea a eantionului din Bilekh, fibrele sclerenchimatice ale eantionului Rakka sunt asemntoare, dar mai numeroase dect cele ale eantionului din Bilekh, fibrele sclerenchimatice liberiene ale eantionului Alepo-Azaz sunt
12

asemntoare cu cele ale eantionului Rakka, iar cele ale lemnoase seamn cu eantionul Bilekh, razele medulare ale eantioanelor Alepo-Azaz i Rass-Aenn sunt asemntoare cu cele ale eantionului Rakka, mduva eantionului Rakka este asemntoare eantionului Bilekh. CAPITOLUL 5 ANALIZA CROMATOGRAFICA A EXTRACTELOR ALCOOLICE OBTINUTE DIN RADACINILE SI RIZOMII DE GLYCYRRHIZA GLAABRA DE ORIGINE SIRIANA 5. 1. ANALIZA CROMATOGRAFIC PE STRAT SUBTIRE Extractele 10 % astfel obinute se supun analizei cromatografice pentru punerea n eviden a flavonelor i a compuilor cu structur sterolic. 1. Analiza cromatografic a compuilor flavonici din rdcinile recoltate din Bilekh Imaginea cromatogramelor obinute dup developrile n UV sunt redate mai jos.

Cromatograma vizualizat n UV la 254 nm Concluzii

Cromatograma vizualizat n UV la 366 nm

Analizele cromatografice efectuate fr a folosi substane de referin arat c cele dou vizualizri scot n eviden prezena compuilor flavonici, numrul acestora observai depinznd de lungimea de und UV. Alte determinri cromatografice pe strat subire Am utilizat urmtoarele sisteme de developare:
13

1. metanol 90% 2. metanol-diclormetan (1:19) 3. cloroform-metanol (10:1) 4. ciclohexan:aceton (3:1) Vizualizri: 1. Reactiv Dragendorff 2. Anisaldehid 1% n acid sulfuric (nclzire timp de 5 minute la 105oC) 3. Expunere la vapori de iod

Cromatograma extractelor siriene (developare cu reactiv Dragendorff) Concluzii: 1. Analizele cromatografice pe strat subire scot n eviden compui ce pot aparine urmtoarelor grupe de substane active: alcaloizi, cumarine, flavones, steroizi, taninuri, 2. Pentru elucidarea i identificarea acestora este necesar s se utilizeze substane etalon din toate grupele menionate. ANALIZA CROMATOGRAFIC A COMPUSILOR FLAVONICI Suport: Placi cromatografice Silicagel F254 (Aluminium TLC sheets (E. Merck) S-au testat 11 standarde de compui flavonici (agliconi i glicozide): kemferol , apigenina, cvercetol, luteolina, cvercitrozida, rutozida, izocvercitrozida, hiperozida, miricetol, fisetina, patuletina. Faze mobil: toluen-acetat de etil-acid formic (36:12:5) Rass-Aenn

14

Cromatograma pe strat subire a extractului alcoolic CONCLUZII n toate sorturile de lemn dulce recoltate din cele patru localiti am identificat cromatografic pe strat subire toate flavonele folosite ca etaloane. De menionat c alturi de aceste flavone speciile de Glucyrrhiza conin i ali componeni flavonici, menionai n capitolul 1. Acetia nu au fost identificai din cauza lipsei de substane etalon. 5. 2. DETERMINAREA HPLC A ACIDULUI GLICIRIZINIC (GLICIRETIC) Aa dup cum s-a artat n alt parte a lucrrii (capitolul I) glicirizina este compusul majoritar al fraciunii care d gustul dulce al produsului. In extractele alcoolice obinute alturi de glicirizin se gsete i acidul glicirizinic, denumit i acid glicirinetic sau acid gliciretic.

Analizele au fost realizate pe un sistem HPLC Thermo-Surveyor echipat cu sistem de injecie automat a probelor i detector DAD (inetrval spectral de detecie 190-360 nm). Cromatogramele au fost nregistrate i prelucrate ntr-un software de tipul ChromQuest, model 4.2.34, cu modul de indentificare spectral a compuilor separai pe coloan.
15

S-a folosit o coloan de tip Discovery RP-Amide (C16) (250 x 4,6, diametrul interior 5 mm) i diametrul particulelor interioare de 5 m. Faza mobil folosit pentru eluie a fost constituit dintr-un amestec acetonitril: acid acetic (10%). Eluia compuilor pe coloan s-a realizat dup un gradient liniar al proporiilor n faza mobil a celor dou componente ale fazei mobile: Timp 0 30 35 37 CH3COOH (10%) 92 9 92 92 ACN 8 91 8 8

Debitul folosit a fost de 1 ml/min, iar detecia s-a realizat la lungimile de und 254 i respectiv 280 nm. ECUAIA CURBEI DE REGRESIE Acidul gliciretinic y = 195863578.8530x - 158400.3749 COEFICIENT DE REGRESIE (R2) 0.9994

Curba de etalonare a acidului gliciretinic LIMITA DE CUANTIFICARE LIMITA DE DETECIE

16

(MG/ML) Acidul gliciretinic 0,000039

(MG/ML) 0,0000259

HPLC cromatograma acidului gliciretinic (etalon) Coninutul n acid gliciretic al sorturilor de Glycyrrhiza glabra provenite din Siria SORTUL DE GLYCYRRHIZA CONINUT % (G)

1. Bilekh

18,50

2. Rakka

19,46

3. Alepo-Azaz

19,64

4. Rass-aenn

19,48

17

Coninutul n acid gliciretic al sorturilor siriene de Glycyrrhiza glabra Concluzii: 1.Analiza HPLC a extractelor alcoolice obinute din rdinile i rizomii de Glycyrrhiza glabra recoltate din cele patru locaii ne arat un coninut n acid gliciretinic cuprins ntre 18,50 % i 19,64 %. 2. Cel mai mare coninut n acid gliciretinic l are Glycyrrhiza recoltat din Alepo-Azaz-19,64 % 3. Cel mai mic coninut l au rdcinile i rizomii recoltai din Bilekh- 18,50 %. CAPITOLUL 6 ANALIZA COMPUILOR POLIFENOLICI DIN GLYCYRRHIZA GLABRA Pentru analiza compuilor polifenolici din extractele de Glycyrrhiza glabra s-a folosit cromatografia de lichide de nalt performan cuplat cu spectrometria de mas (LC/MS). Analiza s-a efectuat utiliznd un sistem Agilent 1100 HPLC Series, echipat cu degazor G1322A, pomp cu gradient cuaternar G1311A, autosampler G1313A. Pentru separare s-a utilizat o coloan analitic cu faz invers Zorbax SB-C18 (100 mm x 3.0 mm i.d., 3.5 m), prevzut cu o precoloan Zorbax SB-C18, meninute la temperatura de 48 0C. S-au testat 18 standarde de compui polifenolici: doi agliconi de tip flavon, 5 agliconi de tip flavonoli, patru glicozide ale cvercetolului, ase derivai de acid cinamic i un acid hidroxibenzoic. COMPUS Flavone apigenin luteolin R3 H H R6 H H R3 H OH R4 OH OH R5 H H
18

cvercetol kemferol Flavonoli patuletin miricetol fisetin hiperozida Flavonozide

OH OH OH OH OH O--Dgalactozida

H H

OH OH

OH H OH OH OH OH OH OH OH

H H H OH H H H H H

OCH3 OH H H H H H H OH OH OH OH OH OH

izocvercitrozid O--Dglucozida cvercitrozida rutozida O--Dramnozida O--Drutinozida

COMPUS Acid p-cumaric Acid cafeic Derivai de acid cinamic Acid ferulic Acid sinapic Acid clorogenic Acid caftaric

R3 H OH H OCH3

R4 OH OH OH OH Acid 3-cafeoilchinic Acid 2-cafeoiltartric

R5 H H OCH3 OCH3

19

Cromatograma unui amestec de 18 polifenoli, detecie UV la 330 i 370 nm Timpii de retenie i parametrii dreptelor de calibrare pentru compuii polifenolici analizai, detecia n UV Nr. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Nume compus Acid caftaric Acid gentisic Acid cafeic Acid clorogenic Acid p-cumaric Acid ferulic Acid sinapic Hiperozida Izocvercitrozida Rutozida Timp retenie (min) 2.10 2.15 5.6 5.6 8.7 12.2 14.3 18.6 19.6 20.2 Ecuaie dreapt calibrare Calitativ Calitativ Calitativ Calitativ A = - 0.325 + 33.23 x A = - 1.016 + 39.55 x A = - 0.236 + 37.10 x A = 0.107 + 19.29 x A = - 0.273 + 12.97 x A = 0.226 + 13.47 x

20

11 12 13 14 15 16 17 18

Miricetol Fisetina Cvercitrozida Cvercetol Patuletina Luteolina Kemferol Apigenina

20.7 22.6 23.0 26.8 28.7 29.1 31.6 33.1

A = -0.544 + 26.45 x A = 0.241 + 19.19 x A = 0.047 + 10.69 x A = -1.152 + 36.32 x A= - 0.429 + 31.44 x A = - 0.760 + 28.97 x A = - 1.270 + 30.15 x A = - 0.908 + 20.40 x

* A = aria picului n mAUs, x = concentraia in g mL-1 Analiza polifenolilor prin detectie MS Modul de analiz MS i ionii caracteristici din spectrul de mas al polifenolilor analizai Nr. Nume compus Mod analiz MS Ioni specifici pentru identificare Ion [M-H] > Ioni din spectru 1 2 3 4 5 6 Acid caftaric Acid gentisic Acid cafeic Acid clorogenic Acid p-cumaric Acid ferulic MRM* MRM MRM MRM MRM MRM 311>148.6, 178.6 153>108.7 179.4>134.7 353.5>178.7, 190.7 163> 118.7 193.2> 133.7, 148.7, 177.6

21

7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

Acid sinapic Hiperozida Izocvercitrozida Rutozida Miricetol Fisetina Cvercitrozida Cvercetol Patuletina Luteolina Kemferol Apigenina

MRM SIM** SIM SIM SIM SIM SIM SIM SIM SIM SIM SIM

223.4>148.6, 163.6, 178.7, 207.7 463.1 463.1 609.1 317.1 285.1 447.1 301.1 331.1 285.1 285.1 269.2

*MRM = multiple reaction monitoring - monitorizare ion specific substanei, n urma unui dublu proces MS (izolare i fragmentare), se aplic atunci cnd substana ionizeaz mai greu, ionii corespunztori au intensiti mai mici, iar spectrometrul i-ar putea considera zgomot de fond ** SIM = single ion monitoring - presupune un singur stagiu MS, acela de izolare a compusului de interes i apoi scanare, fr etapa de fragmentare (se aplic atunci cnd analitul nu se fragmenteaz eficient).

Rezultatele analizei celor 4 extracte sunt reunite n tabelul 6.3, exprimate n g/ml extract. Compuii fenolici sunt redai n ordinea timpilor de retenie. Coninutul (g/ml) n compui polifenolici al extractelor metanolice, nehidrolizate i hidrolizate, din cele 4 extracte (G1 - Bilekh, G2 - Rakka, G3 - Alpo-Azaz, G4 - Rass-Aenn) Polifenoli NH Acid gentisic * G1 H * NH G2 H * NH G3 H * NH G4 H *
22

Acid cafeic Acid p-coumaric Acid ferulic Luteolina Apigenina Acid sinapic

* * 0.620 * -

* 3.627 5.014 1.139 1.218 3.694

* -

* 4.932 11.84 0.85 1.054 2.93

* * 0.332 1.054 *

2.173 6.236 0.908 1.381 13.981

* * 0.217 0.728 -

* 2.173 5.141 0.332 1.463 2.032

NH prob nehidrolizat; H prob hidrolizat * S-a realizat doar determinare calitativ prin MS; semnalul UV < LQ (limita de cuantificare) sau interferenele/suprapunerea picurilor altor compui nu permite determinarea cantitativ a acestor substane.

Variaia coninutului luteolinei i apigeninei n cele patru extracte nehidrolizate de Glycyrrhiza glabra

Variaia coninutului acidului p-cumaric, ferulic, sinapic, a luteolinei i apigeninei n cele

23

patru extracte hidrolizate de Glycyrrhiza glabra

Rezultatele obinute indic prezena acidului gentisic, p-cumaric, ferulic i sinapic n toate probele, n special sub form de ester. Acidul gentisic i cafeic nu au putut fi determinai cantitativ n nici una din probe, cantitatea fiind sub limita de cuantificare. n cazul flavonoidelor, luteolina i apigenina sunt prezente n toate cele patru probe sub form glicozidat i sub form de agliconi liberi, cu excepia probei Rakka ce conine doar apigenin sub form glicozidat. In probele analizate nu s-au gsit cei cinci flavonoli analizai (cvercetol, patuletin, kemferol, fisetin, miricetin) i nici cele patru flavonozide (hiperozid, cvercitrozid, izocvercitrozid, rutozid) testate. Determinarea cantitativ a fost posibil pentru acidul cumaric, acidul ferulic, luteolin apigenin i acid sinapic n special dup hidroliz, iar din probele Alpo-Azaz i Rass-Aenn luteolina i apigenina au putut fi cuantificate i sub form de aglicon. Concluzii Acidul gentisic, p-cumaric, ferulic i sinapic sunt acizii polifenolcarboxilici cel mai des ntlnii n probele analizate, din care acidul p-cumaric, ferulic i sinapic pot fi cuantificai. Luteolina este observat n toate probele att nehidrolizate ct i hidrolizate. n nici una din probe nu s-au gsit patuletin, kemferol, fisetin, miricetin, hiperozid, cvercitrozid, izocvercitrozid, rutozid. Proba din Bilekh a avut cea mai mare cantitate de luteolin, cea din Rakka de acid pcumaric i acid ferulic, cea din Alpo-Azaz de acid sinapic, iar cea din Rass-Aenn de apigenin. CAPITOLUL 7 ANALIZA FITOESTROGENILOR DIN GLYCYRRHIZA GLABRA Fitoestrogenii reprezint un grup heterogen de compui non-steroizi care se gsesc n plante n mod natural i care datorit structurii moleculare asemntoare cu a estradiolului, pot mima efectele acestuia n organism. Pentru analiza compuilor fitoestrogenici din extracte de Glycyrrhiza glabra am folosit cromatografia de lichide de nalt performan cuplat cu spectrometria de mas (LC/MS). (166170)

Metoda se poate aplica pentru analiza cantitativ a opt compui cu activitate fitoestrogenic (apte izoflavone i un lignan). S-au utilizat urmtoarele standarde, in ordinea eluiei
24

cromatografice: daidzin, genistin, ononin, daidzein, glicitein, genistein, cumestrol, formononetin. Analiza s-a efectuat utiliznd un sistem Agilent 1100 HPLC Series, echipat cu degazor G1322A, pomp cu gradient cuaternar G1311A, autosampler G1313A. Pentru separare s-a utilizat o coloan analitic cu faz invers Zorbax SB-C18 (100 mm x 3.0 mm i.d., 5 m), prevzut cu o precoloan Zorbax SB-C18, meninute la temperatura de 50 oC. Detecia s-a realizat prin spectrometrie de mas utiliznd un spectrometru de mas Agilent Ion Trap 1100 VL dotat cu o interfa ESI (electrospray) cu mod de ionizare negativ, SIM pentru agliconi i SRM pentru glicozide. Pentru a obine valori maxime de sensibilitate, condiiile de lucru au fost optimizate astfel: gaz de uscare - azot, debit 12 L/min, temperatur 360 o C, nebulizator - azot, presiune 65 psi, potenial capilar - +4500 V.
Intens. x10 6 1 0 x10 5 2 0 x10 5 1 0 x10 4 4 2 0 x10 5 4 2 0 x10 6 1.0 0.5 0.0 x10 6 1 PROBE__000005.D: EIC 268.4-269.4 -MS2(269.0) PROBE__000005.D: EIC 282.4-283.4 -MS2(283.0) PROBE__000005.D: EIC 252.4-253.4 -MS2(253.0) PROBE__000005.D: EIC 266.4-267.4 -MS2(429.0) PROBE__000005.D: TIC -All MSn

PROBE__000005.D: EIC 252.4-253.4 -MS2(415.0)

PROBE__000005.D: EIC 268; 269 -MS2(431.0)

0 x10 6 1 0 0 2 4 6 8

PROBE__000005.D: EIC 266.3-267.3 -MS2(267.0)

10

12

14

16 Time [min]

Cromatograma amestecului de izoflavone i cumestrol, detecie MS (cromatograma1: TIC- toi compuii, cromatograma 2: daidzina (3.9 min), cromatograma 3: genistin (5.8 min), cromatograma 4: ononina (9.1 min), cromatograma 5: daidzeina 9.6 min), cromatograma 6: gliciteina (10.4 min), cromatograma 7: genisteina (11.3 min), cromatograma 8: cumestrol (13.0 min) i formononetina (14.8 min) Timpii de retenie i parametrii de detecie (mod detecie, valori m/z) pentru compuii analizai
25

Nr. 1 2 3 4 5 6 7 8

Nume compus Daidzina Genistina Ononina Daidzeina Gliciteina Genisteina Cumestrol Formononetina

Timp retenie (min) 3.9 5.8 9.1 9.6 10.4 11.3 13.0 14.8

Mod detecie SRM SRM SRM SIM SIM SIM SIM SIM

m/z ion printe [M-H]415 431 429 253 283 269 267 267

m/z monitorizat 253 268, 269 267 253 283 269 267 267

*SRM= single reaction monitoring; SIM = single ion monitoring Timpii de retenie i parametrii de detecie (mod detecie, valori m/z) pentru compuii analizai Nr. 1 2 3 4 5 6 7 8 Nume compus Daidzina Genistina Ononina Daidzeina Gliciteina Genisteina Cumestrol Formononetina Timp retenie (min) 3.9 5.8 9.1 9.6 10.4 11.3 13.0 14.8 Mod detecie SRM SRM SRM SIM SIM SIM SIM SIM m/z ion printe [M-H]415 431 429 253 283 269 267 267 m/z monitorizat 253 268, 269 267 253 283 269 267 267

*SRM= single reaction monitoring; SIM = single ion monitoring Curbele de calibrare au fost realizate in intervalul 40-2000 ng/ml.

26

Curba de calibrare pentru ononin Concentraiile de fitoestrogeni regsite n probele nehidrolizate Proba Compus Daidzin Genistin Ononin Daidzein Glicitein Genistein Cumestrol Formononetin G1 233.4 0.0 23120.1 2681.4 0.0 285.1 1016.1 7838.7 G2 G3 Concentraie (ng/ml) 0.0 306.9 0.0 0.0 507.3 13928.8 0.0 2026.6 0.0 0.0 0.0 180.3 0.0 432.9 64.2 3919.3 G4 114.5 0.0 21335.3 382.6 0.0 69.0 575.5 4789.8

Concentraiile de fitoestrogeni regsite n probele hidrolizate (echivalent n extractul iniial) Proba Compus Daidzin Genistin Ononin Daidzein Glicitein Genistein Cumestrol Formononetin G1 0.0 0.0 5036.7 2487.6 0.0 433.6 705.4 14505.3 G2 G3 Concentratie (ng/ml) 0.0 0.0 0.0 0.0 5055.1 6605.0 3165.5 2590.4 0.0 0.0 193.9 330.8 252.6 320.0 12032.2 14896.6 G4 0.0 0.0 4350.7 634.9 0.0 288.3 214.9 14157.0
27

Coninutul comparativ n fitoestrogeni din cele patru probe nehidrolizate

Coninutul comparativ n fitoestrogeni din cele patru probe hidrolizate Concluzii 1. Comparnd rezultatele din probele analizate, se observ c, extractele din Bilekh, Alepo-Azaz i Rass-Aenn sunt mai bogate n compui fitoestrogenici. 2. Ononina este cea mai abundent izoflavon glicozidat i se gsete n toate probele. Agliconul su, formononetina, este prezent n cantitile cele mai mari n toate extractele, cu excepia probei din Rakka ce conine cantiti mai mici din acest compus.
28

3. Daidzina i agliconii genisteinei i cumestrolului lipsesc din extractul din Rakka. 4. Diferenele calitative i cantitative dintre extractele testate pot fi explicate prin condiiile pedoclimatice diverse din ariile de recoltare ale produsului vegetal.

CAPITOLUL 8 ANALIZA COMPUILOR STEROLICI DIN GLYCYRRHIZA GLABRA Sterolii sunt monoalcooli secundari ciclici, care deriv de la o hidrocarbur policiclic, numit steran, nucleul de baz fiind de natur ciclopentanperhidrofentrenic. Pentru analiza sterolilor din extractele de Glycyrrhiza glabra s-a folosit cromatografia de lichide de nalt performan cuplat cu spectrometria de masa (LC/MS). Metoda de analiza utilizat se bazeaz pe o metod HPLC publicat n literatura de specialitate, la care s-au adus unele modificri. Principala modificare adus metodei iniiale este schimbarea coloanei cromatografice i a debitului fazei mobile. Ca rezultat, fa de metoda publicat n literatur, timpul de analiz a sczut de la 30 minute la 5 minute fr a afecta separarea i rezoluia sterolilor. Probele luate n lucru sunt constituite din pri din rdcini de Glycyrrhiza glabra colectate din Siria, din 4 locaii: Bilekh (notat G1), Rakka (notat G2), Alepo-Azaz (notat G3), Rass-Aenn (notat G4). Pentru determinarea cantitativa, au fost utilizate patru standarde, beta-sitosterol, stigmasterol, campesterol si ergosterol (fig. 1), achiziionate de la firma Sigma (Germania). Din standardele au fost preparate soluii cloroformice stoc (1 mg/ml), pstrate la 4 0C, ferite de lumin, care au fost diluate corespunztor cu acetonitril nainte de injectarea n HPLC. Analiza s-a efectuat utiliznd un sistem Agilent 1100 HPLC Series, echipat cu degazor G1322A, pomp cu gradient cuaternar G1311A, autosampler G1313A. Pentru separare s-a utilizat o coloan analitic cu faz invers Zorbax SB-C18 (100 mm x 3.0 mm i.d., 5 m), prevzut cu o precoloan Zorbax SB-C18, meninute la temperatura de 40 0C. Pentru prepararea fazei mobile s-a folosit un amestec alctuit din metanol i acetonitril 30:70 (v/v), iar eluia a fost izocratic. Debitul fazei mobile este de 1 ml/min, iar volumul de injectare este de 4 l. S-a folosit detecie MS/MS, mod de analiz MRM, monitorizarea ionilor specifici sterolilor. Pentru detecia prin spectrometrie de mas s-a utilizat un spectru de mas Agilent Ion Trap 1100 VL dotat cu o interfa APCI (atmosferic pressure chemical ionisation) cu mod de
29

ionizare pozitiv. Pentru a obine valori maxime de sensibilitate, condiiile de lucru au fost optimizate astfel: gaz de uscare - azot, debit 7 L/min, temperatur 250 0C, nebulizator - azot, presiune 50 psi, potenial capilar - -4000 V. Datele cromatografice au fost procesate utiliznd programul Chem Station (vA09.03) i Data Analysis (v 5.3) de la Agilent, SUA. n conditiile cromatografice anterioare, timpii de retenie ai celor patru steroli analizai sunt: 2.4 min pentru ergosterol, 3.7 min att pentru stigmasterol ct i pentru campesterol (coeluie) i 4.2 min pentru sitosterol. Ionii monitorizai prin metoda MS sunt prezentai n tabelul VIII.1. Deoarece n condiiile de ionizare toi sterolii pierd o molecul de ap, ionii detectai de spectrometru sunt ntotdeauna de forma [M-H2O+H]+. Ionii specifici sterolilor monitorizai n metoda de screening, n ordinea cresctoare a timpului de retenie

Sterol Ergosterol Stigmasterol Campesterol Sitosterol

Timp retenie min 2.4 3.7 3.7 4.2

M 396 412 400 414

M-H2O 378 394 382 396

M-H2O+H+ 379 395 383 397

Detecia MS a pus n eviden ionii-printe ai sterolilor analizai (ioni parinte = ioni care se formeaz dupa ionizarea substanei, nainte de o eventuala fragmentare). n cazul fiecrui sterol, s-a pus n eviden ionul ateptat (tabelul 8. 1). Cromatograma totalului ionic a unui amestec al celor patru steroli este prezentat mai jos. Este reprezentat grafic suma tuturor ionilor scanai de spectrometru, indiferent de masa acestora.

30

Intens. x10 6 5

ST_CC___000011.D: TIC +All MSn

0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 Time [min]

Cromatograma totalului ionic al unui amestec de standarde de steroli. Ordinea de elutie este ergosterol (2.4 min), stigmasterol i campesterol (ambele la 3.7 min), sitosterol (4.2 min); [picul de la 3.2 min corespunde colesterolului]

x10 6 1.50 395.4 1.25

+MS, 3.6-3.6min (#999-#1017)

1.00

0.75

0.50 384.5

0.25

396.4 397.4 409.4 407.3 390 395 400 405 m/z

385.5 0.00 385

Spectrul de tip full-scan al stigmasterolului n faza mobil Ionii specifici ai celor patru standarde de steroli (379 pentru ergosterol, 395 pentru stigmasterol, 383 pentru campesterol i 397 pentru beta-sitosterol) au fost fragmentai, iar pe baza fragmentelor din spectrul MS s-au construit cromatogramele extrase ale fiecrui compus.
31

Aceast metod de analiz (numit i MS/MS) este extrem de specific, deoarece n metoda de screening, unde se nregistreaz doar intensitatea ionului principal, un compus izomer deci cu aceeai mas molecular poate da un semnal fals pozitiv. Dar n analiza pe baza fragmentelor din spectrul MS, care sunt specifice fiecrei structuri n parte i nu sunt aceleai la izomeri diferii, se va detecta doar compusul de interes, fr interferene din partea Mai mult, intensitatea ionilor din spectrul de mas este proporional cu concentraia substanei n proba analizat, deci metoda poate fi aplicat i pentru cuantificare n loc de identificare calitativ.
Intens. x10 4 297.1 1.0

0.8

0.6 255.0 0.4 200.9 160.9 0.2 146.9 186.9 215.0 227.0 269.1 339.2 325.2 0.0 100 150 200 250 300 350 400 m/z 241.0 283.1 311.1

Spectrul MS/MS al ergosterolului.

Intens. 243.0

6000 174.9 257.0 160.9 215.0 189.0 203.0 4000 146.9 229.0 315.2 287.1

2000 271.0

301.2 379.2 341.1

327.2 0 100 150 200 250 300

355.2 369.2 350

395.1

400

m/z

32

Spectrul MS/MS al campesterolului n vederea cuantificrii celor patru steroli din extractele vegetale, s-au construit cromatogramele extrase pentru fiecare dintre ei, innd cont de intensitatea principalilor ioni din spectrul de mas. Ionii folosii pentru cuantificare sunt enumerai n tabelul urmtor. Ionii din spectrele MS ale sterolilor analizai pe baza crora s-a realizat cuantificarea Nr. Nume compus Ioni specifici pentru identificare Ion [M-H2O+H+] > Ioni din spectru 1 2 3 4 Ergosterol Stigmasterol Campesterol Beta-Sitosterol 379> 158.9; 184.9; 199; 213; 225; 239; 253; 295; 309; 323 395> 255; 297; 283; 311; 241; 201 383> 147; 149; 161; 175; 189; 203; 215; 229; 243; 257 397> 160.9; 174.9; 188.9; 202.9; 214.9; 243; 257; 287.1; 315.2

Pentru construirea curbelor de calibrare, cele patru standarde de steroli au fost dizolvate n cloroform (concentraie 1 mg/ml), dup care s-au fcut diluii succesive n acetonitril pentru obinerea soluiilor de calibrare. Concentraiile soluiilor de calibrare ale stigmasterolului i acurateea determinrii
Stigmasterol Nivel concentraie 1 2 3 4 5 Concentraie teoretic (ng/ml) 150.0 300.0 600.0 1200.0 2400.0 Concentraie regsita (ng/ml) 163.5 277.0 534.3 1213.0 2651.4 Acuratete (%) 109.0 92.3 89.1 101.1 110.5

33

6 7

4800.0 7200.0

4727.7 7781.6

98.5 108.1

Intens. x10 6 4 3 2 1 0 x10 6 1.5 1.0 0.5 0.0 x10 5 6 4 2 0 x10 6 1.5 1.0 0.5 0.0 x10 6 1.5 1.0 0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0

ST_CC___000011.D: TIC +All MSn

A
ST_CC___000011.D: EIC 158.9; 184.9; 199; 213; 225; 239; 253; 295; 309; 323 +MS2(379.3)

B
ST_CC___000011.D: EIC 255; 297; 283; 311; 241; 201 +MS2(395.3)

C
ST_CC___000011.D: EIC 147; 149; 161; 175; 189; 203; 215; 229; 243; 257 +MS2(383.3)

D
ST_CC___000011.D: EIC 160.9; 174.9; 188.9; 202.9; 214.9; 243; 257; 287.1; 315.2 +MS2(397.3)

E
3.5 4.0 4.5 Time [min]

Cromatogramele celor patru steroli analizai (A: semnale suprapuse, B: ergosterol, C: stigmasterol, D: campesterol, E: beta-sitosterol).

34

Curba de calibrare a stigmasterolului n tabelul urmtor sunt prezentai parametrii curbei de calibrare pentru fiecare standard utilizat. STANDARD Ergosterol Stigmasterol Campesterol Sitosterol ECUAIA CURBEI DE CALIBRARE y = 2006.6073 x + 14988.2649 y = 656.1371 x + 6552.3729 y = 2514.6804 x + 56452.9510 y = 2085.1047 x + 16268.9043 R2 0.9994 0.9957 0.9987 0.9937

Concentratiile de steroli regsite n cele 4 extracte de Glycyrrhiza glabra sunt prezentate n tabelul de mai jos. Concentratiile sterolilor n probele analizate (concentraiile sunt determinate n proba injectat n HPLC) Proba Compus Ergosterol Stigmasterol Campesterol Sitosterol 3117.8 7185.5 1484.0 6624.8 G1 G2 G3 G4

Concentratie (ng/ml) 2053.1 6346.0 1411.5 7408.6 2977.2 5784.1 2285.8 12448.7 1894.3 3241.9 1074.2 5562.0

Cromatogramele extrase pentru cei patru steroli determinai din probele analizate sunt prezentate n figurile 8.(16 19) dintre care o prezentm doar pe cea a probei G1

35

Intens. x10 6 1.0 0.5 0.0 x10 6 0.75 0.50 0.25 0.00 x10 5 4 2 0 x10 6 2 1

ST_CC___000013.D: EIC 158.9; 184.9; 199; 213; 225; 239; 253; 295; 309; 323 +MS2(379.3)

ST_CC___000013.D: EIC 255; 297; 283; 311; 241; 201 +MS2(395.3)

ST_CC___000013.D: EIC 147; 149; 161; 175; 189; 203; 215; 229; 243; 257 +MS2(383.3)

ST_CC___000013.D: EIC 160.9; 174.9; 188.9; 202.9; 214.9; 243; 257; 287.1; 315.2 +MS2(397.3)

0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 Time [min]

Cromatogramele extrase ale ergosterolului, stigmasterolului, campesterolului i sitosterolului din proba G1 n figurile 8.(20 23) este reprezentat grafic coninutul n fitosteroli n fiecare din probele analizate, iar n figura 8.24 comparativ pentru cele patru probe.

Ergos terol Sitos terol

Campes terol

Stigmas terol

36

Fig.8.20. Concentraia n fitosteroli n proba G1

Ergos terol

Sitos terol

Stigmas terol Campes terol

Fig.8. 21. Concentraia n fitosteroli n proba G2

Ergos terol

Sitos terol

Stigmas terol

Campes terol

Fig.8. 22. Concentraia n fitosteroli n proba G3

37

Ergos terol

Sitos terol Stigmas terol

Campes terol

Fig.8. 23. Concentraia n fitosteroli n proba G4 Din cei patru steroli analizai, n proba G1 din Bilekh se gsete o cantitate mai mare de stigmasterol, fapt mai rar ntlnit n lumea vegetal, n plante, de obicei, predomin betasitosterolul, aa cum este cazul probelor G2-G4.
14000 12000 10000 8000 6000 4000 2000 0 1 2 3 4 Ergosterol Stigm asterol Cam pesterol Sitosterol

Fig.8.24. Coninutul comparativ n fitosteroli din cele patru probe

38

Concluzii 1.In toate cele patru probe predomin beta-sitosterolul i stigmasterolul, n proba G3 din Alepo-Azaz gsindu-se cea mai mare cantitate de beta-sitosterol, 2. In proba G1 din Bilekh gasindu-se cea mai mare cantitate de stigmasterol, n care se se gsete i cea mai mare cantitate de ergosterol. 3. n proba G3 din Alepo-Azaz se gsete i cea mai mare cantitate de campestrol. 4. Proba G4 din Rass-Aenn are coninutul cel mai mic n steroli.

CAPITOLUL 9 ANALIZA COMPUILOR POLIFENOLICI, FITOESTROGENICI I STEROLICI DIN TINCTURA DE GLYCYRRHIZA GLABRA

Pentru a avea o valoarea a coninutului n compui polifenolici, fitoestrogenici i sterolici ct mai exact dintr-o form farmaceutic, aceti compui s-au determinat utiliznd aceleai metode ca i n capitolele 6-8 dintr-o soluie alcoolic de tip tinctur. Pentru analiza compuilor polifenolici din tinctur s-a folosit cromatografia de lichide de nalt performan cuplat cu spectrometria de mas (LC/MS), utiliznd aceleai 18 standarde: acid cafeic, acid clorogenic, acid p-cumaric, kenferol, apigenin, rutozid, cvercetol, cvercitrozid, izocvercitrozid, fisetin, hiperozid, miricetol, acid ferulic, acid gentisic, acid sinapic, patuletin, luteolin, acid caftaric. Pentru analiza compuilor fitoestrogenici din tinctur am folosit cromatografia de lichide de nalt performan cuplat cu spectrometria de mas (LC/MS), utiliznd ca standarde daidzin, genistin, ononin, daidzein, glicitein, genistein, cumestrol, formononetin. Pentru analiza sterolilor din tinctur s-a folosit cromatografia de lichide de nalt performan cuplat cu spectrometria de masa (LC/MS), iar ca standarde: beta-sitosterol, stigmasterol, campesterol si ergosterol. Analizele s-au efectuat utiliznd un sistem Agilent 1100 HPLC Series, echipat cu degazor G1322A, pomp cu gradient cuaternar G1311A, autosampler G1313A. Pentru separare s-a utilizat o coloan analitic cu faz invers Zorbax SB-C18 (100 mm x 3.0 mm i.d., 3.5 m pentru polifenoli i 100 mm x 3.0 mm i.d., 5 m pentru steroli i fitoestrogeni), prevzut cu o precoloan Zorbax SB-C18, meninute la temperatura de 48 0C (polifenoli), 50 0C (fitoestrogeni), 40 0C (steroli), . Pentru polifenoli detecia s-a realizat: - n ultraviolet la 330 nm primele 17 minute, apoi la 370 nm pn la 38 minute, utiliznd un detector DAD G1315 A.

39

- prin spectrometrie de mas, utiliznd un spectrometru de mas Agilent Ion Trap 1100 VL dotat cu o interfa ESI (electrospray) cu mod de ionizare negativ, gaz de uscare - azot, debit 12 L/min, temperatur 360 0C, nebulizator - azot, presiune 70 psi, potenial capilar - +3000 V. Pentru fitoestrogeni detecia s-a realizat: - prin spectrometrie de mas, utiliznd un spectrometru de mas Agilent Ion Trap 1100 VL dotat cu o interfa ESI n mod de ionizare negativ, SIM pentru agliconi i SRM pentru glicozide, gaz de uscare - azot, debit 12 L/min, temperatur 360 0C, nebulizator - azot, presiune 65 psi, potenial capilar - +4500 V. Pentru steroli detecia s-a realizat: - prin spectrometrie de mas, utiliznd un spectru de mas Agilent Ion Trap 1100 VL dotat cu o interfa APCI n mod de ionizare pozitiv, gaz de uscare - azot, debit 7 L/min, temperatur 250 0 C, nebulizator - azot, presiune 50 psi, potenial capilar - -4000 V. Datele cromatografice au fost procesate utiliznd programul Chem Station (vA09.03) i Data Analysis (v 5.3) de la Agilent, SUA.

1. Analiza compuilor polifenolici Coninutul (g/ml) n compui polifenolici al tincturii, proba nehidrolizat Compus Ac gentisic Ac cafeic Ac p-cumaric Ac ferulic Luteolina Identificat UV NU NU DA DA DA Confirmat MS DA DA DA DA DA Concentraie n tinctur (ug/ml) 1.270 1.560 0.620
40

Apigenina

DA

DA

1.708

Coninutul (g/ml) n compui polifenolici al tincturii, proba hidrolizat Compus Ac gentisic Ac cafeic Ac p-cumaric Ac ferulic Ac sinapic Luteolina Apigenina Identificat UV NU NU DA DA DA DA DA Confirmat MS DA DA DA DA DA DA DA Concentraie n tinctur (ug/ml) 13.859 25.912 9.534 0.966 2.361

Fig.9.1. Coninutul comparativ n compui polifenolici din tinctur, proba nehidrolizat/prob hidrolizat

41

Fig. 9.2. Cromatograma tincturii de Glycyrrhiza glabra nehidrolizate, UV

Fig. 9.3. Cromatograma tincturii de Glycyrrhiza glabra hidrolizate, UV Acidul gentisic i cafeic nu au putut fi determinai cantitativ n nici una din probe, cantitatea fiind sub limita de cuantificare. Luteolina, apigenina, acidul p-cumaric i ferulic sunt prezente att n proba nehidrolizat ct i n cea hidrolizat, sub form glicozidat i sub form de agliconi liberi, cantitile fiind mai mari dup hidroliz. n proba hidrolizat s-a gsit i cuantificat acid sinapic. 2. Analiza compuilor fitoestrogenici
42

Concentraiile de fitoestrogeni regsite n tinctur, proba nehidrolizat i hidrolizat sunt n tabelelul 9.3. Figurile 9.5-9.6 prezint cromatogramele tincturii de Glycyrrhiza glabra, proba nehidrolizat i hidrolizat. Tabel 9.3 Concentraiile (ng/ml) de fitoestrogeni regsite n hidrolizat Proba Compus Daidzin Genistin Ononin Daidzein Glicitein Genistein Cumestrol Formononetin 884.3 0.0 13744.6 2672.3 1237.7 513.2 948.8 12749.0 286.8 251.2 11620.5 2682.1 1907.6 531.3 211.1 10030.7 Tinctur proba nehidrolizat tinctur, proba nehidrolizat i

Tinctur proba hidrolizat

43

Fig.9.4. Concentraia n fitoestrogeni n tinctur (nehidrolizat i hidrolizat) Daizina, ononina, cumestrolul, formononetina se gsesc n cantiti mai mari n tinctur, proba nehidrolizat, iar daidzeina, gliciteina, genisteina se gsesc n cantiti mai mari n tinctur, proba hidrolizat. 3. Analiza sterolilor Concentratiile de steroli regsite n tinctura de Glycirrhiza glabra sunt prezentate n tabelul 9.5 i figura 9.7, iar cromatogramele extrase pentru cei patru steroli determinai sunt redat n figura 9.8.

Tabel 9.5 Concentratiile sterolilor n tinctur (concentraiile sunt determinate n proba injectat n HPLC) Proba Compus Ergosterol Tinctur Concentraie (ng/ml) 1856.3

44

Stigmasterol Campesterol Sitosterol

14847.5 4704.0 27549.2

E rgosterol

Stigm asterol Sitosterol

Cam esterol p

Fig. 9.7 Concentraia n fitosteroli n tinctur Tinctura analizat prezint toi cei patru steroli analizai: sitosterol, ergosterol, stigmasterol, campesterol. Figurile 9.(9 12) prezint comparativ coninutul n compuii analizai n tinctur.

45

Ac p -cum aric Ac ferulic Luteolina Ap igenina Daid zin G enistin Ononin Daid zein G licitein G enistein Cum estrol Form ononetin 0

1.27 1.56 0.62 1.708 884.3 0 13744.6 2672.3 1237.7 513.2 948.8 12749 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000

Fig. 9.9. Coninutul comparativ n componeni polifenolici i fitoestrogenici din tinctur, proba nehidrolizat
Ac p -cum aric Ac ferulic Luteolina Ap igenina Daid zin G enistin Ononin Daid zein G licitein G enistein Cum estrol Form ononetin 0 2000 4000 6000 8000 531.3 211.1 10030.7 10000 12000 14000 2682.1 1907.6 13.859 25.912 0.966 2.361 286.8 251.2 11620.5

Fig. 9.10. Coninutul comparativ n componeni polifenolici i fitoestrogenici din tinctur, proba hidrolizat

46

Sitosterol Campesterol Stigmasterol E rgosterol Formononetin Cumestrol Genistein Glicitein Daidzein Ononin Genistin Daidzin Apigenina Luteolina Ac ferulic Ac p-cumaric 0

27549.2 4704 14847.5 1856.3 12749 948.8 513.2 1237.7 2672.3 13744.6 0 884.3 1.708 0.62 1.56 1.27 5000 10000 15000 20000 25000 30000

Fig. 9.11. Coninutul comparativ n componeni polifenolici i fitoestrogenici din tinctur, proba nehidrolizat i compuii sterolici
Sitosterol Campesterol Stigmasterol E rgosterol Formononetin Cumestrol Genistein Glicitein Daidzein Ononin Genistin Daidzin Apigenina Luteolina Ac ferulic Ac p-cumaric 0 27549.2 4704 14847.5 1856.3 10030.7 211.1 531.3 1907.6 2682.1 13744.6 251.2 286.8 2.361 0.966 25.912 13.859 5000 10000 15000 20000 25000 30000

Fig. 9.12. Coninutul comparativ n componeni polifenolici i fitoestrogenici din tinctur, proba hidrolizat i compuii sterolici Concluzii n nici una din probe nu s-au gsit patuletin, kemferol, fisetin, miricetin, hiperozid, cvercitrozid, izocvercitrozid, rutozid. Acidul p-cumaric, ferulic, luteolina i apigenina s-au gsit i cuantificat n ambele probe (nehidrolizat idrolizat). Acidul sinapic s-a determinat doar n proba hidrolizat.
47

Daizina, ononina, cumestrolul, formononetina, daidzeina, gliciteina, genisteina sunt prezente n tinctur, att n proba nehidrolizat, ct i n cea hidrolizat. Genistina este absent n proba nehidrolizat. Dintre steroli, cea mai mare cantitate regsit n tinctur este de sitosterol, iar cea mai mic ergosterol. Comparnd componentele determinate n tinctur, se poate observa c, predomin sitosterolul, stigmasterolul, formononetina i ononina.

48

CONCLUZII GENERALE. CONTRIBUII ORIGINALE. PERSPECTIVE DE CERCETARE. CONCLUZII GENERALE n lucrare sunt prezentate rezultatele studiului ntreprins asupra a patru eantioane din specia de Glycyrrhiza glabra recoltate din diferite zone ale Siriei: Bilekh, Rakka, Alepo-Azaz, Rass-Aenn. Lucrarea este structurat n dou pri: Stadiul cunoaterii format din 3 capitole i Contribuii proprii format din 6 capitole. Partea general sistematizeaz informaiile din materialul bibliografic referitoare la Glycyrrhiza glabra: 1. Primul capitol intitulat Profilul botanic i chimic al speciei Glycyrrhiza glabra cuprinde ncadrarea sistematic a speciei, rspndirea speciilor pe glob, varietile comerciale de licviriie, caracterele organoleptice, condiiile de recoltare i condiionare, caracterele microscopice, date referitoare la compoziia chimic din Glycyrrhiza glabra, Glycyrrhiza uralensis, Glycyrrhiza inflata, Glycyrrhiza eurycarpa, Glycyrrhiza aspera, compui cu structur triterpenic, flavonoide, isoflavonoide, calcone, cumarine. 2. Capitolul doi cuprinde aspecte farmacocinetice, date referitoare la aciunile farmacologice ale Glycyrrhizei glabra: aciune antiinflamatoare, aciune antimicrobian i antiviral, aciune antiprotozoaric, aciune antioxidant, aciune asupra aparatului digestiv, aciune antitumoral, studii asupra sistemului nervos central, studii cardiovasculare, imunologice, studii renale, activiti citotoxice, studii respiratorii, efecte asupra diferenelor de jonciune ale canaleor, studii endocrinologice, farmacologia clinic, efecte gastrointestinale, efecte anticanceroase, efecte antioxidative, efecte antivirale i hepatoprotectoare, studii dermatologice, efecte endocrinologice, boli respiratorii. De asemenea, au fost prezentate informaii referitoare la analiza toxicologic: semnele clinice de intoxicaie, tratament, carcinogenez, mutagenez, scderea fertilitii. Tot n acest capitol am mai prezentat modificrile chimice ale acidului glicirizic n vederea obinerii de noi substane active 3. Dintre metodele de analiz a principiilor active din Glycyrrhiza glabra ne-am oprit la metodele cromatografice cromatografia pe strat subire, cromatografie de lichide de nalt performan, metodele spectrale UV, IR, RMN, metodele elctrochimice electroforez, polarografie. Partea de Contribuii originale este structurat n 6 capitole ce includ: caracterizarea macroscopic i microscopic a rdcinilor de Glycyrrhiza glabra recoltate din Siria, analiza
49

compuilor polifenolici, fitoestrogenilor, compuilor sterolici din Glycyrrhiza glabra i analiza compuilor polifenolici, fitoestrogenici i sterolici din tinctura de Glycyrrhiza glabra.

4. Capitolul 4 cuprinde caracterizarea din punct de vedere macroscopic i microscopic eantioane de Glycyrrhiza glabra recoltate din flora Siriei, din patru zone diferite: Bilekh, Rakka, Alepo-Azaz, Rass-Aenn. n cadrul analizei microscopice s-au urmrit drept caractere histoanatomice de difereniere n caracterizarea celor 4 eantioane: periderma (localizare; grosime; grad de exfoliere); fibrele sclerenchimatice (corticale; liberiene; lemnoase); razele medulare (principale; secundare); mduva. La toate eantioanele razele medulare (principale i secundare) fragmenteaz inelul iniial de liber secundar n trapeze foarte nguste. In urma analizei microscopice putem spune ca exist diferene n caracterele histoanatomice de tip periderm, fibre sclerenchimatice, raze medulare i mduv ale celor patru eantioane de Glycyrrhiza glabra, dar i asemnri dup cum urmeaz: periderma eantioanelor din Alepo-Azaz i Rass-Aenn este asemntoare cu cea a eantionului din Bilekh, fibrele sclerenchimatice ale eantionului Rakka sunt asemntoare, dar mai numeroase dect cele ale eantionului din Bilekh, fibrele sclerenchimatice liberiene ale eantionului Alepo-Azaz sunt asemntoare cu cele ale eantionului Rakka, iar cele ale lemnoase seamn cu eantionul Bilekh, razele medulare ale eantioanelor Alepo-Azaz i Rass-Aenn sunt asemntoare cu cele ale eantionului Rakka, mduva eantionului Rakka este asemntoare eantionului Bilekh. 5. n capitolul 5 am prezentat analiza cromatografic a extractelor alcoolice obinute din rdacinile i rizomii de Glycyrrhiza glabra de origine sirian prin cromatografie pe strat subire i cromatografie de lichide de nalt performan. Analizele cromatografice pe strat subire au fost efectuate fr a folosi substane de referin i au artat c cele dou vizualizri scot n eviden prezena compuilor flavonici, numrul acestora observai depinznd de lungimea de und UV. 6. Capitolul 6 include analiza compuilor polifenolici din Glycyrrhiza glabra utiliznd cromatografia de lichide de nalt performan cuplat cu spectrometria de mas (LC/MS). Acidul gentisic, p-cumaric, ferulic i sinapic sunt acizii polifenolcarboxilici cel mai des ntlnii n probele analizate, din care acidul p-cumaric, ferulic i sinapic pot fi cuantificai. Luteolina este observat n toate probele att nehidrolizate ct i hidrolizate. n nici una din probe nu s-au gsit patuletin, kemferol, fisetin, miricetin, hiperozid, cvercitrozid, izocvercitrozid, rutozid. Proba din Bilekh a avut cea mai mare cantitate de luteolin, cea din Rakka de acid p-cumaric i acid ferulic, cea din Alpo-Azaz de acid sinapic, iar cea din Rass-Aenn de apigenin. 7. Analiza fitoestrogenilor din Glycyrrhiza glabra s-a realizat prin cromatografia de lichide de nalt performan cuplat cu spectrometria de mas (LC/MS). Metoda se poate aplica pentru analiza cantitativ a opt compui cu activitate fito-estrogenic (apte izoflavone i un
50

lignan). Comparnd rezultatele din probele analizate, se observ c, extractele din Bilekh, AlpoAzaz i Rass-Aenn sunt mai bogate n compui fitoestrogenici. Ononina este cea mai abundent izoflavon glicozidat i se gsete n toate probele. Agliconul su, formononetina, este prezent n cantitile cele mai mari n toate extractele, cu excepia probei din Rakka ce conine cantiti mai mici din acest compus. Daidzina i agliconii genisteinei i cumestrolului lipsesc din extractul din Rakka. Diferenele calitative i cantitative dintre extractele testate pot fi explicate prin condiiile pedoclimatice diverse din ariile de recoltare ale produsului vegetal. 8. Pentru analiza sterolilor din extractele de Glycyrrhiza glabra s-a folosit cromatografia de lichide de nalt performan cuplat cu spectrometria de masa (LC/MS). In toate cele patru probe predomin beta-sitosterolul i stigmasterolul, n proba G3 din Alpo-Azaz gsindu-se cea mai mare cantitate de beta-sitosterol, iar n proba G1 din Bilekh gasindu-se cea mai mare cantitate de stigmasterol, n care se se gsete i cea mai mare cantitate de ergosterol. n proba G3 din Alpo-Azaz se gsete i cea mai mare cantitate de campestrol. Proba G4 din Ras-Aenn are coninutul cel mai mic n steroli. 9. Pentru a avea o valoarea a coninutului n compui polifenolici, fitoestrogenici i sterolici ct mai exact dintr-o form farmaceutic, aceti compui s-au determinat dintr-o soluie alcoolic de tip tinctur. Luteolina, apigenina, acidul p-cumaric i ferulic sunt prezente att n proba nehidrolizat ct i n cea hidrolizat, sub form glicozidat i sub form de agliconi liberi, cantitile fiind mai mari dup hidroliz. n proba hidrolizat s-a gsit i cuantificat acid sinapic. Daizina, ononina, cumestrolul, formononetina se gsesc n cantiti mai mari n tinctur, proba nehidrolizat, iar daidzeina, gliciteina, genisteina se gsesc n cantiti mai mari n tinctur, proba hidrolizat. Tinctura analizat prezint toi cei patru steroli analizai: sitosterol, ergosterol, stigmasterol, campesterol. CONTRIBUII ORIGINALE Rezultatele cercetrilor experimentale efectuate n cadrul tezei de doctorat includ o serie de contribuii cu caracter de originalitate: analiza speciei de Glycyrrhiza glabra din patru zone zone ale Siriei: Bilekh, Rakka, Alepo-Azaz, Rass-Aenn am pus la punct o metod cromatografic pe strat subtire i una cromatografic de lichide de nalt performan pentru extracte alcoolice am pus la punct o metod HPLC-MS pentru determinarea compuilor polifenolici din extractele de Glycyrrhiza glabra am pus la punct o metod HPLC-MS pentru determinarea compuilor fitoestrogenilor din extractele de Glycyrrhiza glabra am realizat o analiz calitativ i cantitativ a compuilor sterolici din cele patru sorturi luate n lucru de Glycyrrhiza glabra prin utilizarea unei metode HPLC-MS am realizat analiza compuilor polifenolici, fitoestrogenici i sterolici din tinctura de Glycyrrhiza glabra
51

PERSPECTIVE DE CERCETARE Datorit compoziiei complexe a speciei analizate, este posibil s se iniieze noi cercetri pentru identificarea i caracterizarea celorlalte grupe de compui cu aciune farmacologic. BIBLIOGRAFIE SELECTIVA 1. Snow J. Glycyrrhiza glabra Monograph. Protocol Journal of Botanical Medicine, 1,3: 9-14, 1996 2. BHMA British Herbal Compendium, Volume 1. British Herbal Medical Association, Bournemouth, Devon, 1992 3. Ciulei I., Grigorescu Em., Stnescu Ursula, Plante medicinale, Fitochimie, Fitoterapie, Ed. Medical Bucureti, 1998 4. Stnescu Ursula, Anca Miron, Monica Hnceanu, Clara Aprotosoaie, Bazele farmaceutice, farmacologice i chimice ale fitoterapiei, vol. I, II, Ed. Gr.T.Popa Iai, 2002 5. Bruneton J. Pharmacognosy, phytochemistry, medicinal plants. Paris, Lavoisier, 549 554, 1995 6. Williamson EM. 2003. Liquorice. In Potters Cyclopedia of Herbal Medicines. C W Daniels: Saffron Walden, UK, 269271. 7. Li JR, Wang YQ, Deng ZZ. 2005. Two new compounds from Glycyrrhiza glabra. J Asian Nat Prod Res 7: 677680.

8. Haraguchi H. 2001. Antioxidative plant constituents. In Bioactive Compounds from Natural Sources: Isolation, Characterization and Biological Properties, Tringali C (ed.). Taylor and Francis: New York, 348352. 9. Hiroaki Hayashi, Miyako Yasuma, Noboru Hiraoka, Yasumasa Ikeshiro, Hirobumi Yamamoto, Erdem Yesilada, Ekrem Sezik, Gisho Honda and Mamoru Tabata, Flavonoid variation in the leaves of Glycyrrhiza glabra, Phytochemistry, Volume 42, Issue 3, 1996, 701-704 10. Ivan A. Ross, Medicinal plants of the world: chemical constituents, traditional and modern medicinal uses, Humana Press, 2003
52

11. Zeng L., Fukai T., Nomura T., et al. Four new prenylated flavonoids, glyasperins A, B, C and D from the roots the Gycyrrhiza aspera // Heterocycles.- 1992.-Vol.34, N 3.-P.575588 12. Xiu-Ping ShenPei-Gen Xiao6tg, Chang-Xiao Liu, Research and application of Radix Glycyrrhizae Asian Journal of Pharmacodynamics and Pharmacokinetics,1608-22812007 13. Behrens, J. Can the utilisation and conservation of medicinal plants co-exist? European Journal of Herbal Medicine, 5, 2001 14. Farese RV Jr, Biglieri EG, Shackleton CH, Irony I, Gomez-Fontes R. Licorice-induced hypermineralocorticoidism. N Engl J Med., 325 (17), 223-1227, 1991 15. Marjan N. A., Hossein H., Review of pharmacological effects of Glycyrrhiza glabra sp. and its bioactive compounds, Phytother. Res. 22, 709-724, 2008 16. Kamei J, Saitoh A, Asano T et al. 2005. Pharmacokinetic and pharmacodynamic profiles of the antitussive principles of Glycyrrhizae radix (licorice), a main component of the Kampo preparation Bakumondo-to (Mai-men-dong-tang). Eur J Pharmacol 507: 163 168. 17. Hatano T, Fukuda T, Miyase TT, Noro T, Okuda T. 1991b. Phenolic constituents of licorice. III. Structures of glicoricone and licofuranone, and inhibitory effects of licorice constituents on monoamine oxidase. Chem Pharm Bull 39:12381243. 18. Hatano T, Fukuda T, Liu YZ, Noro T, Okuda T. 1991a. Phenolic constituents of licorice. IV. Correlation of phenolic constituents and licorice specimens from various sources, and inhibitory effects of licorice extracts on xanthine oxidase and monoamine oxidase. Yakugaku Zasshi 111: 311321. 19. Akamatsu H, Komura J, Asada Y, Niwa Y. 1991. Mechanism of anti-inflammatory action of glycyrrhizin: effects on neutrophil functions including reactive oxygen species generation. Planta Med 57: 119121. 20. Wang ZY, Nixon DW. 2001. Licorice and cancer. Nutr Cancer 39: 111. 21. Human skin fibroblasts. J Pharm Pharmacol 57: 16611666. 22. Perera P, Ringbom T, Huss U, Vasange M, Bohlin L. 2001. Search for natural products which affect cyclooxygenase-2. In Bioactive Compounds from Natural Sources: Isolation, Characterization and Biological Properties, Tringali C (ed.). Taylor and Francis: New York, 458, 462.

53

23. Tsukahara M, Nishino T, Furuhashi I, Inoue H, Sato T, Matsumoto H. 2005. Synthesis and inhibitory effect of novel glycyrrhetinic acid derivatives on IL-1b-induced prostaglandin E2 production in normal human dermal fibroblasts. Chem Pharm Bull 53: 11031110. 24. Hatano T, Shintani Y, Aga Y, Shiota S, Tsuchiya T, Yoshida T. 2000b. Phenolic constituents of licorice. VIII. Structures of glicophenone and glicoisoflavanone, and effects of licorice phenolics on methicillin-resistant Staphylococcus aureus.Chem Pharm Bull 48: 12861292. 25. Hatano T, Kusuda M, Inada K et al. 2005. Effects of tannins and related polyphenols on methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Phytochemistry 66: 20472055. 26. Fukai T, Marumo A, Kaitou K, Kanda T, Terada S, Nomura T. 2002b. Antimicrobial activity of licorice flavonoids against methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Fitoterapia 73:536539. 27. Fukai T, Satoh K, Nomura T, Sakagami T. 2003. Preliminary evaluation of antinephritis and radical scavenging activities of glabridin from Glycyrrhiza glabra. Fitoterapia 74: 624629. 28. Onkarappa R, Shobha KS, Chaya K. 2005. Efficacy of four medicinally important plant extracts (crude) against pathogenic bacteria. Asian J Microbiol Biotech Env Sci 7: 281 284. 29. He J, Chen L, Heber D, Shi W, Lu Q-Y. 2006. Antibacterial compounds from Glycyrrhiza uralensis. J Nat Prod 69: 121124. 30. Meghashri, Shubha Gopal, In Vitro Antifungal and Antibacterial Activities of Root Extract of Glycyrrhiza Glabra, Journal of Applied Sciences Research, 5(10): 1436-1439, 2009 31. Cohen JI. 2005. Licking latency with licorice. J Clin Invest 115:591593. 32. Jenett-Siems K, Mockenhaupt FP, Bienzle U, Gupta MP, Eich E. 1999. In vitro antiplasmodial activity of Central American medicinal plants. Trop Med Int Health 4: 611615. 33. Haraguchi H, Yoshida N, Ishikawa H, Tamura Y, Mizutani K, Kinoshita T. 2000. Protection of mitochondrial functions against oxidative stresses by isoflavans from Glycyrrhiza glabra. J Pharm Pharmacol 52: 219223. 34. Sheela ML, Ramakrishna MK, Salimath BP. 2006. Angiogenic and proliferative effects of the cytokine VEGF in Ehrlich ascites tumor cells is inhibited by Glycyrrhiza glabra. Int Immunopharmacol 6: 494498.
54

35. Jo E-H, Kim S-H, Ra JC et al. 2005. Chemopreventive properties of the ethanol extract of Chinese licorice (Glycyrrhiza uralensis) root: induction of apoptosis and G1 cell cycle arrest in MCF-7 human breast cancer cells. Cancer Lett 230:239247. 36. Salvi M, Fiore C, Armanini D, Toninello A. 2003. Glycyrrhetinic acid-induced permeability transition in rat liver mitochondria. Biochem Pharmacol 66: 23752379. 37. Hosseinzadeh H, Nassiri Asl M. 2003. Anticonvulsant, sedative and muscle relaxant effects of carbenoxolone in mice. BMCPharmacol 3: 3. 38. Mendes-Silva W, Assafim M, Ruta B, Monteiro RQ, Guimaraes JA, Zingali RB. 2003. Antithrombotic effect of glycyrrhizin, a plant-derived thrombin inhibitor. Thrombosis Res 112:9398. 39. Adamyan TsI, Gevorkyan ES, Minasyan SM, Oganesyan KR, Kirakosyan KA. 2005. Effect of licorice root on peripheral blood indexes upon vibration exposure. Bull Exp Biol Med 140: 197200 40. Somjen D, Katzburg S, Vaya J et al. 2004a. Estrogenic activity of glabridin and glabrene from licorice roots on human osteoblasts and prepubertal rat skeletal tissues. J Steroid Biochem Mol Biol 91: 241246. 41. Puodziuniene G, Janulis V, Milasius A, Budnikas V. 2005. Development of coughrelieving herbal teas. Medicina 41: 500505. 42. Goldie MP. 2005. Antioxidants in oral health care: making the connection. Int J Dent Hygiene 3: 9395. 43. Kasyanov, G.I.; Kvasenkov O.I. Pat. 2000117, Rusian Federation. Pub. 7.09.1993. Bull. No. 33-36 44. Bondarev, A.I.; Zarudyi, F.S.; Rusakov, I.A. Chim. Pharm Zh., 1995, 29, 33. 45. Bondarev, A.I.; Zarudyi, F.S.; Rusakov, I.A. Chim. Pharm Zh., 1995, 29, 33. 46. Fodorea C. S., Vlase L., Leucuta S. E., Tamas M., Phytochemical Study on Some Polyphenols of Geranium pyrenaicum, Chemistry of Natural Compounds, 2005, 41(4), 400-403 47. Suciu S., Vlase L., Fodorea C. S., Tamas M., Leucuta S. E., Analiza HPLC a compusilor polifenolici din specia indigena Eryngium campestre L., Revista de Medicina si Farmacie (Orcosi es Gyogyszereszeti Syemel), 2004, 50(2), 52-54
55

56