NADH i NAD+.

Structur i rol biologic

Nicotinamid adenin dinuecleotida(C21H27N7O14P2) , abreviat NAD +, este o coenzima ce se gaseste in toate celulele vii. Compusul este o dinucleotid, deoarece const din dou nucleotide unite prin intermediul gruparilor de fosfat, cu o nucleotida coninnd o baz adenina i alta nicotinamida. n metabolism, NAD + este implicat n reacii redox, transportand electronii de la o reacie la alta. Coenzima este, prin urmare, gsit n dou forme, n celule: NAD + este un agent de oxidare - se accept electroni din alte molecule i se reduce. Aceast reacie formeaza NADH, care pot fi apoi utilizat ca agent de reducere pentru a dona electroni. Aceste reactii de transfer de electroni sunt principala funcie a NAD +. Cu toate acestea, este de asemenea utilizat n alte procese celulare, cel mai notabil fiind un substrat de enzime care aduga sau elimina grupe chimice din proteine, n modificri posttranslationale. Datorit importanei acestor funcii, enzimele implicate in metabolismul NAD + sunt obiective pentru descoperirea de droguri. n organisme, NAD + poate fi sintetizat de la simple blocuri de -construit (de novo) din aminoacizii triptofan sau acid aspartic. ntr-un mod alternativ, mai multe componente complexe ale coenzimelor sunt preluate din alimente ca vitamina numit niacin. Compui similari sunt eliberati de reacii care descompun structura NAD +. Aceste componente preformate apoi trec printr-o cale de salvare care le recicleaz napoi n forma activ. O parte din NAD + este, de asemenea, convertit n fosfat -nicotinamid adenin dinucleotida (NADP +); chimia acestei coenzima inrudite este similar cu cea a NAD +, dar are roluri diferite n metabolismul.
Fig1. Reactia redox NAD-NADH

Proprieti fizice i chimice

Nicotinamid adenin nucleotida, la fel ca toate dinucleotidele, const din dou nucleotide unite printr-o pereche de punti de grupari fosfat. Nucleotidele constau din inele de riboz, unul cu adenina ataat la primul atom de carbon (pozitia numarul 1) i cellalt cu nicotinamid n aceast poziie. Jumtatea cu nicotinamid poate fi ataat n dou orientri n acest atom de carbon anomeric. Datorit acestor dou structuri posibile, compusul exist sub forma a dou diastereomeri. Este diastereomer -alta NAD +, care se gsete n organisme. Aceste nucleotide sunt unite printr-un pod de dou gruparilor de fosfat prin al 5-lea atom de carbon.

In metabolism, compusul accepta sau doneaza electroniin reactii redox.Astfel de reactii(rezumate in formula de mai jos) includ inlaturarea a doi atomi de hidrogen din reactant(R), sub forma unui ion hidrura(H-) si unui proton(H+). Protonul este eliberat in solutie, in timp ce reducatorul RH2 este oxidat si NAD+ redus la NADH prin transferul hidrurii la inelul de micotinamida. RH2 + NAD+ NADH + H+ + R Din perechea de electroni din hidrura, un electron este transferat la azotul incarcat pozitiv din inelul de nicotinamida al NAD+, iar al doilea atom de hidrogen transferat la atomul de carbon C4 opus azotului. Potentialul de mijloc al cuplului redox NAD+/NADH este de -0.32 volti, lucru ce face ca NADH sa fie un agent reducator puternic. Reactia este usor reversibila, cand NADH reduce alta molecula este re-oxidat la NAD+. Aceasta inseamna ca coenzima poate repeta periodic ciclul intre formele NAD+ si NADH fara a fi consumata. In aparenta, toate formele coenzimei sunt pulberi albe amorfe ce sunt higroscopice si solubile in apa. Solidele sunt stabile daca sunt depozitate in loc uscat si intunecos. Solutiile de NAD+ sunt incolore si stabile pentru o saptamana la 4C si pH neutru, dar se descompun rapid in acizi sau substante alcaline. Dupa descompunere, formeaza produsi ce sunt inhibitori de enzime. Atat NAD+ cat si NADH absorb puternic in ultraviolet datorita bazei adenina. De exemplu maximul absorbtiei NAD+ este la 259 nm cu un coeficient de extinctie de 16900M-1cm-1. NADH de asemenea absoarbe la lungimi de unda inalte, cu un al doilea maxm in absorbtie UV de 339nm, si coeficient de extinctie de 6220 M-1cm-1. Aceasta diferenta intre spectrele de absorbtie in UV dintre forma oxidata si redusa a coenzimelor la lungimi de unda mari face mai usor de masurat conversia intre cele doua forme in teste enzimatice- prin masurarea absorbtiei UV la 340nm, folosind un spectrofotometru.

Fig2.

Spectrul de emisie UV NAD si NADH

NAD+ si NADH de asemenea difera in ceea ce priveste flourescenta. NADH in solutie are un maxim de emisie de 460nm si un timp de flourescenta de 0.4nanosecunde, in timp ce forma oxidata a coenzimei nu este flourescenta. Proprietatile semnalului flourescent se schimba cand NADH se leaga de proteine, deci aceste schimbari pot fi folosite pentru a masura constantele de disociere, care sunt utile in studiul cineticii enzimatice. Aceste schimbari in flourescenta sunt de asemenea folosite pentru a masura diferente in starea redox a celulelor vii, prin mocroscopie flourescenta. In ficatul de sobolan, cantitatea totala de NAD+si NADH este de aproximativ 1mol per gram de masa umeda, de aproximativ 10 ori concentratia NADP+ in aceleasi celule. Concentratia actuala de NAD+ in citosolul celulei este mai greu de masurat, cu estimari recente in celule animale de 0.3nM, si aproximativ 1.0-2.0mM in drojdie. Totusi, mai mult de 80% din NADH mitocondrial este legat de proteine, deci concentratia in solutie este mult mai mica. Date pentru alte compartimente in celula sunt limitate, desi, in mitocondrie concentratia de NAD+ este similara cu cea din citosol. Acest NAD+este carat in mitocondrie cu ajutorul unei proteine membranare specifice de transport, intrucat coenzima nu poate difuza prin membrane. Echilibrul dintre formele oxidata si redusa ale nicotinamid-adeninnucleotidei se numeste raportul NAD+/NADH. Acest raport este un component important component a ceea ce se numeste starea redox a unei celule, o masuratoare ce reflecta atat activitatile metabolice si santatea celulei. Efectele raportului NAD+/NADH sunt complexe, controland activitatea catorva enzime cheie, inclusiv gligeraldehid 3-fosfat dehiidrogenaza si piruvat dehidrogenaza. In tesuturile sanatoase de mamifere, estimari ale raporului dintre NAD+ liber si NADH in citoplasma sunt de obicei in jur de 700; raportul este deci favorabil pentru reactiile de oxidare. Raportul de NAD+/NADH total este mult mai mic, variind intre 0.05 si 4. In contrast, raportul NADP+/NADPH este normal cam 0.005, deci NADPH este forma dominanta a aceste coenzime. Aceste raporturi diferite sunt cheia pentru rolurile diferite metabolice ale NADH si NADPH.

Biosinteza NAD + este sintetizat prin dou ci metabolice. Acesta este produs fie printr-o cale de novo din aminoacizi sau n ci de salvare prin reciclarea componentelor preformate, cum ar fi cu nicotinamid napoi la NAD

Producia de novo Cele mai multe organisme sintetizeaz NAD + din componente simple. Seturile specifice de reactii difer intre organisme, dar o caracteristic comun este generarea de acid quinolinic (QA) din un aminoacid - fie triptofan (TRP) n animale i unele bacterii, sau acid aspartic n unele bacterii i plante. Acidul quinolinic este convertit la acid nicotinic mononucleotide (NaMN) prin transfer unei fraciuni de fosforiboza. Molecula de adenilat este apoi transferat, pentru a forma acid nicotinic adenin dinucleotid (NaAD). n cele din urm, fraciunea de acid nicotinic n NaAD este amidat la o molecula de nicotinamid (Nam), formnd nicotinamid adenin dinucleotid. n continuare o parte din NAD + este convertit n NADP + de + NAD kinaza, care fosforileaza NAD+. n organisme, aceast enzim utilizeaz ATP ca surs de grupare fosfat, dei mai multe bacterii, cum ar fi Mycobacterium tuberculosis i o hyperthermophilic archaeon horikoshii Pyrococcus, utilizeaz polifosfat anorganic ca un donator de fosforil alternativ. Cai de salvare Pe langa asamblarea NAD+ de novo din simpli precursori de aminoacizi, celulele mai si salveaza compusi preformati continand nicotinamida. Desi alti percursori sunt cunoscuti, cei trei compusi naturali ce contin inel de nicotinamida si sunt folositi in aceste cai metabolice de salvare sunt acid nicotinic(Na), nicotinamida(Nam) si nicotinamid riboza(NR0. Precursorii sunt alimentati in calea biosintetica de NAD(P)+, aratata mai sus, prin reactii de adenilare si fosforibolizare. Acesti compusi pot si asimilati din dieta, unde amestecul de acid nicotinic si nicotinazmida se numeste vitamina B3 sau niacin. Totusi, acesti compusi sunt de asemenea produsi in celule, unde moleculele de nicotinamida sunt eliberate din NAD+ in reactii de transfer ADP-riboza. Intradevar, enzimele implicate in aceste cai de salvare par sa fie concentrate in nucleul celulelor, ceea ce poate compensa pentru nivelul mare de reactii ce consuma NAD+ in acest organit unicelular. Celulele pot de asemenea prelua NAD+ extracelular din imprejurimi. In ciuda presentei caii de novo, caile de salvare sunt esentiale in oameni; o lipsa de niacin in dieta poate cauza deficienta de vitamine numita pelagra. Functii Nicotinamid adenin dinucleotida are mai multe roluri eseniale
5

n metabolism. Aceasta acioneaz ca o coenzima in reactii redox, ca un donator de molecule ADP-riboz n reaciile ADP-ribosilare, ca un precursor al celei de-a doua molecule mesager ce inconjoara ADP-riboza, precum i acionnd ca un substrat pentru ADN-ului bacterian ligaza i un grup de enzime numite sirtuins care utilizeaz NAD + pentru a elimina grupurile acetil din proteine. Oxidoreductaza Rolul principal al NAD + n metabolism este transferul de electronii de la o molecul la alta. Reaciile de acest tip sunt catalizate de ctre un grup mare de enzime numite oxidoreducctaze. Numele corect pentru aceste enzime conine numele a celor dou substraturi: pentru exemplu NADHubiquinona oxidoreductaza catalizeaza oxidarea NADH de coenzima Q. Cu toate acestea, aceste enzime sunt, de asemenea, menionate ca dehidrogenaze sau reductaze, cu oxidoreductaza NADH-ubiquinona de obicei fiind numita NADH dehidrogenaz sau uneori, coenzima Q reductaz. Cnd sunt legate de o protein, NAD+ si Rossmann fold in part of the lactate obicei ntr-un motiv NADH au loc de Fig3. Rossmann fold in part of the lactate dehydrogenase of Cryptosporidium dehydrogenase of Cryptosporidium parvum, showingstructural cunoscut ca pliseul Rossman. NAD+ in red, beta parvum, showing NAD+ in red, beta sheets in yellow, Motivul este numit dup Michael Rossmann, and alpha helices in sheets in yellow, and alpha helices in care a fost primul om de tiin care a observat purple. modul n care aceast structur comun este n proteine nucleotid-legate. Aceast cuta conine trei sau mai multe beta toroane legate paralel prin doua elice alfa n ordinea beta-alfa-beta-alfa-beta. Aceasta formeaz o foaie beta flancata de un strat de elice alfa pe fiecare parte. Deoarece fiecare cuta Rossman leaga o nucleotida, domeniile de legatura pentru dinucleotid NAD + const din dou cute Rossmann, cu fiecare cuta legand o nucleotide de cofactor. Cu toate acestea, aceasta impaturire nu este universala printre enzimele NAD-dependente, deoarece o clasa de enzime bacteriene implicate in metabolismul aminoacizilor au fost recent descoperit, care leag coenzima, dar le lipseste acest acest motiv. Atunci cnd legat n site-ul activ al unei oxidoreductaze, inelul de nicotinamida al coenzimei este poziionat astfel nct s poat accepta o
6

hidrur de la alt substrat. Din moment ce carbonul C4 ce accept hidrogenul este prochiral, acest lucru poate fi exploatat n cinetica enzim pentru a oferi informaii despre mecanismul enzimei. Acest lucru se realizeaz prin amestecarea unei enzime cu un substrat care are atomi de deuteriu nlocuind hidrogenul, astfel ca enzima va reduce NAD + prin transferarea deuteriului, mai degrab dect hidrogen. n acest caz, o enzim poate produce una dintre cei doi stereoizomeri de NADH. n unele enzime hidrogenul este transferat de deasupra planului inelului nicotinamida, acestea sunt numite de oxidoreductaze de clasa A, n timp ce enzimele din clasa B transfera atomii de mai jos. n ciuda similitudinii n modul n care proteinele leag cele dou coenzime, enzimele arat aproape ntotdeauna un nivel ridicat despecificitate fie pentru NAD + sau NADP +. Aceast caracteristic reflect rolurile distincte metabolice al respectivelor coenzime, i este rezultatul unor seturi distincte de aminoacizi n cele dou tipuri de cavitati ce leaga conezime. . Pentru exemplu, pe site-ul activ al enzimelor NADP dependente, o legtur ionic se formeaz ntre un lant lateral de aminoacizi de i grupul acid fosfat al NADP +. In mod contrar, n enzimele NAD dependente ncarcatura in aceasta cavitate este inversat, prevenind NADP + sa se lege. Cu toate acestea, exist cteva excepii de la aceast regul general,i enzime, cum ar fi aldoza reductaza, glucozo-6-fosfat, pot folosi ambele coenzime in unele specii. Rol n metabolismul redox O descriere simplificat a metabolismului redox, artnd cum NAD + i NADH leaga ciclul acidului citric i fosforilarea oxidativ.Reaciile redox catalizate de oxidoreductaze sunt vitale n toate prile metabolismului, dar un domeniu special important n care aceste reacii apar este eliberarea de energie din nutrieni. Aici, compui redusi, cum ar fi glucoza sunt oxidati, astfel elibernd energie. Aceasta energie este transferata la NAD +prin reducere la NADH, ca parte a glicolizei i ciclului acidului citric. n eucariote electronii transportati de ctre NADH, care este produs n citoplasm de ctre Fig 4. A simplified outline of redox glicoliza sunt transferai n mitocondrii metabolism, showing how NAD+ and (pentru a reduce NAD + mitocondrial), NADH link the citric acid cycle and
oxidative phosphorylation.

prin suveici mitocondriale, cum ar fi transferul de malat-aspartat. NADH-ul mitocondrial este oxidat apoi la rndul su, de ctre lan de transport de electroni, care pompeaza protoni de peste o membran i genereaz ATP prin fosforilare oxidativ. Din moment ce ambele forme oxidat i redus de nicotinamid adenin dinucleotid sunt utilizate n aceste seturi legate de reacii, celula menine concentraii semnificative att de NAD + i NADH, cu un raport mare de NAD + / NADH care s permit acestei coenzime s acioneze att ca oxidant i un agent de reducere. n schimb, principala funcie a NADPH este ca un agent de reducere n anabolism, cu aceast coenzim fiind implicat n ci, cum ar fi sinteza si fotosinteza de acizi grai. Deoarece NADPH este necesar pentru a conduce reacii redox ca un puternic agent de reducere, NADP + / raportul NADPH este meninut foarte sczut. Dei este important si n catabolism, NADH-ul este, de asemenea, utilizat n reaciile anabolice, cum ar fi gluconeogenez. Aceastnevoie de NADH-ul si n anabolism reprezint o problem pentru procariotele ce cresc pe nutrienti care elibereaza doar o cantitate mic de energie. De exemplu, bacteriile nitrificatoare cum ar fi Nitrobacter oxideaz nitrii la nitrat, care elibereaza suficient energie pentru a pompa protonii i de a genera ATP, dar nu suficient pentru a produce NADH-ul direct. Dup cum NADH-ul este nc necesar pentru reacii anabolice, aceste bacterii utilizeaza un azotit oxidoreductaza pentru a produce o cantitate suficienta forta de protonimotrice pentru a a rula o parte a lanului de transport de electroni n sens invers. Roluri non-redox Coenzima NAD + este, de asemenea, consumat n reacii de transfer ADP-riboz. De exemplu, enzime numite ADP-riboziltransferaze aduga fraciunea de ADP-riboz a acestei molecule in proteine , ntr-o modificare posttranslationala numit ADP-ribozilare. NAD + poate fi, de asemenea, adugat pe ARN celular ca o modificare de baz. ADP -ribozilarea implic fie adugarea unei singure fraciuni de ADP-riboz, n mono-ADPribozilare, sau transferul de ADP-riboza la proteine din lanuri lungi ramificate, care se
8

numete poli (ADP-ribozil) are. Mono-ADP-ribozilarea a fost identificata pentru prima ca mecanism al unei grup de toxine bacteriene, n special toxina holerei, dar este de asemenea implicat n semnalizarea celulelor normal. Poli (ADP-ribosyl) area este efectuat de ctre poli (ADP-riboz)polimeraze. Structura poli (ADP-riboz) este implicata n reglarea mai multor evenimente celulare i este cea mai important n nucleul celulei, si n procese cum ar fi repararea ADN-ului i ntreinerea telomerilor. n plus fa pentru a aceste funcii n cadrul celulei, un grup de ADP-ribosiltransferaze extracelulare a fost recent descoperit, dar funciilor lor rmn obscure. O alt funcie a acestei coenzime n semnalizarea celulelor este ca un precursor al ADP-ribozei ciclice, care este produs de la NAD + prin ADPribozil cyclases, ca parte a unui sistem mesager secund. [66] Aceast molecul acioneaz n calciu semnalizarea prin eliberarea de calciu din magazine intracelulare/ Ea face acest lucru prin legarea i deschiderea unei clase de canale de calciu numite receptori de rianodina, care se afl n membranele organitelor organite, cum ar fi reticulul endoplasmic. NAD + este, de asemenea, consumat de ctre sirtuine, care sunt deacetilaze NAD-dependente, cum ar fi Sir2. Aceste enzime acioneaz ctre transferarea unui grup acetil din substrat lor de proteine la moleculele de ADP-riboz ale NAD +; aceasta scindeaz Coenzima i elibereaz nicotinamid i O-acetil-ADP-riboz . Sirtuina n principal, pare s fie implicat n reglementarea transcrierii prin deacetilarea histonelor i modificarea structurii nucleozomilor. Cu toate acestea, proteinele non-histone pot fi dezacetilate de sirtuina, de asemenea. Aceste activiti al sirtuinei sunt deosebit de interesante, din cauza importanei lor n reglementarea imbatranire Alte enzime NAD dependente includ ADN ligaze bacteriene, care unesc cele dou capete ale ADN-ului prin utilizarea NAD + ca un substrat donator de fraciuni de adenozin monofosfat (AMP), la fosfat 5 'al unui capat al ADN -ului Acest intermediar este apoi atacat de ctre grupul de 3 'hidroxil de la celalalt sfarsit al ADN-ului, formnd o legtur fosfodiester nou . Acest lucru contrasteaz cu ligazele ADN eucariote, care utilizeaz ATP la forma ADN-AMP intermediar Farmacologie si utilizari medicale Enzimele care fac si folosesc NAD+ si NADH sunt importante atat in farmacologia curenta cat si in cercetarea pentru tratamente viitoare pentru boli. Fabricarea de medicamente exploateaza NAD+ in trei feluri: ca o tinta directa pentru medicamente, prim creearea inhibitorilor sau activatorilor de
9

enzime bazati pe structura ei ce modifica activitatea enzimelor NADdependente, si prin incercarea de a inhiba biosinteza NAD+. Coenzima NAD+ nu este folosita ca tratament pentru nicio boala. Totusi, este potential utilizabila in terapia bolilor neurodegenerativem cum ar fi Alzheimer si Parkinson. Dovezile folosirii NAD+ in neurodegenerare este mixta. Studiile pe soareci sunt promitatoare, in timp ce un experiment clinic controlat placebo a intarziat sa dea rezultate. NAD+ este de asemenea o tinta directa a medicamentelor cu izoniazida, care este folosit in tratamentul tuberculozei, infectie cauzata de Mycobacterium tuberculosis. Studii au fost tinute asupra ciclistilor profesionisti si cei ce alearga pe distante lungi. Atletii au aratat: Cantitate mai mare oxigen absorbita, timp mai mic de reactie, minunata acuitate mentala, 7% mai multa energie musculara, cresterea nivelului de dioxid de carbon expirat, performanta cognitiva imbunatatita, rezistenta fizica marita.

10