Analisis Quimica de Los Alimentos

UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN ANTONIO ABAD DEL CUSCO FACULTAD DE INGENIERIA AGROINDUSTRIAL
CURSO: ANALISIS DE LOS ALIMENTOS
ANALISIS DE HUMEDAD Todos los alimentos, cualquiera que sea el mtodo de industrializacin o que hayan sido sometidos, contienen agua en mayor o menor proporcin. En los tejidos animales o vegetales, puede decirse que existen en dos formas generales: agua libre y agua ligada. El agua libre o absorbida, que es la forma predominante, se libera con gran facilidad y es estimada en la mayor parte de los mtodos usados para el clculo del contenido de agua. El agua ligada se halla combinada o absorbida. Se encuentra en los alimentos como agua de cristalizacin (en los hidratos) o ligada a las protenas o a las molculas de sacridos y absorbida sobre la superficie de las partculas coloidales. Estas formas requieren para su eliminacin en forma de vapor un calentamiento de distinta intensidad. Parte de la misma permanece ligada al alimento incluso a temperaturas que la carbonizan. Para la determinacin del contenido de agua en alimento, existen algunos mtodos que se nombran a continuacin: 1. Mtodo por desecacin en estufa hasta peso constante: Implica la deshidratacin de la muestra hasta peso constante a temperaturas y presiones adecuadas al tipo de muestra, por cuanto existen patrones en las que se fijan: tiempo, temperatura a condiciones particulares. 2. Mtodo por desecacin en estufa al vaco: en este mtodo la determinacin de humedad se vera afectada por el hecho de que el alimento, en su composicin, tendra sustancias que puedan desdoblarse por efecto del calor o por productos voltiles, esto a consecuencias de las elevadas temperaturas. Por ello se utilizan presiones entre 25-100 mg Hg y temperaturas menores de 75C, con un tiempo de secado entre 3 y 6 horas. 3. Mtodo de destilacin con solvente inmiscible: es el mtodo de destilacin ms frecuentemente utilizado (mtodo de Bidwell-Sterling), en la cual se mide el volumen de agua liberada por la muestra durante su destilacin continua, junto con un solvente inmiscible (tolueno), esto proporciona directamente la cantidad de agua en la muestra. 4. Mtodo de desecacin con la balanza de humedad: basado en la determinacin de porcentaje de humedad mediante el uso de una balanza que tiene acoplada una fuente de ayos infrarrojos, que proporciona el calor necesario para desecar la muestra. Requiere de la realizacin de curva de calibracin, para cada producto en particular que permiten el anlisis rpido, de ello se obtiene el tiempo y temperatura ms adecuada para la muestra. Existen un gran nmero de procedimientos y aparatos de secado. La deshidratacin puede efectuarse a presin atmosfrica o bajo vaco y que la transferencia de calor se haga por conveccin, conduccin o radiacin. Los ms empleados son los que utilizan aire caliente y concretamente el secado por atomizacin. Otros criterios permiten diferenciar los diversos procedimientos y aparatos: 1) La forma y el estado de dispersin del producto slido, pelcula liquida ms o menos viscosa (secador o tambor), aerosol (secador o atomizacin); un producto finamente disperso se seca ms rpido. 2) El movimiento del producto (secador rotatorio) o el de fluido caliente o ambos; este movimiento presenta un secado ms rpido y ms uniforme. 3) La operacin discontinua o continua de secado. 4) El reciclado parcial del aire que mejora la eficacia calorfica, asegura un secado ms uniforme y facilita el mantenimiento de las condiciones constantes de secado. 5) El modo de calentamiento del aire: directo; por mezcla de gases de combustin (con peligro de contaminacin por combustible) o indirecto. PRINCIPALES TIPOS DE PROCEDIMIENTOS Y APARATOS DE SECADO. I. Horno de aire caliente: un aporte rpido de aire y una agitacin de la capa de producto, aseguran un secado uniforme en los diversos niveles de espesor. II. Secadores de plato: el alimento se coloca en capa delgada sobre los platos. Se caliente por estantes calientes o ms frecuentemente por aire caliente circulando entre los platos. El aire se recicla sobre todo al final del secado. Se obtiene un secado ms uniforme si se logra invertir, de vez en cuando, el sentido de circulacin del aire. III. Tneles de secado: el producto se coloca sobre platos o bandejas, estos platos estn dispuestos sobre carros que recorren un tnel donde circula aire caliente. La operacin de secado es continua y puede hacerse totalmente automtica. Por lo general, un tnel de secado
Elaborado por: Ing. David J. Ramos Huallpartupa
comprende dos secciones; una donde circula el aire en el mismo sentido que el producto y otra segunda donde circula en contracorriente. IV. Secador rotativo: en estos aparatos, el producto avanza mientras se esta agitando en el interior de un cilindro rotativo, ligeramente inclinado. El aporte de calor queda asegurado por una circulacin de aire caliente (con velocidad baja para no arrastrar partculas de productos) o por conduccin a partir de las paredes del aparato. El secado es rpido y uniforme. V. Secador por atomizacin: estos aparatos estn muy generalizados para la deshidratacin de diversos productos lquidos: leches concentradas, huevos, extractos de levaduras, zumos de frutas, t, sangre y concentrados proteicos, etc. Para ello se atomizan (se transforma en aerosol o nieblas) una solucin o una suspensin ms o menos viscosas de productos, las pequeas gotitas lquidas as formadas se arrastran y deshidratan en una corriente de aire dando un polvo seco antes de caer sobre las paredes inferiores del aparato. VI. Secadores a tambor: se coloca una ligera capa de alimento lquido en la superficie exterior de un tambor metlico hueco, calentando el interior por vapor. El tambor gira ms o menos rpido y la capa lquida se seca, despus de de rotacin. La transferencia de calor se hacen por conduccin a travs de la superficie metlica del tambor. La operacin es continua y el secado es rpido (menos de minuto y medio). La eleccin de un procedimiento de secado depende de las caractersticas fsicas (slido de tamao ms o menos grande, lquido ms o menos viscosos) y qumicas (sensibilidad al calor o a la oxidacin por el aire) del producto; tambin depende de la mejora de la calidad que puede aportar un procedimiento ms costoso (tal como secado bajo vaco); as mismo hay que considerar la diversidad y cantidad de producto a secar. METODOLOGA CALENTAMIENTO DIRECTO Se sec en estufa cpsulas vacas. Se colocaron en desecador y se pasaron a temperatura ambiente. Se pes dos a tres gramos de muestra, perfectamente homogenizada. Se coloc la muestra en horno. Se sacaron y se colocaron en desecador hasta que alcanzaron temperaturas ambiente. Se procedi a pesar la muestra cada 1 horas segn contenido de humedad. Se llev a peso constante colocando nuevamente en estufa durante 1 hora. Luego se llevo al desecador donde se dej enfriar y se pes. Se repiti esta operacin hasta que dos pesadas consecutivas varen solo en la cuarta cifra decimal. POR DESTILACIN CON SOLVENTES MISCIBLES Se lav el refrigerante y el tubo receptor perfectamente con mezcla sulfocronica, se enjuag muy bien con agua destilada. Se lav con alcohol y se sec en la estufa para evitar que quede algn residuo de agua adherida a la superficie interna del aparato. Se procedi a pesar suficientemente muestra para obtener de 2-5 ml de agua. Se coloc en el erlenmeyer. Se cubri con tolueno (aproximadamente 75 cc). Se conect el aparato. Se llen el tubo receptor con tolueno agregando a travs del condensador. Se destil lentamente (aproximadamente 2 gotas/seg.), Hasta que o pase ms agua. Luego se lav el condensador, agregndole tolueno por la parte de arriba y se continuaba la destilacin hasta asegurarse que no salga agua. Se repiti el lavado del condensador. Permanecieron algunas gotas de agua adheridas a una varilla de cobre, donde se lav al mismo tiempo el condensador con tolueno. El proceso dur aproximadamente una hora. Tubo receptor a temperatura ambiente.
Quedaron algunas gotas adheridas y se bajaron con tolueno. Se procedi a leer el volumen de agua. Bibliografa F.L. HART y H.D. FISHER, Anlisis Moderno de los Alimentos. De la edicin en lengua espaola, Editorial Acribia. Zaragoza (Espaa). 1991. HAROLD, EGAN y Otros, Anlisis Qumico de Alimentos de Pearson. Primera Edicin. Compaa Editorial Continental, S.A de CV. Mxico. 1987. H.G. MULLER y GITOBIN, Nutricin y Ciencia de los Alimentos, Editorial Acribia, Zaragoza (Espaa) ANLISIS DE AGUA Las condiciones hidrolgicas relacionadas con la lluvia, con las corrientes de agua y con la infiltracin, son factores de mucha importancia en la formacin de depsitos de aguas de abastecimiento y en la purificacin de estas aguas. Las variaciones de estos factores afectan no solo la cantidad de agua aprovechable, sino tambin su calidad. Para la comodidad, las fuentes aprovechables de agua en el ciclo hidrolgico pueden clasificarse como sigue: 1. Lluvia y nieve 2. Agua de superficie 3. Corrientes de agua 4. Lagunas y lagos naturales 5. Embalses 6. Aguas subterrneas 7. Manantiales 8. Pozos poco profundos y galeras de infiltracin 9. Pozos profundos Lluvia y nieve. El vapor de agua condensado en nubes o precipitado en forma de lluvia o nieve es prcticamente puro en altitudes muy grandes. A medida que caen, la lluvia y la nieve absorben oxgeno, dioxido de carbono y otros gases del aire, as como polvo, humos y vapores. La lluvia o la nieve recogen tambin las bacterias y las esporas vegetales que se encuentran en el aire. En general, la cantidad de estas impurezas es pequea; mayor al principio de la precipitacin y menor al final. la lluvia y la nieve que caen en el campo son ms limpias que las que caen en las ciudades; y despus de una sequa o en una regin rida contiene ms partculas de polvo que durante la temporada de lluvias o en un lugar sujeto a muchas precipitaciones. Generalmente estas impurezas tienen poco significado sanitario. El agua de lluvia es suave, saturada de oxgeno, pero inspida y un poco corrosiva. Con excepcin de muy pocos lugares, como las Bermudas, y algunas casas aisladas en otras reas, el agua de lluvia no se emplea para el consumo domstico. En los sitios donde se usa, su calidad esencial depende de la limpieza de la zona de recoleccin y de los sistemas de almacenamiento y distribucin. Debido a su suavidad y corrosividad no debe entrar en Contacto con tuberas o recipientes de plomo. Agua de superficie. Cuando la lluvia cae sobre la tierra, una parte corre al ocano, a las corrientes de agua, lagunas o lagos. La nieve se evapora hasta cierto punto, pero en climas templados permanece casi en su totalidad para fundirse y correr en la primavera, contribuyendo con eso a las inundaciones en esta poca del ao. En las regiones montaosas, la nieve, en las partes ms elevadas, se funde lentamente con el tiempo caluroso y de esa manera mantiene las corrientes de agua y afecta en el verano la calidad y cantidad. La calidad del agua tomada de una fuente de superficie depende del carcter y rea de la cuenca, de su geologa y topografa, de la extensin y naturaleza del desarrollo realizado por el hombre, de la poca del ao y de las condiciones del tiempo. La calidad del agua de las corrientes es generalmente ms variable y menos satisfactoria que la de las lagunas y lagos. El agua de regiones calcreas es ms dura pero menos corrosiva, que el agua de regiones granticas. Las fuentes de superficie en zonas muy pobladas estn afectadas por las aguas de alcantarilla y desperdicios industriales. Corrientes de agua. La formacin de las corrientes de agua se debe a los escurrimientos producidos por precipitaciones directas, que han corrido sobre la superficie de la tierra, al rebosamiento de lagos y
pantanos y a la filtracin del agua a travs de la tierra de las regiones montaosas hacia los valles. La proporcin del flujo de estas fuentes vara de una temporada a otra y segn la geologa y el desarrollo de la cuenca. Durante los periodos de grandes precipitaciones, de nieve fundida y de inundaciones, el caudal de las corrientes consta principalmente de agua de superficie. En esas temporadas el agua puede ser lodosa, relativamente suave y con un alto contenido de bacterias. Durante grandes inundaciones, la dilucin puede ser tal que el agua es menos lodosa y su contenido de bacterias menor que en aguas de inundaciones de magnitud moderada. En tiempos de sequa, el agua de las corrientes contiene una proporcin relativamente grande de agua de subsuelo, por lo cual es mas dura que en otras temporadas. Las corrientes sujetas a polucin por el hombre o sus actividades pueden volverse sumamente defectuosas debido a la sobrecarga con materia orgnica putrescible. Finalmente, entre el caudal mximo y el mnimo puede haber importantes variaciones en calidad. La calidad y clase de los aluviones de superficie llevados en las corrientes dependen del carcter del material de la superficie, de la inclinacin de los declives del valle, del rea y tipo de los bosques, pantanos y de la cantidad y clase de cultivo. Los suelos arcillosos producen corrientes lodosas y las tierras pantanosas dan notable color al agua. Las pendientes con fuerte declive provocan corrientes rpidas cuyo resultado es la erosin y un cambio en la calidad del agua por el arrastre de limo. Por otra parte, los bosques retardan el escurrimiento y tienden a igualar el caudal de la corriente. Las otras condiciones siendo iguales, los escurrimientos que provienen de arcas con rboles de hojas caedizas son ms subidos de color que los que provienen de reas con rboles siempre verdes. Los escurrimientos que atraviesan tierras de cultivo llevan limo y partculas de fertilizantes, mientras que los escurrimientos de pastizales llevan estircol y otros desechos orgnicos. En el otoo, mucha vegetacin muerta es llevada por el viento o los escurrimientos en las corrientes de agua. Por lo tanto, es evidente que aun las corrientes de cuencas relativamente poco pobladas llevan considerable polucin natural. Los minerales solubles de las corrientes proceden no slo de los escurrimientos que absorben estas substancias en la superficie suelo suelo, sino tambin de la disolucin en el agua subterrnea de estos minerales durante la percolacin a travs de la tierra. Estos minerales solubles aumentan la alcalinidad y la dureza del agua segn las proporciones relativas del agua subterrnea y del agua de superficie y el carcter de la formacin geolgica. Desde el punto de vista sanitario, la polucin por el hombre o como resultado de sus actividades es la ms significativa. En regiones poco pobladas, la polucin humana es relativamente indirecta, incidental o accidental. En regiones pobladas, la polucin por las aguas de cloaca y los desechos industriales es directa. Esta polucin puede traer grmenes de enfermedades contenidos en las excreciones humanas o substancias txicas de los desechos de las fbricas. El grado de deterioro de una corriente es aproximadamente proporcional a la densidad de la poblacin en la zona de la corriente de agua. Como resultado final, la polucin natural y la provocada por el hombre producen el color, turbiedad, sabores y olores, dureza, bacterias y otros microorganismos en el agua. Corregir estos defectos es la funcin del tratamiento de agua antes de que las aguas de superficie se empleen para usos domsticos o industriales Hay causas naturales que tambin tienden a purificar las corrientes contaminadas. Estas causas son fsicas, qumicas y fisiolgicas. La sedimentacion quita el limo y otras materias en suspensin; la oxidacin modifica los componentes orgnicos; la luz del sol aclara el color y las fuerzas biolgicas destruyen los organismos patgenos. El grado de autopurificacin obtenida depende de numerosos factores, entre ellos el tiempo, la temperatura y el carcter de la policion y aireacin. Una capa de hielo retarda esos procesos naturales, puesto que aumentan con la aireacion superficial, y est probado que los grmenes patgenos, como los de la fiebre tifoidea, viven ms tiempo en agua fra que en agua caliente. La descomposicin de los depsitos de materias orgnicas en el fondo de las corrientes tiene tambin un efecto adverso sobre el color, el sabor y el contenido de hierro y dixido de carbono. Las condiciones climatolgicas, geogrficas e hidrogrficas se encuentran entre los factores que afectan los caracteres fsicos, qumicos y biolgicos de las corrientes de agua. Las temperaturas varan segn la estacin del ao y la situacin geogrfica. En las grandes corrientes, las temperaturas
fluctan menos rpidamente que en las corrientes chicas. El agua de las corrientes en regiones calcreas es dura; en las regiones silceas es suave. Las diferentes partes de un pas tienen corrientes de distintos caracteres principales. Las corrientes de Nueva Inglaterra, por ejemplo, son de aguas suaves claras y coloradas; las aguas del Medio Oeste Son duras, turbias y bajas de color. La flora y fauna microscpicas estn fomentadas o retardadas por las variaciones de las condiciones fsicas y qumicas. Las inundaciones, que aumentan temporalmente la turbiedad y las materias en suspensin, lavan los depsitos del lecho de las corrientes y se llevan las materias orgnicas que, al descomponerse, alteraran la calidad del agua. Las corrientes rpidas, poco profundas, pueden pasar por la autopurificacin ms rpidamente que las corrientes lentas y profundas, aunque en las ltimas la sedimentacin puede reducir con mas efectividad las materias en suspensin y con ellas las bacterias. Lagunas y lagos naturales. El agua que llega a las lagunas y a los lagos es la de las corrientes tributarias. En estos sitios de agua relativamente quieta, los notables cambios en la calidad se deben a las fuerzas de autopurificacin. El grado y el carcter de estos cambios dependen del volumen del cuerpo de agua en relacin con su rea de drenaje, tiene su forma y de las corrientes de aire. Un largo almacenamiento permite la sedimentacion de las materias en suspensin, la aclaracion del color y la remocin de bacterias. Por lo tanto, las agitas almacenadas son generalmente de calidad mucho ms uniforme que las aguas tomadas directamente de las corrientes. La accin de las olas produce aguas turbias en la orilla, y en algunos casos el crecimiento de organismos microscopicos puede ser considerable en estas aguas. En los Grandes Lagos, la mayor parte de la polucin ocurre a lo largo de las orillas en la proximidad de los grandes centros de poblacin. Las corrientes inducidas por los vientos, las avenidas de las corrientes tributarias y los tmpanos de hielo pueden llevar la contaminacin a muchas millas en estos lagos. Generalmente, en los lagos grandes, la dilucion y la autopurificacin aseguran la buena calidad del agua tiene se encuentra lejos de las orillas, a menos que se produzca una contaminacin localizada y pasajera debida al movimiento de los barcos. En lagos ms chicos, la autopurificacin es generalmente menos completa que en los grandes. Adems, la accin de corto circuito, que implica un flujo continuo de agua con menos del abasto normal, es un factor mayor. En pequeas lagunas se produce, en particular el crecimiento de algas. Y en los estados norteos, las lagunas y los pequeos lagos sufren unos trastornos de primavera y de otoo que revuelven temporalmente los sedimentos del fondo. Embalses. Los embalses, formados con diques a traves de los valles cortados por corrientes, estn sujetos a las mismas condiciones que las lagunas y los lagos naturales. Cuando se construyeron los primeros depsitos. Se arrancaba toda la vegetacin del fondo y se quitaba la capa superficial de la tierra para evitar los efectos de la descomposicin de las materias orgnicas. En los mtodos ms recientes se omite la remocion de la tierra y se confa en la eleccin del punto de admisin y en el tratamiento para asegurar la calidad satisfactoria del agua. Normalmente, la mejor calidad de agua se encontrar a una profundidad mediana. El agua de la parte superior es propensa a desarrollar algas. El agua del fondo puede tener un alto contenido de dixido de carbono, hierro, manganeso y. a veces. sulfuro de hidrogeno. En lagos y embalses profundos, el agua del fondo permanece fra durante todo el ao porque se produce una zona permanente de relativa estancacin a profundidades abajo de seis metros aproximadamente. Agua subterrnea. Parte de la lluvia que cae sobre la superficie de la tierra se filtra en el suelo y se torna en agua subterranea. Durante su paso a travs del suelo, el agua entra en contacto con muchas sustancias, tanto orgnicas como inorgnicas. Algunas de estas substancias son fcilmente solubles en agua. Otras, como las que causan la alcalinidad y la dureza, son solubles en agua que contiene dixido de carbono absorbido del aire o de las materias orgnicas en descomposicin de la tierra. La descomposicin de materias orgnicas quita tambin el oxgeno disuelto del agua que se filtra a travs de ellas. Esta agua, exenta de oxgeno y con un alto contenido de dixido de carbono, disuelve el hierro y el manganeso del suelo. Las aguas que contienen hierro y manganeso favorecen el desarrollo de bacterias del gnero Crenothrix y otros organismos similares en los depsitos de agua subterrnea
almacenada. A veces, en las aguas subterrneas se produce sulfuro de hidrogeno cuando hay ausencia de oxigeno, descomposicin de materias orgnicas o reduccin de sulfatos. Aunque las bacterias y otros organismos vivientes en la superficie de la tierra pueden ser recogidos primero por la lluvia que cae sobre ellos, la filtracin en el subsuelo da por resultado la separacin de estos organismos. Hay una excepcin cuando cerca de la superficie las rocas estn agrietadas, como ocurre con la piedra caliza. En este caso, la contaminacin de superficie debe ser llevada a grandes distancias sin variacin importante. Las condiciones sanitarias en la proximidad de las fuentes de agua subterrnea son importantes, en particular cuando la polucin en el subsuelo proviene de letrinas pozos absorbentes y albaales con fugas. Especialmente seria es la polucion que se presenta al nivel o debajo del manto fretico. Las fuentes de polucin situadas en la superficie de la tierra, aunque no deben ser ignoradas, son menos importantes que las fuentes subterrnea. Manantiales. El agua subterrnea que corre en la parte superior de un estrato impermeable puede salir a la superficie en forma de manantial. Esto sucede generalmente cuando el estrato impermeable aflora debajo de una extensin elevada de material permeable. A veces, los manantiales brotan entre las grietas de las rocas. Las aguas de manantiales provenientes de estratos someros se vern ms probablemente afectadas por la polucin superficial que las aguas profundas. En general, sus caracteres de calidad reflejan la formacin geolgica del lugar con que surgen. Normalmente, la cantidad de agua que se obtiene en manantiales es limitada y, por lo tanto, este modo de abastecimiento se aprovecha solamente para pe pequeas poblaciones.. Pozos someros y galeras de filtracin. Los pozos someros son los que se forman en depsitos superficiales de material permeable encima de un estrato impermeable. De un modo arbitrario, los pozos someros con ms de 15 m de profundidad se califican de profundos. Hay pozos someros de gran dimetro abiertos por excavacin y los hay de pequeo dimetro abiertos por perforaciones y utilizados mediante tubera. Generalmente se extrae el agua por aspiracin. El limitado descenso de nivel aprovechable reduce el tamao del rea de donde proviene el agua subterrnea. Por lo tanto, la calidad del agua proveniente de un suelo de profundidad se determinara principalmente por el carcter de la zona vecina de captacion. Pozos profundos. Los pozos profundos se excavan o se perforan, segn los estratos de la regin. Frecuentemente atraviesan capas impermeables antes de alcanzar el estrato acufero deseado. Al igual que en los pozos someros, las aguas provenientes de pozos profundos tienen los caracteres determinados por la naturaleza de la superficie tributaria de captacion y las formaciones geolgicas atravesadas por el agua. Generalmente, el terreno de captacin para pozos profundos es bastante extenso. Esto significa que el agua subterrnea recorrer largas distancias y tendr amplio contacto con las formaciones rocosas y con la tierra. Las aguas de pozos profundos a ser, por lo tanto, ms intensamente mineralizadas que las aguas provenientes de pozos de poca profundidad. METODOLOGA MAS COMN Determinacin de pH. Se encendi el pH metro, y se dej calentar durante 30 min. Se calibr con solucin buffer. Luego se lavo el electrodo con agua destilada. Se midi 100 ml de la muestra (agua de pozo) y se coloco en un beacker de 250 ml Se introdujo el electrodo dentro del beacker y se verific el pH. Determinacin de dureza. Se midi 50 ml de muestra y colocadas en una fiola de 125 ml (por duplicado). Se aadi 3 gotas de anaranjado de metilo. Se adiciono HCl 1N, hasta que la muestra tom un color rosado plido. Se neutraliz con NaOH 0.1N hasta color anaranjado.
Se agreg 1 ml de solucin tampn NH4Cl / NH4OH (pH7) (Buffer pH10). Se titul con solucin 0.02 M de EDTA.
Determinacin de alcalinidad parcial y total. Parcial: Se midi 50 ml de muestra y se transfiri a una fiola de 125 ml Se aadieron 3 gotas de fenolflatena (la solucin se mantuvo incolora, esto indica ausencia de OH - y CO3=). Total: A la muestra anterior se le agrego 2 gotas de anaranjado de metilo. Se titul la solucin con HCl (0.1N) hasta una coloracin amarillo anaranjado. Determinacin de cloruros. (Mtodo de Mohr). Se midi 100 ml de muestra y se agregaron en una fiola de 125 ml Se aadieron posteriormente 3 gotas de cromato de potasio. Desde una bureta con solucin de AgNO3 0.1 N, se dej caer gota a gota, hasta una coloracin marrn. Determinacin de Residuos fijos. Se pasaron los crisoles vacos. Se agreg 25 ml de muestra en los crisoles. Se llev a calentamiento hasta evaporacin. Luego se llev a la estufa a 105oC durante 10 minutos. Se retiraron de la estufa y se colocaron en el desecador para enfriar a temperatura ambiente. Se pesaron en la balanza analtica. Bibliografa F.L. HART y H.D. FISHER, Anlisis Moderno de los Alimentos. De la edicin en lengua espaola, Editorial Acribia. Zaragoza (Espaa). 1991. HAROLD, EGAN y Otros, Anlisis Qumico de Alimentos de Pearson. Primera Edicin. Compaa Editorial Continental, S.A de CV. Mxico. 1987. H.G. MULLER y GITOBIN, Nutricin y Ciencia de los Alimentos, Editorial Acribia, Zaragoza (Espaa). ANLISIS DE GRASAS No hay una distincin clara entre los trminos grasa y aceite. La primera, generalmente, significa el estado slido mientras que, corrientemente, aceite, se aplica a la forma lquida. La vaguedad de esta terminologa es evidente por el hecho de que una grasa en una zona de temperatura climtica, puede ser un aceite a temperaturas tropicales. Los trminos estn empleados indistintamente sin una referencia especfica al estado fsico. Las grasas naturales se caracterizan por: a) ser insolubles en agua y solubles en la mayor parte de los disolventes orgnicos. b) poseer un carcter oleaginoso c) tener pesos especficos menores que el del agua, y d) ser fcilmente saponificables con lcalis. Adems de los triglicridos, las grasas naturales contienen ciertos constituyentes no glicridos que, mayormente, son insaponificables. Esta porcin insaponificable consta de esteroles, hidrocarburos, tocoferoles y otras materias que no se determinan o identifican. El contenido de insaponificables de la mayor parte de las grasas naturales oscila normalmente entre el 0,5 y el 2,6 %, aunque hay unas pocas excepciones particularmente en el caso de los aceites de animales marinos. La mayora de las grasas naturales que provienen de fuentes animales o vegetales son triglicridos respectivamente. Los triglicridos que constituyen la fraccin mayor de todas las grasas y aceites naturales se clasifican en simples y mixtos, dependiendo de su composicin. Un triglicrido simple es aquel que tiene idnticos los tres radicales de cido graso. Los triglicridos que no tienen iguales los radiales de cido graso se denominan triglicridos mixtos. Las grasas naturales han sido definidas como mezclas de
triglicridos mixtos, puesto que, en la Naturaleza la mayor parte de los triglicridos se presentan como del tipo mixto Clasificacin de los Lpidos A.- Lpidos simples. Esteres de cidos grasos y alcoholes. 1. Grasas y aceites. Esteres de glicerol con cidos monocarboxlicos. 2. Ceras. Esteres de alcoholes monohidroxilados y cidos grasos. B.- Lpidos compuestos. Lpidos simples conjugados con molculas no lpidas. 1. Fosfolpidos. Esteres que contienen cido fosfrico en lugar de un cido graso, combinado con una base de nitrgeno. 2. Glucolpidos. Compuesto de carbohidratos, cidos grasos y esfingosinol, llamados tambin cerebrsidos. 3. Lipoprotenas. Compuestos de lpidos y protenas. C.- Compuestos asociados. 1.- cidos grasos. 2.- Alcoholes 3.- Hidrocarburos. 4.- Vitaminas liposolubles. Tambin se pueden clasificar como saponificables o insaponificables (esteroles, hidrocarburos y prostaglandinas). La ms importante aplicacin de las grasas es en la alimentacin. Una cantidad considerable de grasa comestible se consume en su forma original, como en carnes, nueces, cereales, productos lcteos y de aves de corral aunque tambin se consume mucho en forma de mantequilla, margarina, grasas de frer, aceites comestibles y de cocina. Las grasas no comestibles abarcan tambin una amplia industria, siendo empleadas en la fabricacin de jabones, aceites secantes para la industria de pinturas y barnices, aceites industriales para la industria textil, aceites de corte y recientes avances en los que las grasas se emplean como materia prima para la sntesis de una amplia variedad de nuevos productos. Las grasas usualmente ocupan alrededor del 99% de la fraccin de lpidos de un alimento y la comodidad relativa de determinar el contenido total de lpidos ms que el verdadero contenido de grasa ha resultado en que el trmino grasa y lpido se hacen virtualmente indistinguible. Los alimentos pueden contener cualquiera o todos los compuestos lipdicos, pero los de mayor importancia son los triacilglicridos y los Fosfolpidos. Los triacilglicridos lquidos a temperatura ambiente son referidos como aceites, tales como: aceite do soya, de oliva y son generalmente de origen vegetal. Los triacilglicridos slidos a temperatura ambiente son tratados como grasas. El trmino grasa es aplicable a todos los triacilglicridos as sean normalmente slidos o lquidos a temperatura ambiente. Acidos Grasos Saturados: Este tipo de cidos grasos, no presenta dobles enlaces en sus molculas. Varan de C4 a C20, siendo los ms comunes el cido palmtico (C16) y el cido esterico(C18). El punto de fusin de un cido saturado es directamente proporcional al tamao de su cadena carbonada, por lo que los de C4 a C8 son lquidos a 20-25C, mientras que los de C10 en adelante son slidos a la misma temperatura. Su solubilidad disminuye a medida que aumenta la longitud de la cadena y el peso molecular de la molcula, como ocurre con el cido butrico (C4) que es completamente miscible en agua, mientras que de C12 en adelante son inmiscibles. Acidos Grasos lnsaturados: Tienen una mayor reactividad qumica que los saturados debido a la presencia de dobles enlaces en su molcula. Predominan sobre los saturados, especialmente en los aceites vegetales y en las grasas de animales marinos que viven a bajas temperaturas. Su punto de fusin disminuye a medida que aumenta el grado de insaturacin y su sensibilidad a las reacciones do oxidacin es mayor cuanto ms insaturado sea el cido. Debido a la presencia de dobles enlaces, los cidos grasos insaturados presentan dos tipos de isomerismo: a.- Geomtrico: cis y trans. b.- Posicional: causado por la diferencia en la localizacin de los dobles enlaces en la cadena carbonada. Esteres: Son compuestos que derivan de la sustitucin del hidrgeno perteneciente a la funcin alcohlica de un alcohol primario o secundario al reaccionar con un grupo cido.
Esteroles: Esta clase de sustancias contiene un grupo qumico comn llamado perhidrociclopentanofenantreno, adems de una cadena hidrocarbonada y un grupo alcohol, y se localizan en lpidos de origen vegetal y animal. Glucsidos: Estn formados por dos fracciones muy diferentes: un azcar reductor y un nocarbohidrato que se conoce con el nombre de aqlucn, cuya unin se efecta a travs del carbono anomrico del azcar. Los glucsidos se denominan O-glucsidos, cuando existe un enlace entre el azcar reductor y el hidroxilo de un alcohol o del fenol del aglucn. Los N-glucsidos, se forman por la unin del azcar con un grupo amino. Los S-glucsidos se denominan tambin tioglucsidos por la presencia de azufre en su molcula. Colesterol: Es un esterol cuya cadena carbonada, en los esteroles, donde se encuentra el grupo(R) est sustituida por un tomo de hidrgeno(H). Es el principal esterol en grasas animales y aceites de origen marino y puede encontrarse (pero en muy bajas proporciones), en algunos aceites y grasas vegetales. Aunque es estructuralmente muy diferente de cidos grasos y triglicridos, aparece en alimentos como en yema de huevos, ostras, hgados y riones, los cuales son muy ricos en este compuesto. Es tambin sintetizado por el cuerpo humano en cantidades que varan con la ingerida en la dieta, con la finalidad de suplir la cantidad necesaria para la formacin de cidos biliares, los cuales son requeridos para la digestin y absorcin de grasas del intestino. El colesterol es tambin un compuesto esencial de la membrana celular y es encontrado en grandes cantidades en el cerebro y tejidos nerviosos. Adems de ello, el cuerpo puede sintetizar tambin vitamina D a partir del colesterol y es necesario para formar las hormonas esteroidales, incluyendo la hormona del sexo. Con relacin al problema del colesterol en la dieta, est basado en el hecho de que altas concentraciones de ste en la sangre puede ser causa de enfermedades como ateroesclerosis, la cual es una forma de enfermedad cardiovascular en el que los depsitos de grasa o desarrollo de placas se llevan a cabo sobre las paredes de las arterias (Schneeman B., 1986). Aunque el consumo de colesterol en la dieta no puede estar relacionado directamente al nivel de colesterol en la sangre, puede ser uno de los factores que contribuyen a su elevacin. Fitoesteroles: Son esteroles de origen vegetal, cuya cadena carbonada donde se encuentra el grupo H en el colesterol, est sustituida por un grupo etilo. El tipo y cantidad de Fitoesteroles que contienen los aceites varan con a fuente vegetal de que se trate Mtodos Analticos para extraer aceites o grasa. Las sustancias que contienen grasa juegan un papel importante en el comercio mundial, puesto que la grasa es un constituyente esencial de la dieta de los hombres y de los animales y porque tiene muchas otras aplicaciones industriales y domsticas. El contenido de grasa de muchos artculos de primera necesidad es la base del comercio de estos artculos. As, el precio del aceite de las semillas de algodn, depende en parte del contenido de aceite de las mismas. El comercio de aceite de soja, durante la Segunda Guerra Mundial, se llevaba de la misma forma. El valor comercial de la leche y de la nata es determinado por su contenido de grasas naturales. Muchos alimentos, tanto humanos como animales, se fabrican para satisfacer algn contenido especificado de grasa. De estos pocos ejemplos, se deduce que la determinacin de la grasa en productos de origen animal y vegetal es una funcin de cierta importancia. No hay un solo mtodo aplicable a la determinacin de grasa en todos los distintos tipos de productos existentes, aunque los mtodos llamados de extraccin estn ms cerca de un mtodo general que la mayor parte de los restantes. A semejanza de otros muchos procedimientos analticos, los mtodos de determinacin de grasa son empricos en cierto grado, dependiendo del mtodo empleado as como de la procedencia del material. Las variaciones en los mtodos de anlisis producen resultados variables. Esta diversidad de resultados puede atribuirse a distintos factores, pero probablemente, los dos ms importantes son: a) el mtodo empleado en la preparacin de la muestra y b) la extensin o el grado en que la grasa, a grasa oxidada y ciertos componentes no grasos, sean solubles en cl disolvente elegido. La exactitud de esos mtodos depende grandemente de la solubilidad de los lpidos en el solvente usado. La determinacin de la grasa implica tres operaciones distintas, independientemente del origen del material o del mtodo. Estos pasos, son: 1. Tratamiento preliminar de la muestra, incluyendo el secado previo, la molienda, la digestin o cualquier combinacin de stos.
2. Separacin de la grasa por extraccin con un disolvente apropiado o por separacin con centrfuga. 3. Valoracin de la grasa por un mtodo u otro. Presecado: La finalidad del secado previo es reducir el contenido de humedad de la muestra. Se realiza por diversas razones: 1. Las muestras presecadas pueden ser molidas o, de otra manera, subdivididas con mayor facilidad que cuando estn en su estado original. Este estado de subdivisin es importante en relacin con su extraccin perfecta. 2. El agua, al menos en cantidades excesivas, impide una extraccin completa y eficiente si se emplea ter etlico o ter de petrleo como agente extractor. 3. El presecado ayuda a separar la grasa de las clulas de los tejidos de la carne y de sus productos. 4. Las emulsiones pueden romperse, por lo menos parcialmente, de forma que la grasa es ms accesible y ms fcil de extraer. Una precaucin importante que debe observarse en el secado previo, es evitar la oxidacin de la grasa, puesto que reduce la solubilidad en el ter de petrleo. La oxidacin puede evitarse, o cuando menos minimizarse, secando la muestra a temperaturas por debajo de los 100C y a presiones menores de 760 mm de mercurio. Si no es posible realizar el secado con ayuda del vaco, es aconsejable emplear un tipo de estufa de tiro forzado para eliminar el agua lo ms rpidamente posible para, de esta forma, exponer la muestra a la menor cantidad posible de calor. Cuando se trata de sustancias especialmente sensibles al calor, pueden secarse sobre un eficaz agente desecante. No obstante, este procedimiento es demasiado lento para ser prctico en usos rutinarios. En tales casos, es preferible seleccionar un mtodo que no requiera secado previo. Pulverizacin o molienda: La finalidad de la molienda es reducir el tamao de partcula de la muestra de forma que el disolvente pueda penetrar en la misma fcil y completamente. Hay una amplia variedad de molinos de laboratorio apropiados, pero ningn tipo de molino solo es satisfactorio para triturar todos los tipos de muestras. Las determinaciones de lpidos en % a nivel de laboratorio pueden hacerse mediante la extraccin con solventes y extraccin hmeda sin solventes. Estas extracciones se diferencian de las anteriores en que no se hacen a gran escala porque no son con fines comerciales sino simplemente para determinar el % de grasa en un alimento. Entre los mtodos utilizados se tienen: extraccin con solventes, extraccin hmeda sin solventes e instrumentales. Mtodos de extraccin con solventes La validez de los anlisis de grasas de un alimento depende del propio muestreo y de la preservacin de la muestra antes del anlisis. Un buen muestreo, una buena preservacin y buen procedimiento de anlisis son los factores crticos en un anlisis de alimentos. La preparacin de la muestra para un anlisis de lpidos depende del tipo de alimento y tipo y naturaleza de los lpidos en el alimento. El mtodo de extraccin para lpidos de un alimento lquido es diferente al de uno slido. Para analizar adecuadamente los lpidos en alimentos, es necesario un conocimiento previo de la estructura, la qumica y la incidencia de las principales clases de lpidos y sus constituyentes. Por lo tanto no hay un mtodo estndar simple para la extraccin de todas las clases de lpidos en diferentes alimentos. Para mejores resultados, la preparacin de las muestras podra hacerse bajo una atmsfera inerte de nitrgeno a baja temperatura para minimizar las reacciones qumicas tales como la oxidacin de los lpidos. Los lpidos no pueden ser extrados efectivamente con ter etlico de alimentos hmedos porque el solvente no podra penetrar fcilmente los tejidos alimenticios hmedos. El ter, el cual es higroscpico se saturara con el agua y se hara ineficiente para la extraccin de lpidos. La muestra seca a temperaturas elevadas es indeseable porque algunos lpidos formaran enlaces con protenas y carbohidratos y los lpidos enlazados no son fcilmente extraibles con solventes orgnicos. El horno a vaco a baja temperatura o la liofilizacin incrementa el rea de superficie de la muestra pava una mejor extraccin de los lpidos. Este procedimiento hace la muestra ms fcil de triturar para una mejor extraccin, rompe las emulsiones agua-grasa y hace que la grasa se disuelva fcilmente en el solvente orgnico y ayuda a liberarla de los tejidos de los alimentos.
La eficiencia en la extraccin de lpidos de alimentos secos depende del tamao de las partculas; por lo tanto, es muy importante una buena trituracin. El mtodo clsico de determinar grasa en semillas aceitosas envuelve la extraccin de a semilla triturada con un solvente seleccionado despus de repetir la pulverizacin a baja temperatura para minimizar la oxidacin de lpidos. Para una mejor extraccin, la muestra y el solvente son mezclados en un triturador a alta velocidad. Aquellos alimentos tales como: pan, harina y productos animales que tienen una porcin de lpidos enlazada a protenas y carbohidratos son extrados ineficientemente con solventes no polares. Tales alimentos deben ser preparados por una hidrlisis cida para la extraccin de lpidos. Esta hidrlisis rompe tanto los enlaces inicos como covalentes de los lpidos con protenas y carbohidratos y as pueden ser extrados fcilmente. La muestra es predigerida con reflujo por una hora con HCL 3N, luego se aade etanol y hexametafosfato slido para facilitar la separacin de lpido de otros componentes antes de que los alimentos sean extrados con el solvente. Un solvente ideal para la extraccin de grasa debe reunir las siguientes caractersticas: a) podra tener un alto poder disolvente para lpidos y uno bajo para protenas, aminocidos y carbohidratos. b) deben ser evaporables fcilmente y no dejar residuos. c) tener un bajo punto de ebullicin. d) no ser inflamables y txicos tanto lquidos como en estado de vapor. e) debe penetrar fcilmente las partculas alimenticias. f) no debe ser caro e higroscpico. Es difcil un solvente que rena todas estas caractersticas. el ter etlico y el de petrleo son los solventes ms comnmente usados. El primero tiene un punto de ebullicin de 34,6C y es mejor solvente para grasas que el segundo, es generalmente comparado con otros solventes, tiene un alto grado de peligro explosivo, es higroscpico y forma perxidos. El ter de Petrleo es la fraccin del petrleo de ms bajo punto de ebullicin y est compuesto principalmente de pentano y hexano tiene un punto de ebullicin de 35-36C y es ms hidrofbico que el ter etlico. Es selectivo para lpidos ms hidrofbicos, es menos higroscpico y menos inflamable que el ter etlico. Frecuentemente se usa una combinacin de dos o tres solventes. Los solventes deberan ser purificados y libres de perxidos. Los mtodos de extraccin de solventes pueden ser continuos, semicontinuos y discontinuos. Mtodo de extraccin continua: Para una extraccin continua con solvente, la muestra triturada y seca es colocada en un dedal poroso de cermica, la cual es tapada con fibra de vidrio y colocada en un portadedal de vidrio que es luego insertado en el aparato de extraccin Goldfish. Despus de ello, se coloca el vaso de precipitado especial con el solvente.(ter etlico) y se enrosca, teniendo cuidado de subir con precaucin la plancha de calentamiento para que haga contacto con el vaso de precipitado que ha sido previamente tarado. Se hace circular el agua por el refrigerante el cual no se observa a simple vista y se enciende el aparato. Se observa el solvente se evapora y al condensarse baja a travs del dedal poroso extrayendo la grasa de la muestra. Este proceso tiene una duracin aproximadamente de 4 horas. Al terminar, se sustituye el dedal con el portadedal por un recipiente donde se recoger el solvente evaporado al calentar nuevamente el vaso de precipitado que contiene el solvente con la grasa. Despus de esto, el vaso de precipitado se coloca en una estufa aproximadamente a 70C para evaporar el resto del solvente, luego se enfra y se pesa nuevamente para determinar la grasa. El vaso de precipitado no debe tocarse directamente con las manos. Mtodo de extraccin semicontinua (soxhlet): Para una extraccin semicontinua, el solvente se coloca en el baln de calentamiento y la muestra seca y triturada (2g) en su portadedal, se ubica en la parte superior del baln, en el sitio indicado para la extraccin. Si la muestra contiene ms de 10% de humedad, se debe secar hasta peso constante a 95 - 100C bajo presin 100 mm de Hg alrededor de 5 horas(AOAC, mtodo 934.01). Se adopta el condensador de serpentn (reflujo), y se hace circular el agua y el baln previamente tarado, se calienta con una plancha de calentamiento. Cuando el solvente se evapora, se condensa y se cae en el sitio donde est la muestra haciendo contacto con ella por un periodo que oscila entre 5 y 10 minutos. Cuando el sitio donde se encuentra la muestra se llena de solvente, ocurre el sifn y todo el solvente con el extracto baja al baln y as se repite varias veces este procedimiento hasta que la muestra se le haya extrado toda la grasa. Este mtodo requiere ms tiempo que el de extraccin continua. El solvente condensado debe caer a una velocidad
de 5 o 6 gotas por segundo (aproximadamente 4 horas) o por 16 horas a una velocidad de 2 3 gotas/segundo. Para obtener el peso de la grasa se debe proceder como en el caso anterior. Mtodo de extraccin discontinua con solvente (Mojonnier): Este mtodo no requiere una remocin previa de la humedad de la muestra. El principio est basado en que la muestra es extrada por tres veces consecutivas con una mezcla de ter etlico y ter de petrleo y la grasa extrada es secada hasta peso constante y expresada como % do grasa por peso de muestra. Este mtodo es ampliamente aplicado en la industria lctea, para la que se dise originalmente. No es aplicado directamente a los productos animales y vegetales. Lo ms singular del aparato Mojonnier es el recipiente de extraccin que puede servir para una gran variedad de productos. Proporciona un medio relativamente sencillo y rpido de separar la grasa de una sustancia determinada. El recipiente est constituido de forma que la disolucin formada por la grasa y el disolvente se puedo extraer de la muestra que se esta analizando. Este mtodo es especialmente conveniente cuando no se requiere un contacto prolongado entre el disolvente y la muestra. Es muy til para las extracciones lquidolquido y ha sido empleado con xito con diversos materiales grasos, diferentes a los productos lcteos corrientes. Mtodos de extraccin hmeda sin solventes. Mtodo de Babcock: Se desarroll para determinar el contenido de manteca de La leche y de la nata, pero el procedimiento primitivo ya se ha modificado y actualmente puede aplicarse a la mayor parte de los restantes productos lcteos, incluyendo helados, quesos, mantequilla y suero. Este mtodo y sus modificaciones emplean un matraz o frasco especial, con un cuello estrecho graduado, el cual est calibrado de tal forma que puede leerse directamente el porcentaje de grasa, con tal que se empleen las cantidades de muestras especificadas. Los matraces y las divisiones graduadas deben calibrarse antes de su empleo, siguiendo los mtodos comnmente empleados para la calibracin volumtrica del material de vidrio. El procedimiento Babcock comprende el calentamiento de la muestra, generalmente en el mismo matraz, con un reactivo para digerir la materia no grasa y dejar sta en libertad. La separacin de la grasa se completa por centrifugacin, despus de que aquella se le hace sobrenadar en una disolucin de mayor densidad que la grasa. Se mide despus la grasa volumtricamente en la parte graduada del frasco. Los cuellos de los matraces de Babcock tienen que ser necesariamente estrechos para permitir mediciones precisas de la grasa, lo que conduce a dificultades en la introduccin en el frasco de muestras que no sean lquidas o que fluyan libremente. Tales productos, que incluyen quesos y carnes, se digieren, por lo tanto, en un vaso y despus se pasan al matraz para la separacin y medicin de la grasa. No determina Fosfolpidos en productos lcteos y no es aplicable a productos que contienen chocolate o azcar aadida. Mtodo Gerber(para grasa de leche): El principio de este mtodo es similar al Babcock pero usa cido sulfrico y alcohol amlico. El cido sulfrico digiere protenas y carbohidratos, libera la grasa y la mantiene en estado lquido por generacin de calor. Este mtodo es ms simple y rpido que el Babcock y tiene aplicaciones ms amplias para una variedad de productos lcteos. El alcohol isoamlico generalmente previene la carbonizacin del azcar encontrado con el mtodo regular de Babcock. Esta prueba es ms popular en Europa que en Amrica. Mtodo Detergente: El principio de este mtodo es que el detergente reacciona con la protena para formar un complejo protena - detergente, rompiendo la emulsin y liberando la grasa. El mtodo fue originalmente desarrollado para determinar grasa en leche, debido a las propiedades corrosivas del H2S04 en el mtodo Babcock. Este mtodo fue modificado ms tarde para usarlo con otros productos. La leche es pipeteada en un recipiente Babcock. Un detergente aninico (fosfato dioetil de sodio) es aadido para dispersar la capa de protena que estabiliza la grasa para liberarla. Entonces se aade un detergente no inico hidroflico, polioxietileno, monolaurato sorbitan para separar la grasa de otros componentes alimenticios. El porcentaje de grasa se mide volumtricamente y se expresa como % de grasa. Mtodo del ndice de refraccin: El ndice de refraccin es caracterstico para cada tipo de grasa y los valores varan con el grado y tipo de insaturacin, oxidacin, tratamiento al calor, temperatura de
anlisis y el contenido de grasa. La grasa es extrada con un solvente (bromonaftaleno) y el ndice de refraccin del solvente es comparado con el de la solucin grasosa y la grasa. El ndice de refraccin disminuye cuando aumenta la temperatura y cuando aumenta la longitud de onda del rayo luminoso. El ndice de refraccin del disolvente debe diferir considerablemente del aceite con el que vaya a emplearse. Es preferible que tenga un alto punto de ebullicin para evitar evaporacin. Comparacin de Mtodos. La extraccin por el mtodo de Soxhlet es el ms comnmente usado para la determinacin de grasa cruda en alimentos. Sin embargo, este mtodo requiere una muestra seca para la extraccin con ter etlico anhidro. Si las muestras son hmedas o alimentos lquidos, el mtodo de Mojonnier es el ms conveniente para determinar el contenido de grasa. Los mtodos instrumentales corno: IR y RMN son muy simples, reproducibles y rpidos, pero son solamente disponibles para la determinacin de grasa de alimentos especficos. La aplicacin de los mtodos instrumentales en estos casos generalmente requiere una curva estndar entre la seal del anlisis del instrumento y el contenido de grasa obtenido por un mtodo de extraccin con solvente de un estndar. Un mtodo instrumental rpido puede ser usado como un control de calidad para la determinacin de grasa de un alimento especifico. Caractersticas o Constantes Fsicas. Indice de refraccin: El ndice de refraccin de un aceite es definido como la relacin de la velocidad de la luz en el aire (tcnicamente, un vaco) a la velocidad de la luz en al aceite. Las muestras se miden con un refractmetro a 200C o 250C para aceites y 40C para grasas, ya que la mayora de las grasas son lquidas a esa temperatura. El ndice de refraccin es usado para controlar la hidrogenacin; la cual decrece linealmente como decrecen los valores de yodo. Es usado tambin como una medida de pureza y medio de identificacin, ya que cada sustancia tiene un ndice de refraccin caracterstico. Punto de Fusin: Puede ser definido de varias formas, correspondiendo cada una a diferentes cantidades residuales de grasa slida. Mtodo del tubo capilar (punto claro). Es la temperatura a lo cual una sustancia pasa del estado slido al estado lquido por accin del calor a una velocidad dada hacindose completamente claro. Punto de fusin deslizado. Es determinado similarmente al del tubo capilar y mide la temperatura a la cual una columna de grasa se mueve en un capilar abierto cuando se calienta. Punto de fusin Wiley. Mide la temperatura a la cual un disco de grasa de 1/8 x 3/8 de pulgada suspendido en una mezcla de alcohol-agua de densidad similar cambia dentro de una esfera. Este mtodo es ms usado en los Estados Unidos y el punto de fusin por deslizamiento es preferido en Europa; sin embargo, el mtodo del tubo capilar es menos usado para aceites y grasas (en comparacin con compuestos puros) ya que ellos carecen de un punto de fusin definido debido a su contenido de varios componentes. Una desventaja del punto de fusin Wiley es la determinacin subjetiva as como cuando el disco es esfrico. Una desventaja del punto de fusin deslizante es el tiempo de estabilizacin de 16 horas. Punto de nube. Es la temperatura a la cual una nube es formada en una grasa lquida debido al comienzo de la cristalizacin. Punto de solidificacin. Es la temperatura a la cual una sustancia grasa pasa del estado lquido al estado slido por enfriamiento. Gravedad especfica (Densidad relativa a 25/25C). Es la relacin entre la masa de una sustancia y la masa de igual volumen de agua, a cierta temperatura. Se puede determinar por medio de la balanza de Westphal o por el Picnmetro. Evaluacin del color: El color de los aceites y grasas est relacionado en particular con el aspecto del producto final, y su evaluacin es de cierta importancia industrial. Las muestras se deben homogeneizar a temperatura ambiente y las grasas en estado fundido. El color se puede determinar visual o espectroscpicamente. a) El color se compara con los cristales de un colormetro Lovibond utilizando una celda adecuada. Tambin se pueden determinar en una cubeta de porcelana poniendo el colormetro en posicin vertical. b) Se mide la longitud de onda de mxima absorbancia frente al tetracloruro de carbono en un espectrofotmetro utilizando una celda de 0,5 - 5 cm.
Deterioro de los Lpidos Las grasas y los aceites son susceptibles a diferentes reacciones de deterioro que reducen el valor nutritivo del alimento y, adems, producen compuestos voltiles que imparten olores y sabores desagradables. Esto se debe a que el enlace ster es susceptible a la hidrlisis qumica o enzimtica y a que los cidos grasos insaturados son sensibles a reacciones de oxidacin. Rancidez: En general, el trmino rancidez, se ha usado para describir los diferentes mecanismos a travs de los cuales se alteran los lpidos. El grado de deterioro depende del tipo de grasa o aceite; los ms susceptibles a estos cambios son los de origen marino, seguidos por los aceites vegetales y finalmente por las grasas animales. El deterioro de los lpidos se ha dividido ondas grupos de reacciones: rancidez hidroltica y rancidez oxidativa. El primero se debe bsicamente a la accin de las lipasas que liberan cidos grasos de los triacilglicridos, mientras que el segundo se refiere a la accin del oxgeno y las lipoxigenasas sobre las insaturaciones de los cidos grasos. Existe una tercera forma de deterioro de las grasas a travs del fenmeno llamado reversin, cuyo mecanismo es poco conocido y que si bien se presenta en muchos lpidos que se almacenan en ciertas condiciones, tiene menos importancia que los de oxidacin de grasas. Para medir el estado de oxidacin de un aceite o grasa es recomendable realizar varias pruebas importantes, entre ellas tenemos: Indice o valor de perxido, prueba de cido tiobarbitrico (TBA) y dienos conjugados. Sin embargo, hay otras pruebas que pueden ayudar al estudio sobre la oxidacin de lpidos tales como: el valor anisidina, valor de yoduro, valor cido, prueba de Kreis, prueba oxirano, medida de compuestos fluorescentes, compuestos carbonilos totales y voltiles, compuestos polares y gases hidrocarbonados. La mayora de las pruebas requieren de la extraccin de lpidos previo al anlisis. Sin embargo, variaciones de algunos mtodos comienzan con la muestra original como es el caso de TBA. La oxidacin inicial de un aceite, por lo general es lenta y relativamente a una velocidad uniforme. Esto se conoce como perodo de induccin. Al final de este perodo, cuando la cantidad de perxidos alcanza un nivel determinado, la velocidad de oxidacin se acelera muy rpidamente. En este punto o poco despus, las grasas o aceites comienzan a tener olor y sabor rancios. Como la rancidez es un fenmeno complejo, resulta aconsejable realizar tantas pruebas como sea posible, sobre todo en muestras dudosas. En el trabajo rutinario, adems de los cidos grasos libres, los anlisis pueden incluir la determinacin del Indice de Perxido y la aplicacin de la Reaccin de Kreiss. Indice de Perxido. El valor de perxido mide el grado de oxidacin de lpidos en grasas y aceites pero no su estabilidad. Este valor es definido como los miliequivalentes de perxido por Kg de grasa. Es una medida de la formacin de grupos perxidos o hidroperxidos que son los productos iniciales de la oxidacin de lpidos. Parece haber relacin entre el ndice de perxido y la rancidez de las sustancias grasas, pero es necesario hacer notar, que las caractersticas del aceite juegan un papel muy importante. As, aceites con alto ndice de yodo, tendrn un ndice de perxido alto al comienzo de la rancidez y aceites con bajo ndice de yodo, tendrn ndice de perxido bajo al inicio do la rancidez. Debe tambin establecerse correlacin entre el ndice de perxido alto y las caractersticas organolpticas de rancidez antes de llegar a conclusiones definitiva. METODOLOGA Se pes un papel de filtro y se tar con la muestra. Se dobl el papel para no perder la muestra. Se coloc en un beacker pequeo y se introdujo en el desecador, posteriormente se llev a estufa a 105C durante la noche. Se pes por diferencia 1 g de muestra en un papel el cual fue doblado e introducido en un dedal de vidrio. Se coloc sta dentro de un recipiente para muestra y se fij bajo el condensador del aparato de extraccin Goldfisch. Se agreg en un beacker para solvente previamente limpio y seco con 40 ml de ter anhidro y se coloc sobre el condensador asegurandolo con el anillo o rosca, el cual se apret con la
mano; pero sin tocar el beacker ya que la grasa de esta puede alterar el % de grasa de la muestra. Se accion la llave del agua que acta como refrigerante del condensador. Se subi la plancha de calentamiento, antes de que tenga contacto con los beacker se prendi el condensador. El ter empes a hervir, luego se dej hasta que transcurriera unas horas. Se aadi ms ter debido a que el contenido en el beacker se evaporaba a medida que se extraa la grasa de la muestra. Luego que transcurri varias horas (5 aprox.) se apag el aparato de Goldfisch, se bajaron las planchas y se retirarn los beacker de solvente y se dej a temperatura ambiente hasta que se evapor el ter y la grasa que este contena se coloc en el desecador. Se retir el dedal con la muestra y se procedi a recuperar el ter localizado en el condensador del aparato del Goldfisch en un vaso recolector. Agregndolo luego en el envase original. Se coloc el beacker que contena la grasa de la muestra localizada en la estufa a 105 por media hora. Luego se procedi a pesar y por diferencia se calcul la cantidad de grasa que contena la muestra. Bibliografa F.L. HART y H.D. FISHER, Anlisis Moderno de los Alimentos. De la edicin en lengua espaola, Editorial Acribia. Zaragoza (Espaa). 1991. HAROLD, EGAN y Otros, Anlisis Qumico de Alimentos de Pearson. Primera Edicin. Compaa Editorial Continental, S.A de CV. Mxico. 1987. H.G. MULLER y GITOBIN, Nutricin y Ciencia de los Alimentos, Editorial Acribia, Zaragoza (Espaa). ANLISIS DE CENIZAS Importancia de las Cenizas en Alimentos La cantidad de cenizas representa el contenido total de minerales en los alimentos. La determinacin del contenido de cenizas puede ser importante por varias razones: Son una parte del anlisis prximo para la evaluacin nutricional. Las cenizas son el primer paso en la preparacin de una muestra de alimentos para anlisis elemental especfico. La determinacin del contenido de cenizas sirve para obtener la pureza de algunos ingredientes que se usan en la elaboracin de alimentos tales como: azcar, pectinas, almidones y gelatina. El contenido de cenizas se usa como ndice de calidad en algunos alimentos como mermeladas y jaleas. En estos productos el contenido de cenizas es indicativo del contenido de frutas en los mismos: por lo tanto, se le considera como un ndice de adulteracin, contaminacin o fraude. Es importante en productos de cereales porque revela el tipo de refinamiento y molienda. Ejemplo una harina de trigo integral (todo el grano) contiene aproximadamente 2% de cenizas; mientras que la harina proveniente del endospermo tiene un contenido de cenizas de 0,3%. Quiere decir que la mayora de las cenizas estn en las cscaras. Se puede esperar un contenido de cenizas constante en productos animales, pero de otra fuente como las plantas, este puede ser variable. Se usa como ndice de calidad en el vinagre. Hay normas al respecto. En algunos productos no slo porque se establece el contenido de cenizas total sino adems, el % de esa ceniza soluble en agua, en cido y tambin la alcalinidad que presenta. Las cenizas contienen los elementos inorgnicos, mucho de los cuales son de inters nutricional como es el caso del calcio, fsforo, etc. Cuando en algn producto alimenticio hay un alto contenido de cenizas se sugiere la presencia de algn adulterante inorgnico. El mtodo ms comn para determinar cenizas es la calcinacin en mufla a temperaturas entre 500 y 600oC. Para determinar cenizas en azcar se han recomendado mtodos basados en la conductividad elctrica (va hmeda). El contenido de cenizas en carnes oscila entre 0,8 - 2% en base hmeda. En frutas y hortalizas est comprendido entre 2 - 12%. Los elementos minerales en los alimentos se encuentran en combinaciones orgnicas e inorgnicas. Las sales inorgnicas, tales como: fosfato, carbonato, cloruro, sulfato, nitrito de sodio, potasio, calcio, son comunes. Tambin pueden encontrarse presentes sales de cidos orgnicos: mlico, oxlico,
acticos, pptico, etc., Por otra parte ciertos elementos minerales pueden encontrarse formando complejos de molculas orgnicas. A veces en la determinacin de cenizas es conveniente mezclar el producto con arena como por ejemplo leche. Mtodos Usados en la Determinacin de Cenizas Existen tres mtodos para la determinacin de cenizas que son: Calcinacin (va seca) Oxidacin hmeda(digestin). Cenizas a baja temperatura(cenizas plasma) Calcinacin Se refiere a la determinacin de las cenizas en una mufla a temperaturas que oscilan entre 500 y 600oC. El agua y sustancias voltiles son evaporadas, mientras que las sustancias orgnicas son incineradas en presencia del oxigeno del aire para producir CO2 y xido de nitrgeno. La mayora de los minerales son convertidos a xidos, sulfato, fosfato, cloruro y silicato. Los elementos tales como: Fe, Se, Pb y As, pueden volatilizarse parcialmente con este procedimiento, es por ello que otros mtodos se deben usar como paso preliminar para anlisis elemental especfico. Las ventajas de este mtodo son: Es un mtodo seguro y no requiere adicin de reactivos y sustancias del blanco. Se requiere de una pequea atencin slo para evitar la formacin de llamas y ello se logra subiendo la temperatura lentamente hasta aproximadamente 200oC. Despus que se ha quemado la materia orgnica, se continua subiendo la temperatura hasta aproximadamente 500oC. Usualmente se pueden manipular varios crisoles a la vez y las cenizas resultantes se pueden utilizar para muchos anlisis como: determinacin, de elementos qumicos, cenizas insolubles en cido y solubles e insolubles en agua. Entre sus desventajas tenemos: El largo tiempo que se requiere para la incineracin (12-18 horas o toda la noche). La prdida de elementos voltiles y las interacciones entre los componentes minerales y los crisoles. Entre los elementos que se pueden perder por volatilizacin tenemos: As, B, Cd, Cr, Fe, Pb, Hg, Ni, P, V, y Zn. Oxidacin hmeda(Digestin hmeda) Es un procedimiento en el cual se oxidan las sustancias orgnicas usando cidos y agentes oxidantes o sus combinaciones. Los minerales son solubilizados sin volatilizacin. Las cenizas hmedas son preferibles a menudo a las cenizas secas como una preparacin para un anlisis elemental especifico La necesidad de vigilancia constante y la posibilidad de altos valores del blanco, hacen al mtodo menos adecuado para el trabajo de rutina. El procedimiento consiste en oxidar la muestra en presencia de cido ntrico, sulfrico, perclrico y perxido de hidrgeno, proporcionando calor hasta lograr la destruccin de toda la materia orgnica y que aparezcan humos blancos. Los cidos se pueden usar en diferentes combinaciones, teniendo cuidado con el perclrico que es explosivo. Este mtodo es muy aplicado a muestras con alto contenido en grasas(carnes y derivados). La oxidacin hmeda posee ventajas frente a la calcinacin en seco, ya que se utilizan temperaturas ms bajas (menos de 350oC) y hay poca probabilidad de prdida de los elementos por volatilizacin. El tiempo de la oxidacin es corto. Entre sus desventajas se tienen: Se toma virtualmente todo el tiempo del operador. Se usan reactivos corrosivos y solamente se puede manipular un pequeo nmero de muestras. Cenizas a baja temperatura (cenizas plasma) Se refiere a un tipo especifico de mtodo de cenizas secas en la cual los alimentos son oxidados en un vaco parcial por oxgeno naciente, formado por un campo electromagntico. Las cenizas as son obtenidas a una temperatura mucho ms baja que con la mufla, previniendo la volatilizacin de muchos elementos. Las estructuras cristalinas usualmente permanecen intactas. La mayor desventaja es la pequea capacidad para las muestras y lo caro del equipo.
Debido a que ciertos alimentos poseen alto contenido de minerales, el contenido de cenizas se hace importante. Se puede esperar un contenido constante de cenizas de productos de animales, pero de otras fuentes como las plantas, este puede ser variable. Contenido de Cenizas en los Alimentos El contenido de cenizas de la mayora de los alimentos frescos raramente es mayor de 5%. Aceites puros y grasas generalmente contienen poca cantidad o nada de cenizas. Los productos tales como tocino puede contener 6% de cenizas y la carne seca de res puede poseer un contenido tan alto como 11,6% (base hmeda. Grasas, aceites y mantequillas varan de 0,00 a 4,09%; mientras que productos secos varan de 0,5 a 5.1%. Frutas, jugo de frutas y melones contienen de 0,2, a 0,6% de cenizas; mientras que las frutas secas contienen de 2,4 a 3,5%. Harinas y comidas varan de 0,3 a 1 .4%. El almidn puro contiene 0,3% y el germen de trigo 4,3%. Se podra esperar que el grano y sus derivados con salvado tendran un contenido superior. Nueces y derivados contienen de 0,8 a 3,4% de cenizas; mientras que a carne, aves y alimentos marinos contienen entre 0,7 y 1,3% de cenizas. Anlisis de cenizas Preparacin de las muestras: Entre 2 y 10 g de muestra son generalmente usados para determinar cenizas. Para este propsito, la molienda o trituracin probablemente no alterarn mucho el contenido de cenizas; sin embargo si estas cenizas son un paso previo para la determinacin de minerales se debe tener cuidado ya que puede haber contaminacin por micronutrientes ya que los molinos son hechos de metal, el uso repetido de materiales de vidrio pueden ser fuente de contaminacin; el agua tambin puede ser fuente de contaminacin, por ello es conveniente usar agua destilada desionizada. Los materiales de las plantas son generalmente secados antes de la molienda por los mtodos de rutina. La temperatura de secado es de pequeas consecuencias para las cenizas. Sin embargo la muestra puede ser usada para determinaciones mltiples (protena, fibra, etc.). Los materiales de las plantas con 15% o menos de humedad pueden ser incinerados sin secado previo. Los productos de animales, Syrups y especias requieren tratamiento previo a la incineracin porque su alto contenido en grasas, humedad o azcar pueden producir prdidas de muestra. Las carnes, syrups y azcares necesitan ser evaporados por secado en bao de vapor o con una lmpara infrarroja. Una o dos gotas de aceite de oliva se puede aadir para permitir escapar al vapor cuando se forma como una costra sobre el producto. La llama y el humo pueden aparecer en la incineracin de muchos productos (quesos, alimentos marinos, especias, etc.). No se debe subir bruscamente la temperatura de la mufla para evitar la formacin de llamas que provocan prdidas de las muestras. La temperatura se debe subir lentamente hasta 200oC y dejarla all hasta quemar toda la materia orgnica (desprendimiento de humo sin llama), despus se sube lentamente hasta 500oC aproximadamente cuando se trate del mtodo de incineracin. En este mtodo a veces la seleccin de los crisoles se hace crtica porque ello depende de su uso especifico. Existen crisoles de cuarzo, vycor, porcelana, platino, silica etc. Los crisoles de cuarzo son resistentes a los cidos y halgenos pero no a los lcalis a temperaturas altas. Los vycor son estables hasta 900oC; pero los Gooch Pyrec estn limitados hasta 500oC. Los de porcelana se asemejan al cuarzo en sus propiedades fsicas pero se quiebran con los cambios bruscos de temperaturas, son econmicos. Los de acero son resistentes a los cidos y lcalis, son baratos pero estn constituidos por cromo y nquel los cuales son fuentes posibles de contaminacin. Los crisoles de platino son muy inertes y probablemente los mejores pero son muy caros para uso rutinario. Los de slica son atacados por alimentos cidos. Todos los crisoles deben ser marcados con creyn de grafito para su identificacin ya que otros tipos de marcadores generalmente se borran con las altas temperaturas. En muchos alimentos, adems de determinar las cenizas totales, es conveniente determinar tambin las cenizas solubles e insolubles en agua. Su alcalinidad y la proporcin de cenizas solubles en cido. Mtodos Usados en la Determinacin de Minerales en Cenizas Anlisis gravimtrico. Las formas insolubles de los minerales son precipitados, lavados, secados y pesados para estimar el contenido de minerales utilizando procedimientos gravimtricos. El anlisis gravimtrico est basado
en el hecho de que los elementos constituyentes en cualquier compuesto puro estn siempre en las mismas proporciones por peso, por ejemplo, en el NaCI siempre hay un 39,3% de Na(100 x 23 / 58,5). En anlisis gravimtrico, el constituyente deseado es separado de las sustancias contaminantes por precipitacin selectiva y entonces lavado para minimizar cualquier adherencia o elementos atrapados. El precipitado es entonces secado y pesado. El peso del elemento mineral est en la misma proporcin del peso del compuesto, igual que como est en el complejo precipitado. El cloruro por ejemplo es a menudo precipitado por cloruro de plata, el cual es lavado, secado y pesado. El peso del cloruro puede entonces ser calculado del peso del cloruro de plata, porque el cloruro es el 24,74% del peso molecular del AgCl. El calcio puede ser determinado por precipitacin como oxalato, y convertido a CaO por ignicin y reportado como peso de calcio/peso de muestra(Ver Suzanne, 1995. mtodo modificado). Los procedimientos gravimtricos son adaptados mejores a tamaos grandes de muestras y son generalmente limitados a alimentos que contienen a grandes cantidades de los elementos a ser determinados. Los procedimientos que usan AgNO2 han sido usados para cuantificar cloruros. La mayora de los elementos traza estn en baja cantidad en los alimentos cuyo procedimiento gravimtrico son demasiado largos para tener un valor analtico. Una desventaja de los procedimientos gravimtricos es el tiempo extra en la segunda ignicin donde el CaC204 es convertido en CaO. Lavados repetidos tienden a solubilizar algo del CaC 2O4. Sin embargo la co-precipitacin de otros minerales necesitan los pasos del lavado. METODOLOGA Determinacin de cenizas en queso crema (kraft). Se pes aproximadamente entre 5 y 8 gr de muestra de queso crema en un crisol de porcelana. Se llev a estufa para deshidratarlas a 105oC por 16 horas. Pasado este tiempo, se sac de la estufa y se colocaron en el desecador para enfriar a temperatura del laboratorio. Luego fueron puestas en el horno de mufla a 500-600oC durante un da para incinerar hasta obtener cenizas blancas o grises. Se sac los crisoles del horno de mufla y se colocaron en desecador para enfriarlos a temperatura del laboratorio. Se pes y luego se procedi a los clculos requeridos.
Preparacin de reactivos Solucin de 250 ml de Hcl 1:1 Se tom una alicuota de 125 ml de Hcl y se transfiri a un baln aforado de 250 ml y se diluy con un volumen de agua destilada igual a 125 ml, para as obtener la solucin de Hcl 1:1. Solucin de 500 ml (NH4)2C2O4 4% P/V. Se pesaron exactamente 4 gr de oxalato de amonio, se llevaron a un baln de 500 ml y se afor con agua destilada. Solucin KMnO4 0,05 N. Se pesaron 1,5962 gr KmnO4 puro y se llev a un beaker de 1000 ml. se calent la muestra con agitacin frecuente hasta que el slido se disolvi a una temperatura inferior a la de ebullicin durante 30 min. Se dej en reposo durante 24 horas. Se filtro a travs de fibra de vidrio. Se par la disolucin a un frasco de vidrio oscuro con tapn de vidrio. Estandarizacin de solucin de KmnO4 con oxalato de amonio. Se midi un volumen de 52,08 ml H2SO4 puros, el cual se transfiri a un baln de 500 ml aforando con agua destilada, para obtener la solucin H2SO4 al 10% P/V. De esta solucin se tom una alcuota de 100 ml que fueron mezclados con 0,15 g exactos de oxalato de sodio previamente pesados. La solucin preparada se calent lentamente hasta ebullicin.
Se enras la bureta con solucin de KmnO4 procediendo a titular en caliente. El punto final se alcanz con la aparicin del color rosado. Con el volumen gastado de KmnO4 se procedi a calcular su normalidad. Solucin alcohlica 50 ml rojo metilo al 0,02%. Se pesaron 0,01 g de rojo metilo y se llev a un baln de 50 ml y se afor con alcohol. Solucin 250 ml H2SO4 8% P/V. Se midieron 10,87 ml puros de H2SO4 y se llevaron a un baln de 250 ml y se afor con agua destilada. Solucin de 50 ml NH4OH 0,5%. Se tom un volumen de 1 ml de hidrxido de amonio y se llevaron a un baln de 50 ml aforando con agua destilada. Preparacin de muestra para determinacin de Calcio (Ca). Se tom la muestra incinerada y se le agreg 5 ml de Hcl 1:1. El crisol se coloc en una plancha de calentamiento hasta la sequedad con el fin de deshidratar los silicatos y hacerlos insolubles, todo esto a la temperatura ms baja. Alcanzada la sequedad, se bajaron de la plancha y se volvi a agregar 5 ml de Hcl 1:1. Fue puesto el crisol en la plancha y calentar por 30 minutos a temperatura baja a fin de hidrolizar los, pirofosfatos a ortofosfatos. Se filtr a travs de un papel de filtro la solucin sin cenizas (pero el papel que se utiliz no indicaba esto) en un matraz aforado de 100 ml. El papel de filtro con el residuo se coloc en un crisol y se llev al horno de mufla para ser incinerada. Al residuo que se obtuvo se le agreg 5 ml de Hcl 1:1 y se calent a baja temperatura por 5 minutos. Pasado este tiempo se procede a filtrar nuevamente la solucin en un papel de filtro. Se recoge el filtrado en el mismo matraz aforado de 100 ml. Se afor a 100 ml con agua destilada (solucin A). Determinacin de calcio (Ca). (Permanganometra). Se transfiri una alicuota de 50 ml de la solucin (A) a un beaker de 250 ml. Se agreg 100 ml de agua destilada. Esta solucin se calent hasta ebullicin. Se le agreg lentamente 10 ml de oxalato de amonio y tres gotas de indicador rojo de metilo hasta la formacin del precipitado. Se agreg gota a gota solucin de hidrxido de amonio 0,5 N hasta que se obtuvo el viraje del indicador (incoloro, pH=5). Luego se dej hervir durante 5 minutos la solucin. Pasado este tiempo, se dej enfriar y luego se dej reposar durante 4 horas. Despus de las cuatro horas, se filtr la solucin a travs de un papel filtro con 20 ml de agua destilada. Se coloc el papel en el mismo envase y se lav el papel con 10 ml de cido sulfrico al 8% para disolver el oxalato de calcio. Se agreg 50 ml de agua hirviendo. Se titul e caliente con solucin de permanganato de potasio 0,05 N hasta una coloracin rosada persistente. Bibliografa F.L. HART y H.D. FISHER, Anlisis Moderno de los Alimentos. De la edicin en lengua espaola, Editorial Acribia. Zaragoza (Espaa). 1991. HAROLD, EGAN y Otros, Anlisis Qumico de Alimentos de Pearson. Primera Edicin. Compaa Editorial Continental, S.A de CV. Mxico. 1987. H.G. MULLER y GITOBIN, Nutricin y Ciencia de los Alimentos, Editorial Acribia, Zaragoza (Espaa).
ANLISIS DE FIBRAS La fibra bruta constituye un ndice de las sustancias presentes en los alimentos de orgen vegetal cuyo valor alimenticio es igual al del heno. Est constituida fundamentalmente por celulosa, lignina y pentosanas, que constituyen junto con pequeas cantidades de sustancias nitrogenadas de las estructuras celulares de los vegetales. Un comit de enlace combinado de la AOCS y la AOAC defini as el trmino: << La fibra bruta se pierde en la incineracin del residuo seco obtenido tras la digestin cido-alcalina bajo condiciones especficas>>. Van Socst y Wine, del Agricultural Research Service del USDA, han introducido un nuevo concepto del significado de fibra bruta. Definen la fibra sobre bases nutritivas como las sustancias vegetales insolubles no digeridas por las enzimas diastticos o proteolticas, nutritivamente intiles excepto por fermentacin microbiana en el tracto digestivo de los animales. Subrayan que la clsica digestin cida-alcalina utilizada para obtener la porcin fibrosa de los vegetales que la que se denomina fibra bruta da una cifra que guarda una elacin variable e incierta con el valor nutritivo de la fibra obtenida. El mtodo ideal debe aislar lignina, la celulosa y la hemicelulosa con un mnimo de sustancias nitrogenadas. El resduo obtenido por digestin cido-alcalina contiene cantidades considerables de protena vegetal perdindose, en cambio, parte de lignina, que se gelatiniza o se disuelve. El valor de la fibra bruta en las nuevas tablas de composiin de los alimentos se est sustituyendo por un valor de carbohidrato no utilizable denominado fibra diettica. El papel de la fibra indigerible o alimento o forraje indigesto en la dieta en el mantenimiento de la salud (Burkih, 1973) es ahora considerado tan importante nutricionalmente como los niveles de nutrimientos absorbibles en los alimentos. La fibra diettica puede ser definida como constituida por todos los componentes de los alimentos que no son todos rotos por las enzimas del conducto alimentario humano para formar compuestos de masa molecular menor, capaces de ser absorbidos al torrente sanguneo. Se han desarrollado diferentes mtodos para la estimacin de la fibra diettica. Dado que no es posible determinar los muchos componentes complejos individualmente de la fibra diettica, los mtodos de uso prctico representan un compromiso en la separacin completa y su determinacin y la aproximacin emprica de fibra cruda. Existen un procedimiento ms selectivo (Van Soestywine, 1967) usa sulfato de sodio y laurilo al 3% sin cido. La Asociacin Americana de Qumicos de cereales ha adoptado como oficial este mtodo en combinacin con una digestin enzimtica para el nalisis de fibra diettica (Schaller, 1977). En general, las cubiertas protectoras de muchos alimentos contienen considerablemente mayor cantidad de fibra que los tejidos interiores, ms suaves y ms fciles de comer. Por consiguiente, el valor de la fibra se puede utilizar para establecer la proporcin de cscara presente en algunos alimentos como el cacao y la pimienta. En forma similar el valor de la fibra sirve para calcular la cantidad de cscara en las nueces, los huesos de las frutas o el aserrn que pueden existir en algunos alimentos; todos estos adulterantes tienen un alto contenido enfibra. Como el contenido en fibra aumenta con la edad de las plantas, su nivel puede servir para calcular la madurez de las verduras. En vista de la cantidad mayor en los tejidos externos del grano detrigo, la harina morena produce valores ms altos que la harina blanca. En consecuencia se ha establecido un mnimo de 0,6% de fibra sobre base seca para la harina y el pan moreno. El grano de trigo es una caripside. El endospermo esta formado por 70% de almidones, 12% de protenas y 1.7% de grasas. El trigo comercial es fundamentalmente la almendra, es decir, el grano sin glumas. Lo ms comn en protenas es de 8-15%. Los trigos mejorados, bajobuenas condiciones de cultivo, tienen entre 10 y 11%. No obstante el porcentaje de proteinas los trigos blancos y blandos estn destinados a galletera y los duros a panaderia. La composicin del grano es la siguiente: Almidn ----- 63-71% Humedad ---- 8-10% Azcares ----- 2-3% Grasas -------- 1.2 2% Minerales ----1.5-2% Las protenas contenidas en el endospermo se denomina glutn, compuesta por gliadina y glutenina. En trigo el glutn tiene la propiedad de retener el CO2 producido por la levadura, siendo este principio bsico de la panificacin (expansin del CO2).
El azcar principal es la sacarosa. El trigo contiene el complejo B de vitaminas, no posee vitaminas C y D, tiene alto contenido de vitamina E. En los trigos redondillos tiernos blandos o almidoneros domina el almidn, dando en la molienda mucho salvado (parte exterior del grano que constituye la mogolla de trigo), usndose con preferencia en la fabricacin de galletas y pasteles. La fibra esta dividida entre fracciones mayores: Polisacridos estructurales (de las paredes celulares) Celulosa: Es prcticamente un polmero lineal de unidades de glucosa unidas entre si por enlaces 14. Es el principal componente estructural de las paredes celulares de las plantas. Se considera relativamente insoluble en agua. Algunos polmeros pueden contener 10.000 unidades de glucosa. Los enlaces hidrgeno entre polmeros paralelos forman microfibrillas fuertes. Estas microfibrillas de celulosa proveen la fuerza y rigidez requerida en paredes celulares de plantas primarias y secundaras. Hemicelulosas: Son un heterogneo grupo de sustancias que contienen un nmero de azcares en su columna vertebral y en los lados de la cadena Xilosa. mannosa y galactosa frecuentemente forman la estructura vertebral, mientras la arabinosa galactosa y cidos urnicos estn presentes en los lados de la cadena. La hemicelulosas por definicin son solubles en lcalis diluidos, pero no en agua. El tamao molecular y el grado de ramificacin son tambin altamente variables Una molcula tpica de hemicelulosa contiene entre 50 y 200 unidades de azcar. Las hemicelulosas son polisacridos matrices que se enlazan junto a las microfibrillas de celulosa y forman enlaces covalentes con la lignina. Pectinas: Son ricas en cidos urnicos Son solubles en agua caliente y forman geles. La estructura esqueletal consiste de cadenas no ramificadas de enlaces 1 ,4 de cido galacturnico. Los lados de la cadena pueden contener ramnosa arabinosa, xilosa y fucosa La solubilidad es reducida por metilacin de los grupos carboxilos libres y por formacin de complejos de calcio y magnesio. Las pectinas similares a la hemicelulosa son polisacridos matrices en las paredes celulares. -Glucanos: Son polmeros de glucosa que contienen ambos enlaces ( 13 y 14) en varias proporciones, dependiendo de la fuente, la cual hace a la molcula menos lineal que la celulosa y ms soluble en agua. Polisacridos no estructurales(no celulsicos) Son probablemente los que estn en mayor proporcin en la mayora de los alimentos que la celulosa o lignina. Frutas y verduras tienden a tener niveles ms altos de celulosa que los cereales. Algunas frutas, en el cual la semilla es comestible tienen una proporcin muy alta de lignina. La composicin fibrosa de las plantas vara con la especie, la parte(esto es: raz, tallo, hoja) y madurez. El contenido de celulosa y lignina por ejemplo, se incrementan significativamente con la madurez de la planta. De acuerdo a como varan las funciones dentro de la planta vara la composicin qumica de cada fraccin. Los polisacridos no estructurales incluyen hidrocoloides tales como mucilago, gomas(asociadas con el endospermo y el espacio intercelular) y polisacridos de algas. Los hidrocoloides son polisacridos hidroflicos que forman soluciones viscosas o dispersiones en agua fra o caliente. Las avenas y cebadas contienen muclagos. Las gomas exudadas de plantas incluyen gomas arbigas, caraya, y tragacanto; mientras que los polisacridos de algas incluyen agar, alginatos, y carragenina. Los polisacridos de las paredes no celulares contienen una gran cantidad de azcares neutros y cidos urnicos. No polisacridos estructurales(Lignina) La lignina es un polmero tridimensional, no-carbohidrato que consiste aproximadamente de 40 unidades de fenol con enlaces intramoleculares fuertes: La lignina es a menudo enlazada covalentemente a hemicelulosa. Contiene unidades de fenil propano derivadas de sipanil, coniferil y alcoholes p-coumarlicos. Son considerados muy inertes, insolubles y resistentes a la digestin. La fibra diettica puede ser determinada comnmente por dos aproximaciones bsicas: gravimtricamente o qumicamente, aunque tambin se utiliza un procedimiento enzimtico rpido(Olds, B 1986). En la primera aproximacin los carbohidratos digeribles, lpidos y protenas, son solubilizados selectivamente por qumicos y/o enzimas. Los materiales indigeribles son recolectados por filtracin y el residuo de fibra es cuantificado gravimtricamente. En la segunda aproximacin, los carbohidratos digeribles son removidos por digestin enzimtica, los componentes fibrosos son hidrolizados por cido y los monosacridos son medidos. La suma de los monosacridos en el
hidrolizado cido representa la fibra. El componente alimenticio que es ms problemtico en el anlisis de fibra es el almidn. En ambas aproximaciones es necesario que todo el almidn sea removido para un estimado exacto de la fibra. Con la aproximacin gravimtrica, la remocin incompleta de almidn incrementa el peso del residuo y abulta el estimado de la fibra. En la segunda aproximacin, la glucosa en el hidrolizado cido es considerada fibra. Por lo tanto, la glucosa que no es removida en los primeros pasos analticos causa una sobre estimacin de la fibra diettica. Existen enzimas especficas para hidrolizar cada uno de los enlaces del almidn (amilasa amiloglucosidasa y pululanasa) la cual hidrolizan los enlaces internos -1,6 de las unidades de glucosa. Todos los mtodos de fibra incluye un paso de calentamiento entre 80 y 130 oC por un tiempo aproximado que oscila entre 10 min. y 3 horas para hinchar y desintegrar los grnulos de almidn. Igual con la gelatinizacin algo de almidn escapa a la digestin (solubilizacin) e infla los valores de la fibra. Por ello es controvercial el hecho de que se considere el almidn resistente corno fibra. En la aproximacin gravimtrica es esencial que todo el material digerible sea removido de la muestra, tal que solamente los polisacridos indigeribles permanezcan o que el residuo indigerible sea corregido como contaminante digerible remanente. Los lpidos son fcilmente removidos de la muestra con solventes orgnicos y generalmente no poseen problemas analticos para el anlisis de fibra. Las protenas y minerales que no son removidos de la muestra durante los pasos de solubilizacin podran ser corregidos por el anlisis de nitrgeno por Kjeldahl y por porciones incineradas del residuo fibroso. Mtodos gravimtricos. Pueden ser usados para aislar varias fracciones las cuales son entonces cuantificadas por peso o diferencia en peso. Fibra cruda: Este mtodo fue desarrollado en los aos 1950 para determinar carbohidratos indiqeribles en alimentos para animales y la fibra en alimentos para humanos fue determinada como fibra cruda a partir de 1970. La fibra cruda es determinada por una digestin secuencial de la muestra con H2SO4 al 1,25% y despus con NaOH al 1,25%. El residuo insoluble se obtiene por filtracin, luego es secado y pesado. All se obtiene el peso de la fibra junto con el de los minerales. Para obtener el contenido de fibra es necesario incinerar esta muestra, donde se elimina la fibra por incineracin, quedando solamente el residuo de las cenizas constituido por los minerales. Por diferencia entre el peso anterior (antes de la incineracin) y el de las cenizas se obtiene el de la fibra cruda; la cual es_una medida del contenido de celulosa y lignina en la muestra, pero los hidrocoloides, hemicelulosas y pectinas son solubilizadas y no pueden ser detectadas. Mtodos Detergente: Los mtodos de fibra detergente cida y fibra detergente neutral fueron adecuados y bien aceptados para hacer ms exactos la estimacin del contenido de lignina, celulosa y hemicelulosa en alimentos para animales; pero no se justifica su uso para determinar pectinas e hidrocoloides ya que estos constituyentes se encuentran en proporciones menores y aunque son importantes para la salud humana resultaran un mtodo muy largo para analizar este tipo de alimentos. Fibra Total, Soluble e Insoluble: Con el conocimiento de que la fibra soluble e insoluble producen respuestas fisiolgicas diferentes y que ambas son importantes para la salud humana, se propusieron una serie de mtodos con pequeas diferencias entre si. De todos hubo uno que fue el mas comn y ampliamente aceptada por la Asociacin de Qumicos Analticos Internacionales (AOAC 1990) el cual representa una combinacin de las metodologas anteriores fibra cruda, fibra detergente y metodologas de Southgate (Suzanne. 1994). Todos los mtodos corrientes usan una combinacin de amilasa estable al calor y amiloglucosidasa para digerir y remover el almidn de la muestra. Los procedimientos gravimtricos entonces digieren y remueven protenas con una proteasa. El material remanente indigerible (fibra) es recolectada por filtracin y luego pesada. El residuo fibroso es corregido por protena residual y contaminacin por las cenizas. Mtodos qumicos Mtodo de Southgate: Southgate (1969 y 1976) fue el primero que cuantific sistemticamente la fibra diettica en un amplio rango de alimentos. La qumica de los carbohidratos usados por Southgate ha sido mejorada y modernizada pero su aproximacin forma la fundacin para que muchos sigan los mtodos gravimtricos y qumicos usados en la determinacin de fibra.
El mtodo fracciona la fibra en soluble e insoluble polisacridos no celulsicos, celulosa y lignina. Esta ltima es determinada gravimtricamente y el contenido de polisacridos es determinado de los constituyentes monosacridos que son medidos colorimtricamente. Procedimiento Englyst-Cummings. Este es una versin modernizada del Southgate y una alternativa para el mtodo AOAC. El almidn es gelatinizado y digerido enzimticamente. Los polisacridos remanentes diferentes al almidn son hidrolizados por cido sulfrico para liberar los monosacridos. Los azcares neutros son determinados por CG y los cidos urnicos son determinados colorimtricamente. Un procedimiento alterno y rpido mide todos los monosacridos por mtodos colorimtricos. Los valores para la fibra total, soluble e insoluble pueden ser determinados por ambas aproximaciones. Con la CG la fibra puede ser dividida en celulosa y polisacridos no celulsicos con valores para azcares constituyentes. Aproximacin de Theander-Marlett: Debido a que los procedimientos de Theander-Marlett son tan similares se decidi unirlos y por eso se conocen con ese nombre(Marlett, 1989; Marlett, 1990 y Theander and Westerland, 1986) El nico aspecto de la aproximacin usada por esos dos grupos de investigadores son: Extraccin de azcares libres de la muestra en los pasos analticos iniciales y cuantificacin directa de lignina. Ambos aspectos fueron parte del mtodo de Southgate pero no son incluidos en otras metodologas corrientes de fibra. Los azcares libres y lpidos son extrados con etanol y hexano. El almidn es removido por digestin enzimtica y la fibra insoluble es separada de la soluble. Las fracciones de fibra son hidrolizadas con cido sulfrico y el contenido de azcar del hidrolizado cido es determinado. La lignina es determinada gravimtricamente. Fibra = monosacridos lignina Comparacin de Mtodos El mtodo modificado de la AOAC el Englyst-Cummings y el Theander-Marlett son los ms ampliamente usados para determinar fibra diettica. Esos tres mtodos y otros muy similares dan resultados comparables del contenido de fibra para una amplia variedad de alimentos. En general el Englyst-Cummings da los valores de fibra ms bajos porque la lignina y el almidn resistente no son incluidos como parte de la fibra en este mtodo. Obviamente, los alimentos con una cantidad significante de almidn resistente tales como hojuelas de maz y alimentos con una cantidad significante de lignina, tales como cereales, afrecho, los cuales mostrarn una desviacin mayor. El mtodo de la AOAC sobrestima la fibra si el alimento es rico en azcares simples glucosa, fructosa y sucrosa), tales como en frutas secas y comidas compuestas. Es una hiptesis el hecho de que algunos azcares simples son atrapados y precipitado con etanol si ellos no son extrados a priori para anlisis de fibra. Esto no parece ser un problema con el procedimiento Englyst-Cummings, posiblemente debido al pequeo tamao relativo de la muestra y la gran cantidad de etanol usado para precipitar la fibra soluble. Con el tamao de muestra pequea 200 mg de materia seca en este procedimiento es imperativo que el alimento est completamente homogneo, tal que las submuestras puedan ser tomadas para anlisis de fibra. Los procedimientos de la AOAC y del anterior incorporan una enzima proteoltica para digerir la protena. La protelisis permite que algo de la fibra sea solubilizada lo cual en efecto mueve algo de la fraccin de fibra insoluble en la fraccin soluble. Adems, la protelisis tiene el efecto general de reducir la cantidad de material medida como lignina. Los procedimientos de la AOAC incluyen almidn resistente como un componente de la fibra diettica. Productos cocidos, hojuelas y extruidos tendrn un valor en fibra significativamente alto si es determinado por el procedimiento de la AOAC que si son determinados por el Englyst-Cummings. El procedimiento rpido de este mtodo requiere, al menos, una cantidad de tiempo, tcnica y equipo especializado comparado a los otros comnmente usados Overall, Englyst-Cummings y TheanderMarlett son ms reproducibles que los del AOAC. Cul mtodo se puede utilizar para determinar fibra en un determinado momento?. Ello depende de: a.- La tcnica disponible b.- El tiempo obligado para ello e.- Disponibilidad de CG o HPLC
d.- Importancia del conocimiento sobre el contenido de los constituyentes integrados por azcar, celulosa, no celulsicos pectina o lignina. Metodologa Se tomaron las muestras que se utilizaron en la prctica de determinacin de estracto etreo Se colocaron en los beacker y se le agreg 200 ml de solucin de H2SO4 que contena 1,25 g de H2SO4 disueltos en 100 ml de agua. Los beacker se colocaron en las hornillas de calentamiento para proceder a la digestin. Se someti a la ebullicin bajo reflujo. Se tom el tiempo cuando empez a ebullir y se esper 30 min exactamente. Pasado este tiempo, se bajaron los beacker de las hornillas y se procedi a filtrar al vaco en los erlenmeyer. Los crisoles estaban recubiertos con fibra de vidrio, para recoger la muestra. Se procedi a lavar con agua destilada para eliminar cualquier rastro de cido. Se tom con una pinza la fibra de vidrio y la muestra contenida en los crisoles. Se colocaron en unos beacker y se lavaron los crisoles con solucin de NaOH, luego se completaron 200 ml de solucin. Se colocaron en las hornillas y se dej ebullir por 30 minutos. Se procedi a filtrar al vaco con agua destilada hasta eliminar completamente el NaOH. Los crisoles se colocaron en la estufa a 105oC por 16 horas. Luego se pas al desecador para llevarlo a temperatura ambiente y se peso. Se reportaron resultados. Posteriormente se inciner en la mufla durante 3 horas a 600oC, se enfri y se peso. Se reportaron resultados. Bibliografa F.L. HART y H.D. FISHER, Anlisis Moderno de los Alimentos. De la edicin en lengua espaola, Editorial Acribia. Zaragoza (Espaa). 1991. HAROLD, EGAN y Otros, Anlisis Qumico de Alimentos de Pearson. Primera Edicin. Compaa Editorial Continental, S.A de CV. Mxico. 1987. H.G. MULLER y GITOBIN, Nutricin y Ciencia de los Alimentos, Editorial Acribia, Zaragoza (Espaa). ANALISIS DE VITAMINAS Y MINERALES Las enfermedades carenciales nutritivas fueron reconocidas hace ms de 200 aos, sin embargo, no fue hasta principios de siglo cuando se aislaron las primeras vitaminas. En 1912 Casimir FunK aisl una fraccin del arroz que curaba el beriberi y debido a que este factor tena propiedades de amina lo llam Vitamina que significa "amina vital". Aunque desde el siglo 17 ya se conoca el escorbuto, no fue hasta 1930 que se aisl por primera vez la vitamina C. Desde entonces, ciertas caractersticas de las vitaminas han complicado su determinacin, entre ellas: i) las vitaminas no pertenecen a un grupo especfico de compuestos, ii) generalmente son de estructura muy compleja, iii) son muy diferentes entre s , iv)sustancias qumicas diferentes pueden tener similar actividad vitamnica, v) se encuentran en los alimentos en cantidades muy pequeas. A pesar de estas dificultades, son mucho los avances que se han hecho en este siglo en cuanto a la determinacin de vitaminas se refiere. Hasta ahora, se han desarrollado al menos un mtodo para la determinacin de cada vitamina conocida. Estos mtodos pueden clasificarse segn sus fundamentos en : A) Mtodos qumicos: estn basados en reacciones especficas de coloracin o precipitacin. Presentan el problema de que generalmente no son lo suficientemente especficos, pudiendo resultar tambin positivas para sustancias de estructura qumica similar pero sin actividad vitamnica. Sin embargo, algunos de estos mtodos permiten la obtencin de buenos resultados, tal es el caso de la tcnica recomendada por la A.O.A.C. para la determinacin de la vitamina C en frutas ctricas. Por lo general estos mtodos son rpidos y econmicos. B) Mtodos Fsicos: Basados en la medicin directa de una propiedad ptica de la solucin problema sin previa adicin de reactivos qumicos. Pertenece a este grupo el mtodo espectofotomtrico de determinacin de Vitamina A, basado en la
medicin directa de la absorvancia que se presentan sus soluciones (carentes de otras sustancias interferentes) a la luz ultravioleta de 328 milimicras. C) Mtodos Fisico-Qumicos: se fundamentan en la medicin de una propiedad fsica de la solucin problema que se desarrolla previo tratamiento con reactivos qumicos especficos. Dentro de este grupo se destaca el mtodo fluoromtrico de Jansen para la determinacin de tiamina, y los mtodos fotocolorimtricos de dosaje de las vitaminas A, B6 y C. Generalmente implican mtodos de extraccin laboriosos y consumidores de tiempo. Tambin pertenecen a este grupo los mtodos de determinacin por cromatografa. D) Mtodos Biolgicos: se hacen midiendo la accin fisiolgica de la vitamina en animales de experimentacin reactivos, en los cuales, o bien se provoca una carencia vitamnica experimental, o bien se estudian detenidamente los efectos curativos del material que se valora, en animales que presentan el cuadro clnico de avitaminosis. Poseen la gran ventaja que permiten medir nicamente las molculas de estricta accin fisiolgica o farmacolgica. Algunos ejemplos son las dosificaciones de Vitaminas A y D. E) Mtodos Microbiolgicos: Se basan en el siguiente fundamento: si un microorganismo no puede sintetizar una vitamina que le es esencial, presenta una necesidad absoluta de dicho factor para su crecimiento, el cual ser proporcional, dentro de ciertos lmites, ala cantidad de la vitamina que se introduzca en su medio de cultivo. El crecimiento se determina mediante la medicin de la turbidez del cultivo (Nefelometra) y la valoracin qumica de la cantidad de cido producida por el microorganismo que es proporcional al desarrollo bacteriano. Estos mtodos son laboriosos, consumidores de tiempo y lo que es ms importantes, los resultados dependen muy significativamente de la experiencia y habilidad del analista. Entre los avances mas novedosos se encuentran los mtodos fisicoqumicos de determinacin de vitaminas por cromatografa lquida de alta eficiencia (HPLC). Estos mtodos desarrollados en su mayora a partir de la dcada de los setenta, cuando se basaban principalmente en la lectura de la fluorescencia producida por el tiocromo derivado de la tiamina, o de la riboflavina como tal, previa extraccin de las mismas a partir de muestras molidas digeridas con cidos y enzimas. Esta enzimas podan ser takadiastasa ( la cual defosforilaba las vitaminas para convertirlas en sus formas libres) y pepsina, para desnaturalizar las matrices proteicas y liberar as las vitaminas. Posteriormente fueron desarrollados mtodos que permitan determinar mas de una vitamina hidrosoluble con un slo mtodo de extraccin y en un solo cromatograma, como el desarrollado por Agostini y Godoy en 1997. En cuanto a las vitaminas liposolubles, su solubilidad en los lpidos requiere de mtodos de extraccin con solventes no polares como ter de petrleo previa saponificacin de las grasas con KOH. La materia no saponificable puede ser concentrada o usada directamente para inyeccin en el equipo de HPLC dotado con detectores UV. Los recientes avances han permitido desarrollar mtodos para determinar con un solo tratamiento las vitaminas A, D y E simultneamente y en un perodo breve de tiempo. Se hace importante entonces reconocer la utilidad y pertinencia de estos mtodos segn vayan destinados a la investigacin, control de calidad, caracterizacin bromatolgica u otras utilidades. Bibliografa F.L. HART y H.D. FISHER, Anlisis Moderno de los Alimentos. De la edicin en lengua espaola, Editorial Acribia. Zaragoza (Espaa). 1991. HAROLD, EGAN y Otros, Anlisis Qumico de Alimentos de Pearson. Primera Edicin. Compaa Editorial Continental, S.A de CV. Mxico. 1987. H.G. MULLER y GITOBIN, Nutricin y Ciencia de los Alimentos, Editorial Acribia, Zaragoza (Espaa).
Anlisis del contenido aminoacdico de los alimentos con fines nutricionales 1. Introduccin. Los aminocidos, pptidos y protenas son componentes importantes de los alimentos. Por un lado proporcionan los elementos necesarios para la sntesis proteica. Por otro lado, los aminocidos y pptidos contribuyen directamente al sabor de los alimentos y son precursores de los componentes aromticos y las sustancias coloreadas que se forman mediante las reacciones trmicas y/o enzimticas que ocurren durante la obtencin, preparacin y almacenamiento de los mismos.
Aminocido. Los aminocidos son cidos carboxlicos que contienen un grupo amino. Existen unos cien en la naturaleza. En el hidrolizado total de las protenas existen veinte aminocidos que tienen, con algunas excepciones, la frmula general siguiente: R-CH-COOH NH2 En el caso ms sencillo, el radical R es un tomo de Hidrgeno (cidoaminoactico o glicina), en los dems aminocidos R es un resto aliftico, aromtico o heterocclico, que puede ser portador de otros grupos funcionales. Existen diez aminocidos, denominados aminocidos esenciales, que el organismo es incapaz de sintetizar y que deben ser aportados por la alimentacin. El organismo no los puede sintetizar porque carece del mecanismo necesario para elaborar los cetocidos correspondientes; se ha comprobado que si se le suministran stos y sales de amonio es capaz de elaborarlos. Los aminocidos constituyentes de las protenas son, aproximadamente, veinte: alanina, arginina, asparagina, cido asprtico, cistena, cido glutmico, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptfano, tirosina y valina. iminocidos,Todos ellos son aminocidos excepto dos, que son la prolina y la hidroxiprolina, que tambin pueden considerarse como aminocidos por su similitud estructural. Se les llama aminocidos porque el grupo amino est unido al carbono de la cadena que es, por convenio, el tomo de carbono adyacente al grupo carboxilo. Los aminocidos contienen tantos grupos cidos como bsicos, por lo que tienen propiedades cidas y bsicas dbiles y se les llama anfolitos. Se comportan como anfiprticos porque pueden aceptar o donar electrones. Las molculas de aminocidos transportan una carga negativa y otra positiva, lo que da como resultado una carga total nula, esta forma se conoce como "zwitterion" del aminocido. La carga total transportada por un aminocido depende del pH de la solucin y de los valores de la constante de acidez de los grupos ionizables presentes. Si el pH es mucho mayor que el valor de la constante de un grupo, se libera un protn y la molcula tendr una carga negativa, pero si el pH es menor, tendr carga positiva. El hecho de que a diferentes valores de pH el aminocido tenga distintas formas y lleve distintas cargas netas se utiliza en muchos mtodos analticos, como en la electroforesis y en la cromatografa de intercambio inico. El punto iso-inico de una molcula es el pH en el que el nmero de cargas negativas debidas a los protones perdidos es igual al nmero de cargas positivas debidas a los protones ganados, entonces predomina la forma zwitterinica. El punto isoelctrico es el pH en el que las molculas no presentan migracin en un campo elctrico y puede determinarse experimentalmente por electroforesis; en los aminocidos es igual que el puntoisoinico. Un aspecto importante en el anlisis de los aminocidos es el hecho de que no se pueden detectar en el visible-UV. Existen varios reactivos que reaccionan con los aminocidos dando compuestos coloreados o fluorescentes y que, por tanto, pueden utilizarse para anlisis cualitativos o cuantitativos. Esto es lo que se denomina derivatizacin de los aminocidos. Los mtodos fluorimtricos tienen muchas ventajas respecto a la espectrofotometra para el anlisis de aminocidos. Necesidades proteicas. Se requiere un criterio para fijar las necesidades o exigencias en protenas para el ser humano. Por ello se establece una "protena de referencia" o "patrn". Conocida la composicin en aminocidos de las protenas de los distintos alimentos que se consumen y cuales han demostrado poseer mayor valor biolgico, a saber: la de la leche, la del huevo y las de la carne; y teniendo en cuenta la composicin cuali-cuantitativa en aminocidos, se ha adoptado dicha "protena de referencia" o "patrn". En la calidad de las protenas influye el contenido en aminocidos esenciales, y es importante la presencia de "limitantes". En efecto,se llama as al aminocido esencial que en una protena dada se encuentra en cantidad relativa ms baja con respecto a la protena patrn porque limita el aprovechamiento de esa protena a los fines biolgicos. Es importante determinar el contenido en aminocidos, en conjunto, para estimar el grado de protelisis enzimtica que ha sufrido el producto, as como la proporcin de cada uno de ellos, como componentes de la protena, cuando se desea establecer su valor biolgico. La determinacin de aminocidos en alimentos permite extraer algunas conclusiones acerca de su composicin; por ejemplo, la gelatina usada como espesante se diferencia rpida y sencillamente, de otros hidrocoloides (grasas vegetales, almidn, etc.), en funcin de su composicin aminoacdica.
Objetivos. En primer lugar recogemos los distintos mtodos oficiales y estndares para el anlisis de aminocidos en alimentos, encontrados en Mtodos Oficiales de Anlisis editados por el Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentacin (1986) y en Methods of Analysis of AOAC (1995), as como algunos mtodos recomendados. Posteriormente, en la discusin, tratamos sobre las distintas tcnicas de separacin (cromatogrficas y electroforesis), del analizador automtico de aminocidos, de los distintos reactivos derivatizantes y el tipo de deteccin apropiada para cada uno, y las ventajas y desventajas de la derivatizacin, tanto antes (precolumna) como despus (postcolumna) de la separacin. 2. Mtodos de anlisis de aminocidos en alimentos. Mtodos oficiales. Determinacin de prolina en miel. Reaccin de la prolina con ninhidrina en medio cido y posterior determinacina 517 nm de la absorbancia del compuesto formado. Preparacin de la muestra: Suponiendo que la miel ya ha sido separada del panelpor escurrimiento a travs de un filtro de luz de malla, optaremos por realizarel siguiente paso, la homogeneizacin. Reblandecer la muestra calentando entre25-30C agitndola al mismo tiempo. Una vez homogeneizada se calienta a 50Cal bao Mara hasta que se consiga la fusin y se deja enfriar rpidamente. Determinacin de hidroxiprolina en carnes. Previa hidrlisis en medio cido de las protenas y oxidacin de lahidroxiprolina. El derivado formado con el p-dimetilaminobenzaldehido se valoracolorimtricamente a 560 nm.. Preparacin de la muestra: Primero, se quitan las diferentes capas protectorasdel producto para poder tomar una muestra representativa. Se parten trozos de0,5 - 1 cm y se cortan dichos trozos en pequeos cubos. Despus se pasan poruna trituradora varias veces hasta conseguir una mezcla homognea. Se guarda enfrascos limpios y secos para prevenir la prdida de humedad. Se conserva enrefrigeracin de forma que evite su deterioro y cualquier cambio en sucomposicin. Mtodos estndares. Determinacin de prolina en miel. Determinacin de hidroxiprolina en carnes. Determinacin de aminocidos en preparados vitamnicos. Determinacin de lisina en suplementos nutricionales. Los grupos amino de las protenas reaccionan con DNFB dando lugar a losderivados lisina-DNFB. Posteriormente se produce una hidrlisis cida y ladeterminacin en un analizador de aminocidos de la lisina. Determinacin de triptfano en alimentos. La muestra es hidrolizada en medio bsico, seguidamente se realiza un ajuste depH. El triptfano es separado por cromatografa lquida de intercambio inicoy determinado por un detector UV a 280 nm. Determinacin de aminocidos sulfurados en alimentos (metionina y cistena). En primer lugar las protenas son oxidadas con cido perfrmico paraconseguir cido cisteico y metionina sulfonada, luego se realiza una hidrlisiscida con HCl. Realizamos una cromatografa de intercambio inico aplicndoleun detector que sea capaz de medir a 570 nm. Mtodos recomendados. Anlisis de aminocidos por HPLC seguido del mtodo del fenilisotiocianato. (Lab. Enzymology and Physical Chemistry of Proteins). A continuacin, incluimos un protocolo tpico del anlisis de aminocidos enharinas: Dejar a reflujo la muestra con HCl 6N durante 24 horas. Evaporar a sequedad en evaporador rotatorio. Aadir agua y evaporar a sequedad. Realizar el examen cromatogrfico de una solucin problema al 10% de lamuestra tratada en solucin acuosa de isopropanol a 10%. El sistema solvente: n-butanol/Hac/H2O en proporcin 12:3:5. Soporte papel Whatman n1.
Longitud del papel 50 cm. Mtodo cromatogrfico descendente. Duracin: 12 horas. Solucin reveladora: solucin acetnica de ninhidrina al 0.25%. Condiciones de revelado: 20 min a 105C. Comparacin frente a muestras puras de clorhidratos de aminocidos.
3. Tcnicas de separacin de aminocidos. A menudo es necesario identificar y cuantificar los aminocidos individualesde una mezcla, tanto en estudios metablicos como en las investigaciones de laestructura de las protenas. El uso de la cromatografa en capa fina o de la electroforesis son adecuadospara averiguar el nmero y la cantidad relativa de los diferentes aminocidospresentes en una muestra (anlisis cualitativo), aunque para los anlisiscuantitativos es necesaria la cromatografa de gases o un analizador de aminocidos. Cromatografa en capa fina. Una importante aplicacin de la cromatografa en capa fina es la de servir como gua para el desarrollo de las condiciones ptimas para realizar separaciones por cromatografa de lquidos en columna. Proporciona una idea rpidade los aminocido mayoritarios existentes en la muestra. Las ventajas de este procedimiento son la rapidez y el bajo coste de los ensayos experimentales. De hecho, algunos cromatografistas son de la opinin de que los ensayos en capa fina deberan preceder siempre al uso de la columna En la cromatografa de papel se pueden aplicar grandes volmenes de muestra, lo que permite la elucin posterior de un aminocido en particular para su posterior purificacin y anlisis, factor que tiene gran importancia en la identificacin de un constituyente desconocido de la muestra. Antes de la realizar la cromatografa, es necesario eliminar las sustancias que interfieren, tales como protenas, carbohidratos y sales, lo que puede hacerse con una resina de intercambio inico. Los aminocidos retenidos pueden eluirse a continuacin aadiendo a la columna un pequeo volumen de amoniaco y lavando despus con agua destilada. La separacin de los aminocidos se basa en que stos se reparten de modo diferencial entre la fase mvil y la fase estacionaria. Generalmente se realizan por el procedimiento ascendente: introduciendo el borde inferior de la placa cromatogrfica en el eluyente que ser succionado por accin de las fuerzas capilares del recubrimiento de la superficie del la placa. La identificacin de un aminocido se realiza comparando los valores de Rf(factor de retraso: cociente entre la distancia recorrida por el compuesto desde el origen y la distancia recorrida por el solvente desde el origen), con otros tomados como referencia, debindose utilizar al menos tres sistemas de disolventes distintos para establecer su identidad con un cierto grado de seguridad. La naturaleza de los aminocidos es un factor importante a la hora de elegir un disolvente, ya que los diferentes solventes pueden permitir una mejor resolucin de los componentes cidos, bsicos o neutros. En general, aumentando la proporcin de agua en el disolvente se incrementan todos los valores de Rf e introduciendo pequeas cantidades de amoniaco aumentan los valores del factor de retraso de los aminocidos bsicos. Algunos disolventes contienen compuestos nocivos, por ejemplo el fenol, lo que restringesu uso rutinario. La composicin qumica del disolvente puede tambin limitarel rango de reactivos de localizacin que pueden aplicarse satisfactoriamente. Por ejemplo, el cido sulfanlico no puede utilizarse con disolventes fenlicos. El poder de resolucin de la cromatografa de capa fina puede aumentarse empleando tcnicas bidimensionales, o sea, utilizando dos disolventes distintos. Se aplica una cantidad de muestra mayor que la utilizada generalmente para la separacin cromatogrfica de una dimensin (aproximadamente el triple) en una esquina del papel o placa y se hace correr en una dimensin. Entonces el cromatograma se seca completamente al aire, se gira un ngulo de 90 y se desarrolla con el segundo solvente. Tras un nuevo secado, se sumerge en el reactivo de localizacin elegido. En la cromatografa de dos dimensiones, la composicin de los dos disolventes es la que determina el orden en que debe utilizarse. Las separaciones bidimensionales permiten la resolucin de un gran nmero de aminocidos presentes en una muestra, ya que los que tienen una movilidad similar en la primera dimensin se
separan en la segunda. sto es muy til en la deteccin de los componentes que estn en muy baja concentracin y pueden quedar enmascarados por otros compuestos que tengan una concentracin alta cuando se utiliza la cromatografa en una dimensin. Electroforesis. La electroforesis es un proceso en el cual las especies cargadas (iones o partculas coloidales) se separan en funcin de su distinta velocidad de migracin en un campo elctrico. Desde los aos cincuenta, las separaciones electroforticas fueron la piedra angular de gran parte de la investigacin de qumicos y bilogos moleculares relacionada con la separacin y anlisis de protenas, polinucletidos y otros biopolmeros. Estas separaciones han sido (y continan siendo) muy eficientes y de una extensa aplicacin, pero por desgracia, son unas tcnicas muy lentas y laboriosas que tienen tendencia a ser poco reproducibles. A mediados de los ochenta, esta situacin cambi espectacularmente con la aparicin de aparatos comerciales para realizar electroforesis analticas a microescala en columnas capilares (electroforesis capilar). El hecho de que los distintos aminocidos transporten diferentes cargas netas aun pH particular, permite separarlos de una mezcla mediante la electroforesis de alto o bajo voltaje. Los medios utilizados ms frecuentes como soporte son elpapel o las placas de capa fina (celulosa o gel de slice), pudindose utilizar para visualizar las manchas, los reactivos de localizacin que describiremos ms adelante. Las separaciones se pueden realizar ms fcilmente con alto que con bajo voltaje, siendo una de las principales ventajas de la primera, el que las sales y otras sustancias presentes en la muestra afectan en menor extensin la calidad del electroforetograma. A pesar de que se pueden conseguir separaciones electroforticas con tampones a distintos pH, en la prctica los valores de pH escogidos estn entre 2 y53. A pH 2 todos los aminocidos tienen carga positiva y los de tipo bsico que tienen la mayor carga positiva migran ms rpidamente hacia el ctodo, mientras, que a pH 5 los aminocidos se dirigen hacia ambos electrodos, dependiendo de la carga transportada. Las separaciones a pH 53 se utilizan para determinar la naturaleza cida o bsica de un aminocido desconocido. Cromatografa de gases. Se han hecho muchos ensayos para aprovechar la velocidad y sensibilidad que ofrece la cromatografa de gases, pero aunque se han realizado considerables progresos en el desarrollo de tales mtodos, an no se utiliza de forma rutinaria para el anlisis de aminocidos en muestras biolgicas. La razn de sto radica en el hecho de que los aminocidos, aunque similares, son compuestos qumicamente heterogneos y adems no son suficientemente voltiles a menos que se conviertan en algn derivado apropiado. Aparecen dificultades no slo a la hora de elegir el mtodo de obtencin de tales derivados, sino tambin en la seleccin de una fase estacionaria que sea capaz de resolver los derivados de todos los elementos de un grupo tan diverso de compuestos. A la hora de elegir el detector aparecen tambin problemas similares. Analizador automtico de aminocidos - HPLC. Existen dos tcnicas para la determinacin de aminocidos a travs de cromatografa lquida: cromatografa de reparto en fase reversa y cromatografa de intercambio inico. La cromatografa de lquidos de alta resolucin es la tcnica de separacin ms ampliamente utilizada. Las razones ms importantes son su sensibilidad, su fcil adaptacin a las determinaciones cuantitativas exactas, su idoneidad para la separacin de especies no voltiles o termolbiles y, sobre todo, surja aplicabilidad a sustancias que son de primordial inters en la industria, en muchos campos de la ciencia y para la sociedad en general. Algunos ejemplos de estos materiales incluyen los aminocidos, protenas, cidos nucleicos y otros. Cromatografa de reparto en fase reversa. La cromatografa en fase reversa consiste en un disolvente fundamentalmente polar como fase mvil y una cadena hidrocarbonada ligada como fase estacionaria. Algunas de las ventajas ms sustanciales de esta alternativa son su gran reproducibilidad, tiempos de retencin cortos, velocidad de muestreo alta, sistema cromatogrfico simple y amplio campo de aplicacin. Por todoello, las aplicaciones son cada vez ms numerosas. La selectividad se basa en las interacciones especficas entre el soluto y la fase mvil, ya sea de tipo polar, de formacin de puentes de hidrgeno o mediante equilibrios secundarios provocados al variar
la composicin de la fase mvil (cido-base, formacin de complejos o pares inicos, adicin de complejos metal-ligando o reactivos quirales para separar los ismeros pticos, etc.). Cromatografa de intercambio inico. La cromatografa inica est relacionada con los mtodos modernos y eficaces para la determinacin de iones que se basan en el uso de resinas de intercambio inico. Existen mtodos automatizados para la separacin y deteccin de aminocidos y otras especies inicas en mezclas complejas. El desarrollo de la HPLC moderna empez a finales de los aos sesenta, pero su aplicacin a la separacin por intercambio inico se retraso debido a la inexistencia de un mtodo general y sensible para la deteccin de especies como los cationes alcalinos y alcalinotrreos,y aniones como los haluros, acetato y nitrato. Esta situacin se remedi en1975 al desarrollarse por tcnicos de Dow Chemical Company la tcnica de supresin del efluente, la cual hace posible la deteccin conductimtrica de los iones eludos. El analizador de aminocidos, con el que se lleva a cabo la cuantizacin de los aminocidos se basa en esta tcnica. Analizador automtico de aminocidos. La separacin de aminocidos fue el primer proceso cromatogrfico automatizado con derivatizacin post-columna. La separacin fue llevada a cabo por Moore, Spackman y Stein (1958), mediante un intercambio inico, seguido de su cuantizacin de cada componente eluido de la columna por reaccin con ninhidrina y posterior deteccin en el visible. Este mtodo se ha realizado durante ms de treinta aos, en cualquier laboratorio de protenas. El equipo usado actualmente se basa en el original pero introduciendo algunas modificaciones para conseguir un mejor grado de eficacia. Consiste en bombear tampones de pH o de fuerza inica variables, a travs de una columna termostatizada. Entre las novedades est la fabricacin de resinas de alta calidad, desarrollo del HPLC, sistemas de automatizacin sofisticados y un aumento en la sensibilidad de los mtodos de deteccin. La separacin tiene lugar en una columna de resina de poliestireno sulfonado. Inicialmente el pH de la fase mvil es bajo, por lo que los aminocidos cargados positivamente se vern atraidos por los grupos sulfurosos ( SO3-). Conforme se va aumentando el pH del tmpon los aminocidos se eluyen diferencialmente al disminuir su carga positiva y ser menos atraidos por el anin. A pH 3.5 los aminocidos con un grupo cido extra, de su cadena tendrn muy poca afinidad por la resina y sern los primeros en salir de la columna, mientras que los que tengan un grupo extra ionizable capaz de transportar una carga positiva (e.g. lisina, histidina) sern retenidos fuertemente por la resina y se eluirn slo cuando el pH haya aumentado sustancialmente y se haya reducido su carga neta positiva. Adems del pH tambin hay que considerar la concentracin del tampn eluyente, pues influye en la elucin de tal modo que cuando la concentracin de ion aumenta en mismo, los aminocidos se eluyen ms rpidamente. Las interacciones no inicas entre los aminocidos y la resina tambin influyen en la secuencia de elucin, permitiendo que algunos aminocidos que tienen un comportamiento similar se eluyan de forma separada. La resolucin cuantitativa de mezclas de aminocidos se consigue variando la composicin del tmpon, bien incrementando del pH y manteniendo constante la concentracin, o viceversa, o incluso variando ambos. Hay otros factores menos significativos en la calidad de la separacin como son la temperatura, la velocidad de flujo del tampn o el tipo de catin utilizado. Aspectos prcticos del analizador: Columna: en los analizadores tipo se usan dos columnas, una para separar los aminocidos cidos y neutros y otra para los bsicos. Las de vidrio o acero inoxidable dan picos estrechos y altos, mejorando la separacin de aminocido similares. Solucin tampn: suele ser citrato sdico o de litio, al que se le aade un detergente, un antioxidante y un conservante. Actualmente se utilizan dos disoluciones tampn, una cida y otra bsica. Se mezclan en proporciones variables para conseguir un aumento de pH. De esta forma se mejora la separacin disminuyendo el tiempo de anlisis y se eliminan las fluctuaciones bruscas dela linea base debidas a cambios repentinos en el tampn, como sucedia con anteriores tcnicas. Temperatura: puede ser constante para evitar cambios en el pH y en la ionizacin de los aminocidos, o bien puede utilizarse un programa de temperaturas que implica un cambio de sta en diversos momentos del proceso.
Flujo de la columna: se requiere un flujo de tampn constante para permitir la reproducibilidad. Se consigue por uso de bombas de presin o de desplazamiento constante. Deteccin: es necesaria una segunda bomba para el reactivo derivatizante (generalmente ninhidrina) que se ha de mezclar con el eluyente de la columna. Cuando la reaccin ha tenido lugar, la corriente se controla en una clula de flujo de un colormetro o un fluormetro. Se mide la absorbancia continuamente a 570 y 440 nm. para detectar los amino e iminocidos respectivamente. El anlisis aminoacdico es un buen ejemplo del hecho de que raramente hay un nico sistema de separacin para problemas analticos, sino que de la eleccin del sistema apropiado depende el problema analtico. Por ejemplo, de la matriz en la cual los aminocidos van a ser determinados, de la sensibilidad deseada yen la velocidad requerida para el anlisis. Los actuales mtodos de deteccin para aminocidos dependen de la reaccin del grupo amino primario del aminocido para formar un derivado coloreado o fluorescente, esta derivatizacin tiene lugar tanto antes como despus de que la separacin de los aminocidos haya sido efectuada. La menor variedad de tipos de aminocidos en comparacin con las estructuras de los pptidos hace que los modos de HPLC disponibles para el investigador sean la cromatografa de intercambio catinico (CEC), y la cromatografa de fase reversa (RPC). La cromatografa en fase reversa es ms apropiada para la separacin de derivados aminoacdicos que para aminocidos libres. La eleccin de HPLC est limitada por la eleccin del agente de derivatizacin y/o la decisin de usar tanto pre- como post-columna de derivatizacin, de hecho, algunos de los ms interesantes descubrimientos llevados a cabo en la separacin de aminocidos por HPLC reside en el desarrollo y optimizacin de nuevos agentes de derivatizacin. Reacciones muy rpidas como la derivatizacin con fluorescamina y ortoftaldehido (OPA) estn siendo empleadas en aumento con el clsico mtodo de la ninhidrina. 4. Reactivos de derivatizacin. El problema de la derivatizacin de aminocidos est concentrado en la deteccin selectiva y sensible de los mismos. Las cantidades de muestra disponibles son muy pequeas, ya sean protenas cuya estructura vaya a ser determinada o muestras de investigaciones en el campo de la ciencia alimenticia, de modo que la reaccin de derivatizacin debera permitir la deteccin en el rango del pmol. La derivatizacin puede ser llevada a cabo antes de la separacin. Debera ocurrir cuantitativamente para producir productos sencillos para cada aminocido, el reactivo no debera interferir. Es probable que la derivatizacin genere productos que son ms parecidos el uno al otro, de cualquier modo, la altaselectividad de separacin de los sistemas cromatogrficos implica que raramente haya problemas. La derivatizacin precolumna puede ser llevada a cabo automticamente inmediatamente antes de la separacin. La derivatizacin tras la separacin requiere, en general, una complejidad instrumental mayor. Los instrumentos comerciales a menudo necesitan ser optimizados para alcanzar sensibilidad de deteccin ms alta. Ninhidrina. La ninhidrina (hidrato de tricetohidrindeno) reacciona con los aminocidos en medio cido (pH entre 3 y 4) y en caliente produciendo amoniaco, dixido decarbono y un complejo de color prpura azulado. Todos los aminocidosprimarios forman el mismo complejo tras su reaccin con ninhidrina, haciendo este agente inapropiado para la precolumna de derivatizacin. La mayora de columnas de HPLC de intercambio catinico utilizadas para el anlisis de aminocidos con postcolumna basada en la ninhidrina todava emplean resinas de sulfonato de poliestireno / divinilbenceno. Los primeros sistemas automticos para el anlisis de aminocidos descritos en 1958 basados en la separacin de aminocidos por cromatografa de intercambio catinico y posterior reaccin con ninhidrina, permanecen hoy da como la metodologa ms fiable para el anlisis de aminocidos en pptidos y protenas. Analizadores comerciales basados en esa metodologa estn disponibles en compaas como Beckman y Pharmacia. A altas temperaturas (>=100C), todos los aminocidos primarios reaccionan con dos molculas de ninhidrina para formar un cromforo (prpura de Ruthermann) con mxima absorcin a 570 nm. En la cuantificacin de los aminocidos individuales puede utilizarse el coeficiente de absorcin molar del compuesto coloreado, aunque su valor vara de un aminocido a otro y debe determinarse para las
condiciones particulares del anlisis. Sin embargo, se debe escoger un valor de referencia para utilizarlo en la cuantificacin de los aminocidos totales de una mezcla. La reaccin coloreada de la ninhidrina se utiliza en trabajos analticos, as como en la visualizacin de las bandas de los aminocidos despus de su separacin por electroforesis o por cromatografa. El reactivo que se utiliza en estas circunstancias se prepara generalmente disuelto en etanol; cuando se aade2,4-6colidina, las diferencias de color entre cada mancha ayudan a la identificacin de los distintos aminocidos. OFtaldehido (OPA). El OPA fue originalmente introducido como un reactivo alternativo a la ninhidrina en la post columna de derivatizacin y suministr un significante incremento en la sensibilidad. Los aminocidos reaccionan con el OPA en presencia de un reductor fuerte, en condiciones alcalinas (pH 9-11), dando un compuesto fluorescente. La separacin en fase reversa seguida de deteccin fluorescente constituye un mtodo de deteccin rpido, sensible y selectivo para todos los aminocidos con grupos amino primario. Los pptidos son menos reactivos que los -aminocidos y las aminas secundarias no reaccionan. Aunque el OPA fue originalmente aplicado solamente para post columnas de derivatizacin ahora est ampliamente usado como un agente para pre columnas. Mientras que la separacin de aminocidos siguiente a una pre columna de derivatizacin est llevada a cabo por cromatografa de fase reversa, ambas, cromatografa de fase reversa y cromatografa de intercambio catinico pueden ser utilizadas cuando el OPA es el agente de derivatizacin en la postcolumna. Una desventaja del OPA reside en la relativa inestabilidad de sus derivados, quizs aadida a los problemas de cuantizacin, aunque sto no es de gran dificultad en la tcnica de derivatizacin en postcolumna. Sin embargo, en precolumna y desde el punto ms bajo de pH 72 hasta un pH tpico de reaccinde 95, los productos deben ser inmediatamente aplicados a un sistema cromatogrfico. Bajando estos dos pH se amortigua la reaccin y sirve para estabilizar ligeramente los productos de reaccin. La mayor desventaja del OPA es que no reacciona con aminas secundarias (prolina e hidroxiprolina) aunque esto puede ser solventado con su oxidacin por cloramina-T o hipoclorito. Una estratgica combinacin del uso de OPA con FMOC (9-fluorenilmetil cloroformato) ha sido recientemente introducida para solucionar esta deficiencia. El mtodo con OPA se utiliza especficamente con precolumna de derivatizacin para el anlisis de aminocidos porque es ms sensible y tarda menos tiempo que otros mtodos HPLC. Fluorescamina. La fluorescamina fue tambin introducida como una posible alternativa a la ninhidrina en postcolumnas de derivatizacin. Todas las aminas primarias reaccionan con la fluorescamina en medio bsico (pH 9-11) dando un producto fluorescente con un incremento en sensibilidad de deteccin mayor que la ninhidrina, aunque la fluorescamina por si misma no tiene fluorescencia. El producto fluorescente es inestable en disolucin acuosa y el reactivo debe prepararse en acetona. Las aminas secundarias no reaccionan, a menos que se conviertan previamente en aminas primarias, lo que puede hacerse con N-clorosuccinimida, hipoclorito o cloramina-T. Aunque el reactivo tiene inters por su rpida velocidad de reaccin con los aminocidos a temperatura ambiente, la reaccin no es tan sensible como la de la ninhidrina. Isotiocianato de fenilo (PITC). El PITC, tambin conocido como reactivo de Edman, ha sido largamente usado para la secuenciacin de polipptidos y protenas y fue introducido para el anlisis de aminocidos al principio de los aos ochenta. Es actualmente, el agente ms usado para pre columnas de derivatizacin, seguido de cromatografa en fase reversa, en anlisis de aminocidos, siendo empleado para mezclas de aminocidos de una gran variedad de fuentes. En lugar de ser analizados como derivados de PTH (feniltiohidantoin), como ocurre durante la secuenciacin de pptido o protenas, los aminocidos son analizados como derivados de PTC (feniltiocarbamol). As, a pH alcalino, los aminocidos primarios y secundarios producen derivados de PTC, que pueden ser registrados por absorbancia UV (240-255 nm) con un lmite de deteccin en el rango de 5 a 50 pmol. Todos los aminocidos forman derivados mono-PTC, exceptolisina y cistena, que producen dobles formas PTC. Los productos son relativamente estables, aunque alguna conversin al derivado PTH puede ocurrir si el pH no se controla adecuadamente. Aunque la metodologa PITC puede ser considerada superior al resto de las tcnicas en un gran
nmero de aspectos, tiene una mayor desventaja en que algunos derivados PTC de aminocidos son fuertemente afectados por la presencia de algunas sales, cationes divalentes, metales e iones tampon. As, mientras el acetato amnico, el cloruro sdico y el borato sdico se ha encontrado que no tienen efecto en aminocidos PTC, otras sales, como el fosfato de sodio y el bicarbonato de sodio si que lo tienen. Adems la contaminacin por trazas de iones metlicos se ha encontrado que reduce la formacin de aminocidos PTC. Incluso aadiendo EDTA se han conseguido mejores rendimientos para la derivatizacin. Cloruro de dansilo y cloruro de dabsilo. El cloruro de dansilo (cloruro de 1-dimetil amino naftaleno-5-sulfonilo) fue inicialmente introducido para el anlisis del nitrgeno terminal de los aminocidos en pptidos y protenas, un propsito para el cual todava es empleado. Reacciona con aminas primarias y secundarias para producir derivados fluorescentes. Su aplicacin adolece de la presencia de numerosos productos laterales y de la formacin de mltiples derivados de ciertos aminocidos. Adems de sto est el requerimiento de un largo tiempo de reaccin. As, aunque el cloruro de dansilo es frecuentemente empleado por lo investigadores para la derivatizacin en precolumna seguida de cromatografa en fase reversa, este mtodo nunca ha sido ampliamente aceptado para el anlisis automtico de aminocidos. El cloruro de dabsilo (cloruro de dimetil amino azobenceno sulfonilo) es un agente muy relacionado con el cloruro de dansilo. Fue introducido y desarrolla por Chang y sus colaboradores, para la deteccin de aminocidos en el rango del visible y en el nivel del pmol. Reacciona con aminocidos primarios y secundarios para producir derivados que tienen una gran absorbancia en el rango del visible. La reaccin se realiza a unos 70C y un pH de 8 a 85,produciendo derivados altamente estables en 10 o 12 minutos. Se forman mono y bis-derivados de lisina, tirosina e histidina. A pesar de las ventajas sobre el cloruro de dansilo como agente de derivatizacin, la tcnica del cloruro de dabsilo tiene una tolerancia limitada a la presencia de sales, y aun no est clara cmo se vera afectada la deteccin a altos niveles de sensibilidad (rango del 10 al 20 pmol) por la presencia de metales, sales y otros contaminantes. Aunque no se usa ampliamente en anlisis automticos de aminocidos como la ninhidrina, el OPA y el PITC, una adaptacin comercial del mtodo del clorurode dabsilo est disponible en Beckman Instruments. Cloruro de 9-Fluoroenilmetil cloroformato (FMOC-Cl). El FMOC-Cl reacciona con grupos amino para formar derivados carbamados altamente fluorescentes y estables. Este agente altamente reactivo, originalmente y todava usado como grupo amino protector en sntesis de pptidos, fue primeramente aplicado como un agente derivatizante en precolumna para anlisis de aminocidos. El FMOC-Cl reacciona con todos los aminocidos a pH alcalino y temperatura ambiente para producir derivados aminoacdicos altamente estables que tienen una fluorescencia comparable a los derivados de OPA. Se pueden formar mono- y bis-derivados con histidina, tirosina y lisina. Las proporciones relativas de estos derivados varan en funcin del pH y de la proporcin de reactivo y aminocido. Durante la reaccin con FMOC-Cl, los productos de hidrlisis del reactivo que se forman tienen fluorescencia parecida a la de los derivados aminoacdicos. Estos productos interfieren en la separacin por cromatografa de fase reversa a menos que sean eliminados por el disolvente orgnico de extraccin, antes de aplicar la muestra a la columna de cromatografa de fase reversa. Una versin automatizada de este procedimiento de derivatizacin ha sido desarrollada y comercializada. Betnr y Foldi solucionaron el problema de las interferencias por la elusin de grandes picos de FMOC-Cl y sus productos de hidrlisis, FMOC-OH, que son eludosen la misma regin cromatogrfica que muchos de los aminocidos FMOC, por derivatizacin del volumen de exceso FMOC-Cl con una amina hidrofbica. El derivado resultante es eludo ms tarde en el cromatograma despus de todos los aminocidos FMOC. Una combinacin entre OPA/FMOC ha sido descrita, la cual usa un analizador comercialmente disponible (Hewlett-Packard Amino Quant). La reaccin de aminocidos primarios es llevada a cabo inicialmente por OPA, seguida por la reaccin de prolina e hidroxiprolina con FMOC. La determinacin de la fluorescencia para los derivados de aminocidos primarios OPA y FMOC-prolina es llevada a cabo entonces a longitudes de onda apropiadas. 7-cloro y 7-fluro-4-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazole (NBD-Cl y NBD-F).
Reactivos de derivatizacin basados en la estructura del nitrobenzofurazan, NBD-Cl y NBD-F, tienen probada utilidad para aplicaciones especficas en el anlisis de todos los aminocidos. El NBD-Cl fue introducido por Ghosh y por Whitehouse como un agente fluorignico para aminas, incluyendo aminocidos y posteriormente Rot como una tilherramienta para el anlisis de aminocidos, particularmente por su realzadareactividad con aminas secundarias. Desde entonces, este reactivo ha tenido empleo ocasionalmente para la deteccin de aminocidos, con particular nfasis en la deteccin de prolina e hidroxiprolina. NBD-Cl ha sido aplicado a la derivatizacin en prey post-columna, con un lmite de deteccin en stas ltimas de 1 nmol para prolina e hidroxiprolina y un lmite de deteccin en las primeras algo menor. Aunque NBD-Cl es estable y permite una deteccin sensible de aminocidos, reacciona algo ms despacio con aminas y no ha tenido un uso extendido como agente analtico general para aminocidos. NBD-F es ms reactivo que su anlogo de cloro, permitiendo una derivatizacin ms rpida, acompaada de una gran fluorescencia para prolina ehidroxiprolina. De forma similar al NBD-Cl, el NBD-F ha sido aplicado tanto aderivatizaciones precolumna como postcolumna. Los lmites de deteccin para la precolumna estn definidos en el rango de 5-15 fmol para la mayora de los aminocidos. El NBD-F tampoco ha sido utilizado ampliamente como mtodo analtico para aminocidos, aunque algunos investigadores emplean este reactivo habitualmente. Otros reactivos derivados del isotiocianato. El 4-N,N-dimetilamino-4-azobencenoisotiocianato (DABITC) ha sido usado satisfactoriamente en la secuenciacin manual y anlisis de nitrgeno terminal de pptidos y protenas. La degradacin tipo Edman de pptidos yprotenas efectuada por este agente produce derivados tiohidantoin coloreados(DABTH), que pueden ser separados por cromatografa de fase reversa. El mtodo de degradacin generalmente comprende un doble acoplamiento, primero con DABITC y luego con PITC. La 4-N,N-dimetilnaftilazobenzeno homologa del DABITC(DANABITC) ha sido tambin aplicada con xito, aunque en menor grado que elDABITC. Difenil indenonilisotiocianato (DIITC) ha sido estudiada para ser utilizada cuando la espectrometra de masas por ionizacin qumica es acoplada con identificaciones previas por cromatografa de fase reversa. La deteccin de derivados de tiohidantoin (DITH) se lleva a cabo por determinacin UV (en el rango por debajo del pmol). La deteccin electroqumica es un utensilio alternativo. Otros reactivos isotiocianatos de derivatizacin precolumna son4-(t-butiloxicarbonilaminometil) fenil isotiocianato (BAMPITC, deteccinfluorescente), trimetilsisil isotiocianato para anlisis de secuencia decarbono terminal (deteccin UV) y p-N,N-dimetilaminofenil isotiocianato (DMAPI)como una instrumento electroqumico para el anlisis de aminocidos. Reactivos mixtos. Otros reactivos estn siendo continuamente desarrollados y utilizados para detecciones de aminocidos. Algunos tienen aplicaciones muy especficas y limitadas, mientras otros son tratados como posibles competidores para amplios usos en sistemas automticos. Tales reactivos incluyen el cido2,4,6-trinitrobencensulfnico (TNBS) y su anlogo 2,4-dinitrobenceno (DNBS),N,N-dietil-2,4dinitro-5-fluoroanilina, fluoro-2,4-dinitrobenceno, cido1,1-difenilbrico y 1-fluoro-2,4-dinitrofenil-5-Lalanina amida (reactivo deMarfey). La deteccin fluorescente es posible cuando se emplean reactivos tales como pentano-2,4-diona/formaldehido, 9-antrildiazometano, cloruro laril,2,3-naftalenodicarboxialdehido, succinimida -naftilcarbamato,3-benzoil-2quinolina-carboxaldehido, 9hidroximetilantraceno e isotiocianatofluorescente y 1-naftil isocianato. Un reactivo quimioluminiscente,4-isocianatoftalhidrazida, tambin ha sido investigado. Con excepcin delpentano2,4-diona/formaldehido, donde el reactivo fue usado en derivatizacin postcolumna seguida de intercambio inico HPLC de aminocidos, todos los dems fueron utilizados para la derivatizacin previa de cromatografa de fase reversa. En la siguiente tabla se pueden comparar las diferentes caractersticas de los reactivos de derivatizacin ms importantes para la determinacin de aminocidos: REACTIVOS DE DERIVATIZACIN Complejos Mtodo de Posto con: separacin columna 1os CIC o electroforsis Postpre- Deteccin VIS 570 nm
OPA Fluorescamina PITC Cloruro de dansilo Cloruro de dabsilo FMOC-Cl NBD-Cl NBD-F
1os 1os 1os y 2os 1os y 2os 1os y 2os 1os y 2os 1os y 2os 1os y 2os
CFR (en postcolumna,CIC) CIC o electroforsis CFR CFR CFR CFR CFR CFR
Pre- y postPostPrePrePrePrePre- y postPre- y post-
Fluorescencia Fluorescencia UV 240-255 nm Fluorescencia VIS Fluorescencia Fluorescencia Fluorescencia
Preparacin de las muestras. La reaccin con los derivatizantes forma el mismo cromforo con las aminas primarias que con las secundarias, por tanto las muestras deben estar libres de sales y lpidos antes de que tengan lugar la hidrlisis y los pasos de derivatizacin. La mayor causa de los bajos rendimientos en las reacciones de derivatizacin es la presencia de contaminantes en la muestra, como son las sales no-voltiles, detergentes y lpidos. Las sales y los tmpones interfieren tanto en la hidrlisis como en la posterior derivatizacin, distorsionan la cromatografa y aaden picos extra al cromatograma. Las sales pueden ser eliminadas de las protenas y de los pptidos usando tampnes voltiles y HPLC de fase reversa, precipitacin, dilisis o columnas de filtracin de gel. 5. Derivatizacin pre-columna frente a post-columna Las opiniones de investigadores sobre los ventajas relativas de la derivatizacin antes o despus del HPLC, de aminocidos sern determinadas por los requerimientos de la aplicacin especfica. Factores como la sensibilidad requerida en la deteccin, cantidad de muestra disponible, tipo demuestra, fuente de muestra, velocidad de anlisis y reproducibilidad e incluso consideraciones econmicas influirn en la eleccin entre la derivatizacin pre- o post-columna de aminocidos. Derivatizacin post-columna. La derivatizacin siguiendo a una cromatografa de intercambio catinico de aminocidos libres tiene distintas ventajas, con tal de que la instrumentacin produzca velocidades y temperaturas de reaccin reproducibles. Adems, para la derivatizacin no es necesario proceder al completo, y los problemas de estabilidad del derivado son insignificantes. Otras ventajas son que la automatizacin es fcil y que el tiempo consumido y la prdida a causa de la preparacin de la muestra son innecesarias. Tambin pueden ser usados detectores en serie. Una gran cantidad de experiencias han sido adquiridas del tradicional mtodo de intercambio catinico y tincin con ninhidrina, el cual ha resultado ser fiable, preciso y capaz de una separacin excelente de mezclas complejas de aminocidos y sus metabolitos. Una desventaja con un sistema HPLC convencional es que son necesarios instrumentos ms complejos que para el mtodo de pre-columna. La derivatizacin post-columna requiere la adicin de una o ms bombas para los disolventes y reactivos derivatizantes. Tambin se requiere la adicin de un reactor post-columna, el cual llevar a un ensanchamiento de banda adicional, y por esto, un decrecimiento en la sensibilidad de deteccin. La columna de elucines continuamente diluida por el reactivo derivatizante, provocando un descenso en la sensibilidad de deteccin. As, la mxima sensibilidad alcanzable por derivatizacin post-columna ser menor que en el caso de la precolumna. Derivatizacin pre-columna. sta, acoplada con cromatografa de fase reversa en lugar de con cromatografa de intercambio catinico, fue originalmente introducida como respuesta al incremento en la demanda de mayor sensibilidad y mayor velocidad de anlisis. Las ventajas de la metodologa dela derivatizacin pre-columna incluyen simplicidad, velocidad y alta sensibilidad. Por ello, si se requiere mxima sensibilidad de deteccin, un reactivo fluorescente combinado con la derivatizacin pre-columna es el mtodo ms indicado. Como desventaja est la necesidad de garantizarse la completa reaccin del reactivo derivatizante y la posibilidad de interferencia con la separacin por exceso de reactivo, el medio de reaccin o la produccin de diferentes derivados de un componente. Adems, la estabilidad del derivado puede ser
un importante factor durante la derivatizacin pre-columna, la demora entre la derivatizacin y la inyeccin llega a ser fundamental para los resultados obtenidos. 6. Bibliografa. David J. Holme y Hazel Peck, Bioqumica Analtica, Longman Group Limited,1983. Hans-Dieter Belitz y Werner Grosch, Qumica de los Alimentos, Springer-VerlagGmbH & Co., 4 edicin. Adolfo Leandro Montes, Bromatologa, Editorial Universitaria de Buenos Aires, 2edicin, 1981. Valcarcel-A. Gmez, Tcnicas Analticas de Separacin, Ed. Revert S.A.,1994. Skoog y J.J.Leary, Anlisis Instrumental, Ed. McGraw Hill Interamericana, 1994. Mtodos Oficiales de Anlisis, Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentacin,Direccin General de Poltica Alimentaria. 1986. Methods of Analysis of AOAC, Association of Official Analytical Chemist, 1995.

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