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MANUAL DE PROCESAMIENTO DE MUESTRAS CLINICAS PARA DIAGNOSTICO BACTERIOLOGICO

Fernando Garca Norman Rojas

FACULTAD DE MICROBIOLOGIA UNIVERSIDAD DE COSTA RICA

INDICE 1. SELECCION, RECOLECCION Y TRANSPORTE DE MUESTRAS CLINICAS............................... 1 1.1. CONSIDERACIONES GENERALES............................................................................................... ..... 1 1.2. SELECCION Y RECOLECCION DE MUESTRAS CLINICAS........................................................... 2 1.3. TRANSPORTE Y ALMACENAMIENTO DE MUESTRAS CLINICAS........................................... 17 2. RECEPCION Y EVALUACION DE MUESTRAS CLINICAS............................................................. 20 2.1. CONSIDERACIONES GENERALES. ................................................................................................ 20 2.2. RECEPCION DE MUESTRAS CLINICAS......................................................................................... 21 2.3. EVALUACION DE LA CALIDAD DE MUESTRAS CLINICAS...................................................... 24 3. PROCESAMIENTO DE UROCULT1VOS............................................................................................. 29 3.1. INTRODUCCIN............................................................................................................ ..................... 29 3.2. MUESTRAS DE ORINA PARA CULTIVO........................................................................................ 40 3.3. PRUEBAS DE TAMIZAJE..................................................................................................... ...............46 3.4. METODOS MICROSCOPICOS........................................................................................................... 47 3.5. CULTIVO DE MUESTRAS DE ORINA............................................................................................. 48 3.6. REFERENCIAS..................................................................................................................................... 52 4. PROCESAMIENTO DE COPROCULT1VOS........................................................................................ 53 4.1. INTRODUCCIN................................................................................................................................. 53 4.2. SELECCION, RECOLECCION Y TRANSPORTE DE MUESTRAS................................................ 59 4.3. MATERIALES...................................................................................................................................... 61 4.4. PROCEDIMIENTOS.......................................................................................................... ................... 63 4.5. REPORTE DE RESULTADOS........................................................................................................ .... 73 4.6. REFERENCIAS..................................................................................................................................... 75 5. PROCESAMIENTO DE HEMOCULT1VOS.......................................................................................... 76 5.1. INTRODUCCION ................................................................................................................................. 76 5.2. RECOLECCION DE LA MUESTRA............................................................................................... ... 83 5.3. CONTROL DE CALIDAD.................................................................................................................. 89 5.4. PROCEDIMIENTOS.......................................................................................................... .................. 90 5.5. PROCESAMIENTO DE HEMOCULTIVOS CON REQUERIMIENTOS ESPECIALES................. 92 5.6. REFERENCIAS.................................................................................................................................... 94 6. PROCESAMIENTO DE MUESTRAS DE PIEL Y TEJIDOS BLANDOS.......................................... 96 6.1. INTRODUCCIN............................................................................................................ ..................... 96 6.2. RECOLECCION Y TRANSPORTE DE LA MUESTRA.................................................................... 96 6.3. PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS......................................................................................... 98 6.4. EVALUACION DE CULTIVOS POSITIVOS..................................................................................... 99 6.5. RECOMENDACIONES PARA LA IDENTIFICACION DE PATOGENOS PROBABLES-........... 102 6.6. REFERENCIAS................................................................................................................................... 103

1. Seleccin, recoleccin y transporte de muestras clnicas.

1.1. Consideraciones generales.

En trminos de la efectividad en el trabajo que se realiza en el laboratorio de bacteriologa mdica, nada es ms importante que la apropiada seleccin, recoleccin y el transporte de una muestra clnica. Cuando la recoleccin y el manejo de las muestras clnicas no son prioridades, el aporte que puede realizar el laboratorio al diagnstico y al bienestar general del paciente es verdaderamente pobre. Por consiguiente, tanto el personal del laboratorio as como el personal mdico y de enfermera involucrados en el manejo de las muestras clnicas deben entender la importancia de mantener la calidad de la muestra a travs de todo su procesamiento, incluyendo la recoleccin inicial. En este proceso, sin embargo, es responsabilidad de la direccin del laboratorio establecer los lineamientos para la seleccin, la recoleccin, el transporte y el almacenamiento de muestras clnicas, adems de poner a disposicin esta informacin a todo el personal mdico y enfermera, el cual debe incluir criterios especficos con respecto a normas de bioseguridad, seleccin y recoleccin, transporte, almacenamiento, recepcin y accesin en el laboratorio, rotulacin y aceptabilidad de las muestras clnicas. En trminos generales, se deben seguir las siguientes normas de bioseguridad para la recoleccin y el transporte de las muestras clnicas: Todos los procedimientos para la recoleccin de muestras clnicas deben realizarse utilizando guantes, gabacha y, cuando sea necesario, bozal o mascarilla. Se debe evitar la contaminacin de la parte externa de los recipientes. Todos los recipientes para las muestras clnicas deben ser a prueba de derrames, con tapa de rosca preferentemente, y los recipientes conteniendo las muestras clnicas deben ser transportados en bolsas plsticas con un compartimiento separado para incluir las

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solicitudes de anlisis y otros documentos. Los documentos nunca deben entrar en contacto con las muestras clnicas. No se deben transportar jeringas con agujas al laboratorio. En su lugar, se debe transferir el contenido a un tubo estril o remover la aguja (con su cobertor colocado en posicin), recubrir la jeringa y transportarla en una bolsa plstica. Los recipientes con muestras clnicas derramadas no deben ser transportadas al laboratorio ni las muestras clnicas derramadas deben ser procesadas.

1.2. Seleccin y recoleccin de muestras clnicas.

La seleccin y la recoleccin de muestras clnicas tienen como objetivo fundamental la obtencin de material que sea representativo del proceso infeccioso y que mantenga la integridad y la viabilidad de los agentes infecciosos involucrados. Aunque posteriormente se discuten aspectos especficos con la recoleccin de los diferentes tipos de muestras clnicas, los siguientes aspectos generales deben ser siempre considerados para la seleccin y recoleccin de muestras clnicas: Siempre que sea posible, la muestra clnica debe ser recolectada antes de iniciar la terapia con agentes antimicrobianos. Se debe evitar la contaminacin con flora normal para asegurar que la muestra clnica sea representativa del proceso infeccioso. (ver cuadro 1). Cuadro 1. Fuentes de contaminacin con flora normal. Sitio de infeccin Fuente de contaminacin Endometrio Vagina Fstula Tracto gastrointestinal Infecciones subcutneas y heridas superficiales Piel y membranas mucosas Odo medio Canal del odo externo Sangre Sitio de venipuncin Senos nasales Nasofaringe Vejiga Uretra y perineo

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Se debe seleccionar el sitio anatmico correcto del cual obtener la muestra clnica y se deben utilizar las tcnicas y los materiales apropiados para la recoleccin de las muestras clnicas. Se deben utilizar siempre materiales, instrumentos y equipos estriles para la recoleccin de las muestras. Se debe tener especial cuidado en la recoleccin de muestras clnicas para cultivos por bacterias anaerobias. En general, las muestras de escogencia son las biopsias y los aspirados, mientras que el material infeccioso recolectado por torunda es indeseable (ver cuadro 2). Las muestras clnicas para cultivo por bacterias anaerobias deben ser mantenidas a temperatura ambiente y no deben ser refrigeradas.
Cuadro 2. Aceptabilidad de las muestras clnicas para cultivo por bacterias anaerobias. Muestras aceptables Muestras Inaceptables Aspirado (por aguja o jeringa) Aspirado de traqueostoma Aspirados de senos Aspirado endotraqueal Aspirado endometrial (tero) Esputo expectorado Aspirado suprapbico (orina) Esputo inducido Aspirados transtraquales Fluido seminal o prosttico Bilis Heces o muestras rectales Cepillado bronquial (broncoscopa) Lavado broncoalveolar DIU1 para Actinomyces spp. Loquios Glndula de Bartholin Orina obtenida por cateterizacin Heces para Clostrdium spp. Orina obtenida por miccin Mdula sea Torunda cervical Ovario Torunda endocervical Placenta obtenida por cesrea Torunda farngea Torundas y tejidos obtenidos por ciruga Torunda nasofarngea Trompas de falopio Torunda perineal Torunda vulval 1 DIU, dispositivo intrauterino. 2 Hay algunas excepciones: botulismo (especialmente botulismo infantil), infecciones por Clostridium perfrnges o por Clostridium difficile.

Es esencial recolectar un volumen de muestra adecuado, por cuanto un material en cantidad insuficiente puede provocar resultados falsos-negativos. Se deben utilizar solamente recipientes estriles para la recoleccin de las muestras clnicas, preferentemente de boca ancha, con tapa de rosca para muestras de orina, otros fluidos corporales, esputo y tejidos. Con pocas excepciones, no se deben utilizar placas 3

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de Petri para el transporte de muestras clnicas. Los contenedores o recipientes deben ser de un material adecuado, diseado para promover la sobrevivencia de los agentes bacterianos y para eliminar riesgos de derrame y de bioseguridad. Idealmente, todos los recipientes conteniendo muestras clnicas deben ser transportados en bolsas plsticas sellables, con dos compartimientos separados, uno para el recipiente y otro para la documentacin. La mayora de las muestras clnicas recolectadas con torundas y que se han secado durante el transporte son inaceptables para su procesamiento. En el caso que sea necesario utilizar torundas, se debe hacer una seleccin adecuada del tipo de material: Material Algodn Caractersticas Los cidos grasos residuales presentes en algunos tipos de algodn pueden inhibir algunas bacterias,particularmente Chlamydia Adecuado para la recuperacin de Streptococcus pyogenes Adecuado para la recuperacin de Chlamydia, pero puede ser txico para algunas cepas de Neisseria Gonorrhoeae, Ureaplasma urealiticum.

Dacron Alginato de calcio

Si la muestra es recolectada a travs de piel intacta (por ejemplo, hemocultivos), se debe lavar la piel con agua y jabn, luego se debe desinfectar en forma centrfuga con etanol al 70% y finalmente de la misma manera con una solucin yodada (tintura de yodo al 12%). Cada muestra clnica debe estar rotulada con el nombre del paciente, nmero de identificacin, el tipo o la descripcin de la muestra, el sitio especifico de recoleccin, la fecha y la hora de la recoleccin y las iniciales del recolector. La muestra clnica debe estar acompaada de una solicitud de anlisis, la cual debe incluir la siguiente informacin: 1. Nombre completo y nmero de identificacin del paciente. 4

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2. Localizacin del paciente (servicio, saln, piso, etc.). 3. Descripcin de la muestra, indicando el sitio de recoleccin segn corresponda. 4. Fecha y hora de la recoleccin de la muestra. 5. Diagnstico -presuntivo o definitivo- del paciente. 6. Indicacin si el paciente est recibiendo o no tratamiento con antimicrobianos. 7. Otra informacin pertinente (si la muestra forma parte de una serie de muestras, evaluacin de tratamiento, etc.). 8. Nombre completo, cdigo y nmero de telfono del mdico tratante. 9. Firma del mdico tratante.

En los cuadros 3 y 4 se brinda una gua prctica inicial para la seleccin y recoleccin de muestras clnicas.

Cuadro 3. Muestras que no deben ser procesadas debido a la poca informacin microbiolgica que puede ser obtenida. Tipo de muestra Torundas de quemaduras Descarga de colostoma Torundas de lceras decbito Puntas de catter Foley Aspirado gstrico de neonato Loquios Torundas de abscesos perirrectales Torundas de lesiones gangrenosas Torundas de lesiones peridontales Torundas de lceras varicosas Vmito Alternativa/Comentario Recolectar tejido o aspirado No procesar Recolectar tejido o aspirado No procesar No procesar No procesar Recolectar tejido o aspirado Recolectar tejido o aspirado Recolectar tejido o aspirado Recolectar tejido o aspirado No procesar

5CUADROS!!!!!!!!

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1.3. Transporte y almacenamiento de muestras clnicas.

Una vez que las muestras clnicas han sido recolectadas deben ser transportadas al laboratorio lo ms pronto posible, con el objeto de:

Asegurar la sobrevivencia y el aislamiento de microorganismos fastidiosos y para evitar el sobrecrecimiento de microorganismos menos fastidiosos. Disminuir el tiempo de contacto de los microorganismos con agentes anestsicos locales que pudieron haber sido utilizados durante la recoleccin. Proporcionar un diagnstico ms preciso del proceso infeccioso.

Las siguientes son recomendaciones generales para el transporte y el almacenamiento de muestras clnicas para cultivo de agentes bacterianos.

Todas las muestras deben ser transportadas rpidamente al laboratorio, preferentemente antes de dos horas despus de la recoleccin. Si la muestra no puede ser procesada inmediatamente debe ser entonces almacenada bajo las condiciones especficas indicadas en los cuadros 4 y 5. En trminos generales, las muestras clnicas conteniendo probables agentes bacterianos no deben ser almacenadas por ms de 24 horas, mientras que muestras clnicas conteniendo agentes virales pueden permanecer almacenadas por 2 6 3 das a 4C.

El transporte ptimo de las muestras clnicas, incluyendo los cultivos anaerbicos, depende principalmente del volumen de muestra obtenido. Las muestras con un volumen pequeo deben ser enviadas al laboratorio en 15-30 minutos luego de recolectadas.

Las biopsias de tejido pueden ser almacenadas hasta por 24 horas a 25C en un sistema de transporte anaerbico. Muestras clnicas conteniendo agentes bacterianos altamente sensibles a condiciones adversas deben ser procesadas lo ms pronto posible, incluyendo Neisseria meningitidis, 17

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Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus influenzae (sensible a bajas temperaturas) y Shigella spp. Se recomienda que las muestras conteniendo Shigella spp. deben ser procesadas inmediatamente para asegurar su recuperacin en cultivo. Para el transporte de muestras clnicas dentro de un mismo edificio, el personal encargado debe evitar las reas ms transitadas por pacientes o visitantes. Considerando lo indicado anteriormente, las muestras clnicas pueden ser almacenadas a 4C mientras son transportadas al laboratorio, con las siguientes excepciones:

Si la muestra de sangre ha sido recolectada directamente en un medio de cultivo, se debe colocar inmediatamente (15 min) a 35-37C para su incubacin. Si la muestra clnica puede contener bacterias sensibles a las bajas temperaturas, es mejor mantener la muestra a temperatura ambiente. Muestras de lquido cefalorraqudeo deben ser mantenidas a temperatura ambiente o a 35-37C, excepto que la muestra haya sido sometida a anlisis por agentes virales. En este caso, la muestra debe mantenerse a 4C.

Muestras de heces que han sido mezcladas con medios de transporte se mantienen a temperatura ambiente.

18 (CUADRO pag 19)

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2. Recepcin y evaluacin de muestras clnicas.

2.1. Consideraciones generales. Con cierta frecuencia, desafortunadamente, llegan al laboratorio bacteriolgico muestras clnicas que han sido seleccionadas, recolectadas o transportadas inadecuadamente. El procesamiento de muestras clnicas de mala o pobre calidad y el reportar los resultados obtenidos de muestras clnicas manipuladas inapropiadamente pueden proporcionar informacin equivocada al mdico tratante, llevndolo a un diagnstico y/o a un tratamiento errneos del paciente. Por estos motivos es fundamental que el personal de laboratorio siga estrictamente una serie de lineamientos con respecto a la aceptabilidad y al rechazo de muestras clnicas. El rechazo de una muestra clnica tiene importantes implicaciones para la condicin del paciente, incluyendo la recoleccin de una segunda muestra, la prolongacin de la estada intrahospitalaria y el consecuente aumento en el riesgo de adquirir una infeccin nosocomial, el retraso en el diagnstico microbiolgico y en el inicio de una correcta terapia con antimicrobianos. El rechazo de una muestra clnica depende de una serie de cualidades de la muestra y este evento puede ocurrir durante la recepcin de la muestra en el laboratorio o durante la evaluacin de la calidad de la muestra. A continuacin se describen los procedimientos a seguir para la recepcin y evaluacin de la calidad de muestras clnicas, as como los procedimientos recomendados cuando se detectan irregularidades en la recoleccin y el transporte de las muestras. Estos procedimientos describen solamente una gua y es responsabilidad de cada laboratorio establecer un protocolo que establezca la normas de aceptabilidad de las muestras clnicas que debe procesar.

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2.2. Recepcin de muestras clnicas.

2.2.1. Procedimiento general para la recepcin de muestras clnicas.

1. Anotar la fecha y la hora de recepcin de la muestra. 2. Verificar que la identificacin (nombre y nmero) del paciente en la solicitud de anlisis y en el recipiente que contiene la muestra concuerden. 3. Verificar que la solicitud de anlisis contenga toda la informacin pertinente, incluyendo, adems de la informacin del paciente, la localizacin del paciente, la descripcin de la muestra, la fecha y hora de recoleccin de la muestra, el posible o supuesto diagnstico clnico del paciente, indicacin si el paciente est recibiendo o no tratamiento con antimicrobianos, otra informacin pertinente, el nombre completo, cdigo, nmero de telfono y firma del mdico tratante. 4. Asignar un nmero de acceso de laboratorio a la muestra clnica. 5. Examinar visualmente la muestra. 6. Revisar y evaluar cuidadosamente la muestra clnica considerando el tipo de anlisis solicitado. 7. Determinar las condiciones del recipiente, incluyendo la presencia de medio de mantenimiento, preservantes y condiciones del recipiente (derrames, rupturas).

2.2.2. Procedimiento para muestras clnicas sin rotular o mal rotuladas 1. Una muestra clnica sin rotular, mal rotulada o que no concuerda con la informacin de la solicitud es inaceptable para su procesamiento en el laboratorio. 2. Si una muestra inaceptable puede ser reemplazada por una segunda muestra, notificar por telfono inmediatamente al servicio, explicando las razones del rechazo y solicitar una segunda muestra. 3. No descartar la primera muestra hasta que se haya confirmado la recoleccin de la segunda muestra. 21

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4. Documentar el nombre de la persona a quien se le notific, la fecha y la hora de la notificacin. 5. Documentar si es imposible recolectar una segunda muestra o si el paciente est recibiendo terapia con antimicrobianos. En este caso, la informacin en la solicitud y sobre el recipiente conteniendo la muestra debe ser verificada por escrito por la persona que recolect la muestra clnica. Si se efecta esta verificacin de la informacin por escrito, continuar con el procesamiento de la muestra clnica.

2.2.3. Procedimiento para muestras clnicas duplicadas.

1. La gran mayora de las muestras clnicas duplicadas recibidas en el laboratorio el mismo da no deben ser procesadas, con excepciones importantes como los hemocultivos, lquidos cefalorraqudeos, tejidos y fluidos corporales normalmente estriles (excluyendo la orina), entre otros (ver cuadro 4, pgina 6 y subsiguientes). 2. No es recomendable mezclar las muestras duplicadas (obtenidas del mismo sitio anatmico) y procesaras luego como una sola muestra. 3. Si se reciben muestras duplicadas en diferentes momentos del da, se debe notificar inmediatamente al personal mdico o de enfermera encargado en el servicio. Si es aceptable no procesar la segunda muestra, se debe reportar Muestra duplicada, no se realiz el anlisis y se refiere el nmero de la primera muestra que s fue analizada. 4. No se deben procesar ms de tres muestras duplicadas en das consecutivos.

2.2.4. Procedimiento para muestras clnicas derramadas. 1. Si existe evidencia clara que el recipiente est contaminado externamente por la muestra, el recipiente estaba abierto cuando fue recibido o est roto o quebrado, la muestra no debe ser procesada. 2. Proceder a solicitar una segunda muestra, como se indic anteriormente en 2.2.2.

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2.2.5. Procedimiento para muestras clnicas contaminadas.

1. Si existe evidencia clara que la muestra recibida est contaminada con otro tipo de muestra (por ejemplo, una muestra de orina contaminada con heces o visceversa), la muestra no debe ser procesada. 2. Solicitar una segunda muestra, como se indic anteriormente en 2.2.2.

2.2.6. Procedimiento para muestras clnicas inapropiadas.

1. No se deben aceptar muestras clnicas que son inapropiadas para el procesamiento bacteriolgico, segn lo indicado en los cuadros 2 (pgina 3), cuadro 3 (pgina 5) y cuadro 4 (pgina 6 y subsiguientes). 2. Documentar la recepcin de la muestra clnica inapropiada. 3. Notificar por telfono inmediatamente al personal mdico o de enfermera a cargo del paciente, explicando las razones del rechazo. 4. Documentar el nombre de la persona a quien se le notific, la fecha y la hora de la notificacin. 5. Aconsejar al personal mdico o de enfermera sobre muestras clnicas alternas apropiadas para procesamiento bacteriolgico, dependiendo del tipo de proceso infeccioso y de su localizacin anatmica.

2.2.7. Procedimiento para muestras clnicas con un tiempo de transporte muy prolongado.

1. Verificar el tiempo transcurrido entre la recoleccin y la recepcin de la muestra, as como las condiciones del transporte y del almacenamiento de la muestra.

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2. Documentar la recepcin de la muestra clnica inapropiada con un tiempo de transporte muy prolongado. 3. Notificar por telfono inmediatamente al personal mdico o de enfermera a cargo del paciente, explicando las razones del rechazo, y solicitar una segunda muestra. 4. Documentar el nombre de la persona a quien se le notific, la fecha y la hora de la notificacin. 5. Documentar si es imposible recolectar una segunda muestra o si el paciente est recibiendo terapia con antimicrobianos. 6. Si el laboratorio debe procesar una muestra subptima, se debe realizar un comentario adicional en el reporte como, por ejemplo, Muestra permaneci en el servicio toda la noche antes de ser procesada, Muestra fue recibida en recipiente no estril, Los microorganismos pueden no ser los clnicamente representativos por cuanto la muestra fue recolectada y/o transportada inapropiadamente.

2.3. Evaluacin de la calidad de muestras clnicas.

Una vez que las muestras clnicas han sido aceptadas y se les ha asignado un nmero o cdigo, es importante determinar la calidad de las muestras antes de su procesamiento bacteriolgico. La evaluacin de la calidad de las muestras es importante para todos los tipos de muestras, aunque es particularmente imperativo en las muestras provenientes del tracto respiratorio inferior, incluyendo muestras de esputo expectorado, aspirados

transtraqueales, lavados o cepillados bronquiales. Este procedimiento tambin es aplicable a cualquier muestra que pueda ser fcilmente contaminada con flora normal de sitios anatmicos adyacentes. El procedimiento consiste en preparar un frotis a partir de la

muestra, realizar una tincin de Gram y una examinacin microscpica de la presencia de clulas de respuesta inflamatoria (polimorfonucleares [PMN]) y de clulas epiteliales escamosas (CEE). Una evaluacin sistemtica de la presencia de estas clulas permite minimizar el procesamiento de muestras clnicas de baja calidad y, consecuentemente, el reportar resultados incorrectos. Se brindan tres mtodos diferentes que pueden ser 24

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aplicados igualmente a las diferentes muestras clnicas, aunque la interpretacin de resultados que se brinda se refiere a muestras del tracto respiratorio inferior y a muestras de heridas. Es importante considerar, sin embargo, que, en pacientes leucopnicos debido a enfermedad o terapia, la presencia de clulas epiteliales ciliadas respiratorias indica que la muestra proviene del tracto respiratorio inferior y debe ser, por lo tanto, procesada para su cultivo.

2.3.1. Procedimiento para evaluar la calidad de muestras clnicas.

a. Preparacin y tincin del frotis.

1. Preparar un frotis con las porciones ms purulentas de la muestra. 2. Fijar y teir por Gram. 3. Utilizar el lente de bajo poder seco ( 10) para examinar la preparacin por la presencia de PMN y de CEE.

b. Mtodo 1. Determinacin del valor Q (del ingls guality [calidad]).

Figura 1. Clculo del valor Q para muestras clnicas.

1. Observar 10-20 campos ( 10) y determinar el nmero promedio de cada tipo de clula (PMN y CEE) por campo. 2. Calcular el valor Q utilizando la figura 1. 25

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3. Realizar la interpretacin de los resultados de la siguiente manera:

Muestras del tracto respiratorio inferior con valores Q de + 1, +2 +3 son apropiadas para cultivo por bacterias aerobias. Muestras del tracto respiratorio inferior con un valor Q de 0, -1, -2 -3 son inapropiadas para cultivo y se debe reportar Muestra no es representativa del tracto respiratorio inferior. Favor enviar una segunda muestra.

Muestras de heridas con un valor Q de +3 son apropiadas para cultivo por bacterias aerobias y anaerobias, si se ha solicitado. Muestras de heridas con un valor Q de +1 +2 son apropiadas para cultivo por bacterias aerobias. Si se ha solicitado cultivo por bacterias anaerobias se debe reportar Muestra tiene evidencia de contaminacin superficial y es inaceptable para cultivo por bacterias anaerobios. Favor enviar una segunda muestra

Muestras de heridas con un valor Q de 0, -1, -2 -3 son inapropiadas para cultivo y se debe reportar Clulas epiteliales escamosas en la muestra indican la presencia de material superficial que puede contener bacterias contaminantes no relacionadas con la infeccin. Favor enviar una segunda muestra.

c. Mtodo 2. Determinacin de la relacin de PMNs versus CEEs.

1. Observar al menos 10 campos (x 10). 2. Determinar la relacin de PMNs versus CEEs. 3. Realizar la interpretacin de los resultados de la siguiente manera:

Una muestra es aceptable cuando la relacin de PMNs versus CEEs es _ 2:1. Una muestra es inaceptable cuando la relacin de PMNs versus CEEs es <2:1.

4. Si la muestra es aceptable procesar para cultivo. 26

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5. Si la muestra es inaceptable se debe reportar Muestra inaceptable para cultivo. Evaluacin celular es consistente con contaminacin orofarngea. Favor enviar una segunda muestra.

d. Mtodo 3. Evaluacin de la presencia o ausencia de PMNs.

1. Observar al menos 10 campos ( 10). 2. Cuantificar el nmero de CEEs. 3. Evaluar la presencia o ausencia de PMNs. 4. Realizar la interpretacin de los resultados de la siguiente manera:

Si no se observan PMNs y el nmero de CEEs es abundante en la tincin de Gram de la muestra de esputo, no se debe examinar el frotis por la presencia de microorganismos. Si se observan PMNs, independientemente del nmero de CEEs, se debe examinar el frotis a x 100 por la presencia de microorganismos. Particularmente se deben analizar zonas del frotis donde se encuentren los PMNs en mayor nmero y se deben evitar zonas con evidente contaminacin orofarngea.

5. Reportar la presencia o ausencia de microorganismos predominantes o flora mixta asociados a las zonas donde se encuentres los PMNs.

2.3.2. Procedimiento para el manejo de muestras inaceptables.

1. Documentar el resultado de la evaluacin de la calidad de la muestra clnica. 2. En el caso que la muestra clnica sea inaceptable por su pobre calidad, notificar por telfono inmediatamente al personal mdico o de enfermera a cargo del paciente, explicando las razones del rechazo. 27

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3. Documentar el nombre de la persona a quien se le notific, la fecha y la hora de la notificacin. 4. Solicitar una segunda muestra. Documentar si es imposible recolectar una segunda muestra o si el paciente est recibiendo terapia con antimicrobianos. 5. Si el laboratorio debe procesar una muestra de pobre calidad a solicitud expresa del mdico encargado del paciente, se debe realizar un comentario adicional en el reporte como, por ejemplo, Los microorganismos pueden no ser los clnicamente representad vos por cuanto la muestra fue recolectada inapropiadamente y tiene evidencia de contaminacin orofarngea.

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3. Procesamiento de urocultivos.
3.1. Introduccin.

3.1.1. Consideraciones generales sobre las infecciones del tracto urinario.

Las infecciones del tracto urinario tienen un gran impacto en la sociedad debido a que son una causa importante de ausentismo laboral y escolar con sus obvias consecuencias econmicas. Adicionalmente, las infecciones del tracto urinario son la principal causa de sepsis y choque sptico a nivel comunitario, la principal causa de infecciones intrahospitalarias y la segunda causa en importancia de choque sptico a nivel nosocomial. La orina dentro del tracto urinario normal es estril y los microorganismos llegan a colonizar solamente las porciones distales de la uretra. La orina, al pasar por las porciones distales de la uretra durante la miccin, se puede contaminar con las bacterias comensales. El nmero de bacterias presentes en la orina recin recolectada de una persona saludable es relativamente bajo, usualmente 102 unidades formadoras de colonias por mililitro (UFC/ml). Por diferentes factores que se discuten luego, los microorganismos, principalmente bacterias, pueden llegar a colonizar y provocar un cuadro inflamatorio en diferentes sitios anatmicos del tracto urinario, causando infecciones a nivel de uretra (uretritis), vejiga (cistitis), pelvis y parnquima renal (pielonefritis). En aproximadamente 30% de los casos de pielonefritis se observa una bacteremia concomitante. La colonizacin y la multiplicacin bacteriana a nivel de la vejiga con aparicin de nmeros significativos (> 102 UFC/ml) de bacterias en orina, pero sin provocar un proceso inflamatorio evidente y, por consecuencia, sin sntomas en el paciente, se denomina bacteriuria asintomtica. Otros tipos de infeccin en el tracto urinario incluyen abscesos perinefrticos, nefritis aguda multifocal, pielitis, tuberculosis renal y prostatitis, entre otros. La prevalencia de las infecciones bacterianas a nivel del tracto urinario depende de una serie de atributos del hospedero, particularmente del sexo y de la edad del individuo.

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La prevalencia de las infecciones bacterianas a nivel del tracto urinario dependen de una serie de atributos del hospedero, particularmente del sexo y de la edad del individuo. Las infecciones urinarias se presentan, en trminos generales, ms frecuentemente en mujeres que en hombres por varias razones anatmicas, fisiolgicas y conductuales o sociales.

3.1.2. Etiologa de las Infecciones urinarias.

La gran mayora de las infecciones del tracto urinario son causadas por bacterias que se originan de la flora intestinal normal del mismo individuo. Sin embargo, el espectro de los agentes etiolgicos depende, en gran parte, de si la infeccin es de origen comunitario o de origen nosocomial. En todo caso, Escherichia coli es el agente etiolgico ms importante como responsable tanto de infecciones del tracto urinario comunitarias como de infecciones nosocomiales. Algunos resultados de diferentes estudios sobre los principales agentes bacterianos de infecciones del tracto urinario se muestran a continuacin: Agentes etiolgicos bacterianos de infecciones del tracto urinario1___________________ Infeccin no complicada2 % Infeccin complicada3 o % nosocomial Escherichia coli 75-85 Staphylococcus coagulasa-negativa 7-15 Proteus spp. 6 Otros grupos bacterianos 1-5 Escherichia col Pseudomonas aerugznosa Bacterias Gram-positivas5 Klebsiella spp. Acinetobacter spp. 40-50 20-25 10-15 5-10 5-10

1. Adaptado de diferentes estudios. La lista no es exhaustiva. 2. Infeccin adquirida en la comunidad. 3. Infeccin en pacientes con anormalidades estructurales o neurolgicas en el tracto urinario. 4. Principalmente Staphylococcus saprophyticus. 5. Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis.

La frecuencia de aislamiento de cada uno de los diferentes agentes bacterianos depende tambin del sexo y la edad, as como de otros atributos o caractersticas del paciente, como se discute ms adelante.

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3.1.3. Atributos del hospedero y otros factores epidemiolgicos de las infecciones del tracto urinario.

a. Rutas de ingreso.

Las bacterias logran llegar hasta diferentes sitios en el tracto urinario bsicamente por tres rutas diferentes:

Ruta ascendente. Es la principal va de inoculacin de bacterias provenientes de la flora intestinal que contaminan la regin periuretral y uretral distal y que posteriormente ascienden hacia las vas urinarias. Este es la ruta por la cual, por ejemplo, Escherichia coli y otras especies de la familia Enterobacteriaceae incluyendo Proteus, Klebsiella y Serratia y especies de Enterococcus llegan hasta las vas urinarias.

Ruta hematgena. Por medio de esta ruta, bacterias que se encuentran circulantes en sangre como causantes de una bacteremia, con o sin sintomatologa concomitante, llegan hasta el sistema urinario, particularmente a nivel de los riones, y pueden provocar una infeccin renal, como los abscesos renales. Esta es una ruta de infeccin relativamente infrecuente para bacterias provenientes de la flora intestinal, pero puede ser importante para otros patgenos como Staphylococcus aureus, Haemophilus influenzae (en nios), Salmonella y Candida entre otros.

Diseminacin directa. Puede ocurrir una inoculacin directa de bacterias de la flora intestinal por medio de fstulas que se originan en el intestino hacia la vejiga o el rin.

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b. Mecanismos de defensa del tracto urinario. Como sistema orgnico, el tracto urinario tiene varios mecanismos de defensa que permite evitar en gran medida la colonizacin y la infeccin causada por bacterias. Algunos de los principales mecanismos de defensa se presentan a continuacin.

Mecanismos mecnicos. En estos mecanismos previenen mecnicamente el ascenso y la colonizacin de las vas urinarias por bacterias de origen intestinal e incluyen: La peristalsis uretrica. El vaciado normal de la vejiga. La descamacin de clulas uroteliales.

Mecanismos qumicos. Un gran nmero de sustancias estn presentes o son secretadas a diferentes niveles en el tracto urinario y tienen algn efecto bacteriosttico o bactericida, de manera que ayudan a prevenir inespecficamente la multiplicacin y la colonizacin bacteriana. En estos mecanismos qumicos se incluyen: Sustancias antibacterianas presentes en las secreciones prostticas como Zn2~. Condiciones hiperosmolares en la orina y la mdula renal. Acidez urinaria. Secrecin de antgenos sanguneos como eventuales receptores para adhesinas bacterianas. Ausencia del antgeno del grupo sanguneo P que acta como receptor para adhesinas tipo P presentes en Escherichia coli y otras especies de la familia Enterobacteriaceae potencialmente uropatognicas.

Mecanismos inmunolgicos. Diversos mecanismos inmunolgicos, especficos y inespecficos, son importantes en el control de la colonizacin bacteriana y las infecciones en el tracto urinario, incluyendo: 32

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Presencia de anticuerpos tipo IgA en las secreciones vaginales, prostticas, uretrales y vesicales. Produccin de anticuerpos IgG y consecuente opsonizacin bacteriana. Factores de complemento como mediadores de opsonizacin y lisis bacteriana.

c. Atributos del hospedero.

Una gran cantidad de diferentes factores del individuo pueden predisponer o llevar al establecimiento de una infeccin en el tracto urinario, incluyendo: Obstruccin urinaria (congnita o adquirida) como clculos, tumores, hipertrofia prosttica, lo cual puede conducir a un aumento del volumen en estasis urinaria o un vaciado incompleto de la vejiga. Factores iatrognicos como la instrumentacin (cateterizacin). Reflujo vesicoureteral. Sexo y edad del paciente. Embarazo, el cual puede provocar aumento en la retencin urinaria, disminucin de la peristalsis, aumento en la presin vesical y mayor reflujo vescoureteral. Alteraciones neurolgicas como la prdida de control de esfinteres. Lesiones renales preexistentes. Diabetes mellitus por prdida de funcin leucocitara y glicosuna.

d. Prevalencia de las infecciones urinarias. Como se indic anteriormente, la ocurrencia de las infecciones urinarias depende del sexo y la edad del paciente de una manera tpica en todas las poblaciones de estudio, como se muestra en la figura 1.

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Figura 1. Prevalencia de la bacteriuria de acuerdo con la edad y el sexo.

Existen mltiples razones por las cuales las infecciones del tracto urinario se presenten mucho ms frecuentemente en mujeres que en hombres, incluyendo:

Razones anatmicas. La uretra de la mujer es mucho ms corta en mujeres que en hombres (~ 5 cm versus ~ 20 cm, respectivamente), adems de que desemboca cerca de la vagina y del ano. El orificio uretral presenta una estrecha cercana anatmica con una regin corporal relativamente hmeda por las secreciones y con una temperatura ligeramente ms alta, lo cual promueve la multiplicacin de aquellas bacterias provenientes del contenido intestinal. Asimismo, las relaciones sexuales provocan traumatismo localizado y masajeo del tercio distal de la uretra, lo cual tambin promueve la colonizacin y la ascensin bacteriana hacia las porciones proximales de la uretra. Por otra parte, la ausencia de la prstata conduce a la obvia carencia de secreciones prostticas conteniendo sustancias antibacterianas.

Razones fisiolgicas. Existen factores fisiolgicos por los cuales las infecciones del tracto urinario son ms frecuentes en mujeres, incluyendo, por ejemplo, los cambios hormonales que se presentan durante el embarazo, lo cual puede conducir a alteraciones en la flora normal. Asimismo, durante el embarazo y despus del parto puede ocurrir

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una disminucin del vaciamiento vesical debido a estiramiento de los tejidos. Conforme mayor sea el nmero de hijos, mayor ser el riesgo a sufrir una infeccin del tracto urinario. Por otra parte, la presencia de restos de sangre y de otras secreciones que durante la menstruacin permanecen en la regin periuretral pueden promover la multiplicacin y la colonizacin bacteriana de la uretra distal y proximal.

Razones conductuales o sociales. Aqu se incluyen los diferentes hbitos y comportamientos de las mujeres: Hbitos higinicos: se debe considerar la manera de limpiarse luego de orinar y de defecar, lo cual puede conducir a la contaminacin con material fecal de las porciones distales y proximales de la uretra, as como el uso de tampones o toallas sanitarias y la frecuencia de su cambio. Hbitos miccionales: el no orinar, sea por aguantar ganas, por rendimiento laboral o por no tomar suficiente cantidad de lquidos, puede conducir a vejigas retencionistas que presentan un mayor volumen total, con un menor volumen de vaciamiento y un mayor volumen residual de orina, en la cual puede ocurrir multiplicacin de las bacterias que all se encuentren. Hbitos sexuales: la actividad sexual por s misma favorece el establecimiento de infecciones en el tracto urinario por masajeo, compresin o traumatismo de la uretra, as como otras prcticas asociadas a la actividad sexual, incluyendo el uso de dispositivos intrauterinos, anticonceptivos orales, sustancias espermaticidas y duchas vaginales.

3.1.4. Factores de virulencia bacterianos asociados a las infecciones urinarias.

Las bacterias causantes de infecciones urinarias generalmente provienen del tracto intestinal donde forman parte de la flora normal. Las cepas uropatognicas se caracterizan por poseer una serie de factores de virulencia que las distinguen de otras cepas bacterianas intestinales no patgenas. Dentro de estas caractersticas se deben considerar las siguientes: 35

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Motilidad bacteriana. Con notables excepciones como Staphylococcus saprophyticus, especies de Klebsiella y Enterococcus, la gran mayora de las bacterias uropatgenas tienen la capacidad de moverse ascendentemente por la uretra hacia la vejiga urinaria. En efecto, las cepas uropatgenas de Escherichia coli y las especies de Proteus tienen una alta capacidad de motilidad ascendente, en forma contracorriente a la orina, lo cual facilita grandemente la colonizacin de la vejiga urinaria. Produccin de adhesinas. Las cepas uropatgenas de Escherichia coli tienen la capacidad de producir diferentes estructuras de adhesin denominadas adhesinas, siendo las ms importantes las fimbrias tipo 1 y las fimbrias tipo P. Las fimbrias tipo 1 son producidas por un gran porcentaje de cepas de Escherichia coli y de otras especies de la familia Enterobacteriaceae. Las fimbrias tipo 1 median la adhesin a residuos de manosa localizados sobre la mucosa intestinal y sobre la mucosa vesical. Se asume que las fimbrias tipo 1 son responsables de la colonizacin de la vejiga urinaria y permiten el establecimiento de las infecciones de las vas urinarias bajas (cistitis). Las fimbrias tipo P reconocen residuos de digalactsido (Gal-Gal) localizados en la superficie de la pelvis renal y, por lo tanto, se presume que las fimbrias tipo P median la colonizacin de dicho sitio anatmico facilitando el establecimiento de infecciones de las vas urinarias altas (pielonefritis). Las fimbrias tipo P solamente se encuentran solamente en ciertas cepas de Escherichia coli denominadas pielonefrognicas. Produccin de ureasa. La produccin de una enzima con actividad urealtica es frecuente en muchos uropatgenos de origen intestinal, incluyendo Proteus

mirabilis, Klebsiella pneumoniae,

Providencia stuartii y

Staphylococcus

saprophyticus. La hidrlisis de urea incrementa la concentracin de amonio en la orina con la subsecuente elevacin del pH urinario. El pH urinario elevado puede llevar a una serie de efectos importantes incluyendo la formacin de clculos debido a la precipitacin de sales de fosfato de magnesio y amonio. La formacin de clculos puede provocar la obstruccin de las vas urinarias e interferir con la miccin y favorece el establecimiento de las infecciones bacterianas. Adicionalmente, la

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alcalinizacin de la orina por la generacin de amonio favorece la multiplicacin y la sobrevivencia bacteriana en el tracto urinario, probablemente porque: Se logra un pH ms adecuado para el crecimiento bacteriano. Se obtiene amonio a concentraciones elevadas como una fuente de nitrgeno ms asimilable. El amonio puede inactivar el cuarto componente del complemento y prevenir as algunas funciones del sistema inmunolgico. Produccin de hemolisinas. La gran mayora de las especies bacterianas aisladas de

infecciones en el tracto urinario son hemolticas cuando se observa su morfologa colonial sobre placas de agar sangre. El caso ms estudiado es el de la hemolisina de Escherichia coli, una citolisina formadora de poros que tiene la capacidad de interactuar y muchas veces lisar diferentes tipos de clulas del hospedero. La lisis de los eritrocitos provoca la liberacin hemoglobina, la cual sirve como una fuente de hierro, un elemento esencial para la multiplicacin bacteriana. Adicionalmente, la interaccin de la hemolisina sobre clulas nucleadas puede alterar la fisiologa celular, de manera que se inhiben muchas funciones de leucocitos polimorfonucleares y otras clulas de respuesta inflamatoria. Tales efectos inhibitorios bloquean la actividad del sistema inmunolgico y favorecen entonces la multiplicacin de las bacterias en el tracto urinario. Por otra parte, la hemolisina de Escherichia coli puede tener un efecto txico sobre las clulas uroepiteliales y del parnquima renal, provocando as un dao directo adicional. Otros casos menos estudiados incluyen las hemolisinas de Proteus mirabilis y Proteus vulgaris, las cuales muestran una gran homologa con la hemolisina de Escherichia coli, la hemolisina de Serratia marcescens y la toxina a de Staphylococcus aureus, entre otras. Produccin de endotoxinas. El lipopolisacrido (LPS), un componente estructural de la membrana externa de las bacterias Gram-negativas, tiene un efecto txico directo sobre clulas de respuesta inflamatoria como leucocitos polimorfonucleares, clulas monocticas y linfocitos T y B, alterando la produccin de una serie de citoquinas involucradas en la respuesta inmunolgica. El LPS es uno de los principales inductores de fiebre en los individuos con infecciones bacterianas en las vas urinarias 37

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superiores. Otros componentes estructurales bacterianos, como fragmentos de pared celular y cidos teicoicos provenientes de bacterias Gram-positivas, tienen efectos muy similares a los producidos por el LPS de bacterias Gram-negativas.

3.1.5. Manejo clnico de las infecciones urinarias.

Diagnstico de las infecciones del tracto urinario: Diagnstico clnico: Cistitis Disuria Frecuencia Urgencia Poco volumen de orina Incontingencia Dolor su suprapbico

Pielonefritis

Dolor localizado en los flancos, la espalda o el abdomen Fiebre Malestar general Sudoracin Dolor de cabeza Nuseas Vmito Postracin

Examen general de orina:

Prueba de deteccin de nitritos positiva.

Presencia de leucocitos.

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Urocultivo: Recuento del nmero de microorganismos presentes por militro de muestra (UFC/ml). Identificacin del/de los microorganismo(s) aislados. Prueba de susceptibilidad a los antibiticos.

Pacientes asintomticos: Bacteriuria (1O~ UFC/mI) por una misma especie bacteriana detectada en dos urocultivos en un lapso de 7 a 15 das. No se da tratamiento con antimicrobianos a los individuos, con excepcin de pacientes inmunosupresos y mujeres embarazadas por el riesgo de partos prematuros y mortinatos.

Pacientes sintomticos: Pacientes con una primoinfeccin, definida como la primera infeccin en la vida o un perodo superior a seis meses entre las infecciones. Se da tratamiento de rutina. Pacientes con una infeccin a repeticin, definida como dos o ms infecciones en un perodo igual o inferior a seis meses entre las infecciones. Se puede presentar una de dos condiciones:

Reinfecciones, las cuales ocurren por agentes bacterianos diferentes. A estos pacientes se les da un tratamiento de rutina y un tratamiento de profilaxis por un periodo mnimo de seis meses. La mayora de los pacientes ( 80%) no presenta problemas de fondo. 39

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Aproximadamente un 20% de los pacientes tiene alteraciones funcionales o anatmicas y usualmente son mujeres mayores de 45 aos o pacientes diabticos. Recurrencias (recadas), las cuales ocurren por el mismo agente bacteriano. A estos pacientes se les da un tratamiento de rutina y un tratamiento de profilaxis por un perodo mnimo de seis meses. La mayora de los pacientes ( 80%) presenta algn problema de fondo y requieren de estudios adicionales. Las patologas ms frecuentemente encontradas en estos pacientes incluyen la presencia de clculos y de reflujo vesicoureteral. Aproximadamente un 20% de los pacientes no presentan problemas de fondo.

3.2. Muestras de orina para cultivo. Es importante considerar los siguientes aspectos sobre las muestras de orina recolectadas para su cultivo en el laboratorio clnico:

Aunque la orina es normalmente estril o contiene un pequeo nmero de microorganismos, la contaminacin de una muestra de orina por microorganismos normalmente presentes en la uretra o en reas periuretrales debe ser siempre considerada durante el procesamiento cuando la muestra es recolectada por miccin. La proliferacin de dichos contaminantes en una muestra recolectada y transportada inapropiadamente puede causar resultados errneos o difciles de interpretar.

Para muestras de orina recolectadas por miccin se debe realizar una cuantificacin del nmero de microorganismos presentes por volumen de muestra mediante recuento en medios slidos, determinando el nmero de unidades formadoras de colonias (UFC) por mililitro de muestra. Esta metodologa se puede aplicar a muestras de orina recolectadas 40

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por cateterizacin, pero no se debe aplicar a aquellas muestras de orina recolectadas por puncin suprapbica por cuanto se evita la contaminacin uretral o periuretral. En pacientes sintomticos (dolor al orinar, urgencia, frecuencia) usualmente una nica muestra es usualmente suficiente y adecuada para el diagnstico, siempre y cuando el paciente no haya sido sometido an a tratamientos con antimicrobianos. En pacientes asintomticos (bacteriuria asintomtica) se pueden necesitar hasta dos o tres muestras recolectadas en tres das consecutivos para poder hacer el diagnstico de laboratorio. En casos de que se sospeche de tuberculosis renal, se deben procesar tres muestras recolectas en tres das consecutivos. Las muestras de orina deben provenir de la primera miccin de la maana para asegurar un mejor diagnstico. La solicitud de anlisis que acompaa la muestra clnica debe indicar si el paciente es sintomtico o asintomtico, y no debe indicar simplemente infeccin urinaria o sepsis urinaria. La orina puede ser un buen medio de cultivo para los diferentes microorganismos, tanto los causantes de infecciones como los contaminantes provenientes de la uretra o de la regin periuretral. Por lo tanto, las muestras de orina deben ser refrigeradas a 4C hasta por 24 horas si no van a ser procesadas inmediatamente en el laboratorio.

3.2.1. Recoleccin de muestras de orina.

a. Recoleccin de muestras de orino por miccin (orina con tcnica orina a medio chorro , orina de segundo chorro).

Se recomienda recolectar la primera orina de la maana siempre que sea posible, por cuanto proporciona recuentos bacterianos ms altos luego de que las bacterias han sido incubadas en la vejiga durante toda la noche.

No se debe forzar la recoleccin de la orina, por cuanto la muestra se puede diluir y se pueden obtener recuentos falsamente ms bajos que 105 UFC/m1. 41

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Debido a que es el mismo paciente quien recolecta su propia muestra de orina por miccin, es fundamental instruir al paciente adecuadamente para la recoleccin de muestras de orina por miccin, particularmente con respecto a la limpieza de los rganos genitales externos femeninos. La explicacin para los pacientes debe ser clara y puede ser verbal y/o escrita. A continuacin se da un ejemplo de la instrucciones que se les puede entregar a los pacientes:

INSTRUCCIONES PARA LA RECOLECCION DE MUESTRAS DE ORINA CON TECNICA PARA CULTIVO PARA PACIENTES FEMENINAS 1. No recolecte la muestra de orina si usted est con la menstruacin (regla). De ser as, recolecte la muestra siete das despus de que la menstruacin le comenz. 2. Una vez que usted se ha lavado bien sus manos y se ha colocado en una posicin como la indicada en el dibujo adjunto, proceda de la siguiente manera: a. Ponga gaza impregnada con jabn lquido en una de sus manos. En su casa utilice un paito o trapo limpio enjabonado. b. Con la otra mano separe sus labios y proceda a limpiarse la vulva con la gaza o el paito, de arriba hacia abajo y adentro. c. Proceda a orinar directamente en un frasco estril, mientras que con una de sus manos mantiene los labios separados. Evite que el frasco toque los labios. d. Tape y rotule el frasco con su nombre y lleve la muestra de orina lo ms pronto posible a la recepcin del laboratorio.

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INSTRUCCIONES PARA LA RECOLECCION DE MUESTRAS DE ORINA CON TECNICA PARA CULTIVO PARA PACIENTES MASCULINOS 1. Retracte el prepucio (si al paciente no se le ha practicado la circuncisin). 2. Limpie el glande con agua y jabn. En su casa utilice un paito o trapo limpio enjabonado. Enjuague con abundante agua. 3. Proceda a orinar descartando la primera porcin de la orina. 4. Sin detener la miccin recolecte la muestra de orina directamente en un frasco estril. Evite tocar el frasco con el glande. 5. Tape y rotule el frasco con su nombre y lleve la muestra de orina lo ms pronto posible a la recepcin del laboratorio. Si no es posible llevar la muestra de orina antes de dos horas mantenga la muestra en refrigeracin a 4C.

Las muestras de orina deben ser siempre recolectadas en frascos estriles con tapa de rosca, rotulados adecuadamente. Los recipientes conteniendo la muestra deben estar acompaados de una solicitud de anlisis con la informacin completa cuando llegan a la recepcin del laboratorio.

Se recomienda recolectar una muestra por da hasta un total de tres muestras en tres das consecutivos en pacientes asintomticos.

b. Recoleccin de muestras de orina por puncin suprapbica. La tcnica de recoleccin de muestras de orina por puncin (aspiracin) suprapbica evita la contaminacin externa. Esta tcnica se recomienda para nios pequeos, para pacientes con dao en la espina dorsal y para pacientes en los cuales la interpretacin del resultado de una muestra de orina recolectada por miccin es difcil. La recoleccin por puncin suprapbica es la tcnica de escogencia para el procesamiento de muestras de orina por bacterias anaerobias, las cuales pueden causar infrecuentemente infecciones de las vas urinarias. La recoleccin por puncin suprapbica es una tcnica que puede ser realizada nicamente por personal mdico. Para la recoleccin por puncin suprapbica se debe inicialmente descontaminar y anestesiar la zona de la piel, para luego introducir una aguja (22) en la vejiga llena en la lnea media entre la snfisis pbica y el ombligo, 43

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aproximadamente 2 cm por encima de la snfisis pbica. Se debe recolectar unos 20 ml de muestra de orina, la cual se transfiere a un recipiente estril adecuado.

___________________________________________________________________________ Figura 2. Recoleccin de una muestra de orina por puncin suprapbica.

La muestra de orina recolectada por puncin suprapbica debe ser procesada como se indica en 6.5., solamente que no es necesario realizar el recuento de microorganismos, ya que se evita la contaminacin externa y, por lo tanto, cualquier nmero de microorganismos se considera significativo.

c. Recoleccin de muestras de orina por cateterizacin. La muestra de escogencia es la orina recolectada del tubo del catter a travs del puerto de recoleccin. Para la recoleccin, se debe limpiar el puerto de recoleccin con un algodn impregnado con etanol al 70%, insertar posteriormente una aguja (21) en el puerto y recolectar la orina con la jeringa. La muestra se transfiere luego a un recipiente estril apropiado.

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La orina recolectada de las bolsas as como las puntas de catter Foley son inapropiadas para el cultivo microbiolgico. Durante la recoleccin de la muestra no se debe desconectar el tubo del catter de la bolsa de recoleccin de orina.

d. Recomendaciones adicionales para la recoleccin de muestras de orina.

No se deben aceptar las siguientes muestras para urocultivo: Puntas de catter Foley. Muestras de orina recolectadas por miccin para examen general de orina, las cuales, generalmente, no se recolectan con la tcnica indicada anteriormente ni son transportadas apropiadamente. Sedimento urinario obtenido de una muestra de orina enviada al laboratorio para examen general de orina. Muestras de orina de 24 horas. Muestras de orina recolectadas por miccin o por cateterizacin para bacterias anaerobias.

Es importante que en la solicitud de anlisis que acompaa la muestra clnica se especifique el mtodo por el cual la muestra fue recolectada.

3.2.2. Transporte de las maestras de orina. Todas las muestras de orina, independientemente de la tcnica de recoleccin, deben ser transportadas lo ms pronto posible al laboratorio clnico. El tiempo mximo permisible para el transporte a temperatura ambiente de una muestra de orina es de dos horas.

Las muestras de orina pueden ser almacenadas a 4C hasta por un periodo de 24 horas, aunque se recomienda que sean procesada antes de 8 horas, siempre que sea posible. 45

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3.3. Pruebas de tamizaje. Se han diseado diversos mtodos rpidos de tamizaje, automatizados y no automatizados, para determinar si la muestra de orina contiene bacterias yio leucocitos en cantidades significativas. Las pruebas de tamizaje pueden ser necesarias en laboratorios clnicos en los cuales el nmero de muestras enviadas para urocultivo es muy alto y se requiere algn elemento para discriminar las muestras que pueden dar un cultivo positivo de las que no. Algunas de estas pruebas disponibles se presentan a continuacin:

___________________________________________________________________________ Mtodo Principio Tiempo de deteccin ___________________________________________________________________________ Tiras con enzimas Glucosa oxidasa Las bacterias metabolizan la glucosa a cido glucmco y 2 min disminuyen su nivel en oruna. Nitrato reductasa La mayora de los bacilos Gram-negativos, as como algunas 2 min especies de cocos Gram-positivos, reducen los nitratos a nitritos. Esterasa Los leucocitos polmiorfonucleares tienen una enzima con 2 min actividad esterasa. Filtracin colorlmtrica FiltraCheck-UTITM1 Las bacterias y los leucocitos polimorfonucleares son retenidos en un filtro y son detectados mediante tincin con safranina O. Bac-T-ScreenTM2 Igual que FiltraCheck- UTITM, pero requiere de instrumentacin para realizar la lectura. Bioluminiscencia UTIscreenTM3

2 min 2 min

El ATP bacteriano es cuantificado con una reaccin lO-45 min enzimtica de bioluminiscencia con luciferina y luciferasa. Requiere de instrumentacin para realizar la lectura. ___________________________________________________________________________
1. Meridian Diagnostics, Cincinnati, Ohio 2. BioMriux Vitek, Inc., Hazelwood, Missouri 3. Los Alamos Diagnostic, Los Alamos, Nuevo Mxico

Algunos de los mtodos de tamizaje, especialmente las tiras con enzimas, tienen baja sensibilidad y se recomienda su utilizacin conjuntamente con otros mtodos de tamizaje. 46

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Se pueden presentar resultados falsos positivos por sustancias interferentes presentes en la orina, orina diluida, pH bajo, interpretacin subjetiva y por dejar las muestras de orina a 4C.

3.4. Mtodos microscpicos. Se han descrito varios mtodos microscpicos que pueden ser tiles en el diagnstico de las infecciones del tracto urinario, particularmente cuando existe la presencia de bacteriuria superior a i05 UFC/ml.

3.4.1. Deteccin de bacteriuria.

a. Tincin de Gram. 1. Colocar 10 l de la muestra de orina, bien mezclada pero sin centrifugar, sobre un portaobjetos. 2. Permitir secar al aire sin esparcir sobre la superficie del portaobjetos. 3. Fijar la lmina al calor. 4. Teir por Gram. 5. Determinar y reportar el nmero de microorganismos por campo de inmersin. 6. La presencia de uno o ms microorganismos por campo de inmersin correlaciona con un recuento de colonias de 105 UFC/ml. 7. La presencia de abundantes clulas escamosas y diferentes morfotipos microbianos son indicativos de que la muestra ha sido probablemente contaminada durante la recoleccin. En este caso, se debe solicitar una segunda muestra.

b. Tincin con naranja de acridina. 1. Preparar un frotis como se indic para la tincin de Gram. 47

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2. Realizar una tincin con naranja de acridina. 3. Determinar el nmero de microorganismos por campo de 400 utilizando un microscopio de fluorescencia. En caso de una morfologa dudosa, se puede examinar el frotis con una magnificacin de 1000. 4. La presencia de uno o ms microorganismos por campo de inmersin correlaciona con un recuento de colonias de 105 UFC/ml.

3.4.2. Deteccin de piuria.

a. Anlisis del sedimento urinario. El anlisis de sedimento urinario por la presencia de leucocitos polimorfonucleares es vlido siempre y cuando el procedimiento se haya estandarizado con respecto al volumen de orina centrifugada, la velocidad y el tiempo de centrifugacin y el volumen en el cual se resuspende el sedimento.

3.5. Cultivo de muestras de orina. Como se indic anteriormente, cuando las muestras de orina son recolectadas por miccin puede ocurrir la contaminacin de la muestra con bacterias habitantes de la uretra o de la regin periuretral. Para descartar el aislamiento y la identificacin de una bacteria contaminante como agente causal de una infeccin urinaria, se recomienda realizar un recuento del nmero de unidades formadoras de colonia (UFC) por mililitro (ml) de muestra de orina recolectada por miccin. Este criterio puede ser aplicado tambin a las muestras de orina recolectadas por cateterizacin pero, sin embargo, no se aplica cuando la muestra ha sido recolectada por puncin suprapbica, por cuanto se evita la contaminacin uretral o periuretral. Durante mucho tiempo se ha aceptado el criterio que si una persona sufre de una infeccin urinaria o una bacteriuria asintomtica tendr un recuento de 105 UFC/ml de un 48

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solo morfotipo colonial, dado que la mayora de las infecciones urinarias son causadas por un solo tipo de microorganismo, mientras que una persona sin infeccin urinaria tendr un recuento de 102 UFC/ml de dos o ms morfotipos bacterianos. Sin embargo, como se discute ms adelante, si una persona con sintomatologa urinaria tiene un recuento de <105 UFC/ml, el microorganismo aislado puede tener importancia clnica y no puede ser simplemente descartado por haber resultado de un recuento ms bajo.

3.5.1. Procedimiento.

a. Recuento por dilucin en tubo. 1. Aadir 0.1 ml de la muestra de orina (bien mezclada y sin centrifugar) a 9.9 ml de solucin salina estril (10-2). 2. Mezclar bien y transferir 0.1 ml de esta dilucin a cada una de las placas con medio (l0-3). 3. Distribuir bien el inculo sobre la superficie del agar utilizando un asa estril o una esptula de Drigalski. 4. Incubar las placas de los medios inoculados a 35 a 37C por 18-24 horas. Las placas de agar sangre deben ser incubadas en jarra con candela. 5. Luego del periodo de incubacin determinar el nmero de colonias en la superficie y el nmero de UFC/ml multiplicando el nmero de colonias por el factor de dilucin (l03).

b. Recuento por inoculacin directa con asa calibrada.

1. Introducir verticalmente un asa calibrada de 0.01 ml (10 l) o de 0.001 ml (1 l) estril justamente por debajo de la superficie de la muestra de orina (bien mezclada y sin centrifugar). 2. Inocular por estra sobre toda la superficie del medio de cultivo. 49

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3. Sin flamear nuevamente el asa, repetir el procedimiento para el segundo medio de cultivo a utilizar. 4. Incubar las placas de los medios inoculados a 35 a 37C por 18-24 horas. Las placas de agar sangre deben ser incubadas en jarra con candela. 5. Luego del perodo de incubacin determinar el nmero de colonias en la superficie del medio de cultivo y el nmero de UFC/ml multiplicando el nmero de colonias por el factor de dilucin (102 para un inculo de 0.01 ml [una colonia representa 100 UFC/ml], 103 para un inculo de 0,001 ml [una colonia representa 1,000 UFC/ml]).

c. Recomendaciones para la inoculacin e incubacin de las placas. Se recomienda utilizar para cada una de las muestras de orina una placa de agar sangre y una placa de agar MacConkey. El agar MacConkey puede ser alternativamente sustituido por agar Eosina-Azul de Metileno). No se deben sembrar medias placas No se deben inocular dos o ms muestras en una misma placa por el riesgo de provocar una contaminacin cruzada de las muestras, particularmente por el fenmeno de swarming provocado por especies de Proteus. La superficie del medio de cultivo debe estar libre de humedad evidente, por lo que se recomienda incubar los medios a 35 a 37C por 1-2 horas antes de ser inoculados. La incubacin de las placas a 35 a 37C en condiciones se realiza en condiciones anaerbicas solamente cuando la muestra ha sido recolectada por puncin suprapbica. 3.5.2. Examen de los medios de cultivo. 1. Examinar las placas que han sido incubadas a 35 a 37C por 18-24 horas. 2. Si no se observa crecimiento y la muestra ha sido recolectada por miccin o por cateterizacin, reportar: No se observa crecimiento > 103 UFC/ml, si se inocularon las placas por dilucin en tubo (10 -3) o con asa calibrada de 1 l.

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. No se observa crecimiento > 102 UFC/ml, si se inocularon las placas con asa calibrada de 10 l. 3. Si no se observa crecimiento y la muestra fue recolectada por puncin suprapbica, incubar las placas por 18-24 horas adicionales. 4. Si se observan colonias muy pequeas o diminutas, incubar las placas por 18-24 horas adicionales. 5. Si no se observa crecimiento y este resultado no correlaciona con lo observado en la tincin de Gram de la muestra o con la condicin clnica del paciente, incubar las placas por 18-24 horas adicionales. 6. Sin tampoco se observa crecimiento luego de una incubacin de 48 horas y este resultado no correlaciona con lo observado en la tincin de Gram de la muestra o con la condicin clnica del paciente, solicitar una muestra de orina recolectada por puncin suprapbica para hacer un cultivo para bacterias anaerobias. 7. Si se observa crecimiento, examine los cultivos por nmero de colonias (UFC/ml) y por los diferentes morfotipos coloniales. 8. Realizar cuantificaciones adicionales segn la condicin clnica del paciente, como se muestra a continuacin:
Tipo de infeccin Pielonefritis Sintomatologa Fiebre, dolor en flancos, escalofros, nuseas, cilindro leucocitarios Asintomtica o disuria y frecuencia Dolor dorsal, fiebre, escalofros Disuria y frecuencia Agentes Bacilos Gram-negativos Staphylococcus aureus Escherichia colz y otros bacilos Gram-negativos Bacilos Gram-negativos Escherichia coli Staphylococcus saprophyticus Recuento significativo 105 105 105 105

Cistitis Prostatitis Uretritis

3.5.3. Interpretacin de los resultados. 1. El criterio de un recuento de 105 UFC/ml se puede aplicar a la mayora de las muestras de orina recolectadas por miccin y enviadas para cultivo. 51

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2. En el caso de recuentos inferiores a 105 UFC/ml se puede aplicar la siguiente gua de nalisis de los resultados:
Recuento 105 105 105 Condicin Tipo de muestra Orina por miccin Orina por miccin Sintomatologa positiva Organismos Cultivo puro Dos morfotipos coloniales Procedimiento a seguir Identificacin y PSA Identificacin y PSA

104 104

10 10 10 10

Ms de dos morfotipos Posible contaminacin coloniales Reportar posible contaminacin y solicitar nueva muestra Orina por cateterizacin Dos morfotipos coloniales Identificacin y PSA Sintomatologa positiva Ms de dos morfotipos Posible contaminacin coloniales Reportar posible contaminacin y solicitar nueva muestra Orina por cateterizacin Cultivo puro Identificacin y PSA Hombre sintomtico Cultivo puro Identificacin y PSA Puncin suprapbica Cualquier nmero de Identificacin y PSA morfotipos Cultivo puro de bacilo Identificacin y PSA Mujer sintomtica Gram-negativo

3.6. Referencias

Albers, A. C., R. D. Fletcher. 1983. Accuracy of calibrated-loop transfer. J. Clin. Microbiol. 18:40-42. Kass, E. H. 1956. Asymptomatic infections of the urinary tract. Trans. Assoc. Am. Phys. 69:56-63. Koneman, E. W., 5. D. Allen, W. M. Janda, P. C. Schreckenberger, W. C. Winn. 1997. Diagnostic Microbiology, 5~ edition. Lippincott. Philadelphia. Miller, y. L., J. B. Kaper, D. A. Portnoy, R. R. Isberg (editors). Molecular Genetics of Bactenal Pathogenesis. American Society for Microbiology Press. Washington, D. C. Pezzlo, M. 1995. Urine culture procedure, section 1.17 In H. D. Isenberg (editor), Clinical Microbiology Procedures handbook, Vol. 1. American Society for Mcrobiology Press. Washington, D. C.

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4. Procesamiento de coprocultivos.

4.1. Introduccin

4.1.1. El tracto gastrointestinal y la flora normal. El tracto gastrointestinal contiene una flora normal bacteriana muy amplia y diversa. Aun cuando la acidez del estmago previene la colonizacin, muchas especies pueden sobrevivir al pasaje por el estmago y se convierten en flora residente del tracto gastrointestinal bajo. Normalmente el intestino delgado contiene una flora escasa (estreptococos, lactobacilos y levaduras, de 101 a 103 /ml), pero conforme se alcanza el leon distal, los recuentos se aproximan a 106 - 107 /ml, y se encuentran enterobacterias y Bacteroides spp. Los bebs son colonizados en las primeras horas de nacido por bacterias de la flora normal epitelial, particularmente estafilococos, corinebacterias, bifidobacterias, clostridios, lactobacilos y estreptococos. Con el tiempo, el contenido de la flora intestinal cambia. La flora normal del intestino grueso del adulto comprende principalmente especies anaerobias, como Bacteroides, Clostridium, Peptostreptococcus, Bifidobacterium y Eubacterium. La razn de especies anaerobias a aerobias, que incluyen enterobacterias, enterococos y otros estreptococos, es de 1000:1. El 80% del peso seco de heces de un adulto normal consiste en bacterias, las cuales son principalmente anaerobias (10
11-12

/g) y aerobias

(E. coli, 108/g, Proteus, Klebsiella, enterococos y otras especies, 105-7/g). Despus de una terapia antimicrobiana, el intestino grueso puede ser colonizado por patgenos nosocomales, tales como Staphylococcu s aureus, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans,

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y bacilos Gram-negativos resistentes, lo cual influencia la flora de cualquier infeccin intraabdominal subsecuente.

4.1.2. Patogenia de la infeccin gastrointestinal. Los agentes etiolgicos de infecciones del tracto gastrointestinal pueden causar enfermedad por cuatro mecanismos bsicos: 1. Produccin de toxinas que afectan la secrecin de fluidos, funcin celular, o funcin neurolgica. El cuadro 4.1 resume los principales agentes bacterianos involucrados en la produccin de toxinas que actan sobre el tejido intestinal. Las neurotoxinas usualmente se ingieren como toxinas preformadas que actan sobre el sistema nervioso autnomo (enterotoxina b, toxina emtica) o en las uniones neuromusculares (toxina botulnica). Las enterotoxinas, por su parte, poseen un efecto directo sobre la mucosa intestinal que estimula en forma potente la secrecin de fluidos. Estas actan principalmente sobre el yeyuno y el leon proximal, donde se lleva a cabo la mayor parte del transporte de fluidos. Finalmente, las citotoxinas actan destruyendo la estructura de las clulas intestinales individuales. Cuando estas clulas son destruidas, se desprenden de la superficie de la mucosa, dejndola desprotegida y con las funciones de absorcin o secrecin daadas. Adems, la destruccin epitelial despierta una fuerte respuesta inflamatoria que acenta el dao tisular (disentera).

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Cuadro 4.1 Enfermedades entricas asociadas con toxinas.


Organismo productor Neurotoxinas Clostridium botulinum Staphylococcus aureus (enterotoxina b) Bacillus cereus (toxina emtica) Enterotoxinas secretoras Vibrio cholerae E. coli ET (LT, Sta y STb) Clostridium perfringes (A) Salmonella Campylobacter spp. Shiguella dysenteriae Citotoxinas Escherichia coli EH (SLTI y SLTII) Clostridium diffcile (A y B) Aeromonas hydrophila Clostridium perfringes (A) Campylobacter jejuni Shiguella Helicobacter pylori Vibrio parahemolyticus S. aureus Fuente Efecto Alimentos enlatados, miel, Parlisis flccida Vegetales y frutas Carne, lcteos, repostera, jamn, Vmito y diarrea. Ensaladas con huevo. Arroz, carne, pollo, vegetales y Vmito y diarrea. postres. Mariscos, agua Carnes, agua Carnes, salsas, aderezos, comida mexicana Carnes, huevos Pollo, carnes Ensalada de papa, huevo, vegetales. Carne Carne Mariscos Carnes, salsas, aderezos, comida mexicana Pollo, carnes Ensaladas de papa, huevo, vegetales ? Mariscos, agua salada Carne, lcteos, repostera, jamn, ensaladas de huevo Alteracin metablica celular Vmito y diarrea Diarrea Diarrea Diarrea Destruccin celular Inflamacin Disentera Vmito y diarrea Diarrea con sangre y moco Disentera Dao a mucosa gstrica Diarrea con sangre y moco Diarrea

II. Crecimiento dentro o cerca de clulas de la mucosa intestinal, causando disfuncin. La mayora de los virus actan de esta manera, principalmente en el intestino delgado, y los sndromes diarreicos no siempre estn asociados con la presencia de sangre o leucocitos. Ejemplos de virus que causan cuadros diarreicos son hepatitis A, B y C, rotavirus, agentes Norwalk y adenovirus.

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III.

Invasin del epitelio mucoso, causando destruccin y ocasionalmente invasin y diseminacin sistmica por el torrente sanguneo. Ciertos parsitos, como Entamoeba histolytica y Balantidium coli invaden el epitelio del colon y causan disentera. Otros parsitos adquiridos por ingestin, como Trichinella y Schistosoma, pueden causar diarrea sanguinolenta transitoria por su paso por la mucosa hacia otros sitios del organismo. Las bacterias que invaden las clulas epiteliales tambin producen sntomas disenteriformes. Los agentes ms comunes son Shigella y E. coli enteroinvasiva. Las bacterias penetran la capa superficial de la mucosa, y rara vez alcanzan el torrente circulatorio. Otras bacterias no solo invaden la mucosa sino que penetran los vasos sanguneos de la submucosa y se diseminan sistmicamente. Salmonella typhi y S. cholerasuis son agentes etiolgicos de fiebre entrica, cuadros sistmicos caracterizados por fiebre, cefalea, vmitos y constipacin. La invasividad contribuye a la patognesis de la enfermedad causada por otros serotipos de Salmonella spp., Yersinia enterocolitica, Vibrio parahemolyticus, Campylobacter jejuni, C. fetus, Plesiomonas shigelloides, Edwardsiella tarda y, posiblemente, Clostridium difficile.

IV. Adhesin a mucosa intestinal, alterando las funciones normales de absorcin y secrecin. La capacidad adherente de Vibrio cholerae as como de varias cepas de E. coli ha sido extensamente estudiada, y se han descrito factores de colonizacin antignicos (CFA), expresados en adhesinas tipo fimbrias o fibrillas. La adhesin le permite a las bacterias colonizar y secretar sus toxinas cerca de las clulas epiteliales. Por otra parte, los cuadros diarreicos producidos por Giardia, Cryptosporidium, Isospora y Microsporidium se asocian en parte a su capacidad de adherirse al epitelio intestinal. 56

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El mbito completo de factores de virulencia involucrados en la produccin de diarrea est representado en los distintos tipos de E. coli, los cuales estn resumidos en el cuadro 4.2. Esta bacteria puede producir una o varias enterotoxinas, ser invasiva, producir colitis hemorrgica o ser adherente/agregativa, dependiendo de genes transmisibles presentes en plsmidos y bacterifagos.

Cuadro 4.2. Mecanismos patognicos de E. coli causante de diarrea.


Tipo I.E.Coli enterotoxignica (ECET) E. coli toxina lbil ECLT E. coli toxina estable a (ECSTa) E. coli toxina estable b (ECSTb) II. E. Coli (ECEH) Mecanismo Adhesin va CFA Toxina similar a clera Guanilato ciclasa Secrecin de bicarbonato Modelo/diagnstico Hemaglutinacin Asas intestinales conejo Inmunoensayo clulas Y1 Ratones lactantes Asas intestinales cerdo Citotoxicidad en HeLa Codificado Plsmido Sntomas Diarrea acuosa profusa

Plsmido Plsmido

enterohemorrgica Toxinas similares a Siga (Verotoxina) ( SLT1 y 2) Invasin local de mucosa

III. E. Coli enteroinvasiva (ECEI)

IV. E. Coli enteropatgena (ECEP) Localmente adherente (AL) Adhesiva y despegable Adhesin focal

Adhesin y dersprendimiento del epitelio V. E. Coli enteroagregativa Adherencia agregativa a (ECEAg) Hep-2 EAST-1, EALT VI. E. Coli difusamente adherente Adherencia difusa (ECDA)

Bacterifago Diarrea acuosa, sanguinolenta sin leucocitos; fiebre leve; dolor abdominal. Test de Sereny Plsmido Disentera: fiebre y colitis. Diarrea con sangre, moco y muchos leucocitos. Fiebre, vmito, malestar, en nios. Diarrea con moco Adherencia localizada en Plsmido Hep-2 Tincin con actina Cromosoma fluorescente (eaeA, intimina) Adherencia en parches a Plsmido Diarrea acuosa, vmito y Hep-2 deshidratacin. Adherencia difusa a Hep-2 Cromosoma Diarrea acuosa, vmito y deshidratacin.

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. 4.1.3. Principios del procesamiento de muestras. Las enfermedades diarreicas son una causa mucho mayor de morbilidad y mortalidad que las enfermedades ms comunes de la sociedad industrializada (cardiopatas, cncer y accidentes cerebrovasculares), siendo los lactantes y nios pequeos los ms afectados, en especial con malas medidas sanitarias y una alimentacin deficiente. La diarrea infecciosa aguda es causada por un nmero de agentes diferentes: bacterias, virus y protozoarios. El laboratorio clnico rutinariamente busca las bacterias que ms comnmente causan diarreas, sin embargo, se requiere la colaboracin del mdico para asegurar la bsqueda precisa de un agente particular. Por consiguiente, se debe obtener una historia clnica completa, que incluya los sntomas del paciente, hora de iniciacin, edad, historia de viajes, consumo de alimentos y tratamiento con antimicrobianos. Cada microorganismo posee mecanismos patognicos nicos que causan una serie de sntomas, los cuales pueden ser clasificados inicialmente como se muestra en el cuadro

4.3. Sin embargo, debe tenerse siempre presente que los microorganismos no se adhieren estrictamente a estas categoras. Cuadro 4.3. Sintomatologa asociada con los mecanismos de la enfermedad diarreica
Parmetro Consistencia de las heces Volumen de las heces Vmito Fiebre Deshidratacin Tiempo de inicio PMNs en las heces Sangre en las heces Moco en las heces Sitio de infeccin primaria Produccin de toxina acuosa voluminosa si no si pocas hrs 2 das no no no intestino delgado Invasin de tejido suaves (semilquida o pastosa) pequeo no si ligera 1-3 das si si si intestino grueso

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4.2. Seleccin, recoleccin y transporte de muestras.

4.2.1. Muestras aceptables. Los principales criterios de aceptacin de muestras para cultivo incluyen: Hisopos rectales de nios o adultos con diarrea aguda Muestras no contaminadas con orina Seleccionar las porciones que contengan pus, sangre o moco. Heces formadas en estudios epidemiolgicos. Recibir 2 o 3 muestras de das separados incrementa la probabilidad de aislar el patgeno Muestras frescas de 1-2 horas, o preservadas de acuerdo con el punto 4.2.4.

4.2.2. Muestras inaceptables. Las muestras que no deben aceptarse, se rigen por los siguientes criterios: Muestras de ms de 2 horas no preservadas Hisopos rectales secos Varias muestras en un mismo da Muestras sin datos del paciente, hora y procedencia.

4.2.3. Recoleccin de la muestra. Para la recoleccin de las muestras se deben de seguir las siguientes recomendaciones:

Frascos plsticos con tapa de rosca de cierre hermtico. Hisopos en tubos con tapa.

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4.2.4. Preservacin y transporte. Las muestras fecales que no se pueden inocular directamente en los medios de cultivo se pueden preservar a 4 - 6C en: Buffer salino de glicerol (partes iguales de buffer salino de fosfatos 0.033 M pH 7.0 y glicerol) recomendado para Salmonella sp. y Shigella sp., pero no para Campylobacter sp. y Vibrio sp., a menos que sea enriquecido con CaC12 (100 mg/l). Medio de transporte Cary-Blair, apropiado para Vibrio spp. y Campylobacter spp, pero no es tan efectivo para recuperar Shigella sp. y es inapropiado para Clostridium difficile. Algunos autores recomiendan reducir el contenido de agar de 0.5% a 0.16% para el mantenimiento de Campylobacter spp.

Otro tipo de muestras se puede preservar y transportar de la siguiente manera:

Muestras para estudio por C. difficile se deben congelar a -200C hasta su procesamiento. Hisopados rectales pueden transportarse alternativamente en un caldo Gram negativo(GN). Contenidos de duodeno, colostomas o ileostomas se transportan en viales. Biopsias rectales se transportan en contenedores estriles con agua destilada, no sumergir en formalina.

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4.3. Materiales 4.3.1. Medios de enriquecimiento. Los medios de enriquecimiento se utilizan para aumentar la probabilidad de crecimiento de ciertas especies bacterianas mientras se inhiben microorganismos no deseados. Son particularmente tiles en la recuperacin de Salmonella de heces de portadores y de pacientes con infecciones leves por Shigella, donde los nmeros pueden ser tan bajos como 200 bacterias/g de heces. El principio de trabajo de los medios de enriquecimiento es el mantenimiento en fase log de E. coli y otros comensales fecales debido a los inhibidores qumicos del caldo (desoxicolato, selenito, tiosulfato). Salmonella y Shigella son menos inhibidas y entran en fase log ms rpidamente, lo que aumenta su nmero. No obstante, con el tiempo la inhibicin de coliformes disminuye, por lo que se recomienda subcultivar dentro de las 8 h de inoculado el caldo para evitar sobrecrecimiento.

Caldo Gram-negativo (GN): contiene desoxicolato de sodio, citrato, manitol. Medio poco selectivo, apropiado para Shigella spp. y Salmonella spp. Caldo selenito F: contiene selenito de sodio. Medio altamente selectivo para Salmonella spp. Caldo tetrationato: contiene tiosulfato de sodio, sales biliares y carbonato de calcio. Debe agregarse 0.1 ml/tubo de solucin yodo-yoduro antes de inocular la muestra. Medio altamente selectivo para Salmonella spp. Agua peptonada alcalina (pH 8.6): apropiado para Vibrio cholerae.

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4.3.2. Medios de inoculacin primaria. El microbilogo debera examinar los especmenes de heces por Salmonella, Shigella, Campylobacter, Aeromonas y Plesiomonas spp., y por predominio evidente de Staphylococcus aureus, levaduras y Pseudomonas spp. Debido al riesgo potencial del clera, debe incluirse el protocolo de aislamiento para Vibrio cholerae en casos sospechosos y en las regiones de mayor incidencia. Cada laboratorio debe evaluar la historia del paciente, la poblacin, la localizacin geogrfica y el tamao del hospital para determinar los medios selectivos de rutina y de aislamiento especial. El cuadro 4.4 resume los principales medios selectivos de inoculacin primaria para coprocultivos.

Cuadro 4.4. Medios de cultivo primarios para coprocultivos e interpretacin del crecimiento. Medio Aislamiento esperado Morfologa colonial Diferencial MacConkey Eosina- Azul de metileno(Levine) Moderadamente selectivos Hektoen Xilosa- lisina-desoxicolato(XLD) Salmonella- Shigella (SS) Altamente selectivos Verde brillante (VB) Bismuto sulfito (BS) Gram- negativos entricos Gram- negativos entricos Salmonella Shigella Patgenos entricos Salmonella- Shiguella Salmonella Salmonella Incoloras o rosadas Incoloras o ligeramente prpura Azul o verde, con o sin centro negro Rojas con o sin centro negro. Incolora con o sin centro negro Rojas o rosadas Negras, con o sin zonas cafnegruscas, o verdes, con o sin brillo metlico alrededor Segn especie. Amarillas o verdes Hemolticas Convexas a mucoides, color gris a rosado

Otros Agar sangre (AS) TCBS AS- Ampicilina Agar- Campy

Predominio de Staphylococcus, levaduras y Pseudomonas Vibrio sp. Aeromonas sp. Campylobacter sp.

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4.4. Procedimientos.

4.4.1. Exmen directo. Un examen al fresco de una muestra de heces sin teir es til para detectar parsitos y, con experiencia, las formas curvas y con movilidad en dardo de Campylobacter y Vibrio cholerae a partir de heces frescas. Estos ltimos se pueden observar mejor en microscopios de campo oscuro o contraste de fases.

4.4.1.1. Examen a fresco con azul de metileno. Seleccionar una porcin de material fecal de un rea con sangre y moco y mezclar con una gota del colorante de azul de metileno de Loeffler (azul de metileno al 0.3% en etanol al 30%) por 2-3 minutos observar en alto poder seco. El predominio de polimorfonucleares indica la presencia de un posible patgeno invasivo, mientras que el predominio de monocitos se asocia con infecciones por Salmonella typhi.

4.4.1.2. Tincin de Gram. Preparar un frotis delgado del material fecal y realizar una tincin de Gram. Observar predominio de polimorfonucleares, levaduras, cocos Gram -positivos o bacilos Gram-negativos, lo cual puede sugerir una infeccin por Candida, S. aureus o El predominio de bacilos Gram-positivos largos,

Pseudomonas, respectivamente.

rectos y con paredes paralelas puede sugerir sobrecrecimiento de Clostridium difficile, aun cuando no es una prueba totalmente confiable de la infeccin. La tincin de Gram modificada con fucsina bsica al 0.1% permite la observacin de bacilos Gram-negativos delgados, en forma de coma, ese (S ) o en alas de gaviota, sugestivos 63

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de infeccin por Campylobacter spp. Adems, puede usarse una tincin de Giemsa para buscar protozoarios relacionados con cuadros diarreicos.

4.4.2. Cultivo primario de rutina. 4.4.2.1. Aislamiento de Salmonella sp. y Shigella sp. Las muestras que se reciben para la deteccin de stos patgenos deben cultivarse en un medio de enriquecimiento, un medio de soporte, un medio levemente selectivo-diferencial, y un medio moderadamente selectivo. El uso de un medio altamente selectivo no se justifica para uso de rutina, con excepcin de la investigacin de un brote. Los medios ms comnmente recomendados, de acuerdo con las posibilidades del laboratorio, son los siguientes: Medio de soporte: agar sangre (agar tripticasa-soya con 5% de sangre). Medio diferencial: agar MacConkey o agar eosina-azul de metileno de Levine. Moderadamente selectivo: agar Hektoen, agar xilosa-lisina-desoxicolato (XLD), agar Salmonella-Shigella (SS). Altamente selectivo: agar verde brillante y agar bismuto sulfito.

Con el fin de aumentar la probabilidad de aislar alguno de estos agentes se pueden utilizar los siguientes caldos: Caldo GN: la muestra se inocula en el caldo, se incuba a 35C estrictamente por 4 a 6 horas y se subcultiva a medios diferenciales y selectivos. Caldo Selenito F y caldo tetrationato: la muestra se inocula en el caldo, se incuba a 35C por 12 horas y se subcultiva a medios diferenciales y selectivos. 64

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Las placas se inoculan directamente con una asada de la muestra de heces, con el hisopo rectal o del medio de transporte, o a partir de los caldos de enriquecimiento, se rayan con asa y se incuban a 35C por 18-24 h. Las colonias que se deben buscan son lactosa negativa con o sin H2S (ver cuadro 4.3.1), las cuales se inoculan por picadura y/o rayado a TSI y urea (puede inocularse adems LIA y SIM). De acuerdo con la reaccin bioqumica, que se muestra en el cuadro 4.5., se procede a la identificacin bioqumica completa y serolgica.
Cuadro 4.5. Diferenciacin de posibles patgenos entricos. TSI LIA Urea Procedimiento Patgeno K/A H2S+ K/K H2S+ Completar identificacin bioqumica b Salmonella spp. K/K Completar identificacin bioqumica Salmonella spp. K/A G H2S+ K/K H2S+ Completar identificacin bioqumica Salmonella spp, Edwarsiella spp. K/A G K/K Completar identificacin bioqumica Salmonella spp. K/K H2S+ Completar identificacin bioqumica Salmonella spp. K/K Indol-, completar identificacin Salmonella spp. Indol+, descartar K/A Completar identificacin bioqumica. Salmonella paratyphi A, Shigella flexneri 6 K/A K/K H2S+ Completar identificacin bioqumica y Salmonella typhi Serologa. K/K Indol+ y oxidasa+, completar ident. Aeromonas spp., Plesiomonas spp., Vibrio spp. indol-, completar identificacin S. typhi K/A Completar identificacin bioqumica y Shigella spp. Serologa. Oxidasa-, completar identificacin Yersinia spp. + Completar identificacin bioqumica A/A K/A Yersinia spp. + Oxidasa-, completar identificacin Yersinia spp. Oxidasa+, completar identificacin Vibrio spp, Aeromonas spp. Oxidasa+, completar identificacin y Vibro cholerae K/K serologa a. Abreviaciones: K, alcalino; A, acido; G, gas; -, negativo; +, positivo; H2S, sulfuro de hidrgeno. b. Mtodo de identificacin usado en el laboratorio, manual, miniaturizado o automatizado.

La identificacin bioqumica completa puede realizarse mediante mtodos manuales tradicionales de tubos con medios de diferenciacin, mtodos miniaturizados (API20E, R/B Enteric, Enterotube-II, Minitek), o automatizados (Biolog, Vitek, Pasco, Microscan Walkaway). 65

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La clasificacin taxonmica de Salmonella incluye 6 subgrupos: Subgrupo 1: incluye la mayora de serotipos, S. typhi, S. cholerasuis, S. paratyphi, S. gallinarum, S. pullorum. Subgrupo 2: S. salame Subgrupo 3a: S. arizonae Subgrupo 3b: S. diarizonae Subgrupo 4: S. houtenae Subgrupo 5: S. bongori Subgrupo 6: S. cholerasuis subsp. indica

La identificacin serolgica de los aislamientos, se basa en la reaccin de suspensiones de colonias sospechosas con antisueros especficos contra los antgenos somticos (O). En Salmonella se considera una nica especie con cinco serogrupos reconocidos y ms de 2,200 serotipos. En el cuadro 4.6 se muestran los principales serogrupos asociados con sndromes clnicos.

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Cuadro 4.6. Clasificacin serolgica y sndromes de Salmonella en humanos. Serotipo S. paratyphi S. paratyphi S. typhimurium S. paralyphi S. cholera.suis S. newport S. typhi S. enteritidis S. Dubln S. arizona Serogrupo O A B B C1 C1
C D D D

No agrupable

Vi + + -

Sndrome Fiebre entrica Fiebre entrica Gastroenteritis Fiebre entrica Bacteremia Gastroenteritis Fiebre entrica Gastroenteritis Bacteremia Gastroenteritis

El gnero Shigella se puede clasificar en cuatro serogrupos O, los cuales corresponden a especies: Serogrupo A: S. dysenteriae Serogrupo B: S. flexneri Serogrupo C: S. Boydii Serogrupo D: S. sonnei La clasificacin del CDC combina S. dysenteriae, S. flexneri, y S. boydii (grupos A, B y C) como Shigella-serogrupos A, B, C, dada su similaridad bioqumica. La actividad de ornitina descarboxilasa y -galactosidasa hacen a la mayora de cepas de S. sonnei bioqumicamente diferentes.

4.4.2.2. Aislamiento de Campylobacter sp. El aislamiento de Campylobacter recae sobre la selectividad del medio, la cual depende de los agentes antimicrobianos en el medio, el ambiente microaerofilico (5% O2, 10% CO2 y 85% N2) y la temperatura de incubacin a 42C, los cuales suprimen el crecimiento de la mayora de bacterias comensales. En muchos laboratorios se tiene como

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prctica comn examinar la muestra al fresco o teida para detectar la presencia de bacilos tpicos y abundantes leucocitos. Las muestras negativas por leucocitos no son procesadas por Campylobacter, ya que la probabilidad de aislar esta bacteria en cantidades significativas es muy baja, y el costo de los medios y los requisitos de cultivo son muy altos. La muestra debe cultivarse en alguno de los medios comerciales recomendados: Agar Blaser (Campy-AS) Agar Skirrow Agar Butzler Agar Preston La atmsfera microaerofilica se puede generar utilizando una jarra y un sobre para anaerobiosis, por evacuacin y reemplazo de mezcla de gases o por medio de Bio-Bags con generadores de gas. Debe hacerse una revisin de las placas a las 24, 48 y hasta 72 horas buscando las colonias sospechosas. Las colonias son pequeas, convexas, translcidas, grisceas y asemejan una gota de agua. La identificacin presuntiva de las colonias incluye una tincin de Gram modificado con fucsina bsica al 0.1% y la observacin de las formas de S o en alas de gaviota. La prueba de oxidasa debe ser positiva y se puede observar la movilidad en dardo resuspendiendo el microorganismo en un caldo Mueller-Hinton y observando a 40X entre porta y cubreobjetos. Las principales pruebas bioqumicas de diferenciacin se muestran en el cuadro 4.7

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Cuadro 4.7. Diferenciacin de especies termofilicas de Campylobacter sp.


Organismo C. fetus subsp. Fetus C. hydrointestinalis C. jejuni C. coli C. laridis C. upsaliensis Catalasa a + + + + + Hipurato + Susceptibilidad b Acido Nalidxico Cefalotina R S R S S R S R R R S S H2S en TSI + -

4.4.2.3. Aislamiento de Aeromonas spp. Aeromonas spp. causa una diarrea acuosa que se ha asociado con ingestin de agua no potable. Debe descartarse Aeromonas spp. si la historia del paciente o los sntomas sugieren una fuente de infeccin de este tipo. Aeromonas spp. crece en los medios de rutina, pero existe un medio selectivo apropiado para su deteccin. Las muestras se cultivan en: Agar sangre con 10 xg de ampicilina /ml(AS-AMP). MAC o EMB Las placas se incuban a 35C por 24 horas en aerobiosis. Investigar las placas por colonias con o sin hemlisis beta que no sean Pseudomonas y realizar prueba de oxidasa, la cual debe ser positiva. En el medio MAC o EMB se obtienen colonias lactosa negativa.

4.4.2.4. Aislamiento de Plesiomonas shigelloides. Plesiomonas spp. se ha implicado como agente de gastroenteritis en pacientes que toman aguas no tratadas y comen mariscos crudos (especialmente ostras y otros bivalvos). Plesiomonas crece en algunos medios diferenciales de rutina, como MAC o HE, sin

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embargo, se puede utilizar un medio selectivo especfico para detectar este microorganismo. Los medios de cultivo utilizados para las muestras de heces son: Medio selectivo: agar inositol-blis-verde brillante. Colonias blanco-rosadas MAC, IlE o XLD: colonias lactosa negativas, positivas a la prueba de oxidasa. AS para evaluar colonias oxidasa positiva diferentes de Pseudomonas.

4.4.3. Cultivo primario de patgenos especiales.

4.4.3.1. Aislamiento de Vibrio sp. Las muestras sospechosas por Vibrio cholerae se cultivan en agar TCBS y agar sangre, los cuales se incuban a 35C por 24 horas. Para el enriquecimiento se utiliza el agua peptonada alcalina, la cual se debe incubar de 5 a 8 horas a 35C para luego subcultivar a agar TCBS y agar sangre. Las colonias sospechosas son aquellas que presentan una coloracin amarilla en el agar TCBS y una hemlisis beta en el agar sangre (cuadro 4.5). En el agar TCBS algunos coliformes, como Proteus sp. y enterococos pueden crecer. Con respecto a la manipulacin, identificacin presuntiva, transporte y reporte preliminar deben seguirse los lineamientos dados por el Centro Nacional de Referencia de Clera, del INCIENSA. A las colonias sospechosas se les practica: Tincin de Gram, observando los bacilos caractersticos en forma de coma. Prueba de oxidasa del agar sangre, la cual debe ser positiva.

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Prueba de hilo mucoide: suspender colonias (obtenidas de un medio no inhibitorio) en una gota de solucin acuosa de desoxicolato de sodio al 0,5%. Si el resultado es positivo, las clulas bacterianas se lisan por efecto del desoxicolato, el ADN liberado ocasionar que la mezcla se haga viscosa. Al retirar lentamente de la suspensin el asa, se forma un hilo mucoide. La mayor parte de Vibrio spp. son positivos, en tanto que las cepas de Aeromonas sp. suelen ser negativas. Identificacin serolgica: el uso de antisueros es uno de los mtodos ms rpidos y especficos para la identificacin de Vibrio cholerae O1 y O139. Las cepas no O1 tambin causan enfermedad, pero las cepas O1 estn relacionadas con epidemias. Perfil completo de reacciones bioqumicas, en forma manual o automatizada.

4.4.3.2. Aislamiento de Yersinia sp. Son bacilos Gram-negativos miembros de Enterobacteriaceae que no fermentan lactosa, crecen mejor a 25C y son mviles a esta misma temperatura y no a 37C. El procesamiento incluye los siguientes medios: Medio selectivo: agar cefsulodin-irgasan-novobiocin (CIN), en el cual Yersinia produce colonias rojo oscuro con bordes transparentes. Enriquecimiento en fro: inocular la muestra en buffer salino de fosfato (pH 7,6) de 4 a 5C por 3 semanas y subcultivar a intervalos de una semana en MAC. Agar HE: produce colonias amarillas pequeas.

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4.4.3.3. Aislamiento de E. coli enterohemorrgica serotipo O157:H7. En el mbito de laboratorio es muy dificil diferenciar las variantes de Escherichia coli, con excepcin de la mayora de cepas de E. coli enterohemorrgica O157:H7 (ECEH). Se utiliza como medio diferencial el MAC-sorbitol, en el cual esta bacteria es incapaz de hidrolizar sorbitol y produce colonias incoloras, sorbitol-negativo. No obstante, es importante indicar que existen otras bacterias entricas sorbitol negativo por lo que la presencia de colonias negativas al sorbitol no es diagnstica de ECEH. Para la identificacin definitiva se toman de 5 a 10 colonias y se realiza la serologa con los antisueros especficos, as como la deteccin de Verotoxina en ensayos con cultivo celular. Por consiguiente, el clnico debe basarse en los sntomas y la historia clnica para solicitar un estudio por un serotipo especfico de E. coli, y someter toda muestra de heces con sangre a anlisis por ECEH.

4.4.3.4. Otros agentes de enfermedad del tracto gastrointestinal. Clostridum dfficile. Debe inocularse un medio selectivo (cicloserina-cefoxitinafructosa-yema de huevo) y realizarse un ensayo para detectar las toxinas, por medio de aglutinacin en ltex o inmunoensayo enzimtico. Bacillus cereus, Clostridium perfringens y S. aureus. Las heces de pacientes con intoxicacin alimentaria, as como las muestras de alimentos, cultivos de personas que manipulan alimentos y cualquier otro material potencialmente infeccioso, deben remitirse a un centro de referencia para su aislamiento e identificacin. E. coli enteropatognica, enteroinvasiva, enterotoxignica o enteroadherente. No se disponen de medios selectivos especficos. Se pueden seleccionar cinco

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colonias de los medios convencionales, aislarlas y remitirlas a un laboratorio de referencia para su identificacin.

4.5. Reporte de resultados

4.5.1. Cultivos negativos. Reportar No se aisl Salmonella, Shigella, Campylobacter, etc., mencionando todos los microorganismos utilizados en el tamizaje.

No reportar No patgenos entricos, porque es muy ambiguo y puede conducir a equivocaciones.

4.5.2. Cultivos Positivos. Si hay sobrecrecimiento de S. aureus, P. aeruginosa o Candida spp., reportar predominancia o cultivo puro de (gnero y especie si es posible) Reportes presuntivos de Salmonella y Shigella: de acuerdo con el resultado de las pruebas bioqumicas preliminares y la reaccin serolgica (por ej., aglutinacin positiva en un serogrupo), puede reportarse de la siguiente manera:

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Resultado Reportar Salmonella sp. que aglutina en un grupo Salmonella grupo X. Confirmacin pendiente. especfico Salmonella typhi Salmonella typhi. Confirmacin pendiente. Salmonella sp. que no aglutina en ningn Organismo identificado bioqumicamente grupo como Salmonella. Confirmacin pendiente. Shigella, grupo A Shigella dysenteriae.Confirmacin pendiente. Shigella, grupo B Shigella flexneri. Confirmacin pendiente. Shigella, grupo C Shigella boydii. Confirmacin pendiente. Shigella, grupo D Shigella sonnei.

Repones finales: basados en los resultados finales provenientes del laboratorio de referencia despus de la identificacin serolgica completa. Reportar cualquier aislamiento de Campylobacter spp. Reportar Aeromonas sp. o grupo A. hydrophila. No se recomienda la identificacin de rutina de los aislamientos de Aeromonas hasta especies, ya que los sistemas disponibles pueden presentar dificultades al determinar las especies. Reportar cualquier aislamiento de Plesiomonas shigelloides de heces. Reportar cualquier aislamiento de Vibrio spp. y de Yersinia spp. En el caso de Vibrio debe notificarse inmediatamente al Centro de Referencia. Reportar la presencia o ausencia de toxinas A y B (citotoxina) de C. difficile, de acuerdo con los resultados del inmunoensayo utilizado. El aislamiento por s solo no es significativo dado que es parte de la flora normal Reportar Cultivo negativo por E. coli O157:H7. o por el serotipo investigado.

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La notificacin inmediata al mdico depende de la poltica del laboratorio, la organizacin y el sistema de comunicacin (por ej., Computarizado). Los aislamientos de V. cholerae o S. typhi requieren notificacin personal inmediata. Notificacin al epidemilogo hospitalario y al sistema de salud pblica: enfermedades de reporte obligatorio El aislamiento de Campylobacter spp., E. coli patognica, Salmonella spp., Shigella spp., Vibrio spp. o Yersinia spp. debe reportarse al epidemilogo o comit de epidemiologa del hospital, as como a las autoridades responsables de salud pblica, para que se tomen las medidas higinicas preventivas correspondientes.

4.6. Referencias. 1. Baron, E. J., L. R. Peterson, and S. M. Finegold. Bailey & Scotts Diagnostic Microbiology, Ninth Edition. 1994. Mosby: St Louis. MO. 2. Grasmick, A. Processing and Interpretation of Bacterial Fecal Cultures, Section 1.10. En: Isenberg, H. D. Clinical Microbiology Procedures Handbook.Vol. 1. 1992. American Society for Microbiology: Washington, D.C. 3. Koneman, E. W., 5. D. Allen, W. M. Janda, P. C. Scbreckenberger, and W. C. Winn. Diagnostic Microbiology, Fifth Edition. 1997. Lippincott: Philadelphia. 4. Murray, P. R. (Ed.). Manual of Clinical Microbiology, Sixth Edition. 1995. American Society for Microbiology: Washington,D.C.

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5. Procesamiento de hemocultivos.

5.1. Introduccin. La bacteremia, situacin en la cual se encuentran bacterias circulando en la sangre, puede ser indicativo de la presencia de un foco infeccioso, tal como infeccin intravascular, neumona o un absceso de hgado, o puede representar la liberacin transitoria de bacterias en el torrente sanguneo. La septicemia o sepsis es indicativo de un proceso en el que las bacterias se multiplican a una tasa que excede la capacidad del sistema reticuloendotelial de removerlas, y cuya presencia en la circulacin est asociado a dao al hospedero. Las bacterias entran al torrente sanguneo desde focos extravasculares, va vasos linfticos. La bacteremia puede ser transitoria, intermitente o continua, reflejando los mecanismos de entrada a la circulacin. La bacteremia transitoria puede ocurrir cuando los microorganismos, a menudo de la flora normal, son introducidos a la sangre como consecuencia de procedimientos relativamente simples (cepillado de dientes, abrasiones gingivales, manipulacin). La bacteremia intermitente ocurre por liberacin peridica de sitios de infeccin, tales como abscesos extravasculares, cavidades empimicas, o infecciones difusas (celulitis, peritonitis, artritis sptica). La bacteremia continua usualmente se

produce en casos donde los organismos tienen acceso directo al torrente circulatorio, tales como endocarditis, fistulas arteriovenosas, catteres intraarteriales o cnulas permanentes. Los sitios de entrada ms comunes para la septicemia son tracto genitourinario (25%), tracto respiratorio (20%) y abscesos (10%), mientras que en un 35% de los

casos no se conoce con exactitud la fuente de la bacteremia. Los bacilos Gram 76

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negativos, en particular los miembros de la familia Enterobacteriaceae (E. coli, Klebsiella, Enterobacter y Serratia) y Pseudomonas aeruginosa estn presentes en ms del 50% de las bacteremias. Estos microorganismos son capaces de colonizar rpida y eficazmente la piel y tracto gastrointestinal de pacientes hospitalizados, lo cual, sumado a su resistencia relativamente alta a los antimicrobianos, se convierten en un factor de riesgo importante. Varios mecanismos juegan un papel en la remocin de microorganismos de la circulacin. En hospederos sanos e inmunocompetentes, un influjo sbito de bacterias usualmente es aclarado de la sangre en 30 a 45 minutos. El hgado y el bazo actan como rganos de eliminacin primarios, y los neutrfilos intravasculares como filtros secundarios. Las bacterias encapsuladas son ms difciles de eliminar, pero la presencia de anticuerpos especficos promueve el aclaramiento. Pacientes con enfermedades debilitantes o inmunodeficientes estn a un alto riesgo porque las bacterias pueden permanecer por horas antes de ser eliminadas. La sepsis bacteriana constituye una de las ms serias enfermedades infecciosas. No es una enfermedad de reporte obligatorio, y es posible que muchas muertes debidas a sepsis sean atribuidas a enfermedades subyacentes. Los signos y sntomas pueden incluir fiebre o hipotermia, hiperventilacin y alcalosis respiratoria subsecuente, lesiones en piel y alteraciones en el estado mental. Las manifestaciones ms serias incluyen hipotensin o choque, coagulacin intravascular diseminada y falla orgnica mltiple. La sepsis es un proceso progresivo, asociado con el dao orgnico, para lo cual se han propuesto nuevos trminos y definiciones, resumidos en el cuadro 5.1.

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Cuadro 5.1. Definiciones en la sepsis por Gram-negativos. Trmino Definicin Infeccin Fenmeno microbiano caracterizado por una respuesta inflamatoria a la presencia de microorganismos o a la invasin de tejidos normalmente estriles del hospedero. Bacteremia Presencia de bacterias viables en sangre. SRIS Respuesta inflamatoria sistmica a una variedad de daos clnicos severos. Presentes dos o ms de las siguientes condiciones: temperatura38C o 36C; ritmo cardaco, 90 latidos/min; frecuencia respiratoria, 20 respiraciones/min, o PaCO2, 32 mm Hg; recuento leucocitario, 12000 clulas/ml, 4000 clulas/ml, o 10% formas inmaduras (bandas). Respuesta sistmica a la infeccin. Presentes dos o ms de las Sepsis siguientes condiciones producto de la infeccin: temperatura, 380C o 360C; ritmo cardaco, 90 lat./min; frecuencia respiratoria, 20 resp./min, o PaCO2, 32 mm Hg; recuento leucocitario, 12000 clulas/ml, 24000 clulas/ml, o 10% formas inmaduras (bandas). Sndrome sptico (sepsis Sepsis asociada con disfuncin orgnica e hipoperfusin, dada por severa) hipoxemia, oliguria, acidosis lctica, o alteracin aguda del estado mental. Choque sptico Sndrome sptico con hipotensin Hipotensin Disminucin sostenida de la presin sangunea sistlia a < 90 mm Hg o reduccin de> 40 mm Hg del nivel basal en ausencia de otras causas de hipotensin. Sndrome de dsfuncin Presencia de funcin orgnica alterada en un paciente sumamente orgnica mltiple enfermo cuya homeostasis no puede mantenerse sin intervencin

Los principales factores de riesgo en el choque sptico se incluyen en el cuadro 5.2. Los fluidos intravenosos contaminados son otro factor de riesgo para el desarrollo de brotes bactermicos en hospitales.

78

Procesamiento de Muestras Clnicas para Diagnstico Bacteriolgico_________________________________ Cuadro 5.2. Factores de nesgo en sepsis Terapia con antibiticos de amplio espectro Tratamientos inmunosupresores: Quimioterapia Radioterapia Agentes para reducir el rechazo de transplantes Esteroides Dispositivos o procedimientos invasivos Ciruga Catteres vasculares y vesicales Tubos de drenaje Equipo de terapia por inhalacin Heridas penetrantes Quemaduras o traumas Obstruccin anatmica Ulceracin intestinal Edad: muy jvenes o muy viejos Condiciones clnicas progresivas: Cncer Diabetes SIDA

El choque es la complicacin ms grave de la septicemia. En el choque sptico la presencia de productos bacterianos y los componentes defensivos del sistema inmune actan en conjunto para provocar graves alteraciones en los principales sistemas fisiolgicos del hospedero. Las bacterias Gram-negativas poseen en su pared celular el lipopolisacrido (LPS), o endotoxina, el cual ejerce un efecto potente sobre varias funciones fisiolgicas. El LPS puede ser liberado durante el ciclo normal de crecimiento bacteriano o despus de la destruccin de las bacterias por las defensas del hospedero. La porcin lipdica del LPS, o lpido A, es capaz de mediar una serie de reacciones sistmicas en las que participan componentes celulares del sistema inmune, tales como monocitosmacrfagos y neutrfilos, productores de citoquinas de accin inflamatoria, como factor de necrosis tumoral o interleucina-1, y componentes humorales, como el sistema de complemento y algunos factores de la coagulacin. De la misma manera, las bacterias Gram-positivas, carentes de LPS, son capaces de iniciar sndromes similares, mediante la accin de toxinas de diverso origen y mecanismo de accin, as como por la liberacin de componentes de pared celular, 79

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entre los que se encuentran el peptidoglican y los cidos lipoteicoicos. La gravedad del sndrome asociado a las bacteremias, indicado por su alta tasa de mortalidad, depende de las condiciones concomitantes, como se muestra en el cuadro 5.3. La sepsis continua siendo una emergencia mdica de difcil manejo clnico, el cual se esquematiza en el cuadro 5.4.

Cuadro 5.3. Tasas de mortalidad y factores de riesgo en sepsis Condicin Mortalidad (%) RRM* Edad <20 13.8 1.00 >50 49.8 3.55 Microorganismo P. aeruginosa E. coli K pneumoniae S. aureus Enterococos Fuente de infeccin SondaFoley Herida quirrgica Absceso Infeccin respiratoria 27.7 35.5 48.0 32.7 45.5 37.8 42.9 51.2 52.3 6.84 3.36 4.52 3.08 4.28 3.38 3.88 4.65 4.73

Condicin predisponente Trauma 27.3 1.30 Diabetes 30.0 1.43 Neoplasma 42.1 2.01 ____________________________________________________
* RRM, riesgo relativo de muerte

Los microorganismos Gram-positivos ms comnmente aislados de sangre son los estafilococos coagulasa-negativa, Staphylococcus aureus, y Enterococcus sp.,

microorganismos habitantes del ambiente hospitalario y colonizadores de piel, rea orofarngea y tracto gastrointestinal de pacientes hospitalizados. Con el uso creciente de catteres intravenosos, lneas intraarteriales y prtesis valvulares, microorganismos que pertenecen a la flora normal de piel pueden ganar acceso a superficies intravasculares y producen cuadros de endocarditis. Cuando esto ocurre, colonias enteras de bacterias 80

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envueltas en fibrina (vegetaciones) se desarrollan en las vlvulas cardiacas, y se liberan en forma continua al torrente circulatorio. Esto conlleva a fenmenos de diseminacin metastsica con infeccin en mltiples rganos, embolias e infartos spticos y circulacin de complejos inmunes. En este contexto son importantes causas de endocarditis en vlvulas prostticas Staphylococcus epidermidis y otros estafilococos coagulasa-negativa, y S. aureus, el cual tambin es comn en septicemias sin endocarditis. Cuadro 5.4. Manejo clinico de la sepsis Manejo temprano: Antibioticoterapia: aminoglucsido +cefalosporina de espectro expandido Manejo de fluidos y electrolitos: aminas simpaticomimticas (dopamina, norepinefrina) Esteroides: uso controversial Inmunoterapia: en ensayos clnicos Sueros policlonales anti-LPS: J5 Anticuerpos monoclonales: E5, HA-lA Anticuerpos contra mediadores: TNF, IL- 1 Antagonistas y citoquinas: IL-lra, IL-10 Los causantes primarios de endocarditis infecciosa son los estreptococos viridans, que incluyen varias especies. Estos organismos son habitantes normales de la cavidad oral o del tracto gastrointestinal, y a menudo ganan acceso al torrente circulatorio a travs de gingivitis, periodontitis, o manipulaciones dentales. Las vlvulas cardiacas, especialmente aquellas que han sido previamente daadas, presentan superficies apropiadas para la adhesin de estas bacterias. Las vegetaciones resultantes provocan la diseminacin hematgena de bacterias a una tasa lenta pero constante. La identificacin bioqumica de los estreptococos podra tener utilidad, ya que ciertas especies, como Streptococccus anginosus, se han asociado con una mayor frecuencia a la formacin de abscesos metastsicos. S. sanguis y 5. mutans son los agentes ms frecuentes de endocarditis estreptocccica. Otros microorganismos causantes de endocarditis con bacteremia asociada estn incluidos en el cuadro 5.4.

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Cuadro 5.4. Agentes etiolgicos de endocarditis infecciosa.


Alta frecuencia Cocos Gram-positivos Estreptococos -Estreptococos grupo viridans: S. mitis, S. sanguis, S. anginosus, S. mutans -Enterococos: E. faecalis, E. faecium, E. Duran, S. bovis S. pneumoniae -Estreptococos -hemolticos: S. pyogenes, S. agalactiae, estreptococos grupos C, E y G -Estreptococos nutricionalmente deficientes Estafilococos S. aureus S. epidermidis Cocos Gram-negativos Neisseria gonorrhoeae, N. Meningitidis Moraxella (Branhamella) catarrhalis Bacilos Gram-negativos Enterobacteriaceae: E. Coli, Klebsiella, Enterobacter, Salmonella, Proteus, Serratia Pseudomonas aeruginosa (drogadictos IV) Burkholderia cepacia Acinetobacter Cocobacilos Gram-negativos Grupo HACEK: Haemophilus spp., Actinobacillus actinomycetemcomitans, Cardiobacterium hominis, Eikenella corrodens, Kingella kingae Baja frecuencia Bacilos Gram-positivos Bacillus cereus, B. Subtilis Corynebacterium jeikeium Erysipelothrix rhusiopathiae Listeria monocytogenes

. Anaerobios Peptococcus (coco Gram+) Clostridium perfringens (bacilo Gram+) Bacteroides spp. (bacilo Gram) Fusobacterium necrophorum

Bacterias intracelulares Brucella spp. Legionella spp. Bartonella henselae, B. Quintana Coxiella burnetii Chlamydia trachomatis, C. Psittaci Mycobacterium spp

La deteccin de Streptococcus bovis (un estreptococo del grupo D no enterococo)en sangre, est significativamente asociado con el carcinoma de colon; adems, su identificacin y diferenciacin de Enterococcus sp. es importante dada su susceptibilidad a la penicilina G, mientras que los cuadros producidos por enterococos requieren una estrategia

teraputica mucho ms agresiva. La neumona neumocccica puede a su vez cursar con bacteremia en un 20 a 30% de los pacientes, y es ms confiable que el cultivo de esputo para establecer el diagnstico. Los neumococos crecen muy bien en lo medios bifsicos para hemocultivo. El pronstico de los pacientes con neumonia neumocccica complicada con sepsis es mucho ms reservado. Las infecciones por especies de Haemophilus representan otro tipo de situaciones clnicas complicaciones por sepsis. Los organismos que a menudo se acompaan de tambin causan septicemias.

anaerbicos

Bacteroides fragilis es el anaerobio ms comnmente aislado a partir de sangre. Sin embargo, Clostridium perfringens puede provocar una enfermedad fatal fulminante, por lo 82

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cual debe ser identificado presuntivamente por medio de una tincin de Gram y la presencia de hemlisis y gas en la botella de hemocultivo. En resumen, la presencia de hemocultivos positivos identifica a una poblacin de pacientes que est a un riesgo significativamente mayor de muerte. En algunos estudios, se afirma que los pacientes con hemocultivos positivos tuvieron hasta 12 veces mas posibilidades de morir durante la hospitalizacin que aquellos con hemocultivos negativos. De este tipo de experiencias, se hace imperativo que el laboratorio realice correctamente los hemocultivos y reporte resultados exactos tan pronto como sea posible. Los factores crticos que deben ser establecidos por la direccin del laboratorio incluyen el tipo de recoleccin, el nmero y la frecuencia de hemocultivos, el volumen de sangre a cultivar, la cantidad y composicin del medio de cultivo, la frecuencia de subcultivos y la interpretacin y reporte de los resultados.

5.2. Recoleccin de la muestra.

5.2.1. Antisepsis de la piel y venipuncin. Las precauciones universales requieren que los flebotomistas usen guantes durante el procedimiento. 5.2.1.1. Seleccin del sitio de puncin. a) Se debe seleccionar un sitio diferente de puncin en cada toma de muestra. b) Evitar sangrar de va intravenosa o catter arterial a menos que halla una sospecha de sepsis por catter.

5.2.1.2. Venipuncin. a) Limpiar el rea de puncin con alcohol 70% (isopropilo o etlico).

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b) Empezando en el centro del sitio, limpiar concntricamente con tintura de yodo 1 a 2% por 30 seg. c) Dejar secar. No tocar el rea antes de sangrar. d) Desinfectar la tapa de las botellas con alcohol o yodo y dejar secar. e) Insertar la aguja en la vena una sola vez y obtener la sangre. No cambiar la aguja antes de inyectar la sangre en la botella. Utilizar una nueva aguja si se falla la vena. f) Inocular el medio de cultivo con anticoagulante. g) Agregar suficiente volumen de sangre para obtener una razn de 1:10 de sangre a medio de cultivo. h) Mezclar bien la sangre para evitar coagulacin. i) Despus de sangrar limpiar el rea con alcohol de 70% para remover el exceso de yodo lo que podra causar irritacin en algunos pacientes.

5.2.2. Volumen de muestra.

La cantidad de sangre es crtica porque la concentracin de las bacterias en la sangre usualmente es baja, especialmente si el paciente est bajo tratamiento antimicrobiano. En infantes y nios la concentracin de microorganismos durante la bacteremia es ms alta que en adultos, por consiguiente, se requiere menos cantidad sangre para el cultivo. 5.2.2.1. Volumen recomendado

a. Nios: 1 a 5 ml de sangre por venipuncin b. Adultos: 10 a 30 ml de sangre por venipuncin

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5.2.2.2. Recoleccin del volumen de sangre Infantes y nios: a) Obtener de 0.5 a 3 ml por botella de cultivo, dependiendo de la edad del paciente. Adultos: a) b) obtener 10-20 ml por puncin dividir en 2 botellas: ambas aerbicas, o bien, una aerbica y otra anaerbica.

El uso de la botella anaerbica es una prctica que se recomienda cuando hay sospecha clnica de infeccin por anaerobios. Segn algunos autores, el uso de dos botellas aerbicas mas el cultivo selectivo por anaerobios puede incrementar en un 6% el nmero de aislamientos clnicamente importantes.

5.2.3. Nmero y el tiempo de la muestra de sangre. 5.2.3.1.En el caso de sepsis aguda, meningitis, osteomielitis, artritis, neumona aguda sin tratamiento o pielonefritis. a) Obtener 2 muestras de sangre de dos sitios diferentes antes de empezar el tratamiento.

2.3.2.

En sospecha de endocarditis y bacteremia continua de baja magnitud.

a) Aguda: extraer 3 muestras de 3 sitios diferentes durante las primeras 1 a 2 horas de evaluacin y antes de iniciar tratamiento. b) Subaguda: extraer 3 muestras en el da 1 (15 minutos o ms de diferencia). Si todos los cultivos estn negativos en el da 2, obtener 3 muestras ms. c) Pacientes con endocarditis bajo tratamiento antimicrobiano: extraer 2 muestras separadas en cada da por 3 das sucesivos. 85

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5.2.3.3. Pacientes con tratamiento antimicrobiano. a) Extraer 6 muestras durante 48 horas. b) Recolectar muestras inmediatamente antes de la siguiente dosis de antibitico.

5.2.3.4. Fiebre de origen oscuro: (abscesos ocultos, fiebre tifoidea, brucelosis). a) Obtener 2 muestras separadas al inicio. Despus de 24 a 36 horas obtener 2 ms antes del aumento en la temperatura corporal. b) Los rendimientos positivos ms all de 4 hemocultivos son mnimos.

5.2.4. Materiales 5.2.4.1. Anticoagulante. a) El medio debe contener 0.025 a 0.05% polianetolsulfonato de sodio (SPS). b) El SPS es un anticoagulante que inhibe la actividad bactericida del suero contra muchas bacterias y la fagocitosis, inactiva el complemento y neutraliza los lisosomas y los antibiticos tipo aminoglucsidos. c) Neisseria spp. puede ser inhibida por SPS. La adicin de gelatina a una concentracin de 1% puede contrarrestar el efecto inhibitorio, pero el SPS es capaz de inhibir otros organismos (Gardnerella vaginalis, Streptobacillus moniliformis, Peptostreptococcus anaerobius).

5.2.4.2. Sistemas manuales para aislamiento de bacterias aerbicas y anaerbicas facultativas. a) Medios lquidos: infusin cerebro-corazn (ICC), Brucella, Columbia, peptona suplementada, tripticasa-soya.

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b) Medios Bifsicos: Medio de Castaeda: fase lquida, caldo tripticasa-soya; fase slida, agar tripticasasoya. Septi-Chek (Roche Diagnostics) con paletas recubiertas de agar. Agar inclinado Becton Dickinson Vacutainer. Ambos medios son comparables en diseo y recuperacin de microorganismos. Los sistemas utilizan una botella con caldo tripticasa-soya, la cual est conectada a una segunda cmara plstica que contiene una paleta con varias superficies recubiertas de medios con agar rico o selectivo-diferenciales. El subcultivo inicial se hace a las 4 a 6 h de incubacin a 35Cpor inversin de la botella, de manera que el caldo inunde las superficies con agar, y se continua la incubacin. La botella puede ser invertida regularmente para reinocular. El SeptiChek puede aumentar la recuperacin de Streptococcus pneumoniae, pero no la de microorganismos anaerobios. a) Sistemas de lisis y centrifugacin: Isolator (Wampole Laboratories). El sistema Isolator es un tubo especial que contiene saponina, un qumico que lisa tanto eritrocitos como leucocitos, propilenglicol para disminuir la formacin de espuma, SPS como anticoagulante y EDTA para quelar iones de calcio y as inhibir la

coagulacin y el complemento. La muestra de sangre (7.5 a 10 ml) se coloca en el tubo, se mezcla por inversin y se centrfuga a 3000 r.p.m. por 15 min. para concentrar los microorganismos con la ayuda de un fluoroqumico inerte (Fluorinert, 3M). Despus de la centrifugacin, se aspira el sedimento y se inocula en los estudios han medios apropiados. Varios

demostrado el aumento en la recuperacin de ciertos microorganismos

(Legionella, Mycobacterium, hongos), pero las desventajas incluyen una mayor tasa de 87

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contaminacin y la necesidad de manipular el sistema en una cmara de bioseguridad de flujo laminar.

a) Medios especficos para anaerobios: Tioglicolato Tiol Infusin cerebro-corazn anaerobio

b) Resinas para remocin de antibiticos: sistema ARD (Marion Laboratories). El vial contiene una resina absorbente polimrica y una resina catinica para remover hasta 100 g de antibitico. La sangre debe mezclarse por rotacin en el vial por 15 minutos, centrifugar para remover las resinas, y luego inocular en los medios de eleccin. An cuando los estudios no han demostrado mayores ventajas con este sistema, se han encontrado aumentos en los porcentajes de recuperacin de microorganismos tales como enterobacterias, S. pneumoniae, Enterococcus y estreptococos viridans. Una desventaja es la inhibicin de ciertas especies fastidiosas de bacilos y cocos Gram-negativos.

5.2.4.3. Sistemas automatizados. La introduccin al mercado de sistemas de hemocultivos de lectura continua, automatizados y computarizados representa uno de los ms significativos avances en la microbiologa clnica de los ltimos 5 a 10 aos. Los sistemas BacT/Alert (Organon Teknika), BACTEC 9240/9 120 y ESP (Difco), han sido aprobados por FDA para su uso en laboratorios clnicos en Estados Unidos. El sistema Vital de BioMerieux no ha sido aprobado por FDA, pero se est utilizando con xito en Europa. 88

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Los principios del funcionamiento de estos sistemas, y sus ventajas y/o desventajas comparativas con otros sistemas comerciales se resumen en el cuadro 5.5.

Cuadro 5.5. Sistemas de hemocultivos automatizados y computarizados.


Sistema BacT/Alert (OrganonTeknika) BACTEC 9240/9120 (Difco) Principio Sensor colorimtrico de CO2 Comentarios Igual o ms sensibles que el BACTEC radiomtrico y Isolator Sensor fluorimtrico de CO2 Igual o ms sensibles que el BACTEC radiomtrico y algunas botellas BacT/Alert y Septi-Check Monitoreo manomtrico de Ms rpido que Septi-Check y produccin de CO2 y consumo de detecta mayor nmero de bacterias H2 y 0 2 que BacT/Alert Sensor fluorimtrico de CO2 No ha sido aprobado por FDA Monitoreo manomtrico de Pendientes estudios comparativos produccin de CO2

ESP (Difco)

Vital (bioMrieux Vitek) O.A.S.I.S. (Unipath)

5.3. Control de calidad.

5.3.1. Medios. Las botellas preparadas que se compran en el mercado no requieren control de calidad en el laboratorio, sin embargo, el fabricante debe proveer los resultados de su control de calidad.

5.3.2. Contaminacin. a) Monitorear regularmente los resultados de los hemocultivos. Debe obtenerse menos del 3% de contaminacin. b) Entrenar regularmente al personal que tiene que ver con la recoleccin y procesamiento de las muestras si la contaminacin excede los rangos que se esperan para la institucin.

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5.4. Procedimientos.

5.4.1. Consideraciones generales Observar las precauciones universales al manejar muestras de sangre. a) Usar guantes al manejar cualquier fluido corporal. b) Si es posible hacer todo el procedimiento en cabinas de bioseguridad, o, en su defecto, utilizar una pantalla transparente para manipular la muestra. c) Descartar las jeringas, agujas y otros objetos punzantes contaminados en un recipiente especial. d) Nunca volver a tapar una aguja.

5.4.2. Sistemas manuales. 5.4.2. l. Medios convencionales. a) Colectar sangre e inocular en medio lquido con anticoagulante. b) Aadir sangre de manera que la dilucin quede 1:10 de sangre por medio. c) Incubar a 35C por 7 das. d) Optativamente, puede agitarse la botella en forma continua durante las primeras 24 horas. e) Inspeccionar las botellas visualmente por lo menos una vez al da. En el cuadro 5.6 se indican algunos signos de crecimiento microbiano en botellas de hemocultivo. f) Hacer tincin de Gram y subcultivos de las botellas a las 6 , 18 horas y a las 48 horas y un ltimo reporte a los 6 das, para confirmar un cultivo negativo.

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Cuadro 5.6. Signos visibles de crecimiento en hemocultivos. Observacin Microorganismo asociado Hemlisis Cocos Gram-positivos, Listeria, clostridios, Bacillus Turbidez Bacilos Gram-negativos aerobios, estafilococos, Bacteroides Gas Bacilos Gram-negativos aerobios, anaerobios Pelcula Pseudomonas, Bacillus, levaduras Cogulo Staphylococcus aureus Colonias visibles Estafilococos, estreptococos

5.4.2.2. Ventilacin de las botellas. a) El propsito de ventilar las botellas es proporcionar una atmsfera que permita que se recupere los aerbicos estrictos como Pseudomonas sp. y levaduras. b) Se ventila solo una botella cuando se envan 2 frascos. Si se utilizan medios aerbico y anaerbico se ventila solo el medio aerbico. c) En una cmara de bioseguridad se inserta el dispositivo para ventilar (por ej., aguja con tapn de algodn estril) y as se libera el vaco. Se retira y se descarta apropiadamente.

5.4.2.3. Medios para subcultivo. a) Los subcultivos iniciales deben incluir agar chocolate, agar sangre, agar MacConkey (si se observan bacterias Gram-negativas) y agar sangre suplementado para anaerobios (optativo). b) Remover aspticamente 2o3 gotas del medio bien mezclado y esparcir sobre las placas. c) La incidencia de infecciones polimicrobianas varia de 3 a 20% en los hemocultivos positivos. Por lo tanto, se deben inocular por rayado las placas para obtener colonias aisladas. d) Incubar las placas de agar chocolate en 5 a 10% de CO2 a 35C por 48 h.

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5.4.3. Reporte de hemocultivos positivos. 5.4.3.1. Reporte verbal. a) Telefonear inmediatamente despus de confirmar un cultivo positivo por Gram. b) Indicar el nombre de la persona que llam, la fecha y hora de la llamada. c) Proveer el mximo de informacin posible: nmero de muestras positivas, morfologa y arreglo microscpico, cultivos positivos de otros sitios anatmicos. Un reporte de cocos Gram-positivos en cadenas es ms til que uno de cocos Gram-positivos solamente. Un reporte de E. coli a partir de un urocultivo y un bacilo Gram-negativo en el hemocultivo pueden sugerirle al clnico la posible fuente de infeccin.

5.4.3.2. Reporte escrito. a) Proveer una copia de todos los resultados preliminares (no crecimiento o positivos por Gram). b) Proveer una copia de los resultados finales. c) Indicar la duracin de la incubacin en los reportes negativos: No crecimiento a los 7 das d) Reportar identificacin y antibiograma de los cultivos positivos.

5.5. Procesamiento de hemocultivos con requerimientos especiales. 5.5.1. Brucelosis. Brucella spp. son patgenos de clase III, por lo tanto las muestras deben manejarse en una cmara de bioseguridad. En algunos casos, solamente los cultivos de mdula sea resultan positivos. 92

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a) Preferiblemente utilizar medios bifsicos o Isolator. Para medios lquidos, inocular caldo tripticasa- soya o Brucella con 5 a 10% de CO2. Incubar a 37C. b) Si se utilizan medios bifsicos, ventilar las botellas como se describio en 4.2.2. c) Inspeccionar botellas cada 48 a 96 horas. Subcultivar botellas visualmente negativas y hacer subcultivos cada semana por 4 semanas. d) Los subcultivos deben hacerse a placas de agar sangre con base de caldo Brucella o infusin cerebro-corazn, e incubar con 10% de CO2 a 37C por un mnimo de 3 semanas.

5.5.2. Leptospirosis.

La leptospirosis puede diagnosticarse mediante el aislamiento de la espiroqueta de la sangre durante los primeros 4 a 7 das de enfermedad. Los medios recomendados son el medio Fletcher, Tween 80-albmina (TA-80), o el medio semislido Ellinghausen, McCullogh, Jonson, Harris (EMHJ), a los cuales se agrega hasta 14% (vol/vol) de suero de conejo.

a) Colocar 5 ml del medio de Fletcher y/o medio TA-80 en cada uno de 6 tubos. b) A 2 tubos de cada medio, aadir una gota de sangre. c) A 2 tubos de cada medio, aadir 2 gotas de sangre. d) A 2 tubos de cada medio, aadir 1 gota de sangre que ha sido diluida 1:10 en una solucin salina buferizada con fosfatos (PBS), pH 7.4. e) Incubar tubos en la oscuridad a 28-30C por 6 semanas. f) Con microscopio de campo oscuro examinar cultivos semanalmente removiendo 1 gota del medio por debajo de la superficie (1-3 cm).

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5.5.3. Infecciones por micobacterias. Organismos del complejo M. tuberculosis y del complejo M avium-intracellulare a menudo pueden ser aislados de sangre de pacientes con SIDA. Al tiempo que la infeccin es diagnosticada, las bacterias usualmente circulan en grandes nmeros.

a) Medios especiales: Caldo Middlebrook 7H9 con 0.05% SPS. Caldo infusin cerebro-corazn con Tween 80, con o sin agar inclinado Middlebrook 7H11. Septi-Chek bifsico. Isolator.

b) Sistemas automatizados: BACTEC 12B, 13A El uso de mtodos manuales rpidos como Septi-Chek o Isolator, junto con los sistemas automatizados, ha disminuido significativamente el tiempo de deteccin de cultivos positivos por micobacterias. La sangre puede permanecer en los tubos de Isolator por periodos prolongados sin disminuir la recuperacin de M. avium, lo que facilita su transporte y procesamiento.

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5.6. Referencias. 1. Bansal, R. C. Infective endocarditis. 1995. Medical Clinics of North America, 79:12051239.

2. Baron, E. J., L. R. Peterson, and 5. M. Finegold. Bailey & Scotts Diagnostic Microbiology, Ninth Edition. 1994. Mosby: St Louis. MO.

3. Bone, R. C. Gram-negative sepsis: a dilemma of modem medicine. 1993. Clinical Microbiology Reviews, 6:57-68.

4. Grasmick, A. Processing and Interpretation of Bood Cultures, Section 1.10. En: Isenberg, H. D. Clinical Microbiology Procedures Handbook.Vol. 1. 1992. American Society for Microbiology: Washington, D.C.

5. Koneman, E. W., 5. D. Allen, W. M. Janda, P. C. Schreckenberger, and W. C. Winn. Diagnostic Microbiology, Fifth Edition. 1997. Lippincott: Philadelphia.

6. Murray, P. R. (Ed.). Manual of Clinical Mcrobiology, Sixth Edition. 1995. American Society for Microbiology: Washington,D.C.

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6. Procesamiento de muestras de piel y tejidos blandos.


6.1. Introduccin. Muchos microorganismos se pueden asociar con infecciones en la piel y tejidos subcutneos. Este documento se referir al aislamiento e identificacin de bacterias aerobias y anaerobias facultativas, las cuales constituyen la mayora de agentes etiolgicos encontrados en estas lesiones. El cuadro 6.1 resume algunos de los principales agentes de infecciones en piel y tejidos blandos. La bsqueda de anaerobios, levaduras, hongos, parsitos y virus deber considerarse dependiendo de la informacin clnica sugerente. En la interpretacin de los resultados de cultivo es importante diferenciar los patgenos potenciales de los microorganismos comnmente presentes como flora normal o contaminantes.

6.2. Recoleccin y transporte de la muestra.

6.2.1. Normas generales a) En la mayora de las infecciones, las muestras de tejido o material aspirado con jeringa y aguja son las ptimas para el aislamiento de organismos infecciosos. b) El material aspirado con aguja y jeringa es preferible al recolectado con hisopos. c) La superficie de la piel debe ser desinfectada apropiadamente antes de recolectar el espcimen, para minimizar la contaminacin externa.

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Procesamiento de Muestras Clnicas para Diagnstico Bacteriolgico_____________________________ Cuadro 1. Lista parcial de bacterias anaerobias facultativas y aerobias causantes de infecciones en piel y tejidos blandos. Organismo Enfermedad o sndrome Actinobacillus (Haemophilus) actnomycetemcomitans Lesiones actinomicticas o similares Infeccin de heridas, celulitis Aeromonas spp. Antrax Bacillus anthracis Capnocytophaga spp. Infeccin de tejidos blandos Abscesos Chromobacterium violaceum Corynebacterium dtphthenae Difteria cutnea Heridas, catteres Corynebacterium grupo JK (C. jeikeium) Eritrasma Corynebacterium minutissimum Dermatitis Dernatophilus congolensis Infeccin de tejidos blandos, mordeduras humanas y Eikenella corrodens lesiones contundentes Heridas, quemaduras, lesiones crnicas y profundas Enterobacteriaceae Heridas, quemaduras Enterococcus spp. Erisipeloide Etysipelothrix rhusiopathiae Lesiones cutneas asociadas con infecciones sistmicas Haemophilus influenzae Infecciones seas y articulares Kingella kingae Listeriosis cutnea Listeria monocytogenes Lesiones cutneas nodulares y ulcerosas Mycobacterium marinum Lesiones cutneas asociadas con infeccin sistmica Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis Abscesos cutneos y subcutneos Nocardia spp. Mordeduras animales, osteomielitis Pasteurella multocida Mordeduras humanas Flora oral indgena Heridas, quemaduras foliculitis, fornculos, carbunclos Pseudomonas aeruginosa Heridas, linfadenitis supurativa Pseudomonas spp. Infecciones superficiales eritematosas, infecciones Staphylococcus aureus profundas, foliculitis, fornculos, carbunclos, abscesos, heridas, quemaduras Catteres Staphylococcus spp., coagulasa negativa Infecciones superficiales eritematosas, heridas, Streptococcuspyogenes (grupo A) quemaduras Heridas Streptococcus spp., beta-hemolticos Streptococcus grupo viridans Heridas, catteres, mordeduras Vibrio vulnificus Heridas, mionecrosis Streptobacillus monilifornis Mordeduras animales

d) Los hisopos deben ser enviados en un medio de transporte adecuado, tal como Stuart o Amies, en recipientes estriles. Los hisopos secos son inaceptables. e) El transporte de las muestras al laboratorio debe ser inmediato. f) Todas las muestras deben de estar debidamente rotuladas, con hora y fecha de recoleccin, as como datos demogrficos del paciente. g) Deben hacerse el mayor esfuerzo en recolectar especimenes de la mejor calidad posible. Las muestras que se entregan con mucho atraso, o que contienen flora de piel 97

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contaminante generan informacin confusa y prdida de valiosos recursos del laboratorio. Se debe solicitar una nueva muestra cuando se presenten muestras inapropiadas, y guardar todos los especmenes, ya que las nuevas recolecciones no siempre son posibles.

6.3. Procesamiento de las muestras.

6.3.1. Consideraciones generales. a) Inocular las muestras en agar sangre, medios selectivos para aerobios Gram-negativos y Gram-positivos (por ej., MacConkey, Manitol-Sal), medios enriquecidos como agar chocolate, y un medio lquido para recuperar organismos en muy bajo nmero. b) Las muestras recibidas en hisopos se emulsifican en 0.5 ml de caldo (CTS, brucella, etc.) y se inoculan del caldo los medios primarios y lminas para tincin de Gram. c) Las muestras recibidas en jeringa se inoculan directamente en los medios y lminas, tan rpido como sea posible. Asimismo, se pueden inocular medios de transporte y cultivo anaerobios. d) Las infecciones de tejidos subcutneos, fascias y msculos a menudo estn asociadas a sepsis, por lo que los hemocultivos son obligatorios.

6.3.2. Tincin de Gram. a) Preparar frotis de las muestras y observar el nmero de neutrfilos o histiocitosmacrfagos (indicadores de infeccin) y clulas epiteliales escamosas (contaminacin superficial), as como las cantidades relativas de los diferentes microorganismos. b) Reportar los resultados inmediatamente.

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c) Determinar la necesidad para procedimientos adicionales, tales como cultivo por hongos o anaerobios, y la necesidad de medios o tcnicas especiales. d) Antes de reportar los resultados finales del cultivo, correlacionar las observaciones de la tincin directa de Gram con el cultivo. Aislar e identificar todas las especies presentes en cantidades significativas en las muestras recolectadas y transportadas adecuadamente.

6.3.3. Medios especiales. a) La mayora de los patgenos potenciales de piel y tejidos subcutneos crecen satisfactoriamente en los medios de rutina. Inocular las muestras en medios enriquecidos como el agar chocolate para cultivar organismos fastidiosos por sospecha clnica. b) Listeria monocytogenes requiere enriquecimiento en fro para favorecer el aislamiento a partir de placenta y otros tejidos. Una porcin del espcimen debe colocarse en un refrigerador a 40C por 4 semanas o ms, y subcultivar semanalmente en agar sangre a 35C. c) Si existe sospecha clnica de infeccin por Nocardia o Mycobacterium spp., se deben incluir medios apropiados, tales como Lowenstein-Jensen o Middlebrook 7H9.

6.4. Evaluacin de cultivos positivos. 6.4.1. Consideraciones generales. a) Examinar los cultivos por crecimiento a las 24 y 48 h. b) Incubar los cultivos con estudio por organismos fastidiosos por 5 das adicionales. c) Reportar los resultados preliminares en todos los cultivos a las 24 h, y actualizar o reportar finalmente a las 48 h. 99

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d) Reportar resultados finales a los 7 das o bien, cuando la identificacin y el antibiograma estn listos. e) Mantener los medios lquidos por 7 das.

6.4.2. Interpretacin de los cultivos. 6.4.2.1. Da 1 (24 h) a) Examinar todos los medios slidos y lquidos por crecimiento. b) Si no hay crecimiento, reportar No-crecimiento en da 1 o No-crecimiento en < 24 h. c) Si hay crecimiento, anotar las caractersticas y cantidad de cada tipo colonial. d) Realizar tincin de Gram en cada colonia sospechosa. e) Realizar pruebas rpidas, y preparar suspensiones para paneles de identificacin (manuales o automatizados), as como pruebas de susceptibilidad a antimicrobianos. f) Si hay crecimiento solo en el caldo, realizar una tincin de Gram. g) Reportar los resultados preliminares en todos los cultivos. h) Reincubar todos cultivos en progreso.

4.2.2. Da 2 (48 h). a) Observar todos los cultivos, y evaluarlos por crecimiento. b) Interpretar y anotar los resultados de los subcultivos, pruebas de identificacin y de sensibilidad a antibiticos. c) Si hay nuevo crecimiento en los medios negativos a las 24 h, realizar las pruebas adicionales apropiadas. 100

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d) Reportar los resultados actualizados o finales en los cultivos positivos. e) Reincubar los caldos o los cultivos negativos por 3 a 5 das adicionales. f) Guardar las placas positivas, selladas con cinta adhesiva, a temperatura ambiente hasta completar todas las pruebas disponibles.

6.4.3. Notas adicionales. Realizar solo aquellos procedimientos que produzcan la informacin clnicamente ms relevante en el menor tiempo posible. Proveer guas y procedimientos de recoleccin al personal mdico para evitar la contaminacin de las muestras con flora indgena de la piel y zonas adyacentes a la lesin. Distinguir microorganismos normales o contaminantes de piel de los patgenos potenciales con el mnimo gasto o esfuerzo posible. Proceder a identificar los patgenos potenciales a partir de muestras recolectadas apropiadamente. A menos que sea solicitado especficamente por el clnico, los cultivos mixtos (mas de tres patgenos potenciales, ninguno predominante) no deben ser procesados exhaustivamente en forma rutinaria, ya que proveen poca informacin clnicamente til. Los especmenes en hisopos pueden contener ms contaminantes de piel y colonizadores no patognicos que aquellos aspirados con jeringa y aguja. El nivel del procesamiento depende de varios factores, tales como la fuente de la muestra, el mtodo de recoleccin y los resultados de la tincin de Gram. Consultar

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con el clnico para esclarecer la necesidad de realizar una identificacin definitiva cuestionable.

6.5. Recomendaciones para la identificacin de patgenos probables. La tincin de Gram debe realizarse antes de cualquier procedimiento de identificacin, de lo contrario, se puede provocar un retraso importante en el reporte de los resultados, gastos innecesarios de material, posibles identificaciones errneas, todas con consecuencias negativas para el paciente.

1. Realizar la identificacin definitiva y la prueba de susceptibilidad a antimicrobianos en los siguientes casos: a. cualquier cantidad de patgenos probables, por ejemplo, Staphylococcus aureus o Pseudomonas aeruginosa. b. patgenos potenciales con patrones de susceptibilidad impredecibles. c. todos los organismos aislados de pacientes con infecciones asociadas con catteres y a partir de sitios normalmente estriles. 2. Realizar solamente identificacin limitada pero no prueba de susceptibilidad a antimicrobianos en los siguientes casos: a. probables contaminantes de piel, los cuales incluyen estafilococos coagulasanegativa, difteroides, estreptococos viridans y Bacillus spp., acompaados de muchas clulas epiteliales escamosas y/o pocos o sin leucocitos polimorfonucleares en el frotis original.

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b. se deben identificar estos microorganismos si provienen de fuentes significativas como puntas de catter, o bien, si son aislados en cultivo puro y correlacionan con la tincin de Gram de la muestra. 3. No realizar identificacin ni antibiograma en los siguientes casos: a. mas de tres especies de flora intestinal a partir de sitios tales como absceso intraabdominal, fluido peritoneal, rea plvica, lcera de decbito, absceso o fstula perianal y drenaje intestinal. En estos casos se debe realizar una descripcin morfolgica de las especies presentes. b. en caso de predominar un microorganismo, debe realiza2rse solamente antibiograma.

6.6. Referencias. 1. Forbes, B. A., D. F. Sahm, and A. 5. Weissfeld. Bailey & Scotts Diagnostic Microbiology, Tenth Edition. 1998. Mosby: St Louis. MO.

2. Koneman, E. W., 5. D. Allen, W. M. Janda, P. C. Schreckenberger, and W. C. Winn. Diagnostic Microbiology. Fifth Edition. 1997. Lippincott: Philadelphia.

3. Mandell, U., R. G. Douglas, Jr., and Bennett, J. E., editors. Principles and practice of infectious diseases, 5tli edition, 1997. Churchill Livingstone, New York. 4. Murray, P. R. (Ed.). Manual of Clinical Microbiology, Sixth Edition. 1995. American Society for Microbiology: Washington,D.C.

5. Processing of skin and subcutaneous-tissue specimens, Section 1.16. En: Isenberg, H. D. Clinical Microbiology Procedures Handbook.Vol. 1. 1992. American Society for Microbiology: Washington, D.C. 103