Guas microbiologa de alimentos - Document Transcript

1. 2. Elaborado por: Mnica Mara Simanca Sotelo. Ingeniera de Alimentos. Alba Manuela Durango Villadiego. MSc. TABLA DE CONTENIDO Pgina 1. INTRODUCCIN 1 2. GUA N 1: Tcnica Ecomtrica. 2 3. GUA N 2: Estudio microbiolgico a manipuladores, utensilios y medio superficies, ambiente. 7 4. GUA N 3: Cuantificacin de microorganismos por el mtodo de recuento en placa. 14 5. GUA N 4: Tcnica del nmero ms probable (NMP). 22 6. GUA N 5: Recuento de mesfilos aerobios y facultativos viables. 31 7. GUA N 6: NMP de coliformes totales y fecales en alimentos de origen animal o vegetal. 33 8. GUA N 7: Recuento de Staphylococcus aureus coagulasa positiva. 36 9. GUA N 8: Recuento de Mohos y levaduras. 39 10. GUA N 9: Investigacin de Salmonella en alimentos. 41 11. GUA N 10: Recuento de esporas Clostridium sulfito reductor. 44 12. GUA N 11: Recuento de Bacillus cereus. 47 13. GUA N 12: Investigacin de Listeria monocytogenes. 50 14. GUA N 13: Investigacin de Vibrio parahaemolytico. 53 15. GUA N 14: Control microbiolgico de conservas no alteradas. 56 16. GUA N 15: Recoleccin de muestras de agua para Anlisis acteriolgico. 59 17. GUA N 16: Cuantificacin de microorganismos por el mtodo de filtracin por membrana. 63 18. GUA N 17: Nmero ms probable de Pseudomona aeruginosa. 67 19. GUA N 18: Presenciaausencia de coliformes en muestras de agua (mtodo del sustrato definido). 69 20. GUA N 19: Prueba del tiempo de reduccin del azul de metileno (T.R.A.M.). 71 21. GUA N 20: Microbiologa de leche y derivados. 73 22. GUA N 21: Microbiologa de crnicos. 76 23. GUA N 22: Microbiologa de ovoproductos. 79 24. GUA N 23: Microbiologa de pescados y mariscos. 82 25. GUA N 24: Microbiologa de frutas y hortalizas. 85 26. GUA N 25: Microbiologa de cereales y panificacin. 88 27. GUA N 26: Microbiologa de bebidas. 91 28. GUA N 27: Microbiologa de aguas. 94 29. ANEXOS 96 I 3. LISTA DE TABLAS Pgina 1. TABLA No.1: Tabla de NMP y lmites de confianza cuando se usan 5 tubos con 10 ml de muestra. 26 2. TABLA No. 2 Tabla de NMP cuando se usan 9 tubos para muestras puras. 26 3. TABLA No. 3 Tabla de NMP cuando se usan 9 tubos para muestras diluidas. 27 ii LISTAS DE FIGURAS Pgina 1. Figura No. 1: Tcnica Ecomtrica. 5 2. Figura No. 2 Diluciones decimales. 19 3. Figura No. 3: Siembra en Profundidad. 20 4. Figura No. 4: Siembra en Superficie. 21 5. Figura No. 5: Tcnica de NMP para 5 tubos (Muestras puras lquidas) 28. 6. Figura No. 6: Tcnica de NMP para 9 tubos (Muestras puras lquidas). 29 7. Figura No. 7: Tcnica de NMP para 9 tubos (Muestras diluidas lquidas o slidas) 30 iii LISTA DE ANEXOS Pgina Anexo A: Divisin laboratorio de alimentos y bebidas alcohlicas- Laboratorio de Microbiologa de Alimentos INVIMA. 96 Anexo B: Normatividad relacionada con alimentos. 97 iv INTRODUCCION La calidad de los alimentos est constituida por tres reas de estudio, las cuales son: calidad microbiolgica, calidad fsico-qumica y calidad sensorial. Entre estas reas la que revista mayor importancia es la calidad microbiolgica, puesto que a travs de esta se puede determinar la inocuidad de los alimentos, es decir, su capacidad de no producir dao (enfermedad) a las personas que lo consumen. Para llevar a cabo el anlisis microbiolgico de los alimentos es necesario disponer de un laboratorio especializado donde solo se manipulen materias primas y aditivos alimentarios, productos procesados, materiales de insumo (envases, empaques) y muestras provenientes de la instalaciones de la empresas de alimentos (manipuladores, superficies y ambiente). En el laboratorio de Microbiologa de Alimentos se deben contar con una dotacin mnima de equipos, entre los cuales cabe mencionar incubadoras, baos termostatados, autoclave, microscopios, balanzas, centrifuga, pHmetro; con una dotacin de medios de cultivo y reactivos, los cuales se deben encontrar en ptimas condiciones de uso y con suficiente cantidad de material de vidriera. El laboratorio adems debe contar con un sistema de calidad en el cual se contemplen los procedimientos de preparacin de medios de cultivo y reactivos, los procedimientos de limpieza y desinfeccin de materiales, equipos y reas y se debe definir el personal de apoyo que labore en el mismo, el cual debe contar con una formacin en el rea donde se desempear. En el presente manual se muestran los procedimientos para llevar a cabo el anlisis microbiolgico de los alimentos.

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UNIVERSIDAD DE CRDOBA FACULTAD DE CIENCIAS AGRCOLAS PROGRAMA DE INGENIERA DE ALIMENTOS MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS GUA N 1: TECNICA ECOMETRICA 1. INTRODUCCIN En el laboratorio de Microbiologa de Alimentos se debe realizar una evaluacin sistemtica de los medios de cultivo no selectivos y selectivos preparados en el laboratorio y an los comerciales, ya que stos varan ampliamente segn su composicin, modo de preparacin, etc. Es muy importante el control que se tenga sobre los medios de cultivo, porque de ellos depende la exactitud de los resultados. Para establecer la calidad de los medios de cultivo se ha desarrollado una tcnica sencilla y confiable, cuyo fundamento es comprobar el crecimiento efectivo en los medios de cultivo, de los microorganismos buscados y la inhibicin de la flora acompaante. Esta tcnica se ha denominado ecomtrica porque evala la susceptibilidad de los medios de cultivo a la colonizacin por cepas interferentes. Esta tcnica implica una siembra por estra con ayuda de un asa bacteriolgica, obtenindose Unidades Formadoras de Colonias (UFC) en nmero decreciente, como sucede en la siembra por agotamiento. En la figura N 1 se ilustra muy bien como se debe realizar la siembra. Todos los microorganismos que se suponen crecen en el medio de cultivo deben desarrollar colonias visibles, an en la estra central. En cambio los microorganismos que se suponen son inhibidos en el medio de cultivo ensayado no deben formar colonias mas all del primer cuadrante, a lo sumo en el segundo cuadrante (Ver figura 1). 2. OBJETIVO Evaluar la selectividad de los diferentes medios de cultivo selectivos mediante la tcnica ecomtrica. 3. MATERIALES Medios de cultivo Reactivos y cepas Materiales* 6 cajas de agar 3 suspensiones de cepas de asas selectivo ( EMB, microorganismos que deben crecer en bacteriolgicas hektoen, BPLS, el medio de cultivo salado manita, 3 suspensiones de cepas de incubadora Baird Parker) microorganismos que no deben crecer Mecheros en el medio de cultivo Cinta de enmascarar

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* Algodn y alcohol al 70% 4. PROCEDIMIENTO 1. Tomar 6 cajas del medio a analizar. 2. Dividir con el asa bien caliente cada caja en cuatro cuadrantes, como se observa en la figura 1. 3. Marcar tres cajas con el nombre de los microorganismos que supuestamente crecen y forman colonias en ese medio de cultivo. 4. Marcar las tres cajas restantes con el nombre de los microorganismos que supuestamente no deben crecer en ese medio de cultivo. 5. Sembrar cada caja con el microorganismo correspondiente, haciendo 5 estras en cada cuadrante y una estra central (Ver figura 1), sin quemar el asa y tomando inculo slo una vez. 6. Incubar a 37C por 24-48 horas. 5. RESULTADOS 1. Se procede a observar el crecimiento o no de cada uno de los cuadrantes de cada caja. 2. El resultado se expresa como un nmero de 6 cifras. Se anota un nmero de 0 a 5 segn el crecimiento en cada cuadrante, incluyendo la estra central considerada como la quinta. 3. Se debe anotar cada uno de los resultados de cada cuadrante, igualmente el microorganismo utilizado. 4. Al final se informar un nmero de 6 cifras. 6. INTERPRETACIN Y REPORTE Las tres primeras cifras indican los sectores positivos de los microorganismos que deben crecer y las tres ltimas cifras los sectores positivos de crecimiento por parte de las cepas cuyo desarrollo no debe producirse. As un medio selectivo perfecto dara un resultado de 555000, pero en la prctica se acepta la frmula 55001 o an otra ms desfavorable. Se reporta segn las indicaciones de la hoja de informe. 7. BIBLIOGRAFA 1. KONEMAN, Elmer W. y Cols. Diagnstico Microbiolgico. Editorial Panamericana. Buenos Aires, Argentina. 2. ACOSTA de GUEVARA Emma y GONZALEZ ORTIZ Lucy. Fundamentos para el anlisis microbiolgico de los alimentos. Barranquilla, 1995. 3. ORGANIZACIN MUNDIAL DE LA SALUD (OMS). Manual de Bioseguridad. Editorial Ginebra. 2 edicin, 1994. 4. MOSSEL, A. y MORENO, B. Microbiologa de los alimentos. Fundamentos ecolgicos para garantizar y comprobar la inocuidad y la calidad de los alimentos. Editorial Acribia. 5. MERCK. Manual de medios de cultivo. Darmstadt, Alemania, 1994.

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3 8. NECESIDADES PARA EL LABORATORIO Todos los grupos deben traer: Fsforo para encender el mechero Toallas absorbentes Cinta para enmascarar Marcador.

10. 4 CONTROL DE CALIDAD DE MEDIOS DE CULTIVO TCNICA ECOMETRICA INFORME 1. Nombre del medio de cultivo:____________________________________ 2. Fundamento del medio de cultivo:________________________________ _________________________________________________________ _________________________________________________________ _________________________________________________________ _________________________________________________________

_________________________________________________________ _________________________________________________________ No de caja Sectores positivos Microorganismo 1 _______________ ___________________ 2 _______________ ___________________ 3 _______________ ___________________ 4 _______________ ___________________ 5 _______________ ___________________ 6 _______________ ___________________ La frmula final obtenida ser: _____________________________________ Conclusin: ____________________________________________________ ______________________________________________________________ ______________________________________________________________ 11. 5 Figura No. 1: Tcnica Ecomtrica Microorganismos que SI crecen Microorganismos que NO crecen 12. 6 UNIVERSIDAD DE CRDOBA FACULTAD DE CIENCIAS AGRCOLAS PROGRAMA DE INGENIERA DE ALIMENTOS MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS GUA N 2: ESTUDIO MICROBIOLOGICO A MANIPULADORES, SUPERFICIES, UTENSILIOS Y MEDIO AMBIENTE. 1. INTRODUCCIN Para asegurar la calidad de los alimentos debe prestarse atencin tanto a los microorganismos patgenos como a los alterantes, que pudieran llagar a las materias primas o al alimento terminado, a partir del hombre (manipulador), de los equipos, tuberas, superficies, aire, etc. Segn el Ministerio de la Proteccin Social se denomina manipulador a toda persona que trabaje a cualquier ttulo y aunque sea ocasionalmente, en un local o establecimiento o en el comercio ambulante donde se produzcan, procesen, almacenen, distribuyan, transportan o expendan alimentos o materias primas para alimentos. En una planta procesadora de alimentos, el manipulador juega un papel importante en la fabricacin de sus productos, ya que se puede convertir en una fuente de contaminacin. Muchos sitios del cuerpo humano albergan una carga microbiana normal, los sitios de importancia donde residen los microorganismos saprfitos y que se constituyen en una fuente de contaminacin para manipuladores de alimentos son la piel y el tracto respiratorio (fosas nasales y faringe). El microorganismo mas importante a analizar a partir de la piel, es el Staphylococus aureus, este microorganismo reside tambin en las fosas, tracto nasofarngeo y la mayora de las veces se encuentra asociado a furnculos, heridas y lesiones de la piel. Debido a sus condiciones metablicas, esta bacteria puede crecer y/o reproducirse en condiciones adversas; esto hace factible que contamine los alimentos y por su facilidad de aislarse en el laboratorio, ha sido utilizado como indicador de contaminacin por manipuladores. La presencia de Staphylococcus aureus coagulasa positiva en los alimentos procesados indica contaminacin a partir de piel, boca o nariz de los manipuladores. La importancia de identificar este microorganismo, radica en la propiedad que tiene de liberar una toxina termoestable en los alimentos y causar intoxicaciones alimentarias; Staphylococcus aureus coagulasa positiva es el agente bacteriano que con mayor frecuencia se asocia a brotes de intoxicacin alimentaria, es por esto que el manipulador de alimentos se puede convertir en una fuente de contaminacin. Otros microorganismos no pertenecientes a la flora normal de la piel, pueden transferirse al alimento debido a una pobre higiene corporal, un ejemplo son los coliformes totales y fecales, provenientes del tracto gastrointestinal, especficamente de la regin anal, la presencia de estos tambin se investiga 13. en las manos dedos y uas de los manipuladores e indican contaminacin de origen fecal. 7 Un manipulador debe cumplir con los siguientes requisitos: 1. No presentar heridas, ni afecciones cutneas en brazos o manos. 2. No padecer enfermedades infectocontagiosas. 3. Practicar buena higiene personal. 4. Durante su trabajo debe usar uniforme y gorro, en las reas de envasado se hace indispensable el uso de mascarilla. 5. Recibir capacitacin sobre manejo higinico de alimentos. Los equipos, utensilios y superficies, utilizados en el procesamiento, fabricacin o preparacin de alimentos, deben estar diseados, construidos, instalados y mantenidos de tal forma que se evite la contaminacin del alimento y se facilite el proceso de limpieza y desinfeccin de los mismos. Igualmente es importante el estudio microbiolgico del aire (ambiente), ya que este se pone en contacto con los alimentos, por eso se debe estar seguro de trabajar en un ambiente adecuado, debidamente desinfectado o esterilizado. 2. OBJETIVOS 1. Detectar la presencia de Staphylococcus aureus coagulasa positiva en fosas nasales y zona farngea de los manipuladores, mediante la realizacin de frotis y cultivos. 2. Establecer la eficacia del lavado de manos, mediante la comparacin del nmero de UFC antes y despus del lavado. 3. Identificar la presencia de coliformes totales y fecales a partir de las manos, dedos y uas de los manipuladores, mediante frotis y cultivos. 4. Identificar la presencia de coliformes totales y fecales en utensilios, equipos y las superficies. 5.

Evaluar la contaminacin del ambiente. 3. MATERIALES Medios de cultivo Reactivos Materiales* A. Baird Parker / A.S.M. Colorantes Gram Escobillones estril A. Ogy Aceite de inmersin Baja lengua estril A. Plate count Plasma fresco Gasa estril A. EMB Reactivo de Kovacs Portaobjetos estriles A. Prpura Bromocresol Microscopio Caldo BHI Incubadora Caldo Brilla Bao serolgico Caldo Indol Tubo taparosca estril Caldo lactosado Asa bacteriolgica * Algodn y alcohol al 70% 14. 8 4. PROCEDIMIENTO 4.1. MANIPULADOR 4.1.1. Fosas nasales y Faringe 1. Marcar las cajas de Agar Baird Parker (Salado de Manitol) como muestra farngea y nasal respectivamente. 2. Inmovilizar la lengua con un bajalengua. 3. Frotar con un escobilln los pilares amigdalianos, realizar un frotis y sembrar en el Agar Baird Parker (Salado de Manitol). 4. Introducir un escobilln en las fosas nasales y frotarlo suavemente en las paredes, realizar un frotis y sembrar inmediatamente en el Agar Baird Parker (Salado de Manitol). 5. Incubar por 24-48 horas a 37C. 6. Observar las cajas de Agar Baird Parker (Salado de Manitol) y buscar colonias negras brillantes con un halo blanco rodeadas de halos claros que contrastan con el medio (Colonias puntiformes amarillas con halos amarillos). 7. Realizar un frotis de cada caja a partir de las colonias de inters y colorearlos con Gram, se deben observar cocos grampositivos agrupados en racimos. 8. Tomar 3 colonias de cada caja y transferirlas a tubos con caldo infusin cerebro corazn (BHI), marcados respectivamente como fosas nasales y faringe. 9. Incubar por 24 horas a 37C. 10. Realizar la prueba de la coagulasa: transferir 0.3 ml de cultivo BHI + 0.3ml de plasma fresco, incubar a 37C en bao serolgico por 4 horas observando cada hora la formacin de coagulo. 4.1.2. Manos 4.1.2.1. Evaluacin del mtodo de desinfeccin 1. Colocar la mano del manipulador en una caja con Agar Prpura de Bromocresol. 2. solicitar al manipulador que lave las manos como siempre lo hace. 3. Colocar la otra mano del manipulador en otra caja con Agar Prpura de Bromocresol. 4. Incubar ambas cajas a 37C por 24-48 horas. 5. Observar y contar el nmero de UFC en las cajas de Agar Prpura de Bromocresol, antes y despus del lavado. 4.1.2.2. Evaluacin de contaminacin fecal 15. 1. Frotar un escobilln humedecido con caldo brilla las manos, dedos y uas del manipulador. 2. Introducir el escobilln dentro de un tubo que contiene caldo brilla con tubo durham. 9 3. Tapar bien el tubo. 4. Incubar a 37C por 24-48 horas. 5. Realizar la lectura (turbidez y produccin de gas indican presencia de coliformes totales). 6. Confirmar la presencia de coliformes Totales, sembrando en placas de Agar EMB. 7. Incubar a 37C durante 24 horas. 8. Realizar la lectura observando la presencia de colonias sospechosas de coliformes Totales (Colonias grandes verdosas con brillo metlico). 9. Transferir dos asadas del tubo positivo a un tubo con caldo brilla (con tubo durham) y a uno con caldo indol. 10. Incubar en bao serolgico a 45C por 24-48 horas, asegurndose de que el nivel del agua cubra el medio de cultivo. 11. Adicionar 5 gotas del reactivo de Kovacs al tubo con caldo indol, para la determinacin de indol. 12. Realizar la lectura (la turbidez y el gas en el tubo de brilla y la produccin de indol en el caldo indol, indican la presncia de coliformes fecales). Recuerde que solo la positividad de ambos tubos, indican la presencia de Coliformes fecales. 4.2. ESTUDIO MICROBIOLGICO A UTENSILIOS, EQUIPOS Y SUPERFICIES. Procedimiento de la esponja o gasa estril. 1. Con la ayuda de una bolsa de plstico, a manera de guante, tomar la esponja estril, evitando posibles contaminaciones. 2. Verter unos mililitros de caldo lactosado a la esponja y muestrear el utensilio, equipo o superficie seleccionada, frotando la esponja por toda el rea. 3. Dejar la esponja en el interior de la bolsa, una vez finalice la operacin y agregar el resto del caldo lactosado. 4. Cerrar y marcar la bolsa. 5. Exprimir la esponja varias veces, suavemente. 6. Incubar la bolsa con la espoja a 37C durante 24 horas. 7. Pipetear 1ml de caldo lactosado y transferirlo a un tubo con caldo brilla. 8. Incubar a 37C durante 24 a 48 horas. 9. Realizar la lectura observando la presencia de gas y turbidez. 10. Continuar como en el inciso 6 del numeral 4.1.2.2. 4.3. ESTUDIO MICROBIOLOGICO AL AMBIENTE. 4.3.1. Evaluacin de la Contaminacin Bacteriana. 1. Abrir una caja de Agar Plate Count por 10 minutos. 16. 2. Cerrar la caja e incubar a 37C por 24-48 horas. 3. Contar y reportar el nmero de colonias. 10 4.3.2. Evaluacin de la Contaminacin Fngica. 4. Abrir una caja de Agar Ogy por 10 minutos. 5. Cerrar la caja e incubar por 3 a 5 das a 22C. 6. Contar y reportar el nmero de microorganismos. 5. INTERPRETACIN Y REPORTE 5.1. Fosas nasales y zona faringea La determinacin del Staphylococcus aureus en estos casos es considerada una prueba de presencia o ausencia, se reporta como prueba positiva o negativa para Staphylococcus aureus coagulasa positiva. 5.2. Manos Evaluacin del mtodo de desinfeccin. Esta prueba sirve para establecer la eficacia del lavado de las manos en manipuladores y se

reporta la diferencia entre las UFC antes y despus del lavado. Evaluacin de la contaminacin fecal. La determinacin de coliformes totales y fecales, en este caso es una prueba de presencia o ausencia, se reporta como presencia de coliformes totales o fecales; indican que el proceso de sanitizacin no es el ideal o contaminacin de origen fecal. 5.3. Estudio microbiolgico a utensilios, equipos o superficies. La presencia de coliformes totales o fecales, indican que el proceso de limpieza y desinfeccin no es el adecuado o contaminacin de origen fecal. 5.4. Evaluacin microbiolgica al ambiente. Se reporta el nmero de colonias, que no debe ser mayor de 10 en 10 minutos, si es mayor indica que el ambiente est contaminado y se debe repetir el proceso de desinfeccin o esterilizacin del ambiente. 6. BIBLIOGRAFA 1. KONEMAN, Elmer W. y Cols. Diagnstico Microbiolgico. Editorial Panamericana. Buenos Aires, Argentina. 17. 2. ACOSTA de GUEVARA Emma y GONZALEZ ORTIZ Lucy. Fundamentos para el anlisis microbiolgico de los alimentos. Barranquilla, 1995. 3. MINISTERIO DE SALUD DE COLOMBIA. Decreto 3075. Norma sobre manipuladores, 1997. 11 4. ESCOBAR DUQUE, Mara Beatriz. Manual de tcnicas y procedimientos. Programa Latinoamericano de microbiologa e higiene de los alimentos. Universidad de Antioquia, Facultad de Salud Pblica Hctor Abad Gmez. Medelln, 1994. 7. NECESIDADES PARA EL LABORATORIO Todos los grupos deben traer: Fsforo para encender el mechero Toallas absorbentes Cinta para enmascarar 18. 12 UNIVERSIDAD DE CRDOBA FACULTAD DE CIENCIAS AGRCOLAS PROGRAMA DE INGENIERA DE ALIMENTOS MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS GUA N 3: CUANTIFICACIN DE MICROORGANISMOS POR EL METODO DE RECUENTO EN PLACA. 1. INTRODUCCIN El recuento en placa es el mtodo ms utilizado y ms recomendado por la Comisin Internacional sobre especificaciones Microbiolgicas en los alimentos (ICMSF). El procedimiento se basa en la cuantificacin de la poblacin microbiana presente en los alimentos slidos o lquidos, sembrando en profundidad o en superficie. La mayora de los alimentos no son estriles, sino que contienen una poblacin microbiana, que vara ampliamente en nmero, dependiendo del alimento. Es por esto que al alimento se le realizan diluciones para su cuantificacin, ya que si se sembraran los alimentos sin diluir, presentaran un recuento tan alto que sera imposible realizar su conteo. Para eso se utilizan las diluciones logartmicas en base 10 (10-1, 10-2, 10-3, 10-4), las cuales se pueden relacionar con el recuento de microorganismos multiplicando por el factor de dilucin, que es el inverso de la dilucin. La dilucin inicial siempre ser 1:10 (10+90; 25+225; 50+450; 100+900), la cantidad de muestra va a depender del tipo de alimento y de los parmetros que existan, pero lo importante que se guarde la relacin: 1+9 o sea 1 parte de alimento y 9 partes de diluyente. 2. OBJETIVOS 1. Preparar correctamente homogenizados a partir de muestras de alimentos slidos o lquidos. 2. Realizar diluciones logartmicas en base 10 a partir de los homogenizados. 3. Sembrar en profundidad 1ml de las diferentes diluciones con agar plate count. 4. Sembrar en superficie 0.1ml de las diferentes diluciones en el agar correspondiente. 5. Contar las UFC teniendo en cuenta las reglas, despus de evaluar la calidad de los controles y de las diluciones. 6. Informar el nmero de UFC/g ml de alimento. 3. MATERIALES Medios de cultivo Reactivos Materiales* Agua peptona 0.1% Homogenizador Agar Plate count Balanza Agar leche Cuchillos-cucharas Agar EMB Incubadora Agar Tributirina Contador de colonias 19. Asa bacteriolgica Bolsas de polipropileno Cajas petri estriles * Algodn y alcohol al 70% 4. PROCEDIMIENTO 4.4. PROCEDIMIENTO DE LAS DILUCIONES 1. Si la muestra no se va a procesar inmediatamente, debe guardarse en refrigeracin a 4C por un tiempo mximos de 24 horas. 2. Desinfectar con alcohol al 70% el frasco o envase que contiene el alimento. 3. En un frasco o fiola adicionar 90ml de agua peptonada al 0.1% y marcarla como dilucin 10-1. 4. Marcar dos tubos de vidrio tapa rosca como dilucin 10-2 y dilucin 10-3, adicionar a cada uno de ellos 9 ml de agua peptonada al 0.1%. 5. Agitar unas 25 veces las muestras lquidas, formando un arco con el antebrazo de 30 cm o resuspendiendo con la pipeta unas 10 veces, si el recipiente no tiene espacio libre con el fin de homogenizar la muestra y tomar una parte representativa del producto. Para muestras slidas pesar 10g de la muestra, tratando de tomar porciones de varias partes. 6. Tomar 10 ml o 10g de la muestra mezclada y agregarlos al frasco que contiene los 90 ml, mezclar resuspendiendo con la pipeta ms de 10 veces, hasta homogenizar la mezcla; as se obtiene la dilucin 10-1. 7. Tomar 1 ml de la dilucin 10-1 y adicionarlos al tubo que contiene 9 ml de agua peptonada al 0.1% marcado con la dilucin 10-2. Mezclar unas 10 veces aspirando con la pipeta. Esta es la dilucin 10-2. 8. Tomar 1 ml de la dilucin 10-2 y adicionarlos al tubo marcado con la dilucin 10-3. Mezclar unas 10 veces aspirando con la pipeta. As se obtiene la dilucin 10-3. 9. De esta forma se tienen

las diferentes diluciones, el nmero de ellas va ha depender del alimento y de los parmetros que existan, pero deben sembrarse por lo menos tres (3) diluciones. (Ver figura 2 ) 4.5. PROCEDIMIENTO DE SIEMBRA EN PROFUNDIDAD. 1. Tomar 5 cajas de petri estriles y marcarlas en la tapa como dilucin 10 -1, 10-2, 10-3, control del diluyente y control del medio; adems escribir en cada una de ellas el N del grupo, el semestre, la fecha, el tipo de examen y el nmero de la muestra. 2. Mezclar unas diez veces con la pipeta la dilucin 10 -1 y tomar 1ml de la dilucin y adicionarlo en la caja marcada con 10-1 (ver figura 3), las diluciones deben sembrarse por duplicado. 3. Mezclar de igual forma con pipeta diferente la dilucin 10-2, tomar 1ml y adicionarlo en la caja marcada como dilucin 10-2. 20. 14 4. Mezclar de igual forma con pipeta nueva la dilucin 10-3, pipetear 1ml y adicionarlo en la caja marcada como dilucin 10-3. El tiempo transcurrido entre la realizacin de las diluciones y la siembra en la ltima caja, no debe ser mayor de 20 minutos. 5. Adicionar 1ml de agua peptonada al 0.1% a la caja marcada como control del diluyente. 6. Adicionar 15ml del agar fundido a 45C, a cada una de las cajas, incluyendo las cajas marcadas como control del diluyente y del medio. Segn la temperatura de incubacin, se obtienen los mesfilos aerobios a 37C, los termfilos cuando se incuban las cajas a 55C, los psicrfilos a 7C por 10 das. La temperatura elegida depender del objetivo que se pretenda con la realizacin del recuento. Tambin dependiendo del medio de cultivo se pueden determinar: mesfilos aerobios y facultativos viables, utilizando agar plate count; protelticos, utilizando agar leche; lipolticos, utilizando al agar tributirina; coliformes, utilizando agar EMB o VRBD. Cambiando las condiciones de aerobiosis por anaerobiosis y el medio de cultivo, se pueden detectar loa mesfilos anaerobios y facultativos viables, utilizando agar cisteinado e incubando por 72 horas en condiciones de anaerobiosis. a. Mesfilos aerobios y facultativos viables: Adicionar 15 ml de Agar Plate Count fundido a 45C a cada una de las cajas, incluyendo las marcadas como control del diluyendo y como control del medio; mezclar como indica el numeral 7, dejar solidificar, invertir las cajas e incubar a 37C por 24 a 48 horas. b. Termfilos: Adicionar 15 ml de Agar Plate Count fundido a 45C a cada una de las cajas, incluyendo las marcadas como control del diluyendo y como control del medio; mezclar como indica el numeral 7, dejar solidificar, invertir las cajas e incubar a 55C por 24 a 48 horas. c. Psicrtrofos: Adicionar 15 ml de Agar Plate Count fundido a 45C a cada una de las cajas, incluyendo las marcadas como control del diluyendo y como control del medio; mezclar como indica el numeral 7, dejar solidificar, invertir las cajas e incubar a 7C por 10 das. d. Proteolticos: Adicionar 15 ml de Agar leche fundido a 45C a cada una de las cajas, incluyendo las marcadas como control del diluyendo y como control del medio; mezclar como indica el numeral 7, dejar solidificar, invertir las cajas e incubar a 22C por 72 horas. 21. e. Coliformes: Adicionar 15 ml de Agar EMB fundido a 45C a cada una de las cajas, incluyendo las marcadas como control del diluyendo y como control del medio; mezclar como indica el numeral 7, dejar solidificar, invertir las cajas e incubar a 37C por 24 a 48 horas. 15 7. Mezclar cinco veces en forma de ochos, en direccin de las manecillas del reloj y viceversa, de arriba hacia abajo y viceversa con el fin de obtener una distribucin homognea de la muestra en el medio de cultivo. 8. Dejar solidificar, invertir las cajas e incubar a 37C de 24 a 48 horas. 4.6. PROCEDIMIENTO DE LA SIEMBRA EN SUPERFICIE. 1. Preparar la muestra y realizar las diferentes diluciones. 2. Marcar tres cajas de petri que contienen agar con el nombre del alimento, fecha, dilucin y No. del grupo. 3. Marcar dos cajas de petri del mismo medio, una como control del diluyente y otra como control del medio. 4. Adicionar 0.1ml de cada una de las diluciones y del control del diluyente en las cajas marcadas respectivamente que contienen el medio de cultivo. 5. Extender con una varilla de vidrio la muestra sobre toda la superficie del medio, hasta que la superficie quede seca. 6. Incubar por 24-48 horas a 35-37C (ver figura 4). 7. Seleccionar las cajas que tengan entre 20 a 200 colonias. 8. Realizar el conteo final multiplicando por la dilucin y por 10. 5. INTERPRETACIN Y REPORTE 1. Sacar las cajas de la incubadora. 2. Evaluar las cajas marcadas como control del diluyente y control del medio. 3. Organizar las cajas de la dilucin menor a la mayor. 4. Evaluar el crecimiento secuencial y la calidad de las diluciones, el recuento debe ser 10 veces menos a medida que aumenta la dilucin. 5. Proceder al recuento de las Unidades Formadoras de Colonia (UFC). 6. INFORMES DE RESULTADOS 1. Se reportan solamente dos dgitos, el primero y el segundo de izquierda a derecha, los otros dgitos deben reemplazarse por ceros. 2. No se reportan cifras decimales, sino que se redondea al mas prximo nmero si el tercer dgito es 5 o mayor y se quita si es menor de cinco. 3. Los recuentos estimados no se reportan para la aceptacin o rechazo de un alimento, porque es til solo como una aproximacin primaria en la calidad bacteriolgica de un alimento.

22. 7. REGLAS PARA EL RECUENTO DE MICROORGANISMOS 16 1. Cajas entre 30 -300 UFC Es la caja ideal (para siembras en profundidad), se cuentan las UFC y se multiplican por el inverso del factor de dilucin. Ej: Dil: 10-1 >300 UFC -2 Dil: 10 > 300 UFC Dil: 10-3 80 UFC Dil: 10-4 10 UFC Resultado: 80x103 UFC /g o mL. Si las cajas se sembraron por duplicado, se promedia el valor y se multiplican por el factor de dilucin. Se reporta Recuento Estndar en placa 80x103 UFC /g o mL Para siembras en superficie se recomienda escoger cajas que contengan entre 20 y 200 UFC, y para el recuento de mohos y levaduras cajas que contengan entre 20 y 100 UFC (Escobar, 1994, p 183 y 199). 2. Diluciones consecutivas entre 30-300 UFC. Se hace el recuento para cada dilucin y se promedian los resultados. Ej: a) Si el conteo de una de las cajas es menos del doble del conteo de la otra caja, se informa el promedio de recuento. Ejemplo: Dil: 10-1 >300 UFC -2 Dil: 10 300 UFC Dil: 10-3 38 UFC Dil: 10-4 10 UFC Resultado: 38000/30000= 1,27, lo que indica que el conteo de la dilucin mayor es manos del doble de la dilucin menor, entonces se reporta el promedio del recuento: (38000 + 30000)/2 = 34000 UFC 34x103. Se reporta Recuento Estndar en placa 34x103 UFC /g o mL b) Si el conteo de una de las cajas es el doble o ms del conteo de la otra caja, se informa el recuento menor. Ejemplo: Dil: 10-1 >300 UFC -2 Dil: 10 200 UFC Dil: 10-3 60 UFC Dil: 10-4 15 UFC Resultado: 60000/20000= 3, lo que indica que el conteo de la dilucin mayor es mas del doble de la dilucin menor, entonces se reporta la dilucin menor o sea 20000UFC 20x103 UFC. Se reporta Recuento Estndar en placa 20x103 UFC/ g mL. 23. 17 3. Ninguna caja entre 30 y 300 UFC En estos casos se elige la caja con el recuento ms cercano a 300, se multiplica por el factor de dilucin y se reporta como Recuento Estimado en Placa. 4. Todas las cajas tienen menos de 30 UFC. Se cuentan las colonias de la caja con menor dilucin y se reporta como Recuento Estimado en placa. 5. Ninguna de las cajas presenta crecimiento. Despus de estudiar los controles, evaluar que no haya presencia de sustancias inhibidoras en el medio de cultivo, se informa como menos de la dilucin mas baja utilizada, menos de 101 UFC /g mL. o menos de 10 UFC /g mL ( para siembra en profundidad) y menos de 10 2 UFC /g mL o menos de 100 UFC /g mL ( para siembra superficial). Se reporta como Recuento Estimado en placa: <1x101 UFC /g mL o 102 UFC /g mL, respectivamente. 6. Todas las cajas presentan mas de 300 UFC a) Dividir la caja de la dilucin mas alta en secciones radiales (2, 4, 8), contar todas las colonias de una seccin y multiplicar ese resultado por el factor de dilucin y se reporta como Recuento Estimado en placa. b) Si hay mas de 200 colonias en cada una de las 8 secciones, multiplicar por 1600 (200x8) y por el factor de dilucin; expresar el resultado como mayor que el nmero resultante. Reportar Recuento Estimado en placa: > 16x105 UFC/g mL. 7. Presencia de Spreader Es el crecimiento de un microorganismo en forma de pelcula, la cual puede ocupar toda la caja o parte de ella. Si cubre solo la mitad contar las colonias presentes en la otra mitad y reportar como Recuento Estimado en placa. Si cubre toda la caja se tiene que repetir el recuento y reportar presencia de spreader o accidente de laboratorio. 8. INVESTIGAR 1. Cmo se realiza la dilucin 10-1 en los alimentos o productos donde la contaminacin es esencialmente superficial? 2. Cmo se realiza la dilucin 10-1 en los productos grasos y que se hace cuando el contenido graso es mayor del 20%? 24. 3. Qu precauciones se deben antes de realizar diluciones a partir de alimentos congelados, deshidratados o pasteurizados? 4. Cul es la importancia y utilidad del recuento en placa? 18 9. BIBLIOGRAFA 1. ACOSTA de GUEVARA Emma y GONZALEZ ORTIZ Lucy. Fundamentos para el anlisis microbiolgico de los alimentos. Barranquilla, 1995. 2. ESCOBAR DUQUE, Mara Beatriz. Manual de tcnicas y procedimientos. Programa Latinoamericano de microbiologa e higiene de los alimentos. Universidad de Antioquia, Facultad de Salud Pblica Hctor Abad Gmez. Medelln, 1994. 3. ICMSF. Microorganismos de los alimentos. Tcnicas de anlisis Microbiolgico. Vol. 1, 2da edicin, Editorial Acribia. Zaragoza, Espaa, 1984. 10. NECESIDADES PARA EL LABORATORIO Todos los grupos deben traer: Fsforo para encender el mechero, toallas absorbentes, Cinta para enmascarar, Marcador. Grupo 1: 100 mL de leche Grupo 2: 100 g de queso Grupo 3: 100 mL de suero costeo Grupo 4: 100 g de pulpa de fruta o una fruta fresca Grupo 5: 100 g de chorizo. Figura No. 2 Diluciones decimales 90 ml Agua Dilucin 10-1 10 g pepto na 1ml 10 ml 9 ml Agua Dilucin 10-2 Pept. 1ml 9 ml Agua Pept. 25. Dilucin 10-3 19 Figura No. 3: Siembra en Profundidad 10-1 10-2 10-3 C.D 1 ml 1ml 1ml 1ml 10-1 10-2 10-3 C.D. C.M . ml 15 Agar 15ml 45C Mezclar Solidifi car Y Incubar

26. 20 Figura No. 4: Siembra en Superficie 10-1 10-2 10-3 C.D 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 10-1 10-2 10-3 C.D. C.M . Agar Incubar 27. 21 UNIVERSIDAD DE CRDOBA FACULTAD DE CIENCIAS AGRCOLAS PROGRAMA DE INGENIERA DE ALIMENTOS MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS GUA N 4: TECNICA DEL NMERO MS PROBABLE (NMP) 1. INTRODUCCIN Esta tcnica sirve para estimar la poblacin de microorganismos viables en una muestra de alimento. En contraste con el recuento estndar en placa, el NMP es un mtodo indirecto y solo da recuentos estimados de la poblacin microbiana; es menos preciso que el recuento en placa cuando se trata de alimentos que contienen altas poblaciones microbianas, pero mas eficaz en poblaciones bajas porque permite el anlisis de muestras de tamao mas significativo. Se usa principalmente para la determinacin de coliformes, pero variando el medio de cultivo tambin se puede utilizar para la cuantificacin de Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, etc. La metodologa de la tcnica se basa en la siembra de volmenes secuenciales de base 10 (10, 1, 0.1, 0.01 mL) de la muestra pura o 1 mL de la diluciones decimales. El nmero de diluciones depender del grado de contaminacin del alimento y/o de los estndares microbiolgicos establecidos para ese producto: La relacin muestra pura o diluida debe ser de 1mL para 10 mL de medio de cultivo. Existen diferentes del NMP para coliformes, dependiendo del medio de cultivo utilizado: el norteamericano emplea el caldo laurel sulfato triptosa, seguida de la confirmacin de los tubos positivos en caldo lactosa bilis verde brillante o siembra por estra en EMB; el britnico solo utiliza caldo Mac-konkey; un tercer mtodo emplea el caldo lactosa bilis verde brillante y confirman con agar cristal violeta rojo neutro bilis lactosa. La utilizacin del mtodo depender del tratamiento a que ha sido sometido el alimento. 2. OBJETIVOS 1. Conocer el fundamento de la tcnica del nmero ms probable. 2. Sembrar muestras puras y diluidas por la tcnica del NMP utilizando diversas modalidades y medio de cultivo. 3. Leer la positividad de los tubos en las tablas correspondientes. 4. Informar los resultados de la tcnica del NMP. 3. MATERIALES 28. Medios de cultivo Reactivos Materiales* Bilis verde brillante Coloracin de gram Homogenizador lactosa con durham A. EMB Balanza Agua peptona 0.1% Cuchillos-cucharas Incubadora Pipetas 1 y 10mL Asa bacteriolgica Bolsas de polipropileno Gradilla Tubos de ensayo * Algodn y alcohol al 70% 4. PROCEDIMIENTO 4.1. TECNICA CON 5 TUBOS PARA MUESTRAS LQUIDAS PURAS 1. Desinfectar con alcohol al 70% toda el rea de trabajo. 2. Marcar 5 tubos que contienen 10mL cada uno de medio Bilis verde brillante lactosa a doble concentracin. 3. Limpiar con alcohol al 70% el recipiente que contiene el alimento a utilizar. 4. Mezclar muy bien el alimento y adicionar 10mL en cada uno de los tubos (ver figura 5). 5. Mezclar en incubar por 24-48 horas a 35-37C. 6. Leer los tubos tubos: Positivos los que presenten gas y turbidez. Negativo los que no presentes estos parmetros o presente solamente uno de los dos. 7. Anotar los tubos positivos y buscar en la tabla No. 1, que es una tabla que se usa cuando se utilizan 5 tubos con 10mL de muestra. El resultado del NMP se obtiene en 100mL, si el resultado se tiene que expresar por mL se divide entre 100. 4.2. TECNICA CON 9 TUBOS PARA MUESTRAS LQUIDAS PURAS. 1. Desinfectar Con alcohol al 70% toda el rea de trabajo. 2. Tomar 9 tubos que contienen 10mL cada uno de medio Bilis verde brillante lactosa, tres de los cuales estn a doble concentracin y los 6 restantes a concentracin simple. 3. Marcar los tubos anteriores de la siguiente manera: con el nmero 10 los tres tubos que tienen doble concentracin, con el nmero 1 tres tubos con concentracin simple y con el nmero 0.1 los tres tubos restantes que tambin tienen una concentracin normal o simple. 4. Limpiar con alcohol al 70% el recipiente que contiene el alimento a utilizar. 5. Mezclar muy bien el alimento y sembrar por triplicado 10mL, 1mL y 0.1 mL en cada uno de los tubos marcados respectivamente (ver figura 6). 6. Mezclar en incubar por 24-48 horas a 3537C. 29. 7. Leer los tubos tubos: Positivos los que presenten gas y turbidez. Negativo los que no presenten estos parmetros o presente solamente uno de los dos. 23 8. Anotar los tubos positivos y confirmar la presencia del microorganismo a determinar usando pruebas complementarias. 9. Anotar los tubos que resultaron positivos en la prueba confirmatoria. 10. Buscar en la tabla No. 2, que es una tabla que se usa cuando se siembran 10mL de muestra en tres tubos, 1mL en otros tres tubos y 0.1mL de muestra en los ltimos tres tubos. El resultado del NMP se da en 100mL, si el resultado se debe expresar por mL se divide entre 100. 4.3. TECNICA CON 9 TUBOS PARA MUESTRAS DILUIDAS LQUIDAS O SLIDAS. 1. Desinfectar con alcohol al 70% toda el rea de trabajo. 2. Limpiar con alcohol al 70% el recipiente que contiene el alimento a utilizar. 3. Mezclar muy bien el alimento y realizar tres diluciones de igual forma que para el

recuento en placa. 4. Sembrar por triplicado 1mL de cada uno de las diluciones en tubos que contengan 10mL de Bilis verde brillante lactosa preparados a concentracin simple (ver figura 7). 5. Mezclar en incubar por 24-48 horas a 35-37C. 6. Leer los tubos tubos: Positivos los que presenten gas y turbidez. Negativo los que no presentes estos parmetros o presente solamente uno de los dos. 7. Anotar los tubos positivos que dieron positivo la prueba confirmatoria (Ver figura 7). 8. Buscar en la tabla No. 3, que se usa cuando se siembra por triplicado 1mL de muestra en cada una de las diluciones. El NMP se expresa por mL. 4.4. PROCEDIMIENTO DE PRUEBAS COMPLEMENTARIAS Estas pruebas se utilizan para comprobar si realmente se ha detectado el microorganismo buscado 4.4.1. Examen microscpico directo: 1. realizar frotis a partir de los tubos positivos. 2. Colorearlos con Gram. 3. Observar los microorganismos al microscopio con objetivo de 100X. Este mtodo no es til ya que no permite distinguir los microorganismos muertos de los vivos. 4.4.2. Subcultivos: 1. Realizar siembras de los tubos positivos en agar selectivo (EMB, mac- Konkey Endo). 2. Incubar por 2448 horas a 37C. 30. 3. Observar el crecimiento del microorganismo buscado e informar. 24 5. RESULTADOS E INTERPRETACIN. Los resultados se expresan como NMP = No. de bacteria/ g mL de alimento; hay veces dependiendo del alimentos se expresa como NMP = No. de bacterias / 100mL. Los resultados de un anlisis de NMP, estn directamente relacionados con la frecuencia con que se presentan una serie de resultados positivos, que son los mas probables que ocurran cuando un nmero dado de organismos estn presentes en una muestra de alimentos. En caso de realizar ms diluciones que las que posea la tabla empleada, se puede usar la siguiente frmula para hallar el NMP por g mL: (NMP de la tabla x Factor de dilucin intermedio de la lectura)/ 100 = Bact/g mL 6. BIBLIOGRAFA 1. ACOSTA de GUEVARA Emma y GONZALEZ ORTIZ Lucy. Fundamentos para el anlisis microbiolgico de los alimentos. Barranquilla, 1995. 2. MINISTERIO DE SALUD DE COLOMBIA. Decreto 3075. Norma sobre manipuladores, 1997. 3. ESCOBAR DUQUE, Mara Beatriz. Manual de tcnicas y procedimientos. Programa Latinoamericano de microbiologa e higiene de los alimentos. Universidad de Antioquia, Facultad de Salud Pblica Hctor Abad Gmez. Medelln, 1994. 4. ICMSF. Microorganismos de los alimentos. Tcnicas de anlisis Microbiolgico. Vol. 1, 2da edicin, Editorial Acribia. Zaragoza, Espaa, 1984. 7. NECESIDADES PARA EL LABORATORIO Todos los grupos deben traer: Fsforo para encender el mechero, toallas absorbentes, Cinta para enmascarar, Marcador. Grupo 1: 100 mL de leche cruda Grupo 2: 100 g de queso Grupo 3: 100 mL de suero costeo Grupo 4: 100 mL de jugo preparado en casa Grupo 5: 100 g de chorizo. 31. 25 TABLA No. 1 TABLA DE NMP Y LMITES DE CONFIANZA CUANDO SE USAN 5 TUBOS CON 10 ML DE MUESTRA NMERO DE TUBOS POSITIVOS NMP/100mL LIMITES DE CONFIANZA 95% Mnimo Mximo 0 2.2 0 6.0 1 2.2 0.1 12.6 2 5.1 0.5 19.2 3 9.2 1.6 29.4 4 10.0 3.0 52.9 5 16.0 8.0 Infinita TABLA No. 2 TABLA DE NMP CUANDO SE USAN 9 TUBOS PARA MUESTRAS PURAS NMERO DE TUBOS POSITIVOS NMP/100mL LIMITES DE CONFIANZA 95% 10mL 1mL 0.1mL Mnimo Mximo 000 <3 001 3 0.5 9 010 3 0.5 13 100 4 0.5 20 101 7 1 21 110 7 1 23 111 11 3 36 120 11 3 36 200 9 1 36 201 14 3 37 210 15 3 44 211 20 7 89 220 21 4 47 221 28 10 150 300 23 4 120 301 39 7 130 302 64 15 380 310 43 7 210 311 75 14 230 312 120 30 380 320 93 15 380 321 110 30 440 322 210 35 470 330 240 36 1300 331 460 71 2400 332 1100 150 4800 32. 333 >2400 26 TABLA NO. 3 TABLA DE NMP CUANDO SE USAN 9 TUBOS PARA MUESTRAS DILUIDAS NMERO DE TUBOS POSITIVOS NMP/g mL LIMITES DE CONFIANZA 10-1 10-2 10-3 99% 95% 000 <3 <1 23 <1 17 010 3 <1 28 1 21 100 4 1 35 2 27 101 7 1 36 2 28 110 7 2 44 4 35 120 11 1 50 2 38 200 9 3 62 5 48 201 14 3 65 5 50 210 15 5 77 8 61 211 20 5 80 8 63 220 21 4 177 7 129 300 23 10 230 10 180 301 40 10 290 20 210 310 40 20 370 20 280 311 70 20 520 30 390 320 90 30 660 50 510 321 150 50 820 80 640 322 210 100 1900 100 1400 330 200 100 3200 200 2400 331 500 200 6400 300 4800 332 1100 333 >2400 Fuente: MAN (1975) De cada dilucin se inoculan tres tubos de medio, cada uno con 1 mL. Para calcular el NMP de diluciones mayores que las que figuran en la tabla, multiplicar el NMP por el factor adecuado: 10, 100, 1000, etc. Por ejemplo, si los tubos seleccionados corresponden a las diluciones 102, 10-3, 10-4, multiplicar por 10; si las diluciones son 10-3, 10-4, 10-5, multiplicar por 100. 33. 27 Figura No. 5: Tcnica de NMP para 5 tubos (Muestras puras lquidas) Litro 10 ml 10 ml 10 ml 10 ml 10 ml 10 ml (doble) (Doble) (Doble) (Doble) (Doble) Incu bar

34. 28 Figura No. 6: Tcnica de NMP para 9 tubos (Muestras puras lquidas) Litro 0.1 ml ml 10 1 ml Incu bar 35. 29 Figura No. 7: Tcnica de NMP para 9 tubos (Muestras diluidas lquidas o slidas) 10 10 ml Gramo s 1ml 1ml 90 ml Agua pepto 9 ml 9 ml A.Pep APep 10-2 10-3 10-1 ml ml 1 1 ml 1 Incu bar 36. 30 37. UNIVERSIDAD DE CORDOBA FACULTAD DE CIENCIAS AGRCOLAS PROGRAMA DE INGENIERA DE ALIMENTOS MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS GUA N 5: RECUENTO DE MESOFILOS AEROBIOS Y FACULTATIVOS VIABLES 1. INTRODUCCIN El nmero de microorganismos mesfilos aerobios encontrados en los alimentos por el mtodo del recuento en placa es uno de los indicadores microbiolgicos de la calidad de los alimentos mas frecuentemente usados. Este ndice no es utilizado en productos alimenticios obtenidos por medio de procesos fermentativos como el queso y ciertos embutidos porque los recuentos de microorganismos son muy elevados. (Luna, 1991, p 49). Este recuento es utilizado para determinar si la limpieza, desinfeccin y el control de temperaturas durante los procesos de tratamiento industrial, transporte y almacenamiento se han realizado de forma adecuada; tambin permite obtener informacin sobre alteraciones incipientes en los alimentos, la probable vida til del producto, la descongelacin incontrolada de los alimentos congelados o las fallas en el mantenimiento de las temperaturas de refrigeracin en alimentos fros. Adems es el mtodo utilizado para poner de manifiesto el origen de la contaminacin durante los procesos de elaboracin de los alimentos. (Luna, 1991, p 49). El recuento en placa de mesfilos aerobios se puede desarrollar a travs de cuatro mtodos: 1. Mtodo de recuento en placa profunda. (Mayor uso). 2. Mtodo de recuento en placa superficial. 3. Mtodo de recuento en placa por siembra de gotas en superficie. 4. Mtodo de recuento en placa por siembra con asa de platino calibrado (Para leche principalmente). 2. OBJETIVOS 1. Realizar recuento de microorganismos mesfilos aerobios y facultativos viables a partir de alimentos de origen animal o vegetal. 3. MATERIALES Medios de cultivo Reactivos Materiales* Agua peptona 0.1% Homogenizador Agar plate count Balanza Cuchillos-cucharas Incubadora Pipetas 1 y 10mL Asa bacteriolgica Bolsas de polipropileno Gradilla Cajas de petri * Algodn y alcohol al 70% 38. 4. PROCEDIMIENTO 4.1. RECUENTO DE MESFILOS AEROBIOS Y FACULTATIVOS VIABLES 1. Preparar las diluciones de igual forma que para el recuento en placa. 2. Marcar tres cajas de petri con fecha, muestra, dilucin y No. del grupo. 3. Marcar una caja como control del medio y otra como control del diluyente. 4. Pipetear a las cajas de petri 1 ml de cada una de las diluciones y 1 ml del diluyente. 5. Verter 15ml de agar plate count fundido a 45C en cada una de las cajas. 6. Mezclar de igual forma que para el recuento en placa. 7. Dejar solidificar. 8. Invertir las cajas e incubar por 24-48 horas a 35-37C. 9. Luego de cumplido el tiempo de incubacin, sacar las cajas y evaluar el control del medio y del diluyente; posteriormente proceder al conteo de las cajas con las diluciones si no se presentan problemas en los controles y si se observa mayor poblacin de microorganismos en las cajas menos diluidas. 5. BIBLIOGRAFA 1. ACOSTA de GUEVARA Emma y GONZALEZ ORTIZ Lucy. Fundamentos para el anlisis microbiolgico de los alimentos. Barranquilla, 1995. 2. ICMSF. Microorganismos de los alimentos. Tcnicas de anlisis Microbiolgico. Vol. 1, 2da edicin, Editorial Acribia. Zaragoza, Espaa, 1984. 3. LUNA CORTES, Gilma Yaneth, Manual operativo de anlisis microbiolgicos para alimentos. Fundacin Universidad de Bogot Jorge Tadeo Lozano, 1 ed. I.S.B.N. 958-9029-00-0, Bogot 1991. 4. MINISTERIO DE SALUD DE COLOMBIA. Decreto 3075. Norma sobre manipuladores, 1997. 32 39. UNIVERSIDAD DE CRDOBA FACULTAD DE CIENCIAS AGRCOLAS PROGRAMA DE INGENIERA DE ALIMENTOS MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS GUA N 6: NMP DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES EN ALIMENTOS DE ORIGEN ANIMALO VEGETAL 1. INTRODUCCIN El trmino habitual de coliformes comprende E.coli y otras especies pertenecientes a otros gneros de la familia Enterobacteriaceae, son microorganismos ubicuitarios; se les puede encontrar ampliamente distribuidos en la naturaleza, el suelo, agua y tambin son carga normal del tracto intestinal del hombre y animales de sangre caliente (Escobar, 1994, p 66). En los alimentos que han sido sometidos a un tratamiento de higienizacin eficaz que asegure su inocuidad al consumidor, est indicado por regla general, la determinacin de coliformes totales o grmenes del grupo coli-aergenes, incubados a 37C, que fermentan la lactosa con produccin de gas en el medio caldo lactosa bilis verde brillante (2%), su presencia no tiene necesariamente

relacin con una contaminacin de origen fecal, y consiguientemente, con la posible presencia en los alimentos de microorganismos patgenos de naturaleza entrica, sino que es solo una indicacin de deficiencias o fallos en el tratamiento industrial, recontaminaciones despus del procesos de los alimentos y en ltima instancia de su calidad higinica; mala calidad higinica en el proceso, falta de higiene de los manipuladores. Ello es debido a la diversa procedencia de los miembros que integra este grupo de microorganismos (Escobar, 1994, p 66). E.coli es un germen cuyo habitat natural es el tracto entrico del hombre y los animales. La mayora de las bacterias del grupo E.coli son comensales inocuos entricos, pero algunas cepas pueden causarle dao a la salud humana o animal. Su presencia en un alimento indica generalmente una contaminacin directa o indirecta de origen fecal y por consiguiente, existe el riesgo de que hayan podido llegar al alimento en cuestin microorganismos patgenos de procedencia entrica (Escobar, 1994, p 68). Resulta claro que E.coli es el indicador de contaminacin fecal universal y de hecho es el marcador sanitario ideal en el anlisis microbiolgico de los alimentos crudos o que no han sido sometidos a ningn tratamiento para asegurar su inocuidad. As por ejemplo, si este microorganismo se encuentra en alimentos tales como verduras, hortalizas, moluscos bivalvos, etc., puede inferirse que ha tenido lugar una contaminacin de origen fecal y que por lo tanto, han podido llegar a estos alimentos microorganismos patgenos de procedencia entrica (Escobar, 1994, p 68). 33 40. 2. OBJETIVOS 1. Determinar coliformes totales y fecales, a partir de productos de origen animal o vegetal. 3. MATERIALES Medios de cultivo Reactivos Materiales* Bilis verde brillante lactosa Coloracin de gram Homogenizador con durham A. EMB Reactivo de Kovacs Balanza Agua peptona 0.1% Cuchillos-cucharas Agua triptona Incubadora Pipetas 1 y 10mL Asa bacteriolgica Bolsas de polipropileno Gradilla Tubos de ensayo Cajas de petri * Algodn y alcohol al 70% 4. PROCEDIMIENTO 4.1. PROCEDIMIENTO DE COLIFORMES TOTALES 1. Desinfectar con alcohol al 70% toda el rea de trabajo y el recipiente que contiene la muestra a analizar. 2. Pesar 10 g o medir 10 ml de la muestra y realizar tres o ms diluciones de igual forma que para el recuento en placa. 3. Sembrar por triplicado 1 mL de cada una de las diluciones en tubos que contengan 10 ml de Bilis verde brillante lactosa con tubos durham preparados a concentracin simple. 4. Mezclar en incubar por 24-48 horas a 35-37C. 5. Leer a las 24 horas los tubos positivos, los negativos reincubarlos otras 24 horas. 6. Repicar mediante una asada todos los tubos positivos al agar EMB e incubar por 24 horas a 35-37C. 7. Anotar todos los tubos positivos que fueron confirmados por crecimiento caracterstico en agar EMB (colonias con brillo verde metlico). 8. Buscar en la tabla No.3 el resultado de NMP. 9. Expresar el resultado como NMP de Coliformes Totales = No. de bacterias / g ml. 4.2. PROCEDIMIENTO DE COLIFORMES FECALES O TEST DE MAC- KENZEI. 1. Subcultivar todos los tubos positivos de coliformes totales en caldo Bilis verde brillante lactosa y agua triptona o medio SIM. 2. Incubar por 24-48 horas a 44.5C en bao serolgico cuidando que el 34 41. nivel del agua cubra el contenido de los tubos. 3. Leer los tubos positivos de la siguiente forma: caldo Bilis verde brillante lactosa: se le por turbidez y gas. Medio SIM o agua de triptona: Se adicionan 5 gotas del reactivo de Kovacs y se lee por formacin de un anillo rojo en la superficie del medio. Para que la prueba sea considerada positiva deben estar ambos tubos positivos. 4. Anotar todos los tubos positivos y buscar en la tabla del NMP. 5. Expresar el resultado como NMP de Coliformes Fecales = No. de bacterias / g ml 5. BIBLIOGRAFA 1. ACOSTA de GUEVARA Emma y GONZALEZ ORTIZ Lucy. Fundamentos para el anlisis microbiolgico de los alimentos. Barranquilla, 1995. 2. ESCOBAR DUQUE, Mara Beatriz. Manual de tcnicas y procedimientos. Programa Latinoamericano de microbiologa e higiene de los alimentos. Universidad de Antioquia, Facultad de Salud Pblica Hctor Abad Gmez. Medelln, 1994. 3. ICMSF. Microorganismos de los alimentos. Tcnicas de anlisis Microbiolgico. Vol. 1, 2da edicin, Editorial Acribia. Zaragoza, Espaa, 1984. 4. MINISTERIO DE SALUD DE COLOMBIA. Decreto 3075. Norma sobre manipuladores, 1997. 35 42. UNIVERSIDAD DE CRDOBA FACULTAD DE CIENCIAS AGRCOLAS PROGRAMA DE INGENIERA DE ALIMENTOS MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS GUA N 7: RECUENTO DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS COAGULASA POSITIVA 1. INTRODUCCIN La intoxicacin estafiloccica se produce por el consumo de alimentos en los que se ha multiplicado S.aureus, produciendo toxinas muy termorresistentes, activas por va oral, que se encuentran ya preformadas en el alimento (Escobar, 1994, p 94). Los estafilococos enterotoxignicos pueden encontrarse, por lo tanto, ya en los alimentos en el momento de su obtencin, en especial en los de origen animal, o bien llegar posteriormente a ellos a partir principalmente de los manipuladores. Un alto porcentaje de personas sanas son portadoras

de S.aureus en fosas nasales y faringe, tambin se encuentran en la piel, cuero cabelludo y, sobre todo en procesos cutneos (acn, furnculos, heridas infectadas) (Escobar, 1994, p 94). 2. OBJETIVOS 1. Realizar recuento de Staphylococcus coagulasa positiva a partir de alimentos de origen animal o vegetal. 3. MATERIALES Medios de cultivo Reactivos Materiales* Agua peptona 0.1% Coloracin de gram Homogenizador Agar Baird Parker Plasma fresco Balanza Infusin cerebro corazn Cuchillos-cucharas Agar azul de O-Toluidina DNA Incubadora Pipetas 1 y 10mL Asa bacteriolgica Bolsas de polipropileno Gradilla Tubos de ensayo Cajas de petri * Algodn y alcohol al 70% 36 43. 4. PROCEDIMIENTO 4.1. RECUENTO DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS COAGULASA POSITIVA 1. Preparar las muestras y realizar las diferentes diluciones. 2. Marcar tres cajas de petri que contienen agar Baird-Parker con fecha, muestra, dilucin y No. del grupo. 3. Marcar dos cajas de petri que contienen agar Baird-Parker, una como control del medio y otra como control del diluyente. 4. Adicionar 0.1 ml de cada una de las diluciones y 0.1 ml del diluyente en las cajas marcadas respectivamente que contienen el medio Baird- Parker. 5. Extender con una varilla la muestra sobre toda la superficie del medio, hasta que la superficie quede seca. 6. Incubar por 24-48 horas a 35-37C. 7. Seleccionar las cajas que contengan entre 20 a 200 colonias y contarlas colonias caractersticas (negras, lustrosas, convexas, rodeadas de un halo claro dentro de anillos opacos). Realizar el conteo final multiplicando por el inverso de la dilucin y por 10. 4.1. CONFIRMACIN E IDENTIFICACIN DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS. 4.1.1. Prueba de coagulasa. 1. Realizar la coloracin de gram a varias colonias caractersticas (raz cuadrada del total y no menos de 3 colonias). 2. Observar al microscopio cocos grampositivos en racimos. 3. Sembrar en igual nmero de tubos que contienen infusin cerebro corazn las colonias caractersticas y grampositivas. 4. Incubar a 37 C por 24 horas. 5. Transferir 0.3 ml de cada cultivo a tubos limpios y marcados como prueba de coagulasa que contienen 0.3ml de plasma fresco humano (o plasma de conejo). 6. Incubar a 37 C por 4 horas, observar cada hora hasta la formacin del cogulo. Si despus de este tiempo da negativo, incubar hasta 24 horas. 7. Realizar el conteo final sobre la cantidad total de colonias contadas y el nmero de confirmadas positivas, ejemplo: Total de colonias contadas en la dilucin 10-2 = 30 3000 Colonias elegidas para realizar la prueba de la coagulasa = 7 Positivas en la prueba de la coagulasa= 5 Reporte de Staphylococcus aureus coagulasa positiva: 3000 x 5 X= = 2142 = 2 x 103 bacterias / g ml. 7 37 44. 4.1.2. Determinacin de termonuclesa. 1. Incubar las placas de Baird Parker positivas por 2 horas a 60C. 2. Adicionar sobre las placas de Baird Parker 15 ml de agar azul de O- Toluidina DNA fundido a 45C. 3. Incubar por 3 horas a 37 C. 4. Observar presencia de una zona rosada brillante sobre cada colonia de Staphylococcus aureus indica una prueba positiva. 5. BIBLIOGRAFA 1. ACOSTA de GUEVARA Emma y GONZALEZ ORTIZ Lucy. Fundamentos para el anlisis microbiolgico de los alimentos. Barranquilla, 1995. 2. ESCOBAR DUQUE, Mara Beatriz. Manual de tcnicas y procedimientos. Programa Latinoamericano de microbiologa e higiene de los alimentos. Universidad de Antioquia, Facultad de Salud Pblica Hctor Abad Gmez. Medelln, 1994. 3. ICMSF. Microorganismos de los alimentos. Tcnicas de anlisis Microbiolgico. Vol. 1, 2da edicin, Editorial Acribia. Zaragoza, Espaa, 1984. 4. MINISTERIO DE SALUD DE COLOMBIA. Decreto 3075. Norma sobre manipuladores, 1997. 38 45. UNIVERSIDAD DE CRDOBA FACULTAD DE CIENCIAS AGRCOLAS PROGRAMA DE INGENIERA DE ALIMENTOS MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS GUA N 8: RECUENTO DE MOHOS Y LEVADURAS 1. INTRODUCCIN Los mohos y las levaduras estn ampliamente distribuidos en la naturaleza, por lo tanto se pueden encontrar como carga normal de los alimentos con bajo pH y Aw, alto contenido de slidos como sal o azcar, temperaturas bajas de almacenamiento o presencia de antibiticos, pues son capaces de desarrollarse en las condiciones mas adversas (Escobar, 1994, p 198). Estos microorganismos pueden utilizar sustratos complejos como: pectinas, hidratos de carbono, cidos orgnicos, protenas, lpidos, etc. Frecuentemente los mohos y levaduras son responsables del mal olor, sabor, decoloracin o pigmentacin de la superficie de los alimentos, son los grandes alteradores de frutas, hortalizas, leguminosas, tubrculos y granos (Escobar, 1994, p 198). 2. OBJETIVOS 1. Realizar recuento de mohos y levaduras en productos de origen animal y vegetal 3. MATERIALES Medios de cultivo Reactivos Materiales* Agua peptona 0.1% Homogenizador Agar Ogy Balanza Cuchillos-cucharas Incubadora Pipetas 1 y 10mL Asa bacteriolgica Bolsas de polipropileno Gradilla Tubos de ensayo Cajas de petri * Algodn y alcohol al 70% 39

46. 4. PROCEDIMIENTO 4.1. DETERMINACIN DE MOHOS Y LEVADURAS 1. Preparar las diluciones de igual forma que para el recuento en placa. 2. Marcar tres cajas de petri con fecha, muestra, dilucin y No. del grupo. 3. Marcar una caja como control del medio y otra como control del diluyente. 4. Pipetear a las cajas de petri 1 ml de cada una de las diluciones y 1 ml del diluyente. 5. Verter 15ml de agar Extracto de malta-oxitetraciclina (OGY) fundido a 45C en cada una de las cajas. 6. Mezclar de igual forma que para el recuento en placa. 7. Dejar solidificar. 8. Invertir las cajas e incubar a 22C por 5 a 7 das (envolver las cajas con papel Kraft). 9. Sacar las cajas, evaluar el control del medio y del diluyente. 10. Seleccionar las cajas entre 20 y 100 colonias y multiplicar por el inverso de la dilucin. 5. INVESTIGACIN 1 Fundamento del agar OGY 2 Importancia de la determinacin de mohos y levaduras y en qu tipo de alimentos se determinan. 6. BIBLIOGRAFA 1. ACOSTA de GUEVARA Emma y GONZALEZ ORTIZ Lucy. Fundamentos para el anlisis microbiolgico de los alimentos. Barranquilla, 1995. 2. ESCOBAR DUQUE, Mara Beatriz. Manual de tcnicas y procedimientos. Programa Latinoamericano de microbiologa e higiene de los alimentos. Universidad de Antioquia, Facultad de Salud Pblica Hctor Abad Gmez. Medelln, 1994. 3. ICMSF. Microorganismos de los alimentos. Tcnicas de anlisis Microbiolgico. Vol. 1, 2da edicin, Editorial Acribia. Zaragoza, Espaa, 1984. 4. MINISTERIO DE SALUD DE COLOMBIA. Decreto 3075. Norma sobre manipuladores, 1997. 40 47. UNIVERSIDAD DE CRDOBA FACULTAD DE CIENCIAS AGRCOLAS PROGRAMA DE INGENIERA DE ALIMENTOS MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS GUA N 9: INVESTIGACIN DE SALMONELLA EN ALIMENTOS 1. INTRODUCCIN Todas las Salmonellas deberan ser consideradas como potencialmente patgenas para el ser humano y los animales. La nica forma de transmisin es la oral, por lo que es de suma importancia el anlisis de los alimentos para detectar su presencia en ellos (Escobar, 1994, p 79). Los alimentos ms contaminados son los de origen animal, incluye huevos crudos, ovoproductos, leche cruda y productos lcteos, carnes y derivados, aves. La infeccin se disemina en los animales por los alimentos concentrados para animales como por ejemplo harinas de pescado y de sangre (Escobar, 1994, p 79). El hombre, los animales domsticos y salvajes, incluidos las aves de corral, porcinos, bovinos, roedores y animales caseros como tortugas, polluelos, perros y gatos son reservorios importantes de Salmonellas (Escobar, 1994, p 79). 2. OBJETIVOS 1. Investigar la presencia de Salmonella en alimentos de origen animal y en derivados vegetales (harinas de cereales) 3. MATERIALES Medios de cultivo Reactivos Materiales* Agua peptona tamponada Coloracin de gram Homogenizador Agar Hecktoen Reactivo de Kovacs Balanza Agar BPLS Griess Cuchillos-cucharas Caldo tetrationato de sodio Alfa naftol Incubadora Caldo selenite- cistina KOH 40% Pipetas 1 y 10mL Caldo nitrato Rojo de metilo Asa bacteriolgica Caldo MR-VP Peroxido hidrogeno 3% Bolsas de polipropileno Agar citrato Gradilla Agar urea Tubos de ensayo Agar kligler Cajas de petri Agar Lia Agar SIM Agar XLD * Algodn y alcohol al 70% 41 48. 4. PROCEDIMIENTO 4.1. DETERMINACIN DE SALMONELLAS 4.1.1. Enriquecimiento no selectivo a. Pesar 25g del producto y disolverlo en 225 ml de caldo lactosado o agua peptonada tamponada. b. Mezclar e incubar a 37C por 1824 horas. 4.1.2. Enriquecimiento selectivo 1. Pipetear 1ml del anterior cultivo en 10 ml de Caldo Selenite-Cistina e incubar en bao serolgico a 43C por 24 horas. 2. Pipetar otro mililitro y adicionarlo en un tubo que contenga 10 ml de caldo tetrationato verde brillante e incubar en bao sexolgico a 43C por 24 horas. 4.1.3. Siembra en agar selectivo 1. Repicar en dos de los siguientes medios selectivo: agar Hecktoen / XLD / BPLS,a partir de los caldos de enriquecimiento selectivo 2. Incubar de 35 a 37C por 24-48 horas. 4.1.4. Identificacin bioqumica 1. Observar las colonias tpicas: en agar Hecktoen vedes con o sin centro negro oscuro, en BPLS rojas o rosadas con halos rosados. 2. Sembrar las colonias tpicas de Salmonellas de cada uno de los agares en medio SIM, Kligler o TSI, LIA, Citrato, Caldo MR-VP, Urea, Nitrato y realizar la prueba de oxidasa. 3. Incubar las pruebas y buscar en las tablas de identificacin bioqumica. 5. INVESTIGACIN 1 Importancia de la determinacin de Salmonellas en los alimentos. 6. BIBLIOGRAFA 1. ACOSTA de GUEVARA Emma y GONZALEZ ORTIZ Lucy. Fundamentos para el anlisis microbiolgico de los alimentos. Barranquilla, 1995. 2. ESCOBAR DUQUE, Mara Beatriz. Manual de tcnicas y procedimientos. Programa Latinoamericano de microbiologa e higiene de los alimentos. Universidad de Antioquia, Facultad de Salud Pblica Hctor Abad Gmez. 42

49. Medelln, 1994. 3. ICMSF. Microorganismos de los alimentos. Tcnicas de anlisis Microbiolgico. Vol. 1, 2da edicin, Editorial Acribia. Zaragoza, Espaa, 1984. 4. MINISTERIO DE SALUD DE COLOMBIA. Decreto 3075. Norma sobre manipuladores, 1997. 43 50. UNIVERSIDAD DE CRDOBA FACULTAD DE CIENCIAS AGRCOLAS PROGRAMA DE INGENIERA DE ALIMENTOS MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS GUA N 10: RECUENTO DE ESPORAS CLOSTRIDIUM SULFITO RESDUCTOR 1. INTRODUCCIN El gnero Clostridium se define como bacilos gram positivos, al menos en las etapas tempranas del crecimiento, usualmente mviles por flagelos peritricos, con excepcin de Clostridium perfringes, presentan esporas termoresistentes ovoides subterminales que deforman el cuerpo del bacilo (Acosta y Gonzlez, 1995, p 298). Son anaerobios estrictos y algunas cepas presentan aerotolerancia. Su temperatura ptima de crecimiento es 37C; crecen a pH entre 4,7 y 9,0 pero su ptimo es de 7,0. Se desarrollan a niveles de Aw entre 0,94 y 0,97 dependiendo de la cepa (Acosta y Gonzlez, 1995, p 298). Clostridium perfringes es un bacilo corto, gram positivo inmvil con esporas subterminal y oval, anaerobio y aerotolerante, fermenta rpidamente la glucosa y lactosa; tiene pH ptimo de 7,0, temperatura de 46C, nivel de Aw de 0,93 a 0,95 y resiste concentraciones de 3% de NaCl y 100 mg de nitrito de sodio (Acosta y Gonzlez, 1995, p 299). Es un microorganismo proteoltico, sacaroltico productor de exotoxinas antignicas de naturaleza proteica (Acosta y Gonzlez, 1995, p 299). 2. OBJETIVOS 1. Determinar e identificar la presencia de esporas de Clostridium sulfito reductor a partir de productos crnicos. 3. MATERIALES Medios de cultivo Reactivos Materiales* Agua peptona 0.1% Coloracin de gram Homogenizador Agua triptona Reactivo de Kovacs Balanza Caldo nitrato Griess Cuchillos-cucharas Caldo MR-VP Perxido hidrgeno 3% Incubadora Agar citrato Oxidasa Pipetas 1 y 10mL Agar urea Asa bacteriolgica Agar kligler Bolsas de polipropileno Agar SIM Gradilla Agar SPS Tubos de ensayo Caldo tioglicolato Cajas de petri Agar gelatina * Algodn y alcohol al 70% 44 51. 4. PROCEDIMIENTO 4.1. RECUENTO DE ESPORAS CLOSTRIDIUM SULFITO REDUCTOR 4.1.1 Recuento en placa 1. Preparar las diluciones del homogenizado de igual que para el recuento en placa, tener cuidado de que al homogenizar no se aumente demasiado la temperatura. 2. Marcar tres (3) cajas de petri con fecha, muestra, dilucin y No del grupo. 3. Marcar dos (2) cajas, una como control del diluyente y otra como control del medio. 4. Pipetear en las cajas de petri 1ml de cada una de las diluciones y 1ml del diluyente en la caja marcada como control del diluyente. 5. Verter 15ml de agar SPS fundido a 45C en cada una de las cajas. 6. Mezclar de igual forma que para el recuento en placa. 7. Dejar solidificar. 8. Colocar las cajas con las tapas hacia arriba en la jara de anaerobiosis. 9. incubar a 37C por 48 horas. 10. Sacar las cajas y evaluar el control del medio y del diluyente. 11. Seleccionar las cajas entre 30 y 300 colonias y contar todas las colonias negras, calcular el nmero de esporas Clostridium sulfito reductor por gramo o mililitro de alimento multiplicando por el inverso de la dilucin. 4.1.2. Recuento en tubo 1. Preparar las diluciones del homogenizado de igual forma que para el recuento en placa. 2. Marcar tres (3) tubos con fecha, muestra, dilucin y No. del grupo. 3. Pipetear en los tubos 1ml de cada una de las diluciones. 4. Calentar en el bao serolgico a 80C durante 10 minutos cada una de las diluciones. 5. Enfriar en un beaker con agua y hielo. 6. Verter 12 ml de agar SPS fundido a 45C en cada uno de los tubos. 7. Dejar solidificar. 8. Adicionar una segunda capa (de aproximadamente 3ml) de agar SPS fundido a 45C. 9. Dejar solidificar. 10. Incubar a 37C por 72 horas. 11. Seleccionar los tubos entre 30 y 300 colonias y contar todas las colonias negras, calcular el nmero de esporas Clostridium sulfito reductor por gramo o mililitro de alimento multiplicando por el inverso de la dilucin. 45 52. 4.1.3. Confirmacin de las colonias de Clostridium perfringes 1. Elegir como mnimo tres (3) colonias caractersticas (negras) y sembrar cada una en tubos con caldo tioglicolato. 2. Incubar en bao setolgico a 46C por 3-4 horas. 3. Realizar un extendido de cada uno de los cultivos y colorearlos con gram. 4. Observar al microscopio, bacilos grandes con extremos redondeados gram positivos con esporas subterminales. 5. Realizar la prueba de la catalasa a partir del cultivo de tioglicolato: tomar 3ml del cultivo y adicionarle 0.5 ml de perxido de hidrgeno al 3%, mezclar y observar desprendimientos de burbujas de gas, lo que indica una reaccin positiva. 6. Inocular a partir del cultivo de tioglicolato en SIM, caldo nitrato, agar gelatina y agar Kligler. 7. Incubar a 37C por 18-24 horas. 8. Considerar positivas las pruebas para Clostridium perfringes cuando se presentan los siguientes resultados: Catalasa Negativa Movilidad Negativa Nitratos Positiva Licuefaccin de la gelatinaPositiva Lactosa Positiva 9. Realizar el conteo final sobre la cantidad total de colonias

contadas y el nmero de confirmadas positivas. Ejemplo: Total de colonias contadas en dilucin 10-2 = 3 300 Elegidas para realizar las pruebas = 6 Colonias que resultaron positivas = 4 300 x 4 Reporte de Clostrium perfringes = = 200 bacterias / g ml 6 5. INVESTIGACIN 1. Fundamento del agar SPS. 2. Importancia de la determinacin de Clostrium perfringes en alimentos. 6. BIBLIOGRAFA 1. ACOSTA de GUEVARA Emma y GONZALEZ ORTIZ Lucy. Fundamentos para el anlisis microbiolgico de los alimentos. Barranquilla, 1995. 2. ICMSF. Microorganismos de los alimentos. Tcnicas de anlisis Microbiolgico. Vol. 1, 2da edicin, Editorial Acribia. Zaragoza, Espaa, 1984. 3. MINISTERIO DE SALUD. Instituto Nacional de Salud. Anlisis Microbiolgico de Alimentos. Serie de Publicaciones cientficas No. 10 Santa fe de Bogot, 1998. 46 53. UNIVERSIDAD DE CRDOBA FACULTAD DE CIENCIAS AGRCOLAS PROGRAMA DE INGENIERA DE ALIMENTOS MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS GUA N 11: RECUENTO DE BACILLUS CEREUS 1. INTRODUCCIN Bacillus cereus, es un bastn aerobio esporulado, ubicuitario y habitualmente se le encuentra en alimentos crudos, secos y elaborados. Los alimentos no deben permanecer a temperatura ambiente una vez cocidos, ya que cerca del 50% de los alimentos e ingredientes alimentarios estn contaminados hasta cierto punto (<10/g) por este organismo. La ingestin de alimentos que han sido conservados a temperatura ambiente despus de su coccin, permite que las esporas, las cuales sobreviven la ebullicin, germinen y se multipliquen a niveles altos y verter las toxinas al alimento, para que finalmente provoquen la intoxicacin. (Escobar, 1994, p 147). 2. OBJETIVOS 1. Realizar Recuento de Bacillus cereus a partir de ovoproductos. 3. MATERIALES Medios de cultivo Reactivos Materiales* Agua peptona 0.1% Coloracin de gram Homogenizador Agar Cereus segn Mossel Reactivo de Kovacs Balanza Agar Gelatina Solucin lugol Cuchillos-cucharas Agar Almidn Griess Incubadora Agar Citrato Simmons Alfa naftol 5% Pipetas 1 y 10mL Agar Urea KOH 40% Asa bacteriolgica Agar SIM Rojo de metilo Bolsas de polipropileno Caldo nitrato Peroxido hidrogeno 3% Gradilla Caldo MR-VP Oxidasa Tubos de ensayo Caldo MR-Glucosa (5%) Caldo MR-Xilosa (5%) Caldo MRArabinosa (5%) Caldo cerebro corazn * Algodn y alcohol al 70% 4. PROCEDIMIENTO 4.1. RECUENTO DE BACILLUS CEREUS 47 54. 1. Preparar las diluciones de igual forma que para el recuento en placa. 2. Marcar tres cajas de petri que contienen agar Cereus segn Mossel con fecha, muestra, dilucin y No. del grupo. 3. Marcar dos cajas que contienen agar Cereus segn Mossel, una como control del medio y la otra como control del diluyente. 4. Adicionar 0.1 ml de cada una de las diluciones y 0.1 ml del diluyente en las cajas marcadas respectivamente que contienen el medio agar Cereus segn Mossel. 5. Extender con una varilla la muestra sobre toda la superficie del medio, hasta que la superficie quede seca. 6. Incubar por 24-48 horas a 35-37C. 7. Seleccionar las cajas que contengan entre 20 a 200 colonias y contarlas colonias caractersticas (colonias rosadas con bordes regulares e irregulares, con un halo denso a su alrededor debido a la lecitinasa). Realizar el conteo final multiplicando por el inverso de la dilucin y por 10. 8. Tomar al menos tres UFC caractersticas, realizarles la prueba de la catalasa y la coloracin de gram; si son catalasa positiva y a la coloracin de gram se observan bastones gram positivos con extremos mas o menos cuadrados encadenas cortas o largas y entrelazadas con espora subterminal, central o elipsoidal que no deforman el cuerpo bacteriano realizar la identificacin bioqumica. 4.2. IDENTIFICACIN BIOQUMICA DE BACILLUS CEREUS 1. Subcultivar tres colonias caractersticas en caldo cerebro corazn. 2. Realizar la siguientes pruebas bioqumicas: Hidrlisis de la gelatina: Siembre dos lneas paralelas en agar gelatina e incubar a 37 por 24 horas Hidrlisis de almidn: Siembra dos lneas paralelas en agar almidn e incubar a 37C por 24 horas. Agar Urea: Inocular el fondo por picadura y el bisel por estra e incubar 37C por 24 horas. Agar Citrato Simmons: Inocular el fondo por picadura y el bisel en lnea e incubar 37C por 24 horas. Movilidad: Inocular el fondo (Agar SIM) por picadura e incubar 37C por 24 horas. Reduccin de nitratos: Caldo Nitrato Produccin acetona: Caldo MR-VP Fermentacin de carbohidratos: Glusoca, Xilosa, Arabinosa 3. Comparar los resultados con las caractersticas bioqumicas de Bacillus cereus: Hidrlisis de la gelatina: Zonas claras alrededor de las colonias luego de cubrir las colonias con reactivo sublimado de Hg. Hidrlisis de almidn: Zonas claras alrededor de las colonias luego de cubrir las colonias con lugol. Agar Urea: Tubos con reaccin cida (amarillos), urea-negativos. Agar Citrato Simmons: medio de cultivo verde citrato negativo.

55. 48 Movil: Crecimiento desplazado a travs de la lnea de siembra. Reduccin de nitratos: Aparicin de un color rojo despus de agregar el reactivo Griess Produccin acetona: aparicin de un color rojo luego de adicionar el alfa naftol y el hidrxido de potasio. Fermentacin de carbohidratos (Glusoca, Xilosa, Arabinosa) por medio de viraje del medio a amarillo. 5. INVESTIGACIN 1. Fundamento del agar Cereus segn Mossel. 6. BIBLIOGRAFA 1. ACOSTA de GUEVARA Emma y GONZALEZ ORTIZ Lucy. Fundamentos para el anlisis microbiolgico de los alimentos. Barranquilla, 1995. 2. ESCOBAR DUQUE, Mara Beatriz. Manual de tcnicas y procedimientos. Programa Latinoamericano de microbiologa e higiene de los alimentos. Universidad de Antioquia, Facultad de Salud Pblica Hctor Abad Gmez. Medelln, 1994. 3. ICMSF. Microorganismos de los alimentos. Tcnicas de anlisis Microbiolgico. Vol. 1, 2da edicin, Editorial Acribia. Zaragoza, Espaa, 1984. 4. MINISTERIO DE SALUD. Instituto Nacional de Salud. Anlisis Microbiolgico de Alimentos. Serie de Publicaciones cientficas No. 10 Santa fe de Bogot, 1998. 56. 49 UNIVERSIDAD DE CRDOBA FACULTAD DE CIENCIAS AGRCOLAS PROGRAMA DE INGENIERA DE ALIMENTOS MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS GUA N 12: INVESTIGACIN DE LISTERIA MONOCYTOGENES 1. INTRODUCCIN Listeria monocytogenes es un pequeo bastn de 0,5 a 2 , que se presenta en empalizada, no capsulado, no espurado, mvil, se multiplica a temperaturas entre 3 y 45C, crece a pH entre 5,6 y 9,6, se destruye por calor a 70C durante algunos segundos, catalasa positivo, oxidasa negativo y anaerobio facultativo (Escobar, 1994, p 224). Es un germen ubicuitario, se encuentra en el suelo, aire, vegetales, aguas residuales, afluentes, lodos, etc. El reservorio lo constituyen los mamferos domsticos y silvestres, aves y el hombre infectados (Escobar, 1994, p 224). Se han notificado casos de listeriosis asociados a la ingestin de hortalizas contaminadas y productos lcteos en especial quesos supuestamente contaminados y leche cruda. Tambin se ha aislado de carne y productos crnicos. 2. OBJETIVOS 1. Realizar investigacin de Listeria monocytogenes a partir de productos lcteos o crnicos. 3. MATERIALES Medios de cultivo Reactivos Materiales* Agar Mac Bride modificado Coloracin de gram Homogenizador Caldo de enriquecimiento EB Griess Balanza Agar soya tripticasa (6% Peroxido hidrogeno Cuchilloscucharas estrato levadura) 3% caldo soya tripticasa (6% Incubadora estrato levadura) Agar sangre Alfa naftol 5% Pipetas 1 y 10mL Agar TSI KOH 40% Asa bacteriolgica Agar SIM Rojo de metilo Bolsas de polipropileno Caldo MR-VP Gradilla Caldo nitrato Oxidasa Tubos de ensayo Agar Urea Caldo prpura de bromocresol + 0.5% glusosa Caldo prpura de bromocresol + 0.5% esculina 57. Caldo prpura de bromocresol + 0.5% maltosa Caldo prpura de bromocresol + 0.5% manitol Caldo prpura de bromocresol + 0.5% ramnosa Caldo prpura de bromocresol + 0.5% Xilosa * Algodn y alcohol al 70% 4. PROCEDIMIENTO 4.1. ENRIQUECIMIENTO SELECTIVO 1. Pesar o medir aspticamente 25 g o ml de la muestra. 2. Agregar 225 ml de caldo de enriquecimiento EB. 3. Homogenizar durante 1 minuto en estomacher. 4. Incubar a 30C durante24 horas y reincubar hasta 7 das. 4.2. SIEMBRA EN MEDIOS SELECTIVOS 1. A partir del caldo de enriquecimiento EB aislar sobre la superficie de una placa de agar Mac Bride modificado. 2. Incubar a 37C durante 24 a 48 horas. 3. Seleccionar al menos 3 UFC sospechosas (las que observadas en microscopio con transiluminacin oblicua se observan azuladas) y sembrar cada una en una placa de agar soya tripticasa (6% de extracto de levadura). 4. Incubar a 37C durante 24 a 48 horas. 5. Examinar bajo la luz oblicua, hacer Gram y catalasa a las U.F.C. tpicas. 6. Comparar con los siguientes resultados: pequeos bastones gram positivos en empalizada y catalasa positivo. 7. A partir de las colonias tpicas sembrar en caldo soya tripticasa (6% de extracto de levadura). 8. Incubar a 37C durante 24 horas para realizar pruebas bioqumicas y de fermentacin. 4.3. PRUEBAS BIOQUMICAS 1. Sembrar en Agar Urea a partir del caldo soya tripticasa (6% extracto de levadura), incubar a 37C durante 5 das y observar el viraje hacia un color amarillo que indica que el microorganismo no hidroliza la urea. 2. Sembrar en caldo nitrato, incubar a 37C durante 5 das y observar resultado negativo (no hay viraje hacia el color rojo). 3. Sembrar en agar SIM, incubar a 37C durante 48 horas y observar la 58. 51 movilidad del microorganismo en forma de paraguas. 4. Inocular dos tubos de caldo MR-VP, icubar a 37C durante 48 horas para la reaccin del Voges proskauer y 5 das para el rojo de metilo (Listeria monocytogenes es MR positiva y VP positiva). 5. Sembrar en agar TSI, incubar a 37C durante 5 das y observar la fermentacin de la glucosa y lactosa pero no la produccin de gas y sulfuro. 6. Sembrar en tubos de caldo prpura de bromocresol conteniendo 0.5% de los siguientes

carbohidratos: glucosa, esculina, maltosa, manitol, ramnosa y xilosa; sembrar a 37C durante 7 das y observar la fermentacin de la glucosa, esculina, maltosa y ramnosa por un viraje al amarillo del medio de cultivo. 7. Sembrar en agar sangre una cepa de S. aureus de manera vertical y sembrar en forma horizontal Listeria monocytogenes; incubar a 37C durante 24-48 horas y observar la hemlisis en la zona adyacente al S.aureus. 5. INVESTIGACIN 1. Fundamento del agar Mac Bride modificado. 6. BIBLIOGRAFA 1. ACOSTA de GUEVARA Emma y GONZALEZ ORTIZ Lucy. Fundamentos para el anlisis microbiolgico de los alimentos. Barranquilla, 1995. 2. ESCOBAR DUQUE, Mara Beatriz. Manual de tcnicas y procedimientos. Programa Latinoamericano de microbiologa e higiene de los alimentos. Universidad de Antioquia, Facultad de Salud Pblica Hctor Abad Gmez. Medelln, 1994. 3. ICMSF. Microorganismos de los alimentos. Tcnicas de anlisis Microbiolgico. Vol. 1, 2da edicin, Editorial Acribia. Zaragoza, Espaa, 1984. 4. MINISTERIO DE SALUD. Instituto Nacional de Salud. Anlisis Microbiolgico de Alimentos. Serie de Publicaciones cientficas No. 10 Santa fe de Bogot, 1998. 59. 52 UNIVERSIDAD DE CRDOBA FACULTAD DE CIENCIAS AGRCOLAS PROGRAMA DE INGENIERA DE ALIMENTOS MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS GUA N 13: INVESTIGACIN DE VIBRIO PARAHAEMOLYTICO 1. INTRODUCCIN V. parahaemolytico es un germen halfilo, gram negativo anaerobio facultativo de crecimiento rpido a temperaturas entre 15 y 43 C, a pH entre 5 y 9 y a concentraciones de sal entre 0.5 y 8% (Escobar, 1994, p 240). Es un enteropatgeno de origen marino. Su relacin con enfermedades asociadas al consumo de alimentos fue descubierta en el Japn por Fujino en 1950 despus del consumo de pescados y mariscos crudos (Escobar, 1994, p 240). 2. OBJETIVOS 1. Realizar investigacin de Vibrio Parahaemolytico a partir de productos de origenmarino. 3. MATERIALES Medios de cultivo Reactivos Materiales* Caldo glucosa sal teepol Coloracin de gram Homogenizador broth (GSTB) Agar TCBS Griess Balanza Agar sangre Perxido hidrogeno Cuchillos-cucharas 3% Agar soya tripticasa (6% Reactivo Kovacs Incubadora NaCl) Agar TSI con 3% NaCl Alfa naftol 5% Pipetas 1 y 10mL Caldo nitrato con 3% NaCl KOH 40% Asa bacteriolgica Agar SIM con 3% NaCl Rojo de metilo 0.5% Bolsas de polipropileno Caldo MR-VP con 3% NaCl Gradilla Agar Hugo Leifson con 3% Oxidasa Tubos de ensayo NaCl Agar LIA con 3% NaCl Aceite mineral Caldo Indol con 3% NaCl Caldo soya tripticasa (0% NaCl) Caldo soya tripticasa (3% NaCl) Caldo soya tripticasa (6% NaCl) Caldo soya tripticasa (8% NaCl) Caldo soya tripticasa (10% NaCl) * Algodn y alcohol al 70% 60. 53 4. PROCEDIMIENTO 4.1. ENRIQUECIMIENTO SELECTIVO 1. Pesar o medir aspticamente 25 g o ml de la muestra. 2. Agregar 225 ml de caldo GSTB (glucosa sal teepol broth). 3. Homogenizar durante 1 minuto en estomacher. 4. Incubar a 30C durante18 a 24 horas. 4.2. SIEMBRA EN MEDIOS SELECTIVOS 1. A partir del caldo GSTB (glucosa sal teepol broth) aislar sobre la superficie de una placa de agar TCBS. 2. Incubar a 37C durante 18 a 24 horas. 3. Seleccionar al menos 3 UFC sospechosas (colonias pequeas con centro verde azulado). 4.3. PRUEBAS BIOQUMICAS 1. Sembrar en el bisel de un tubo con agar soya tripticasa, incubar a 37C durante 24 horas y apartir de este cultivo realizar la prueba de oxidasa (V. parahaemolytico es oxidasa positivo). 2. Sembrar en agar TSI por picadura en el fondo y por estra en el bisel, incubar a 37C durante 24 horas y observar la fermentacin de la glucosa (fondo cido), pero no de la lactosa (bisel alcalino), ni la produccin de gas y de H2S. 3. Sembrar en agar LIA por picadura en el fondo y por estra en el bisel, incubar a 37C durante 24 horas y observar la descarboxilacin de la lisina (bisel y fondo alcalino). 4. Sembrar en agar nitrato, incubar a 37C durante 24 horas y observar la reduccin de nitritos a nitratos. 5. Sembrar en agar SIM, incubar a 37C durante 24 horas y observar la movilidad positiva. 6. Sembrar en indol, incubar a 37C durante 24 horas y observar la produccin de indol. 7. Inocular dos tubos de caldo MR-VP, incubar a 37C durante 48 horas para la reaccin del Voges proskauer y 5 das para el rojo de metilo (Vibrio parahaemolytico es MR positiva y VP negativa). 8. Sembrar en dos tubos de agar Hugo Leifson por picadura profunda, agregar en uno de los tubos 1ml de aceite mineral estril, incubar a 37C durante 48 horas y observar el metabolismo fermentativo 9. (cambio de color en ambos tubos de verde a amarillo) o el metabolismo oxidativo; Vibrio parahaemolytico tiene un metabolismo fermentativo con respecto a la glucosa. 10. Inocular un tubo de gelatina nutritiva a partir del TSI, incubar a 37C durante 1 a 7 das; refrigerar el medio durante 10 minutos, si el medio continua lquido, la gelatina es licuada, si ella se solidifica no lo es (Vibrio parahaemolytico licua rpidamente la gelatina).

61. 54 11. Inocular un tubo con caldo soya tripticasa por suspensin, incubar en bao termostatado a 42C durante 24 horas y observar el crecimiento por turbidez del medio (Vibrio parahaemolytico crece a 42C). 12. Realizar el test de halofilismo sembrando en tubos con caldo soya tripticasa con 0, 6, 8 y 10% de NaCl, incubar a 37C durante 24 horas, observar el crecimiento positivo por turbidez del medio en las concentraciones de 6 y 8% de sal. 13. Sembrar en gar sangre a partir de un cultivo de soya tripticasa con 3% de NaCl, incubar a 37C durante 24 horas y observar la - hemlisis que se presenta como una zona transparente 5. INVESTIGACIN 1. Fundamento del agar TCBS. 6. BIBLIOGRAFA 1. ACOSTA de GUEVARA Emma y GONZALEZ ORTIZ Lucy. Fundamentos para el anlisis microbiolgico de los alimentos. Barranquilla, 1995. 2. ESCOBAR DUQUE, Mara Beatriz. Manual de tcnicas y procedimientos. Programa Latinoamericano de microbiologa e higiene de los alimentos. Universidad de Antioquia, Facultad de Salud Pblica Hctor Abad Gmez. Medelln, 1994. 3. ICMSF. Microorganismos de los alimentos. Tcnicas de anlisis Microbiolgico. Vol. 1, 2da edicin, Editorial Acribia. Zaragoza, Espaa, 1984. 4. MINISTERIO DE SALUD. Instituto Nacional de Salud. Anlisis Microbiolgico de Alimentos. Serie de Publicaciones cientficas No. 10 Santa fe de Bogot, 1998. 62. 55 UNIVERSIDAD DE CRDOBA FACULTAD DE CIENCIAS AGRCOLAS PROGRAMA DE INGENIERA DE ALIMENTOS MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS GUA N 14: CONTROL MICROBIOLGICO DE CONSERVAS NO ALTERADAS. 1. INTRODUCCIN El enlatado (conserva) se define como la conservacin de alimentos en recipientes cerrados y generalmente supone someterlos a un tratamiento trmico como principal agente que evita su alteracin. El proceso trmico como mtodo de conservacin puede ser aplicado a cualquier producto alimenticio siempre que se envase en un recipiente adecuado. La principal exigencia es que el envase, una vez cerrado hermticamente no se deteriore durante la manipulacin o el almacenamiento. La alteracin de los alimentos que han sido sometidos a tratamiento trmico, puede ser debida a causas qumicas o biolgicas o a causas de ambos tipos. La alteracin qumica ms importante de los alimentos enlatados es el abombamiento por hidrgeno, consecuencia de la presin del hidrgeno liberado al actuar el cido de un determinado alimento sobre el hierro de la lata. La acidez de los alimentos enlatados es importante para determinar el tratamiento trmico necesario para conseguir su esterilizacin y el tipo de alteracin a esperar en caso de que el tratamiento trmico se insuficiente o de que se produzcan fugas. 2. OBJETIVOS 1. Realizar el control microbiolgico a conservas no alteradas. 3. MATERIALES Medios de cultivo Reactivos Materiales* Infusin cerebro corazn Coloracin de gram Abrelatas Parafina esteril Balanza Almidn Cuchillos-cucharas Agua tibia Incubadora Asa bacteriolgica Cajas de petri Tubos estriles Toallas desechables .. Algodn y alcohol al 70% 63. 56 4. PROCEDIMIENTO 4.1. PRE-INCUBACIN 1. Retirar las etiquetas de las latas (en caso de tenerlas). 2. Lavar bien las latas con agua tibia jabonosa y escobillones en caso de ser necesario. 3. Enjuagar con agua tibia. 4. Secar las latas con toallas de papel desechables. 5. Envolverlas en papel filtro o en toallas desechables con el fin de descubrir microfugas durante el perodo de preincubacin. 6. Marcar las latas con el No de identificacin, fecha y temperatura de preincubacin. 7. Incubar una lata a 35C y la otra a 55C durante 10 das. 8. Agitar en invertir la posicin de las latas diariamente. 9. Observar todos los das con el fin de descubrir microfugas y abombamiento, si una lata presentase microfugas o abombamientos, se debe examinar inmediatamente. 4.2. PREPARACIN DE LAS LATAS PARA SU ANALISIS 1. Desinfectar con alcohol al 70% toda el rea de trabajo y las latas a analizar. 2. Flamear rpidamente la parte a ser abierta, en el caso de estar las latas abombadas tomar precauciones para evitar un peligro. 3. Abrir las latas con ayuda de un abrelatas, preferiblemente en un cubculo o campana asptica; no se debe abrir la lata por la tapa del fondo, donde lleva impresa su fecha de vencimiento. 4. Cubrir inmediatamente con la base de una placa de petri la superficie expuesta al aire. 4.3. ANALISIS DEL CONTENIDO DE LA LATA 1. Pesar 2 gramos de cada lata, tomando de todas las partes del contenido a fin de que la muestra sea representativa. 2. Disponer de 6 tubos con caldo Cerebro Corazn adicionado de almidn al 0.1% para las latas incubadas a 35C y 6 tubos para la lata incubada a 55C. 3. Adicionar los 2 gramos de cada lata en cada uno de los tubos con caldo cerebro corazn adicionado de 0.1% de almidn. 4. Verter una capa de 1cm de parafina estril en seis tubos (tres de las latas a 35C y tres de las latas a 55C), con el fin de crear condiciones de anaerobiosis. 5. Incubar los seis tubos de la lata a 35C y los seis tubos de la lata a 55C (tres en aerobiosis y tres en anaerobiosis) durante 72 horas. 6. Observar si hay desarrollo microbiano que se evidencia por turbidez en el tubo. 7.

Considerar que el producto es estril comercialmente o satisfactorio, cuando mximo un tubo en aerobiosis muestra desarrollo. (sinembargo 64. 57 si esto ocurre mejorar la asepsia durante las manipulaciones. 8. Hacer un frotis directo del producto, desengrasar si es necesario con xilol. 9. Efectuar coloracin de gram en el producto para determinar el tipo de grmenes presentes. 10. Contar el nmero de clulas bacterianas por campo; un nmero elevado, indicar malas condiciones de higiene durante su proceso o la utilizacin de materias primas muy contaminadas. 4.4. PRUEBAS ADICIONALES 1. Evaluar el color, olor, aspecto y pH del producto. 2. Vaciar el contenido del producto. 3. Lavar la lata en la estufa a 37C para secarla. 4. Observar si tiene o no la capa protectora. 5. INVESTIGACIN 1. Criterios de clasificacin de las conservas. 2. Cules son las causas de alteraciones biolgicas en las conservas? 3. Clases de alteraciones fsicas y qumicas en las conservas. 6. BIBLIOGRAFA 1. ESCOBAR DUQUE, Mara Beatriz. Programa de Microbiologa e higiene de los alimentos. Medelln, Universidad de Antioquia, Facultad Nacional de salud pblica Hector Abad Gmez, 1990. ca. 150h. QW85 E8-90. 2. MINISTERIO DE SALUD. Instituto Nacional de Salud. Anlisis Microbiolgico de Alimentos. Serie de Publicaciones cientficas No. 10 Santa fe de Bogot, 1998. 7. NECESIDADES PARA EL LABORATORIO Todos los grupos deben traer: Fsforo para encender el mechero, toallas absorbentes, Cinta para enmascarar, Marcador. Grupo 1: 2 conservas de atn Grupo 2: 2 conservas de salchicha Grupo 3: 2 conservas de frutas Grupo 4: 2 conservas de verduras Grupo 5: 2 conservas mixtas (animal y vegetal) NOTA: las dos conservas deben de la misma marca y de la misma presentacin y contenido. 65. 58 UNIVERSIDAD DE CRDOBA FACULTAD DE CIENCIAS AGRCOLAS PROGRAMA DE INGENIERA DE ALIMENTOS MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS GUA N 15: RECOLECCIN DE MUESTRAS DE AGUA PARA ANLISIS BACTERIOLGICO 1. INTRODUCCIN El agua es un elemento fundamental para la vida, tanto del hombre como de los animales y las plantas. Basta decir que sin ella, no habra vida en este planeta. El agua qumicamente pura es un lquido muy escaso y difcil de obtener debido a que es un solvente casi universal y en el cual son soluble la mayora de las sustancias. Por esta propiedad, el agua se contamina frecuentemente con las sustancias con las que entra en contacto. Son muy pocas las operaciones industriales o de ingeniera que se pueden realizar con buenos resultados si no se cuenta con adecuados equipos para obtener aguas a condiciones dadas de calidad. Es de importancia tener conocimiento a cerca de las condiciones microbiolgicas de las aguas que sirven como abastecimiento para las diferentes necesidades de una poblacin, para evitar as contaminaciones ambientales y problemas de salud publica. Segn el Ministerio de Salud al agua potable se le realizan las siguientes determinaciones microbiolgicas: Coliformes Totales y Fecales por el mtodo de sustrato definido o de filtracin por membrana (Decreto 475 de marzo 10 de 1998). 2. OBJETIVOS 1. Realizar la toma de muestras de agua del grifo, pozo, piscina y envasada. 2. Conocer el fundamento de las tcnicas de filtracin por membrana y del sustrato definido. 3. Determinar la presencia de coliformes totales o fecales por el mtodo de filtracin por membrana o del sustrato definido. 4. Realizar el conteo teniendo en cuenta las reglas, despus de evaluar la calidad del control. 3. MATERIALES Medios de cultivo Reactivos Materiales* Tiosulfato sodio 0.01N Frasco o bolsas estriles Refrigerador portatil * Algodn y alcohol al 70% 66. 59 4. PROCEDIMIENTO 4.1. Cristalera Las muestras para anlisis bacteriolgico se deben tomar en frascos que se hayan lavado con extremo cuidado, enjuagados con agua limpia y esterilizados por lo menos 60 minutos a una temperatura de 170C. Es necesarios evitar que la parte baja de la tapa y la boca del frasco no toquen cosa alguna que pueda contaminarla muestra. 4.2. Decloracin Los frascos que se destinen para la recoleccin de muestras de agua con cloro residual deben llevar un agentes declorador (0.5 ml de tiosulfato de sodio 0.01 N por cada 100 ml de agua); su presencia en una muestra de agua clorada en el instante de la recoleccin, neutraliza cualquier cloro residual y evita que con esto prosiga la accin bactericida del cloro durante el tiempo que la muestra se encuentre en trnsito al laboratorio, en tales condiciones es probable que el examen bacteriolgico indique el verdadero contenido bacteriano de la muestra en el momento del muestreo. 4.3. Preservacin y almacenamiento El examen bacteriolgico de las muestras de agua se deben iniciar inmediatamente despus de su recoleccin, sin embargo, muy raras veces se puede proceder as y se deben establecer normas mas prcticas. El tiempo permisible entre la captacin de la muestra y el examen bacteriolgico no debe ser mayor de 6 horas para aguas muy contaminadas y de 12 para aguas relativamente puras. En ningn caso ese lapso debe

exceder las 36 horas. En el perodo que transcurre entre la recoleccin y el examen, se debe mantener la temperatura de la muestra entre 6 y 10C (refrigeracin, no congelacin). Para lograr estas condiciones, en el transporte se introducen los frascos con las muestras en un termo o nevera de icopor con bolsas de hielo. Es importante que al refrigerar las muestras se tomen precauciones y medidas para prevenir cualquier contaminacin proveniente del hielo derretido. 4.4. Captacin de las muestras 4.4.1. Muestras de grifo o llaves 1. Observar que el grifo no presente escapes de agua. 2. Rotular el frasco recolector de la muestra con la siguiente identificacin: tipo de muestra, fecha hora 3. Abrir el grifo y dejar correr agua durante 2 o 3 minutos para eliminar impurezas y agua acumulada en el interior de la caera. 67. 60 4. Restringir el flujo de la llave para recoger el agua sin salpicaduras. 5. Destapar el frasco e iniciar la recoleccin de la muestra hasta las partes del frasco. 6. Tapar el frasco, refrigerar y enviar al laboratorio lo ms pronto posible. 7. Nota: si se diera el caso que muestras sucesivas del mismo grifo tengan coliformes, entonces este deber ser desinfectado con una solucin de hipoclorito para eliminar cualquier foco de contaminacin externa; en este caso el laboratorio suministrar la informacin pertinente. 4.4.2. Muestras de Ros, Arroyos, Lagos 1. Rotular el frasco recolector de la muestra con la siguiente identificacin: tipo de muestra, fecha hora. 2. Sumergir rpidamente el frasco tapado debajo de la superficie del agua (15-20 cm) para evitar recolectar materia flotante. 3. Destapar e invertir el frasco para que la boca quede ligeramente hacia arriba y en sentido opuesto a la corriente (sostener con una mano por su parte posterior, formando con la horizontal un ngulo de 45). 4. Mover el frasco lentamente en contra de la corriente mientras entra el lquido para evitar que el agua que toca la mano entre en el frasco. 4.4.3. Muestra de agua de pozo con bomba 1. Dejar funcionando la bomba por lo menos una hora antes de captar la muestra. 2. Rotular el frasco recolector de la muestra con la siguiente identificacin: tipo de muestra, fecha hora. 3. Tomar las muestras en la descarga libre de la bomba o en algn grifo colocado para este fin siguiendo las instrucciones (4.4.1) 4.4.4. Muestra de agua de pozo sin bomba Es una muestra muy difcil de recolectar, debe hacerse con muchas precauciones para que el examen bacteriolgico tenga significado alguno, pero por lo peligros de contaminacin externa, los exmenes bacteriolgicos de las aguas de esta clase de pozo, no tienen mucho significado. 1. Rotular el frasco recolector de la muestra con la siguiente identificacin: tipo de muestra, fecha hora. 2. Atar un cordel al cuello del frasco. 3. Destaparlo en la superficie e inmediatamente sumergirlo con cuidado, evitando que toque las paredes del pozo. 4. Llenar el frasco, sacarlo y taparlo inmediatamente. 5. Refrigerar y enviar al laboratorio lo ms pronto posible. 4.4.5. Muestra de agua de estanque 1. Rotular el frasco recolector de la muestra con la siguiente identificacin: tipo de muestra, fecha hora 68. 61 2. Tomar el frasco por su parte inferior con una mano. 3. Invertir el frasco boca abajo. 4. Sumergir a una profundidad de 30 cm. 5. Destapar el frasco. 6. Invertir el frasco boca arriba, hasta que quede inclinado formando un ngulo de 45. 7. Desplazar el frasco para crear una corriente que permita llenarlo hasta las partes. 8. Sacar el frasco y taparlo. 9. Refrigerar y enviar al laboratorio. 4.5. Volumen de muestra El volumen de la muestra debe ser el suficiente para verificar todas las pruebas que se requieran, de preferencia alrededor de 300ml. 5. BIBLIOGRAFA 1. ACOSTA de GUEVARA Emma y GONZALEZ ORTIZ Lucy. Fundamentos para el anlisis microbiolgico de los alimentos. Barranquilla, 1995. 2. ICMSF. Microorganismos de los alimentos. Tcnicas de anlisis Microbiolgico. Vol. 1, 2da edicin, Editorial Acribia. Zaragoza, Espea, 1984. 3. MINISTERIO DE SALUD. Instituto Nacional de Salud. Alisi Microbiolgico de Alimentos. Serie de Publicaciones cientficas No. 10 Santa fe de Bogot, 1998. 6. NECESIDADES PARA EL LABORATORIO Todos los grupos deben traer: Fsforo para encender el mechero, toallas absorbentes, Cinta para enmascarar, Marcador. Grupo 1: 200 mL de agua de grifo. Grupo 2: 200 ml de agua envasada. Grupo 3: 200 mL de agua de pozo. Grupo 4: 200 mL de ro. Grupo 5: 200 g de agua de pozo con bomba. 69. 62 UNIVERSIDAD DE CRDOBA FACULTAD DE CIENCIAS AGRCOLAS PROGRAMA DE INGENIERA DE ALIMENTOS MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS GUA N 16: CUATIFICACIN DE MICROORGANISMOS POR EL METODO DE FILTRACIN POR MEMBRANA 1. INTRODUCCIN La tcnica de filtro de membrana (FM) es altamente reproducible, puede utilizarse para estudiar volmenes relativamente grandes de muestra y proporciona resultados numricos ms rpidos que los mtodos de los tubos mltiples. Esta es extraordinariamente til para controlar posibles situaciones de emergencia en elacin con el agua potable y para estudiar distintas aguas naturales. Sin embargo esta tcnica tiene limitaciones sobre todo para estudiar aguas con elevada turbidez o que contenga bacterias no coliformes.

Para esta agua, y tambin en caso de que no se haya utilizado anteriormente la tcnica de filtro de membrana, es preferible llevar a cabo pruebas paralelas mediante la tcnica de fermentacin en tubos mltiples para demostrar la aplicabilidad y comparacin de aquella. (Estndar Methods, 17 ed). 2. OBJETIVOS 1. Conocer el fundamento de la tcnica de filtracin por membrana. 2. Sembrar muestras lquidas por medio de la tcnica de filtracin por membrana. 3. Contar las UFC teniendo en cuenta las reglas, despus de evaluar la calidad del control. 3. MATERIALES Medios de cultivo Reactivos Materiales* Agar Chromocult Coloracin de gram Equipo de filtracin por membrana estril Reactivo de Kovacs Membranas de acetato de celulosa (0,45) Agua esteril Pinzas de punta lisa Tiosulfato sodio 0.01N Incubadora tijeras Toallas desechables Bolsas de polipropileno Gradilla Tubos de ensayo Cajas de petri Frasco o bolsas estriles Probeta esteril * Algodn y alcohol al 70% 70. 63 4. PROCEDIMIENTO 1. Abra el paquete que contiene el filtro de membrana estril, tome el filtro de membrana con la pinza y colquelo con la trama hacia arriba sobre la placa porosa del aparato. 2. Coloque cuidadosamente el embudo sobre el receptculo y ajuste hermticamente el embudo a la base o receptculo. Asegrese de que la llave est cerrada. 3. Tome la muestra y agtela fuertemente por unos segundos. 4. Mida el volumen de la muestra apropiado (100ml) usando una probeta estril. 5. Vierta la muestra de agua dentro del embudo del portafiltro y filtre aplicando vaco parcialmente. 6. Luego de filtrar la muestra cierre la llave y asegrese que la membrana no quede muy seca para evitar que se rasgue. 7. Adicione 30 ml de agua estril por tres veces y filtre aplicando vaco a travs de la membrana. 8. Tras el enjuagado y la desconexin del vaco en el proceso de filtrado, desbloquee y retire el embudo. 9. Inmediatamente retire el filtro de membrana con unas pinzas estriles. 10. Adhiera la membrana sobre una placa con agar Chromocult, haciendo un movimiento de rotacin para evitar que quede aire atrapado. 11. Introduzca una muestra de agua estril pare el lavado, comprobando posibles contaminaciones. 12. Incube las muestras de agua y la membrana de control a una temperatura de 35C durante 22 a 24 horas. 13. Realizar la lectura de los resultados. 5. RESULTADOS E INTERPRETACIN Lectura: Las colonias de E.coli presentarn una coloracin azul violeta oscura, los coliformes totales presentarn colonias rojas y colonias azul violeta oscuro, mientras que otras enterobacterias que pueden crecer en este medio de cultivo presentarn colonias incoloras. Reprtese las colonias contadas como UFC de coliformes totales o fecales. Tenga en cuenta para el recuento membranas que contengan entre 20 y 80 UFC de coliformes totales y no ms de 200 UFC por membrana de todos los tipos de microorganismos que puedan crecer. Comprobacin o confirmacin de coliformes fecales: Cubrir las colonias coloreadas de azul violeta oscuro con una gota del reactivo de Kovacs, una coloracin roja del reactivo al cabo de aproximadamente un minuto indica la formacin positiva del indol. 64 71. Cuando se filtran volmenes mayores de muestra (100ml) corrija el resultado de la siguiente forma: UFC de Coliformes /100ml = UFC de Coliformes contadosx100 ml de muestra de agua Reprtese como de Recuento de Coliformes Totales/100ml para el recuento de coliformes comprobados, tenga en cuenta el recuento inicial y el % de comprobacin positivo, para ello aplique la siguiente frmula: % coliformes verificados= Nmero de UFC comprobados ___x100 Nmero total de UFC presuntivas En las aguas potables o de buena calidad el recuento de estos microorganismos es mnimo, por lo tanto se debern contar todas las UFC de coliformes, sin tener en cuenta el lmite inferior de 20. Si aparece un crecimiento difuso o congruente que cubre toda la membrana o una buena parte de ella y las UFC no estn separadas entre s, se reporta como crecimiento congruente o difuso, con o sin coliformes. Se pedir otra muestra que debe ser tomada del mismo lugar, al hacer el anlisis nuevamente de la muestra de 100ml se deber dividir en dos alcuotas de 50 ml para evitar el sobrecrecimiento. Si el nmero total de UFC supera los 200 o si las colonias no estn separadas para permitir su conteo, se deber comunicar este resultado como muy numeroso para el recuento. La dudosa presencia de coliformes se puede confirmar colocando la membrana en caldo lactosa bilis verde brillante, otra alternativa es raspar la membrana bien sea con un asa o un escobilln e inocular en el tubo con caldo lactosado verde brillante. Si este cultivo produce gas en 48 horas a temperatura de 35C mas o menos0.5C se comunicar la presencia de coliformes. Para aguas de calidad diferente a la potable al igual que sucede si ninguna membrana tiene recuentos dentro de los parmetros ideales, realice un recuento total de coliformes en todas las membranas y reporte como recuento en 100 ml por ejemplo si se han analizado porciones en dos membranas y se encuentran cinco y tres colonias respectivamente, se reportar un

recuento de 8 colonias/100ml, es decir: = (5+3) x 100 (50 + 50) De la misma forma si se han estudiado porciones de 50, 25 y 10 ml y el recuento ha sido 15, 6 y menos de una colonia de coliformes, reprtese un recuento de 25/100ml. 72. 65 6. BIBLIOGRAFIA 1. ESCOBAR DUQUE, Mara Beatriz. Manual Tcnico y Procedimientos. Programa latinoamericano de Microbiologa e Higiene de los Alimentos. Facultad Nacional de Salud Pblica Hctor Abad Gmez. Universidad de Antioquia. Medelln, 1994. 2. MERK. Manual de medios de cultivo. Darmstadt, Alemania, 1994. 66 73. UNIVERSIDAD DE CRDOBA FACULTAD DE CIENCIAS AGRCOLAS PROGRAMA DE INGENIERA DE ALIMENTOS MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS GUA N 17: NUMERO MS PROBABLE DE PSEUDOMONA AERUGINOSA 1. INTRODUCCIN El gnero Pseudomona y los otros gram negativos no fermentativos (Alcalgenes, Alteromonas, Flavobacterium, Acrhromobacter Moraxella) son bacilos o diplobacilos, grmenes ubicuitarios, carga norma del suelo, aguas dulces y marinas y vegetales (frutas y legumbres), etc. Son aerobios facultativos, mviles por un flagelo polar (monotricos) o inmviles, con raras excepciones son oxidasa positiva, tienen un metabolismo estrictamente respiratorio (oxidativo) y no fermentativo; ciertas especies pueden atacar la glucosa y otros glcidos por va oxidativa. Crecen en medios simples a temperaturas de 30C, produciendo pigmentos en la mayora de los casos (Escobar, 1994, p 251). En el medio hospitalario se comporta como oportunista, produciendo infecciones y hasta septicemias, son carga norma del muchos alimentos produciendo alteracin en los mismos, su presencia en aguas recreacionales puede causar problemas de infecciones como conjuntivitis, otitis, etc. (Escobar, 1994, p 251). 2. OBJETIVOS 1. Determinar el NMP de Pseudomona aeruginosa en muestras de agua envasada o de piscina. 3. MATERIALES Medios de cultivo Reactivos Materiales* Caldo casoy doble Oxidasa Incubadora concentracin Caldo casoy concentracin Solucin amortiguadora Pipetas 1 y 10mL simple fosfato pH 7.2 Agar cetrimide Asa bacteriolgica Bolsas de polipropileno Gradilla Tubos de ensayo Cajas de petri Lmpara luz UV * Algodn y alcohol al 70% 74. 67 4. PROCEDIMIENTO 1. Limpiar con alcohol al 70% el recipiente que contiene la muestra de agua a analizar. 2. Mezclar muy bien la muestra. 3. Adicionar la muestra de agua as: 10ml en tubos (5) que contienen 10ml cada uno de caldo casoy a doble concentracin. 1ml en tubos (5) que contienen 10ml cada uno de caldo casoy a concentracin simple. 1ml en tubos (5) que contienen 10ml cada uno de caldo casoy a concentracin simple, a partir de una dilucin 1:10 de solucin buffer fosfato pH 7,0. 4. Mezclar e incubar por 24 horas a 37C. 5. Anotar los tubos que presentan crecimiento positivo (turbidez). 6. Confirmar la presencia de Pseudomona aeruginosa mediante un repique de todos los tubos positivos al agar cetrimide. 7. Incubar a 37C por 24 horas. 8. Confirmar la presencia de Pseudomona aeruginosa realizando la prueba de la oxidasa: colocar una colonia en la tirilla, adicionar una gota de agua destilada estril y leer en los 60 segundos siguientes. La aparicin de un color morado o azul indica prueba de oxidasa positiva. 9. Anotar todos los tubos positivos que fueron confirmados por crecimiento en el agar cetrimide por formacin de un pigmento verde azulado, adems el olor a frutas caracterstico y la prueba de la oxidasa positiva. 10. Buscar en la tabla correspondiente y expresar el resultado como NMP de Pseudomona aeruginosa/ 100 ml de agua. 5. INVESTIGACIN 1. Importancia de la determinacin de Pseudomona aeruginosa en aguas envasadas. 6. BIBLIOGRAFA 1. ACOSTA de GUEVARA Emma y GONZALEZ ORTIZ Lucy. Fundamentos para el anlisis microbiolgico de los alimentos. Barranquilla, 1995. 2. ESCOBAR DUQUE, Mara Beatriz. Manual Tcnico y Procedimientos. Programa latinoamericano de Microbiologa e Higiene de los Alimentos. Facultad Nacional de Salud Pblica Hctor Abad Gmez. Universidad de Antioquia. Medelln, 1994. 3. ICMSF. Microorganismos de los alimentos. Tcnicas de anlisis Microbiolgico. Vol. 1, 2da edicin, Editorial Acribia. Zaragoza, Espaa, 1984. 4. MINISTERIO DE SALUD DE COLOMBIA. Decreto 3075. Norma sobre manipuladores, 1997. 75. 68 UNIVERSIDAD DE CRDOBA FACULTAD DE CIENCIAS AGRCOLAS PROGRAMA DE INGENIERA DE ALIMENTOS MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS GUA N 18: PRESENCIA-AUSENCIA DE COLIFORMES EN MUESTRAS DE AGUA (METODO DEL SUSTRATO DEFINIDO) 1. INTRODUCCIN La prueba de presenciaausencia de coliformes es una sencilla modificacin del procedimiento de fermentacin en tubos mltiples. La simplificacin que se deriva de utilizar una sola porcin grande (100ml) en un solo frasco de cultivo para obtener una informacin cualitativa sobre la presencia-ausencia de coliformes, se justifica por la teora de la falta de esos

microorganismos en una muestra de agua potable de 100ml (Escobar, 1994, p 331). La prueba de presencia-ausencia proporciona adems una oportunidad opcional para hacer una deteccin sistemtica posterior del cultivo y aislar otros indicadores (coliformes fecales, Pseudomonas, Streptococcus fecales y Clostridium), tambin de manera cualitativa. Otras ventajas son la posibilidad de estudiar un mayor nmero de muestras por unidad de tiempo y de hacer estudios comparativos con el procedimiento de filtro de membrana, que indica que la prueba de presencia-ausencia puede aumentar al mximo la deteccin de coliformes en muestras que contienen microorganismos que podran sobre pasar en su crecimiento al de loas colonias de coliformes, provocando problemas para su deteccin (Escobar, 1994, p 331). La prueba de presencia-ausencia se recomienda para el estudio habitual de las muestras obtenidas en los sistemas de distribucin o en las plantas de tratamiento de aguas. En principio, se estudian alrededor de 100 muestras por el mtodo de filtro de membrana, adems de la prueba de presencia-ausencia. Una vez establecido que los mtodos cuantitativos suelen dar resultados negativos para coliformes, se puede utilizar nicamente la prueba de presencia-ausencia. Cuando una muestra produce un resultado positivo en esta prueba, se estudiarn las posteriores muestras repetidas mediante un mtodo cuantitativo, hasta que se vuelvan a obtener resultados negativos en dos muestras consecutivas (Escobar, 1994, p 331). 2. OBJETIVOS 1. Determinar coliformes totales y fecales en una muestra de agua a travs de la prueba de presenciaausencia( sustrato definido) 69 76. 3. MATERIALES Medios de cultivo Reactivos Materiales* Caldo LMX / Fluorocult / Reactivo de Kovacs Bolsas de polipropileno Readicult / Collilert Incubadora Lmpara luz UV Asa bacteriolgica Gradilla Tubos de ensayo Cajas de petri Pipetas 1 y 10mL * Algodn y alcohol al 70% 4. PROCEDIMIENTO 1. Inocular 100ml de la muestra de agua en el frasco o bolsa estril. 2. Adicionar el medio de cultivo deshidratado si se trata de materiales listos para usar (Readicult, Collilert); 3. Mezclar vigorosamente para obtener una buena homogenizacin de la muestra con el medio. 4. Incubar a 37C durante 18-24 horas. 5. Realizar la lectura del crecimiento comparando con los siguientes resultados: Coloracin verde (amarillenta) del medio con precipitado o material flotante: presencia de coliformes totales. Fluorescencia a la luz UV: presencia de coliformes fecales (E.coli). 6. Reportar como presencia o Ausencia de coliformes totales o E.coli / 100mlde agua. 5. INVESTIGACIN 1. Fundamento de la prueba de presencia-Ausencia. 6. BIBLIOGRAFA 1. ACOSTA de GUEVARA Emma y GONZALEZ ORTIZ Lucy. Fundamentos para el anlisis microbiolgico de los alimentos. Barranquilla, 1995. 2. ICMSF. Microorganismos de los alimentos. Tcnicas de anlisis Microbiolgico. Vol. 1, 2da edicin, Editorial Acribia. Zaragoza, Espea, 1984. 3. MINISTERIO DE SALUD DE COLOMBIA. Decreto 3075. Norma sobre manipuladores, 1997. 77. 70 UNIVERSIDAD DE CRDOBA FACULTAD DE CIENCIAS AGRCOLAS PROGRAMA DE INGENIERA DE ALIMENTOS MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS GUA N 19: PRUEBA DEL TIEMPO DE REDUCCIN DEL AZUL DE METILENO (T.R.A.M.) 1. INTRODUCCIN Cuando se agrega una pequea cantidad de azul de metileno a la leche , se le mezcla e incuba a 37C, sobreviene una decoloracin debida al metabolismo bacteriano, es rapidez de decoloracin es directamente proporcional al nmero de grmenes presentes (Escobar, 1994, p 289). La mayora de microorganismos son capaces un su multiplicacin de modificar el potencial de oxido-reduccin de la leche, razn suficiente para transformar el azul metileno en un compuesto incoloro (Escobar, 1994, p 289). 2. OBJETIVOS 1. Realizar la prueba de tiempo de reduccin del azul de metileno a muestras de leche cruda, pasteurizada o hervida de diferente procedencia. 3. MATERIALES Medios de cultivo Reactivos Materiales* Azul de metileno (0.5%) Homogenizador Bao serolgico Pipetas 1 y 10mL Asa bacteriolgica Gradilla Tubos de ensayo * Algodn y alcohol al 70% 4. PROCEDIMIENTO 1. Agitar muy bien la muestra de leche 2. Depositar en un tubo tapa rosca 10 ml de la muestra de leche. 3. Adicionar 1ml de la solucin de azul de metileno 0.5%. 4. Tapar el tubo y mezclar. 5. Incubar en el bao serolgico a 37C y observar la muestra cada 30 minutos, agitando el contenido en cada lectura. 6. Anotar el tiempo de decoloracin del azul de metileno. 78. 71 5. INVESTIGACIN 1. La relacin existente entre el tiempo de reduccin del azul de metileno, la calidad de la leche y la carga bacteriana. 2. Factores que influyen en la reduccin del azul de metileno. 6. BIBLIOGRAFA 1. ACOSTA de GUEVARA Emma y GONZALEZ ORTIZ Lucy. Fundamentos para el anlisis microbiolgico de los alimentos. Barranquilla, 1995. 2. ICMSF. Microorganismos de los alimentos. Tcnicas de anlisis Microbiolgico. Vol. 1, 2da

edicin, Editorial Acribia. Zaragoza, Espea, 1984. 3. MINISTERIO DE SALUD DE COLOMBIA. Decreto 3075. Norma sobre manipuladores, 1997. 72 79. UNIVERSIDAD DE CRDOBA FACULTAD DE CIENCIAS AGRCOLAS PROGRAMA DE INGENIERA DE ALIMENTOS MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS GUA N 20: MICROBIOLOGA DE LECHE Y DERIVADOS 1. INTRODUCCIN La leche es el producto de secrecin de origen animal y sus cualidades sanitarias estn influenciadas por muchos factores que intervienen en su curso de produccin, elaboracin y entrega al consumidor. Las caractersticas nutritivas de sta y de sus productos los convierte en alimentos deseables al consumidor, adems de que estos mismos valores nutritivos facilitan la proliferacin de muchos microorganismos, los cuales pueden ocasionar cambios indeseables en el producto. Los microorganismos y los subproductos son indeseables en la leche y derivados si son capaces de alterar las caractersticas organolpticas, produciendo enfermedades o si indican manejo descuidado o antihiginico del producto. Las decoloraciones, la viscosidad, la putrefaccin, la rancidez, la gaseosidad y muchos otros defectos estn causados por diversos microorganismos que crecen en productos lcteos. Los anlisis microbiolgicos que se le deben practicar a la leche y derivados se encuentran consignados en el Decreto 2437 de agosto 30 de 1983 emanado del Ministerio de Salud, los cuales abarcan los siguientes: LECHE HiGIENIZADAS O PASTEURIZADA: Recuento de microorganismos mesfilos aerobios y facultativos viables, Coliformes Totales y Fecales. LECHE EN POLVO: Recuento de microorganismos mesfilos aerobios y facultativos viables, Coliformes Totales, Fecales, Staphylococcus aureus coagulasa positiva, recuento de mohos y levaduras, Bacillus cereus, Salmonella y determinacin de Esporas de Clostridium sulfito reductor. LECHE ULTRAPASTEURIZADA: Recuento de microorganismos mesfilos aerobios y anaerobios, Coliformes Totales y Fecales. (Decreto 476/98). YOGURT O KUMIS: Coliformes Totales, Fecales, recuento de mohos y levaduras. (Resoluciones: 2310/86, 1804/89, 11961/89). HELADOS: Recuento de microorganismos mesfilos aerobios y facultativos viables, Coliformes Totales, Fecales, Staphylococcus aureus coagulasa positiva y Salmonella. (Resoluciones: 2310/86, 1804/89, 11961/89). CREMA DE LECHE PASTEURIZADA: Coliformes Totales, Fecales, recuento de mohos y levaduras, Staphylococcus aureus coagulasa positiva y Salmonella. (Resoluciones: 2310/86, 1804/89, 11961/89). 80. 73 AREQUIPE: Recuento de microorganismos mesfilos aerobios y facultativos viables, Coliformes Totales, Fecales, Staphylococcus aureus coagulasa positiva, recuento de mohos y levaduras. (Resoluciones: 2310/86, 1804/89, 11961/89). QUESO FRESCO: Coliformes Fecales, Staphylococcus aureus coagulasa positiva, recuento de mohos y levaduras y Salmonella. (Resoluciones: 2310/86, 1804/89, 11961/89). A las leches crudas o pasteurizadas se les puede realizar la prueba de tiempo de reduccin del azul de metileno con el fin de determinar de una forma rpida su calidad y conocer de una manera aproximada su carga bacteriana. 2. OBJETIVOS 1. Realizar recuento de microorganismos mesfilos aerobios y facultativos viables, colifomes totales y fecales a partir de leche hervida. 2. Determinar coniformes fecales, Recuento de mohos y levaduras y Recuento de Staphylococcus coagulasa positiva a partir de queso fresco. 3. Realizar recuento de mesfilos aerobios y facultativos viables, coniformes totales y fecales, recuento de mohos y levaduras y de Staphylococcus coagulasa positiva a partir de arequipe. 4. Realizar pruebas microbiolgicas al yogurt y suero costeo elaborados en la granja de Berstegui. 5. Realizar la prueba del tiempo de reduccin del azul de metileno a leches de diferente calidad y procedencia. 3. MATERIALES Medios de cultivo Reactivos Materiales* Bilis verde brillante lactosa Coloracin de gram Homogenizador con durham A. EMB Reactivo de Kovacs Balanza Agua peptona 0.1% Plasma fresco Cuchillos-cucharas Agua triptona Griess Incubadora Agar Baird Parker Alfa naftol Pipetas 1 y 10mL Agar Hecktoen KOH 40% Asa bacteriolgica Agar BPLS Rojo de metilo Bolsas de polipropileno Caldo tetrationato de sodio Peroxido hidrogeno 3% Gradilla Caldo selenite- cistina Azul de metileno (0.5%) Tubos de ensayo Caldo nitrato Cajas de petri Caldo MR-VP Agar citrato Agar urea Agar kligler Agar Lia Infusin cerebro corazn Agar plate count 81. Agar Ogy * Algodn y alcohol al 70% 74 4. PROCEDIMIENTO De acuerdo al producto a analizar. 5. INVESTIGACIN 1. Consecuencias del crecimiento de hongos en productos lcteos fermentados 6. BIBLIOGRAFA 1. ACOSTA de GUEVARA Emma y GONZALEZ ORTIZ Lucy. Fundamentos para el anlisis microbiolgico de los alimentos. Barranquilla, 1995. 2. ICMSF. Microorganismos de los alimentos. Tcnicas de anlisis Microbiolgico. Vol. 1, 2da edicin, Editorial Acribia. Zaragoza, Espaa, 1984. 3. MINISTERIO DE SALUD DE COLOMBIA. Decreto 3075. Norma sobre manipuladores, 1997. 7. NECESIDADES PARA EL LABORATORIO Todos los grupos deben traer:

Fsforo para encender el mechero, toallas absorbentes, Cinta para enmascarar, Marcador. Grupo 1: 200 mL de leche hervida. Grupo 2: 200 g de queso fresco. Grupo 3: 200 mL de suero costeo. Grupo 4: 200 mL de arequipe. Grupo 5: 200 g de yogurt. 82. 75 UNIVERSIDAD DE CRDOBA FACULTAD DE CIENCIAS AGRCOLAS PROGRAMA DE INGENIERA DE ALIMENTOS MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS GUA N 21: MICROBIOLOGA DE CARNICOS 1. INTRODUCCIN La carne es, tanto por su valor nutritivo como su valor sensorial, uno de los alimentos ms importantes para el hombre. Es el alimento bsico para cubrir las necesidades de protenas de alta calidad. La carne como material biolgico, es una materia prima muy delicada. La calidad de los productos obtenidos de ella depende tanto de los animales de abasto como del proceso de la materia prima a partir de stos, as como de su procesado, y distribucin hasta el consumidor. Adems, la tecnologa tiene que tener en cuenta las caractersticas biolgicas y los cambios que acontecen en sta durante su obtencin y procesado as como las exigencias higinicas para un aprovechamiento ptimo de la carne. Tras la produccin de carne, la obtencin de sta y su procesado tienen tambin una gran importancia econmica. Adems de una ptima obtencin y procesado de la carne exigen un alto estndar higinico, para poder ofrecer al consumidor carne y productos crnicos que se pongan en riesgo sanitario mnimo, por ello la higiene, tiene que estar completamente integrada en la moderna tecnologa de los alimentos. Los anlisis microbiolgicos practicados a los productos crnicos procesados segn el Decreto 2162 /83 y el 2131/97 son los siguientes: Crnicos cocidos: Mesfilos aerobios facultativos viables, NMP de coliformes totales y fecales, recuento de estafiloccos coagulasa positiva, Recuento de esporas Clostridium sulfito reductor, investigacin de Salmonella e investigacin de Listeria monocytogenes. Crnicos crudos madurados o ahumados: NMP de coliformes totales y fecales, recuento de estafiloccos coagulasa positiva, Recuento de esporas Clostridium sulfito reductor, investigacin de Salmonella e investigacin de Listeria monocytogenes. Crnicos crudos: NMP de coliformes fecales, recuento de estafiloccos coagulasa positiva, Recuento de esporas Clostridium sulfito reductor, investigacin de Salmonella. 2. OBJETIVOS 83. 1. Realizar Recuento de microorganismos mesfilos aerobios y facultativos viables, Staphylococcus coagulasa positiva, coniformes totales y fecales a partir de productos crnicos. 76 2. Determinar e identificar la presencia de Salmonella a partir de productos crnicos. 3. Determinar e identificar la presencia de esporas de Clostridium sulfito reductor a partir de productos crnicos. 3. MATERIALES Medios de cultivo Reactivos Materiales* Bilis verde brillante lactosa Coloracin de gram Homogenizador con durham A. EMB Reactivo de Kovacs Balanza A. leche Plasma fresco Cuchillos-cucharas Agua peptona 0.1% Griess Incubadora Agua triptona Alfa naftol Pipetas 1 y 10mL Agar Baird Parker KOH 40% Asa bacteriolgica Agar Hecktoen Rojo de metilo Bolsas de polipropileno Agar BPLS Peroxido hidrogeno 3% Gradilla Caldo tetrationato de sodio Oxidasa Tubos de ensayo Caldo selenite- cistina Cajas de petri Caldo nitrato Caldo MR-VP Agar citrato Agar urea Agar kligler Agar Lia Infusin cerebro corazn Agar plate count Agar SPS Caldo tioglicolato Agar gelatina * Algodn y alcohol al 70% 4. PROCEDIMIENTO De acuerdo al producto a analizar. 5. INVESTIGACIN 1. Importancia de la investigacin de Listeria monocytogenes en productos crnicos. 6. BIBLIOGRAFA 84. 1. ACOSTA de GUEVARA Emma y GONZALEZ ORTIZ Lucy. Fundamentos para el anlisis microbiolgico de los alimentos. Barranquilla, 1995. 2. ICMSF. Microorganismos de los alimentos. Tcnicas de anlisis 77 Microbiolgico. Vol. 1, 2da edicin, Editorial Acribia. Zaragoza, Espaa, 1984. 3. MINISTERIO DE SALUD. Instituto Nacional de Salud. Anlisis Microbiolgico de Alimentos. Serie de Publicaciones cientficas No. 10 Santa fe de Bogot, 1998. 7. NECESIDADES PARA EL LABORATORIO Todos los grupos deben traer: Fsforo para encender el mechero, toallas absorbentes, Cinta para enmascarar, Marcador. Grupo 1: Crnicos crudos: 200 g de Chorizo o carne fresca Grupo 2: Crnicos crudos: 200 g de Hamburguesa. Grupo 3: Crnicos Escaldados: 200 g de Salchicha. Grupo 4: Crnicos Ahumados: 200 g de Salchichn Grupo 5: Crnicos Cocidos: 200 g de Morcilla butifarra 85. 78 UNIVERSIDAD DE CRDOBA FACULTAD DE CIENCIAS AGRCOLAS PROGRAMA DE INGENIERA DE ALIMENTOS MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS GUA N 22: MICROBIOLOGA DE OVOPRODUCTOS 1. INTRODUCCIN Los huevos tienen una vida muy corta, puesto que tienden a descomponerse rpidamente o a ser alimento de numerosos microorganismos, entre ellos la Salmonella. Con el fin de prolongar la conservacin de los huevos

evitando a la vez su cont6aminacin microbiana, se someten a diversos procesos industriales, con lo que se convierten en ovoproductos. Los ovoproductos se pueden obtener a partir de huevos sin cscara; Estos ovoproductos tienen que ser pasteurizados a una temperatura menor de 65C durante un tiempo menor de 4 minutos. Los anlisis microbiolgicos que se le realizan a lo derivados del huevo son los siguientes: Mayonesa: Mesfilos aerobios facultativos viables, NMP de coliformes totales y fecales, recuento de estafiloccos coagulasa positiva, Recuento de Bacillus cereus, recuento de mohos y levaduras e investigacin de Salmonella. (Resolucin 17882/85). Pastas alimenticias al huevo: Mesfilos aerobios facultativos viables, NMP de coliformes totales y fecales, recuento de estafiloccos coagulasa positiva, Recuento de Bacillus cereus, recuento de mohos y levaduras, recuento de esporas de Clostridium sulfito reductor e investigacin de Salmonella. (Resolucin 4393/91) Sabajn: Mesfilos aerobios facultativos viables, NMP de coliformes totales y fecales, recuento de estafiloccos coagulasa positiva, recuento de mohos y levaduras e investigacin de Salmonella. (Invima) 2. OBJETIVOS 1. Realizar Recuento de microorganismos mesfilos aerobios y facultativos viables, Staphylococcus coagulasa positiva, mohos y levaduras, coliformes totales y fecales a partir de ovoproductos. 86. 2. Determinar e identificar la presencia de Salmonella a partir de ovoproductos. 3. Realizar recuento de Bacillus cereus a partir de ovoproductos. 79 3. MATERIALES Medios de cultivo Reactivos Materiales* Bilis verde brillante lactosa Coloracin de gram Homogenizador con durham A. EMB Reactivo de Kovacs Balanza A. leche Plasma fresco Cuchilloscucharas Agua peptona 0.1% Griess Incubadora Agua triptona Alfa naftol Pipetas 1 y 10mL Agar Baird Parker KOH 40% Asa bacteriolgica Agar Hecktoen Rojo de metilo Bolsas de polipropileno Agar BPLS Peroxido hidrogeno 3% Gradilla Caldo tetrationato de sodio Oxidasa Tubos de ensayo Caldo selenite- cistina Cajas de petri Caldo nitrato Caldo MR-VP Agar citrato Agar urea Agar kligler Agar Lia Infusin cerebro corazn Agar plate count Agar SPS Caldo tioglicolato Agar gelatina Agar Cereus segn Mossel Agar almidn Caldo MR-Glucosa (5%) Caldo MR-Xilosa (5%) Caldo MR-Arabinosa (5%) Agar SIM * Algodn y alcohol al 70% 4. PROCEDIMIENTO De acuerdo al producto a analizar. 5. INVESTIGACIN 1. Cules son los riesgos microbiolgicos por el consumo de las aves y los derivados del huevo. 6. BIBLIOGRAFA 87. 1. ACOSTA de GUEVARA Emma y GONZALEZ ORTIZ Lucy. Fundamentos para el anlisis microbiolgico de los alimentos. Barranquilla, 1995. 2. ICMSF. Microorganismos de los alimentos. Tcnicas de anlisis 80 da Microbiolgico. Vol. 1, 2 edicin, Editorial Acribia. Zaragoza, Espaa, 1984. 3. MINISTERIO DE SALUD. Instituto Nacional de Salud. Anlisis Microbiolgico de Alimentos. Serie de Publicaciones cientficas No. 10 Santa fe de Bogot, 1998. 7. NECESIDADES PARA EL LABORATORIO Todos los grupos deben traer: Fsforo para encender el mechero, toallas absorbentes, Cinta para enmascarar, Marcador. Grupo 1y 2: Mayonesa Grupo 3 y 4: Pastas alimenticias al huevo Grupo 5: Sabajn 88. 81 UNIVERSIDAD DE CRDOBA FACULTAD DE CIENCIAS AGRCOLAS PROGRAMA DE INGENIERA DE ALIMENTOS MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS GUA N 23: MICROBIOLOGA DE PESCADOS Y MARISCOS 1. INTRODUCCIN Los productos como pescados y mariscos contienen gran cantidad de sustancias nutritivas, en las cuales priman las protenas y son muy escasos los carbohidratos razn por la cual es muy fcil que las bacterias procedan a descomponer las sustancias nitrogenadas de este produciendo colores, sabores y olores desagradables, haciendo al producto inconsumible. Segn las normas nacionales (Invima) a los pescados y mariscos se le realizan las siguientes determinaciones microbiolgicas: Pescado fresco y congelado, incluido el congelado en el mar, bloques de pescado picado o no y moluscos antes del consumo (peligrosidad reducida): Coliformes fecales, Staphylococcus aureus, Salmonella y Vibrium. Pescado de agua dulce (peligrosidad reducida): Recuento de mesfilos (para determinar vida til), coliformes fecales, Staphylococcus aureus, Salmonella y Vibrium. Productos empanados, precocidos incluyendo porciones dedos y pasteles de pescado, normalmentese cocinan antes del consumo (peligrosidad escasa): Coliformes fecales, Staphylococcus aureus, Salmonella y Vibrium. Gambas, langostinos, mariscos congelados crudos, normalmente se consumen tras la descongelacin, pero pueden consumirse tras una demora impredecible (peligrosidad escasa): Coliformes fecales, Staphylococcus aureus, Salmonella y Vibrium. 2. OBJETIVOS 1. Realizar Recuento de microorganismos mesfilos aerobios y facultativos viables, Staphylococcus coagulasa positiva, coliformes fecales a partir de pescados y mariscos.

89. 2. Determinar e identificar la presencia de Salmonella y Vibrium a partir de pescados y mariscos. 3. Conocer las normas del comercio internacional que existen para productos marinos. 82 3. MATERIALES Medios de cultivo Reactivos Materiales* Bilis verde brillante lactosa Coloracin de gram Homogenizador con durham A. EMB Reactivo de Kovacs Balanza Agua peptona 0.1% Plasma fresco Cuchillos-cucharas Agua triptona Griess Incubadora Agar Baird Parker Alfa naftol Pipetas 1 y 10mL Agar Hecktoen KOH 40% Asa bacteriolgica Agar BPLS Rojo de metilo Bolsas de polipropileno Caldo tetrationato de sodio Oxidasa Gradilla Caldo selenite- cistina Tubos de ensayo Caldo nitrato Cajas de petri Caldo MR-VP Agar citrato Agar urea Agar kligler Agar Lia Infusin cerebro corazn Agar Plate count Agar TCBS Caldo soya tripticasa * Algodn y alcohol al 70% 4. PROCEDIMIENTO De acuerdo al producto a analizar 5. INVESTIGACIN 1. Cuales son las principales enfermedades transmitidas por alimentos que se pueden contraer por el consumo de productos marinos crudos contaminados? 6. BIBLIOGRAFA 1. ACOSTA de GUEVARA Emma y GONZALEZ ORTIZ Lucy. Fundamentos para el anlisis microbiolgico de los alimentos. Barranquilla, 1995. 90. 2. ICMSF. Microorganismos de los alimentos. Tcnicas de anlisis Microbiolgico. Vol. 1, 2da edicin, Editorial Acribia. Zaragoza, Espaa, 1984. 3. MINISTERIO DE SALUD. Instituto Nacional de Salud. Anlisis Microbiolgico de Alimentos. Serie de Publicaciones cientficas No. 10 Santa fe de Bogot, 1998. 83 7. NECESIDADES PARA EL LABORATORIO Todos los grupos deben traer: Fsforo para encender el mechero, toallas absorbentes, Cinta para enmascarar, Marcador. Grupo 1: Pescados de agua dulce = 200 g Grupo 2: Pescado de agua salada = 200 g Grupo 3: productos empanados, precocidos (dedos, pasteles) = 200 g Grupo 4: Mariscos (camarn, langostas) = 200 g Grupo 5: Moluscos (ostras, mejillones, caracol): 200 g 91. 84 UNIVERSIDAD DE CRDOBA FACULTAD DE CIENCIAS AGRCOLAS PROGRAMA DE INGENIERA DE ALIMENTOS MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS GUA N 24: MICROBIOLOGA DE FRUTAS Y HORTALIZAS 1. INTRODUCCIN Las frutas son alimentos muy saludables ya que poseen generalmente muy poca grasa y muchas vitaminas y fibra, lo cual las hace indispensable en la dieta, supliendo estas, los requerimientos que otros alimentos no pueden proporcionar, haciendo parte de una dieta integral y equilibrada. Contrario de lo que sucede en la mayora de los alimentos, las frutas continan con su proceso de respiracin despus de la recoleccin, generando esto una serie de "alteraciones", que en muchos casos vienen precedidas de una mala recoleccin, clasificacin y/o almacenamiento, reflejndose esto en el desarrollo de podredumbres, hecho que no favorece la comercializacin, la economa y la calidad del producto. Por otra parte los cultivos frutales estn a la intemperie, lo cual los pone en contacto con una gran cantidad de factores (agua de riego, polvo, insectos, pjaros, etc.) que son de vital importancia al momento de determinar la carga microbiana de las frutas. Segn el Invima a las frutas y derivados se les realizan las siguientes determinaciones microbiolgicas: Pulpas de frutas congeladas (Resolucin 7992 de junio 21-91): Recuento de mesfilos aerobios, coliformes totales y fecales, recuento de mohos y levaduras y esporas de Clostridium sulfito reductor. Pulpas de frutas pasteurizadas (Resolucin 7992 de junio 21-91): Recuento de mesfilos aerobios, coliformes totales y fecales, recuento de mohos y levaduras y esporas de Clostridium sulfito reductor. Pulpas de frutas ultrapasteurizadas (Resolucin 7992 de junio 21-91): Recuento de mesfilos aerobios, coliformes totales y fecales, recuento de mohos y levaduras y esporas de Clostridium sulfito reductor. 92. Pulpas de frutas concentradas con dos o ms frutas (Resolucin 7992 de junio 21-91): Recuento de mesfilos aerobios, coliformes totales y fecales, recuento de mohos y levaduras y esporas de Clostridium sulfito reductor. Pulpas de frutas azucaradas (Resolucin 7992 de junio 21-91): Recuento de mesfilos aerobios, coliformes totales y fecales, recuento de mohos y levaduras y esporas de Clostridium sulfito reductor. 85 Frutas en almbar (Resolucin 7992 de junio 21-91): Recuento de mesfilos aerobios, 92oniformes totales y fecales, recuento de mohos y levaduras y esporas de Clostridium sulfito reductor. Mermelada de frutas (Resolucin 15789/84): Recuento de mesfilos aerobios, 92oniformes totales y fecales, recuento de mohos y levaduras y esporas de Clostridium sulfito reductor. Jalea de frutas (Resolucin 15789/84): Recuento de mesfilos aerobios, 92oniformes totales y fecales, recuento de mohos y levaduras y esporas de Clostridium sulfito reductor. 2. OBJETIVOS 1. Realizar Recuento de microorganismos mesfilos aerobios y facultativos viables, 92oniformes totales y fecales a partir de frutas. 2. Determinar e identificar la presencia de esporas de Clostridium sulfito reductor a partir de frutas. 3. Realizar recuento de mohos y levaduras a partir de pulpas de frutas. 3. MATERIALES

Medios de cultivo Reactivos Materiales* Bilis verde brillante lactosa Coloracin de gram Homogenizador con durham A. EMB Reactivo de Kovacs Balanza A. leche Peroxido hidrogeno 3% Cuchillos-cucharas Agua peptona 0.1% Incubadora Agua triptona Pipetas 1 y 10mL Agar ogy Asa bacteriolgica Agar plate count Bolsas de polipropileno Agar SPS Gradilla Caldo tioglicolato Tubos de ensayo Agar gelatina Cajas de petri Caldo nitrato Agar kligler Algodn y alcohol al 70% 4. PROCEDIMIENTO 93. De acuerdo al producto a analizar. 5. INVESTIGACIN 1. Por qu en las frutas y derivados no se investigan estafilococos salmoneras? 86 Cules son los patgenos de importancia en las frutas y derivados? 6. BIBLIOGRAFA 1. ACOSTA de GUEVARA Emma y GONZALEZ ORTIZ Lucy. Fundamentos para el anlisis microbiolgico de los alimentos. Barranquilla, 1995. 2. ICMSF. Microorganismos de los alimentos. Tcnicas de anlisis Microbiolgico. Vol. 1, 2da edicin, Editorial Acribia. Zaragoza, Espea, 1984. 3. MINISTERIO DE SALUD. Instituto Nacional de Salud. Alisi Microbiolgico de Alimentos. Serie de Publicaciones cientficas No. 10 Santa fe de Bogot, 1998. 7. NECESIDADES PARA EL LABORATORIO Todos los grupos deben traer: Fsforo para encender el mechero, toallas absorbentes, Cinta para enmascarar, Marcador. Grupo 1: Pulpa de fruta congelada: 200 g. Grupo 2: Pulpa de fruta azucarada: 200 g. Grupo 3: Nctar de frutas: 200. Grupo 4: Mermelada: 200 g. Grupo 5: Frutas en almbar: 200 g. 94. 87 UNIVERSIDAD DE CRDOBA FACULTAD DE CIENCIAS AGRCOLAS PROGRAMA DE INGENIERA DE ALIMENTOS MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS GUA N 25: MICROBIOLOGA DE CEREALES Y PANIFICACIN 1. INTRODUCCIN Los cereales son las semillas de ciertas gramneas y en conjunto constituyen el producto alimenticio ms importante del mundo. Cocinados o molidos y transformados en harinas, aceites y otras sustancias, son excelente fuente de energa para el hombre y el ganado. La cerveza y otras bebidas alcohlicas se elaboran con cereales fermentados. Denominacin que engloba varias especies de la familia de las Gramneas cultivadas por sus semillas, que son importantes productos alimenticios. El nombre deriva de Ceres, diosa romana de la agricultura. Aunque los cereales no pertenecen a ninguna familia especfica de las gramneas en sentido estricto, la eleccin de algunas especies como fuente de alimento parece haber estado determinada por el mayor tamao de la semilla o por la facilidad de obtenerla en cantidad suficiente y de liberarla de la cscara no comestible. Los granos ms cultivados son maz, trigo, arroz, cebada, sorgo, mijo, avena y centeno. Todas estas plantas se cultivan desde la antigedad y tanto su cultivo como su utilizacin han constituido un indicador de crecimiento econmico, en especial en los pases ms pobres. Proceden de Europa, Asia y frica, salvo el maz, que es de origen americano. Segn el Invima, a los cereales y productos de panificacin se le realizan las siguientes determinaciones microbiolgicas, dependiendo de la clase Galletas y Colaciones: Resolucin No. 11488 de agosto 27-84 Recuento de mesfilos, 94oniformes totales y fecales, Staphyfilococcus coagulasa positiva, recuento de mohos y levaduras. Harina de trigo para panificacin: Norma No. 267 del INVIMA Recuento de mesfilos, 94oniformes totales y fecales, Staphyfilococcus coagulasa positiva, recuento de mohos y levaduras, Salmonella y Bacillus cereus. 95. Avena en hojuelas para consumo humano: Norma No. 2159 del INVIMA Recuento de mesfilos, 95oniformes fecales, recuento de mohos y levaduras, Salmonella. Harina de avena para consumo humano: Norma No. 2160 del INVIMA Recuento de mesfilos, 95oniformes fecales, recuento de mohos y levaduras, Salmonella. 88 2. OBJETIVOS 1. Realizar recuento de microorganismos Mesfilos aerobios, 95oniformes totales y fecales a partir de cereales y productos de panificacin. 2. Determinar e identificar la presencia de Salmonella a partir de productos de cereales y productos de panificacin. 3. Realizar recuento de hongos y levaduras a partir de cereales y productos de panificacin. 3. MATERIALES Medios de cultivo Reactivos Materiales* Bilis verde brillante lactosa Coloracin de gram Homogenizador con durham A. EMB Reactivo de Kovacs Balanza Agar plate count Plasma fresco Cuchillos-cucharas Agua peptona 0.1% Griess Incubadora Agua triptona Alfa naftol Pipetas 1 y 10mL Agar Baird Parker KOH 40% Asa bacteriolgica Agar Hecktoen Rojo de metilo Bolsas de polipropileno Agar BPLS Gradilla Caldo tetrationato de sodio Tubos de ensayo Caldo selenite- cistina Cajas de petri Caldo nitrato Caldo MR-VP Agar citrato Agar urea Agar kligler Agar Lia Infusin cerebro corazn Agar ogy Agar B.cereus-Mossel Agar leche Agar almidn Algodn y alcohol al 70% 4. PROCEDIMIENTO De acuerdo al producto a analizar.

96. 5. INVESTIGACIN Cules son los factores que permiten la invasin y el crecimiento de los microorganismos en los granos de cereales? 89 6. BIBLIOGRAFA 1. ACOSTA de GUEVARA Emma y GONZALEZ ORTIZ Lucy. Fundamentos para el anlisis microbiolgico de los alimentos. Barranquilla, 1995. 2. ICMSF. Microorganismos de los alimentos. Tcnicas de anlisis Microbiolgico. Vol. 1, 2da edicin, Editorial Acribia. Zaragoza, Espaa, 1984. 3. MINISTERIO DE SALUD. Instituto Nacional de Salud. Anlisis Microbiolgico de Alimentos. Serie de Publicaciones cientficas No. 10 Santa fe de Bogot, 1998. 7. NECESIDADES PARA EL LABORATORIO Todos los grupos deben traer: Fsforo para encender el mechero, toallas absorbentes, Cinta para enmascarar, Marcador. Grupo 1: Galleta: 200 g. Grupo 2: Colacin: 200 g. Grupo 3: Harina: 200 g. Grupo 4: Pan: 200 g. Grupo 5: Bizcocho: 200 g. 97. 90 UNIVERSIDAD DE CRDOBA FACULTAD DE CIENCIAS AGRCOLAS PROGRAMA DE INGENIERA DE ALIMENTOS MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS GUA N 26: MICROBIOLOGA DE BEBIDAS 2. INTRODUCCIN Las bebidas refrescantes constituyen un conjunto muy heterogneo en el que se distinguen dos tipos de productos cuyas caractersticas microbiolgicas son muy diferentes, las cuales son: las bebidas a base de extractos naturales de frutas o de otros vegetales y los zumos de frutas o bebidas a base de zumos de frutas. Otro tipo de bebidas son las alcohlicas, las cuales se producen a partir de diversas materias primas, pero especialmente a partir de cereales, frutas y productos azucarados; Entre ellas se encuentran bebidas no destiladas como la cerveza y el vino, y destiladas como el whisky y el ron. Un ltimo tipo de bebidas consumidas por sus caractersticas refrescantes y estimulantes son las aromticas entre las cabe mencionar el caf, el t y las obtenidas a partir del cacao. Segn el Invima los anlisis microbiolgicos que se le realizan a las bebidas son los siguientes: Cerveza: Recuento de mesfilos, 97oniformes totales y fecales, recuento de esporas de Clostridium sulfito reductor y recuento de mohos y levaduras. Gaseosas: Recuento de mesfilos, 97oniformes totales y fecales, recuento de esporas de Clostridium sulfito reductor y recuento de mohos y levaduras. Refresco lquido en bolsa: Recuento de mesfilos, 97oniformes totales y fecales, recuento de esporas de Clostridium sulfito reductor y recuento de mohos y levaduras. Caf: Recuento de mesfilos, 97oniformes totales y fecales, Staphyfilococcus coagulasa positiva, recuento de mohos y levaduras. Aromtica: Recuento de mesfilos, 97oniformes totales y fecales, Staphyfilococcus coagulasa positiva y recuento de mohos y levaduras. 98. 3. OBJETIVOS 1. Realizar Recuento de microorganismos mesfilos aerobios y facultativos viables, Staphylococcus coagulasa positiva, 98oniformes totales y fecales a partir de bebidas. 2. Determinar e identificar la presencia de esporas de Clostridium sulfito reductor a partir de bebidas. 91 4. MATERIALES Medios de cultivo Reactivos Materiales* Bilis verde brillante lactosa Coloracin de gram Homogenizador con durham A. EMB Reactivo de Kovacs Balanza A. leche Plasma fresco Cuchillos-cucharas Agua peptona 0.1% Griess Incubadora Agua triptona Alfa naftol Pipetas 1 y 10mL Agar Baird Parker KOH 40% Asa bacteriolgica Agar Hecktoen Rojo de metilo Bolsas de polipropileno Agar BPLS Peroxido hidrogeno 3% Gradilla Caldo tetrationato de sodio Oxidasa Tubos de ensayo Caldo selenite- cistina Cajas de petri Caldo nitrato Caldo MR-VP Agar citrato Agar urea Agar kligler Agar Lia Infusin cerebro corazn Agar plate count Agar SPS Caldo tioglicolato Agar gelatina Algodn y alcohol al 70% 5. PROCEDIMIENTO De acuerdo al producto a analizar 6. INVESTIGACIN Cules son las barreras naturales al crecimiento de los microorganismos que presentan las bebidas? 7. BIBLIOGRAFA 1. ACOSTA de GUEVARA Emma y GONZALEZ ORTIZ Lucy. Fundamentos para el anlisis microbiolgico de los alimentos. Barranquilla, 1995. 99. 2. ICMSF. Microorganismos de los alimentos. Tcnicas de anlisis Microbiolgico. Vol. 1, 2da edicin, Editorial Acribia. Zaragoza, Espaa, 1984. 3. MINISTERIO DE SALUD. Instituto Nacional de Salud. Anlisis Microbiolgico de Alimentos. Serie de Publicaciones cientficas No. 10 Santa fe de Bogot, 1998. 92 8. NECESIDADES PARA EL LABORATORIO Todos los grupos deben traer: Fsforo para encender el mechero, toallas absorbentes, Cinta para enmascarar, Marcador. Grupo 1: Cerveza Grupo 2: Aromtica Grupo 3: Caf Grupo 4: Refresco lquido en bolsa Grupo 5: Jugo 100. 93 UNIVERSIDAD DE CRDOBA FACULTAD DE CIENCIAS AGRCOLAS PROGRAMA DE INGENIERA DE ALIMENTOS MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS GUA N 27: MICROBIOLOGA DE AGUAS 1. INTRODUCCIN Segn el Invima los anlisis microbiolgicos que se le realizan a las bebidas son los siguientes: Agua

potable: 100oniformes totales y fecales. (Decreto 475/98). Agua potable envasada: Recuento de mesfilos aerobios y facultativos viables, 100oniformes totales y fecales y Pseudomona aeruginosa. (Resolucin 12186/91). 2. OBJETIVOS 1. Realizar NMP de 100oniformes totales y fecales a partir de agua potable. 2. Realizar recuento de microorganismos mesfilos aerobios y facultativos viables, 100oniformes totales y fecales a partir de agua envasada. 3. MATERIALES Medios de cultivo Reactivos Materiales* Caldo LMX / Fluorocult / Coloracin de gram Bolsas de polipropileno Readicult / Collilert Caldo casoy doble Reactivo de Kovacs Incubadora concentracin Caldo casoy concentracin Oxidasa Lmpara luz UV simple Agar cetrimide Solucin amortiguadora Asa bacteriolgica fosfato pH 7.2 Gradilla Tubos de ensayo Cajas de petri Pipetas 1 y 10mL Algodn y alcohol al 70% 101. 4. PROCEDIMIENTO De acuerdo al producto a analizar 5. INVESTIGACIN 94 1. Cules son los principales riesgos por el consumo de agua que no cumple con los criterios de potabilidad? 6. BIBLIOGRAFA 1. ACOSTA de GUEVARA Emma y GONZALEZ ORTIZ Lucy. Fundamentos para el anlisis microbiolgico de los alimentos. Barranquilla, 1995. 2. ICMSF. Microorganismos de los alimentos. Tcnicas de anlisis Microbiolgico. Vol. 1, 2da edicin, Editorial Acribia. Zaragoza, Espaa, 1984. 3. MINISTERIO DE SALUD. Instituto Nacional de Salud. Anlisis Microbiolgico de Alimentos. Serie de Publicaciones cientficas No. 10 Santa fe de Bogot, 1998. 102. 95 ANEXO A: Divisin laboratorio de alimentos y bebidas alcohlicas-Laboratorio de Microbiologa de Alimentos INVIMA. 103. 96 ANEXO B: Normatividad relacionada con Alimentos A continuacin encontrar una recopilacin de normas relacionadas con productos alimenticios. CLASE DE NMERO AO DE EXPEDIDA TEMA PRINCIPAL NORMA ADOPCIN POR Reglamenta el sacrificio de animales de abasto pblico 2278 Ministerio de Decreto 1982 para consumo humano, Ver Salud procesamiento, transporte y comercializacin de su carne. Se establecen las normas de 2106 Ministerio de identidad y pureza de los Decreto 1983 Ver Salud endulcolorantes utilizados en los productos alimenticios. Regula la produccin, 2162 Ministerio de procesamiento, transporte y Decreto 1983 Ver Salud expendio de los productos crnicos procesados. Regula la produccin, 2437 Ministerio de Decreto 1983 procesamiento, transporte y Ver Salud comercializacin de la leche. Regula la captura, 561 Ministerio de procesamiento, transporte y Decreto 1984 Ver Salud expendio de los productos de la pesca. Reglamenta la sanidad 1601 Minsalud y portuaria y vigilancia Decreto 1984 Ver Mintransporte epidemiolgica en naves y vehculos terrestres. Subrogase el Captulo 1 del 1036 Ministerio de Decreto 1991 Ttulo 1 del Decreto No 2278 Ver Salud de agosto 2 de 1982 Reglamenta la comercializacin y publicidad de los alimentos 1397 Ministerio de Decreto 1992 de frmula, para lactantes y Ver Salud complementarios de la leche materna. Por la cual se dictan normas referentes a la composicin, 2229 Ministerio de Decreto 1994 requisitos y comercializacin de Ver Salud las Bebidas Hidratantes Energticas para Deportistas. 104. Regula las condiciones sanitarias de produccin, 547 Ministerio de Decreto 1996 empaque y comercializacin, al Ver Salud control de la sal para consumo humano. Reglamenta la fortificacin de la harina de trigo y se 1944 Ministerio de Decreto 1996 establecen las condiciones de Ver Salud comercializacin, rotulado, vigilancia y control. 2131 Ministerio de Disposiciones sobre productos Decreto Ver 1997 Salud crnicos procesados. Regula las actividades de fabricacin, procesamiento, preparacin, envase, 3075 Ministerio de Decreto 1997 almacenamiento, transporte, Ver Salud distribucin y comercializacin de alimentos en el territorio nacional. Modifica algunos artculos del 476 Minsalud y Decreto 1998 Decreto 2437/83 y deroga el Ver Minagricultura Decreto 2473/86 sobre leches. Modifica los artculos 23 y 24 698 Minsalud y Decreto 1998 del decreto 547 de 1998 sobre Ver Minagricultura la sal para consumo humano. Crea el Comit Nacional del 977 Minsalud y Decreto 1998 CODEX alimentarios y se fijan Ver Mindesarrollo sus funciones. Reglamenta la expedicin de 612 Ministerio de registros sanitarios Decreto 2000 Ver Salud automticos para alimentos, cosmticos y productos varios. Por el cual se promueve la aplicacin del sistema de anlisis de peligros y puntos de 60 Ministerio de Decreto 2002 control crtico HACCP en las Ver Salud fbricas de alimentos y se reglamenta el proceso de certificacin. 1270 Ministerio de Adiciona literal al artculo 50 Decreto 2002 Ver Salud del Decreto 3075 de 1997. Decreto 1175 2003 Ministerio de Por el cual se modifica Ver la Proteccin parcialmente el Decreto 3075 de Social 1997, especialmente lo relativo al artculo 65 - expedicin del certificado de inspeccin sanitaria para exportacin

Resolucin 126 1964 Ministerio de Regula la elaboracin y control Ver Salud de grasas y aceites comestibles para consumo humano. Resolucin 1287 1976 Ministerio de Norma sobre grasas y aceites 105. Ver Salud comestibles. Resolucin 4135 1976 Ministerio de Normas sobre alimentos Ver Salud procesados de base vegetal para uso infantil Por la cual se crea un comit provisional y un comit asesor 6328 Ministerio de para el estudio y aprobacin de Resolucin 1984 Ver Salud la publicidad o propaganda de los alimentos y bebidas alcohlicas. Norma con respecto al procesamiento, composicin, requisitos y comercializacin de 11488 Ministerio de Resolucin 1984 los alimentos infantiles, de los Ver Salud alimentos o bebidas enriquecidos y de los alimentos o bebidas de uso diettico. Se reglamenta las caractersticas organolpticas 15789 Ministerio de Resolucin 1984 fsico qumicas y Ver Salud microbiolgicas de las mermeladas y jaleas de frutas. Se reglamenta las caractersticas organolpticas 15790 Ministerio de Resolucin 1984 fsico qumicas y Ver Salud microbiolgicas de los derivados del tomate. Resolucin 17855 1984 Ministerio de Recomendaciones diarias de Ver Salud consumo de caloras y nutrientes. Resolucin 10593 1985 Ministerio de Lista de colorantes permitidos Ver Salud en la Industria alimentaria Resolucin 13402 1985 Ministerio de Modifica la resolucin 10593 de Ver Salud 1985. Resolucin 16078 1985 Ministerio de Reglamenta Laboratorios de Ver Salud control de calidad de alimentos. Resolucin 17882 1985 Ministerio de Regula los alimentos Ver Salud relacionados con la mayonesa, su elaboracin, conservacin y comercializacin. Resolucin 19021 1985 Ministerio de Regula lo concerniente a la Ver Salud mostaza, su elaboracin, conservacin y comercializacin. Regula lo concerniente a procesamiento, composicin, 2310 Ministerio de Resolucin 1986 requisitos, transporte y Ver Salud comercializacin de los derivados lcteos. 106. Resolucin 9553 1988 Ministerio de Identificacin a los empaques y Ver Salud envases de la sal para consumo humano. Resolucin 1804 1989 Ministerio de Por la cual se modifica la Ver Salud resolucion la Resolucin 2310 de 1986. Resolucin 11961 1989 Ministerio de Modifica parcialmente la Ver Salud resolucin nmero 2310 del 24 de febrero de 1986. Resolucin 222 1990 Ministerio de Por la cual se declaran aptos Ver Salud los equinos como animales de abasto pblico en el territorio nacional. Resolucin 1618 1991 Ministerio de Por la cual se modifica la Ver Salud Resolucin 11488 de 1984 en en lo que se refiere al aspartame como endulcolorante artificial. Resolucin 4124 1991 Ministerio de Regula lo concerniente a los Ver Salud antioxidantes que se pueden utilizar en los alimentos. Resolucin 4125 1991 Ministerio de Regula lo referente a los Ver Salud conservantes que se pueden utilizar en alimentos. Resolucin 4126 1991 Ministerio de Regula lo relacionado a los Ver Salud acidulantes, alcalinizantes, reguladores de pH de la acidez utilizados en los alimentos. Resolucin 4241 1991 Ministerio de Por la cual se definen las Ver Salud caracterstiscas de las especies o condimentos vegetales y se dictan normas sanitarias y de calidad de estos productos y de sus mezclas. Resolucin 4393 1991 Ministerio de Regula la fabricacin, empaque Ver Salud y comercializacin de pastas alimenticias. Resolucin 7992 1991 Ministerio de Por la cual se reglamenta Ver Salud parcialmente lo relacionado con la elaboracin, conservacin y comercializacin de jugos, concentrados, nctares, pulpas, pulpas azucaradas y refrescos de frutas. Resolucin 12186 1991 Ministerio de Por la cual se fijan las Ver Salud condiciones para los procesos de obtencin, envasado y comercializacin de agua potable tratada, con destino al consumo humano. Por la cual se establece una 5213 Minsalud - Resolucin 1992 delegacin de los vistos buenos Ver Mincomex en los registros de importacin 107. a los productos alimenticios elaborados o procesados en el exterior. Resolucin 604 1993 Ministerio de Regula condiciones sanitarias Ver Salud de las ventas de alimento en la va pblica. Resolucin 2284 1995 Ministerio de Establece las medidas Ver Salud sanitarias sobre produccin, elaboracin y comercializacin de la panela. Resolucion 19304 1995 Ministerio de Elaboracion y control de grasas Ver Salud y aceites comestibles para el consumo humano Resolucin 580 1996 Ministerio de Modifica la resolucin 10593 de Ver Salud 1985 en el sentido de hacer obligatorio la declaracin expresa de tartrazina. Resolucin 599 1998 INVIMA Por la cual se adopta el Ver formulario nico para solicitud, modificacin y renovacin del Registro Sanitario para los productos alimenticios y se establece la nomenclatura para la expedicin de Registro Sanitario de los alimentos de fabricacin nacional y de los importados. Resolucin 730 1998 Ministerio de Por la cual se adopta el Ver Salud Sistema de Anlisis de Riesgos y Puntos Crticos de control HACCP en los productos pesqueros y acucolas. Resolucin 4547 1998 Ministerio de Define los exmenes de Ver Salud laboratorio en alimentos y bebidas alcohlicas en salud pblica, departamentales y distritales, los laboratorios clnicos y

los laboratorios de citohistopatologa. Resolucin 2387 1999 Ministerio de Por la cual se oficializa la Ver Salud norma tcnica colombiana NTC 512-1 relacionada con el rotulado de alimentos. Resolucin 260576 2000 INVIMA Mediante la cual se derogan las Ver Resoluciones 238148/99 y 248903/99. Registros Sanitario de Panela Resolucin 1893 2001 Ministerio de Incentivos promocionales en Ver Salud alimentos. Resolucin 402 2002 Ministerio de Por la cual se establecen los Ver Salud requisitos para la 108. comercializacin de las aves beneficiadas enteras, despresadas y/o deshuesadas que se someten a la tcnica de marinado. Prohibir BROMATO DE POTASIO 1528 Ministerio de para uso alimentario o en Resolucin 2002 Ver Salud tratamiento de la cebada para Bebidas Alcohlicas Por la cual se modifica la 1987 Resolucin 2002 ICA Resolucin 1746 del 23 de julio Ver de 2002 Resolucin 2012 2002 ICA Por la cual se prorroga la Ver suspensin de la expedicin de Documentos Zoosanitarios para la Importacin de bovinos, porcinos, dems especies susceptibles y sus productos de riesgo desde Ecuador Resolucin 16563 2002 INVIMA Por la cual se establecen los Ver requisitos sanitarios para la aprobacin de las licencias y registros de importacin del azcar de caa o de remolacha azucarera en estado slido. Establece requisitos para 2002001697 aprobacin de Registros de Resolucin 2002 INVIMA Ver Importacin a la leche en polvo y derivados lcteos en polvo Se adoptan unos conceptos y 2002007893 recomendaciones de la Sala Resolucin 2002 INVIMA Ver Especializada de Alimentos y Bebidas Alcohlicas Resolucin 2002011308 2002 INVIMA Se adoptan unos conceptos y Ver recomendaciones de la Sala Especializada de Alimentos y Bebidas Alcohlicas Acuerdo Ver 2003 Acciones conjuntas para controlar la fabricacin ilegal de la panela Circular DG-0100-19 2002 INVIMA Aplicacin y cumplimiento de la 6 Resolucin 0402 de 2002. Pollo Ver Marinado Norma NTC 512-1 Cuarta Industrias Alimentarias Tcnica Ver Actualizacin Rotulado