QuantiFERON -TB

Gold
(Metoda n tub)
Test IFN-gamma al sngelui total Msurarea rspunsurilor la antigenele peptidice ESAT-6, CFP-10 & TB7.7(p.4)

Prospect
Utilizare pentru Diagnostic In Vitro

CUPRINS
1. UTILIZARE INTENIONAT 2. REZUMATUL I EXPLICAIA TESTULUI Principiile dozrii Timpul necesar pentru efectuarea dozrii 3. REACTIVII I MODUL DE PSTRARE Materiale necesare (dar nu furnizate) Instruciuni de pstrare Tuburile de colectare a sngelui Reactivii Kit-ului Reactivii reconstituii i neutilizai 4. ATENIONRI I PRECAUII Atenionri Precauii 5. COLECTAREA I MANIPULAREA PROBEI 6. INSTRUCIUNI PENTRU UTILIZARE STADIUL NTI Incubarea sngelui i recoltarea plasmei STADIUL DOI IFN- Uman - ELISA 7. CALCULE I INTERPRETAREA TESTULUI Obinerea curbei standard Controlul calitii testului Interpretarea rezultatelor 8. LIMITRI 9. CARACTERISTICILE PERFORMANEI 10. INFORMAII TEHNICE Rezultate nedefinite Probele de plasm coagulat Probleme de trasare ELISA Dezvoltarea nespecific a coloraiei Citiri pentru standarde cu densitate optic mic Background ridicat Curba standard neliniar i variabilitatea duplicatului 11. BIBLIOGRAFIE 12. SERVICII TEHNICE 13. PROCEDURA DE TESTARE REZUMAT 3 3 5 5 6 6 7 7 7 7 8 8 9 10 11 11 12 16 16 17 18 22 22 25 25 25 26 26 26 27 27 28 30 31

1. UTILIZARE INTENIONAT
QuantiFERON-TB Gold In-Tube (IT) este un test pentru diagnostic in vitro, care utilizeaz un cocktail de peptide: ESAT-6, CFP-10 i TB7.7(p4) care stimuleaza celulele din sngele ntreg heparinizat. Detecia -interferonului (IFN-) prin Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) este utilizat pentru identificarea rspunsurilor in vitro la aceste antigene peptide care sunt asociate cu infecia cu Mycobacterium tuberculosis. QuantiFERON-TB Gold IT este un test indirect pentru infecia cu M. tuberculosis (inclusiv boala) i este destinat utilizrii n acociaie cu evaluarea riscului, radiografie i alte evaluri medicale i de diagnostic.

2. REZUMATUL I EXPLICAIA TESTULUI

Tuberculoza este o boal transmisibil, cauzat de infecia cu organismele complexe M. tuberculosis (M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum), care n mod normal se mprtie la noi gazde, prin picturi ce conin nuclei care se mprtie n aer de la pacienii cu tuberculoz. Un individ nou infectat poate deveni bolnav de tuberculoz n decurs de sptmni pna la luni, dar majoritatea indivizilor infectai rmn n stare de infectie latenta. Infecia latent de tuberculoz (ILTB), o stare asimptomatic netransmisibil, persist la unii indivizi, care pot dezvolta boala de tuberculoz mai trziu, dup luni sau ani. Scopul principal al diagnosticrii ILTB este s ia n consideraie tratamentul medical pentru prevenirea tuberculozei. Pn recent, testul dermatologic de tuberculin (TDT) a fost singura metod disponibil pentru diagnosticarea ILTB. Sensibilitatea cutanat la tuberculin apare de la 2 pn la 10 sptmni dup infectare. Oricum, unii indivizi infectai, incluznd pe aceia cu un interval larg de condiii ce mpiedic funciile imunitare dar, de asemenea, i ceilali fr aceste condiii, nu rspund la tuberculin. Dimpotriv, unii indivizi pentru care este puin probabil s aibe infecie cu M. tuberculosis manifest sensibilitate la tuberculin i au rezultate TDT pozitive dup vaccinarea cu bacil Calmette-Gurin (BCG), infecie cu mycobacteria, alta dect complexul M. tuberculosis, sau ali factori nedeterminai. ILTB trebuie deosebit de boal de tuberculoz, o stare raportabil care, de obicei, implic plmnii i tractul respirator inferior, dei i alte sisteme de organ pot fi, de asemenea, infectate. Boala de tuberculoz este diagnosticat de rezultate istorice, fizice, radiologice, histologice i micobacteriologice. Testul QuantiFERON-TB Gold IT este un test pentru rspunsurile celulare imun-mediate (CIM) la antigenele peptidice care stimuleaz proteinele micobacteriene. Aceste proteine, ESAT-6, CFP-10 i TB7.7(p4), sunt absente din toate suele BCG i din majoritatea micobacteriilor non-tuberculoz, cu excepia M. kansasii, M. szulgai i M. marinum.1 Indivizii infectai cu organismele complexului M. tuberculosis au de obicei limfocite n sngele lor, care le recunosc pe acestea i alte antigene micobacteriene. Acest proces de recunoatere implic generarea i secreia citokinei, IFN-. Detecia i cuantificarea ulterioar a IFN- st la baza acestui test.

Antigenele utilizate n QuantiFERON-TB Gold IT sunt un cocktail de peptide ce stimuleaz proteinele ESAT-6, CFP-10 i TB7.7 (p4). Numeroase studii au demonstrat c aceste antigene peptide stimuleaz rspunsurile IFN- n celulele T ale indivizilor infectai cu M. tuberculosis, dar n general nu la persoanele neinfectate sau la cele vaccinate cu BCG fr boal sau risc de ILTB.1-34 Oricum, tratamentele medicale sau condiiile care reduc funcionalitatea imunitar pot reduce potenial rspunsurile IFN-. Pacienii cu alte anumite infecii micobacteriene pot fi de asemenea sensibili la ESAT-6, CFP-10 i TB7.7 (p4), deoarece genele care codific aceste proteine sunt prezente n M. kansasii, M. 1,22 szulgai i M. marinum. Testul QuantiFERON -TB Gold IT este un test pentru ILTB ct i un ajutor preios pentru diagnosticarea infeciei complexe cu M. tuberculosis la pacienii bolnavi. Un rezultat pozitiv susine diagnosticul de boal de tuberculoz; oricum, infeciile cu alte micobacterii (de ex.., M. kansasii) pot de asemenea s determine rezultate pozitive. Alte evaluri medicale i de diagnosticare sunt necesare pentru confirmarea sau excluderea bolii de tuberculoz.

Principiile dozrii
Sistemul QuantiFERON-TB Gold IT utilizeaz tuburi de colectare a sngelui specializate, care sunt utilizate pentru colectarea sngelui integral. Incubarea sngelui are loc n tuburi, timp de 16 pn la 24 de ore, dup care plasma este recoltat i testat pentru prezena IFN-, produs ca rspuns la antigenele peptide. Testul QuantiFERON-TB Gold IT este efectuat n dou etape. nti, sngele ntreg este colectat n fiecare din tuburile QuantiFERON-TB Gold de colectare a sngelui, care includ un tub de control Nil, un tub Antigen TB i un tub Mitogen, opional. Tubul Mitogen poate fi utilizat cu testul QuantiFERON-TB Gold IT, ca un control pozitiv. Acesta poate fi n special util n cazul n care exist un dubiu referitor la starea imunitar a individului. Tubul Mitogen servete, de asemenea, ca un control pentru corecta manipulare i incubare a sngelui. Tuburile trebuie incubate la 37C ct mai repede posibil maxim la 16 ore de la colectare. Dup o perioad de incubare de 16 pn la 24 de ore, tuburile sunt centrifugate, plasma este ndeprtat, iar cantitatea de IFN- (UI/mL) msurat de testul ELISA. Un test este considerat pozitiv pentru rspunsul la tubul Antigen TB dac este semnificativ peste valoarea IFN- UI/mL din tubul Nil. Dac este utilizat, proba de plasm Mitogen-stimulat servete ca un control pozitiv de IFN- pentru fiecare prob testat. Un rspuns sczut la Mitogen (<0,5 UI/mL) indic un rezultat nedeterminat dac o prob de snge are de asemenea rspuns negative la antigenele TB. Acest model poate apare cu limfocite insuficiente, datrit activitii limfocitare reduse ca urmare a manipulrii necorespunztoare a probei, datorit umplerii/omogenizrii incorecte a tubului Mitogen, sau a incapacitii limfocitelor pacientului de a produce IFN-. Proba Nil ajusteaz fundalul, efectele anticorpului heterofil, sau IFN- nespecific n probele de snge. Concentraia IFN- din tubul Nil este sczut din concentraia IFN- din tubul Antigen TB i tubul Mitogen (dac este utilizat).

Timpul necesar pentru efectuarea dozrii

Timpul necesar pentru efectuarea dozrii QuantiFERON-TB Gold IT este estimat mai jos; timpul testrii probelor multiple dac sunt numrate este, de asemenea, indicat: Incubarea tuburilor cu snge la 37C: ELISA: 16-24 ore Aprox. 3 ore pentru o plac ELISA (28 pn la 44 indivizi) <1 o or de munc Se adaug 10-15 minute pentru fiecare extra plac

3. REACTIVII I MODUL DE PSTRARE

Tuburile de colectare a sngelui Tuberculoz i Control Antigen Numr de Catalog: 0590 0301 1. Control Nil (capac Gri) 2. Antigen TB (capac Rou) 3. Control Mitogen (capac Mov) NOT: Tuburile sunt disponibile i n alte configuraii: No.de catalog 0590-0201: 100 x Control Nil, 100 x tuburi cu Antigene TB. No.de catalog. 0593 0201: 100 x tuburi cu Control Mitogen. Tuburi pentru nalt altitudine (a se vedea seciunea 5) No.de catalog 0590 0501: (Altitudine nalt) 100 x Control Nil, 100 x tuburi Antigen TB. No.de catalog 0590 0505: (Altitudine nalt) 100 x Control Nil, 100 x TB Antigen & 100 x Mitogen. No. De catalog T0593 0501 (Altitudine nalt) 100 x tuburi Control Mitogen. 100 x tuburi 100 x tuburi 100 x tuburi

Componenete ELISA Numr de Catalog: 0594 0201 1. Benzi Microplci 24 x 8 lcauri 2. Standard IFN- Uman, liofilizat 1 x flacon 3. Diluant Verde 1 x 30mL 4. Conjugat 100X Concentrat, liofilizat 1 x 0.3mL 5. Ap tampon 20X Concentrat 1 x 100mL 6. Soluie Substrat Enzim 1 x 30mL 7. Soluie de oprire a Enzimei 1 x l5mL

Materiale necesare (dar nu furnizate)

Incubator 37C. CO2 nu este necesar. Pipete calibrate de volum variabil pentru eliberarea a 10 L pn la 1000 L, cu capetele de unic folosin. Pipet multicanal calibrat capabil s elibereze 50 L i 100 L, cu capetele de unic folosin. Omogenizator microplac. Ap deionizat sau distilat - 2L. Spltor microplac (este recomandat spltor automat). Cititor microplac cuplat cu filtrul 450nm i 620nm la filtrul de referin 650nm.

Instruciuni de pstrare Tuburile de colectare a sngelui

Tuburile de colectarea a sngelui se pstreaz la 4C pn la 25C. Termenul de valabilitate al tuburilor de colectare a sngelui QuantiFERON-TB Gold este de 15 luni de la data fabricrii, dac sunt pstrate la 4C pn la 25C.

Reactivii Kit-ului
Kit-ul se pstreaz la frigider, la 2C pn la 8C. A se feri ntotdeauna Soluia Substrat Enzim de lumina solar direct. Termenul de valabilitate al kit-ului ELISA QuantiFERON-TB Gold este de 3 ani de la data fabricrii, dac se pstreaz la 4C pn la 8C.

Reactivii reconstituii i neutilizai

Pentru instruciuni privind modul de reconstituire a reactivilor, v rugm s vedei Seciunea 6 (pagina 11). Kit-ul Standard reconstituit poate fi pstrat pn la 3 luni, dac este pstrat la 2C pn la 8C. Notai data la care Kit-ul Standard a fost reconstituit. Odat reconstituit, Concentratul Conjugate 100X neutilizat trebuie n continuare pstrat la 2C pn la 8C i trebuie, de asemenea, utilizat n decurs de 3 luni. Notai data la care Conjugatul a fost reconstituit. Concentraia de lucru a Conjugatului trebuie utilizat n decurs de 6 ore de la preparare. Concentraia de lucru a Apei Tampon poate fi pstrat la temperature camerei pn la 2 sptmni.

4. ATENIONRI I PRECAUII Atenionri

Un rezultat negativ al testului QuantiFERON-TB Gold IT nu exclude posibilitatea infeciei cu M. tuberculosis sau a bolii de tuberculoz: rezultatele false-negative pot fi datorate stadiului infeciei (de ex., proba obinut nainte de apariia rspunsului imunitar celular), condiii co-morbide care afecteaz funciile imunitare, incorecta manipulare a tuburilor de colectare a sngelui dup venopunctur, efectuarea incorect a dozrii, sau alte variaii imunologice. Un rezultat pozitiv al testului QuantiFERON-TB Gold IT nu trebuie s reprezinte singura i definitiva baz pentru determinarea infeciei cu M. tuberculosis. Efectuarea incorect a dozrii poate determina rspunsuri fals pozitive. Un rezultat pozitiv al testului QuantiFERON-TB Gold IT trebuie urmat de o evaluare medical ulterioar i o evaluare a diagnosticului pentru boala activ de tuberculoz (de ex., frotiu i cultur AFB, radiografie pulmonar). n timp ce ESAT-6, CFP-10 i TB7.7(p4) sunt absente din toate tulpinile BCG i din majoritatea micobacteriilor ne-tuberculoase cunoscute, este posibil ca un rezultat pozitiv al testului QuantiFERON-TB Gold IT s poat fi datorat infeciei cu M. kansasii, M. szulgai or M. marinum. Dac sunt suspectate astfel de infecii, trebuie effectuate teste alternative.

Precauii
Test pentru diagnosticare in vitro. Duntor: Soluia Substrat de Enzim conine 3,3`,5,5`Tetrametilbenzidin, care este duntoare prin ingestie, inhalare sau la contactul cu pielea. Iritant pentru piele i ochi. Mutagen. Utilizai msuri de protecie a ochilor, purtai mnui i manipulai soluia ca un potenial carcinogen. Duntor: Soluia de Oprire a Enzimei conine H2SO4, care este duntor prin ingestie, la contactul cu ochii, contactul cu pielea i prin inhalare. Utilizai msuri de protecie a ochilor, purtai mnui i utilizai halatele normale de laborator pentru protecie. Dac soluia de Oprire a Enzimei intr n contact cu pielea sau cu ochii, splai bine zona afectat cu ap i apoi consultai medicul. Duntor: Standardul IFN- i Concentratul de Conjugat 100X pot produce discomfort dac sunt ingerate i pot produce iritaii ale pielii. Purtai mnui i utilizai halatele normale de laborator pentru protecie. Manipulai sngele uman ca i cum ar fi potenial infecios. inei seama de ghidurile relevante de manipulare a sngelui. Timerosalul este utilizat ca i conservant n unii reactivi. El poate fi toxic dup ingestie, inhalare sau la contactul cu pielea. Diluantul Verde conine n mod normal ser obinut de la oareci i cazein, care poate declana rspunsuri alergice; evitai contactul cu pielea. Deviaiile de la modul de utilizare specificat n Prospect pot determina obinerea rezultatelor eronate. V rugm s citii cu atenie instruciunile nainte de utilizarea testului. Nu utilizai kit-ul dac vreunul din flacoanele cu reactive prezint semen de deteriorare sau scurgere nainte de utilizarea acestora. Nu amestecai sau nu utilizai reactivi ELISA din alte serii de kit-uri QuantiFERON-TB Gold. Eliminai reactivii neutilizai i probele biologice conform reglementrilor locale naionale sau federale. Nu utilizai tuburile de colectare a sngelui sau kit-ul ELISA kit dup data de expirare.

5. COLECTAREA I MANIPULAREA PROBEI

Testul QuantiFERON-TB Gold IT utilizeaz urmtoarele tuburi de colectare:
1. 2. 3.

Control Nil (Capac gri cu inel alb) ( a se utiliza ntre nivelul mrii i 810m) Antigen TB (Capac rou cu inel alb) (a se utiliza ntre nivelul mrii i 810m) Control Mitogen - opional (Capac mov cu inel alb) (a se utiliza ntre nivelul mrii i 810m) Control Nil (Capac gri cu inel galben) (a se utiliza ntre 1,020m i 1,875m) Antigen TB (Capac rou cu inel galben) (a se utiliza ntre 1,020m i 1,875m) Control Mitogen - opional (Capac mov cu inel galben) (a se utiliza ntre 1,020m i 1,875m)

4. 5. 6.

Antigenele au fost uscate n peretele interior al tuburilor de colectare a sngelui, astfel nct este esenial ca, coninutul tuburilor s fie viguros omogenizat su sngele. Tuburile trebuie transferate ntr-un incubator la 37C, ct mai repede posibil (maxim 16 ore de la colectare). Pentru obinerea rezultatelor optime trebuie respectate urmtoarele proceduri: 1. Pentru fiecare subiect se colecteaz 1mL de snge prin venopunctur, direct n fiecare tub de colectare a sngelui din testul QuantiFERON-TB Gold IT. Deoarece din tuburile de 1mL sngele se extrage relativ ncet, pstrai tubul n ac timp de 2-3 secunde dup ce tubul pare s fie complet umplut, pentru a fi siguri c este extras volumul corect. Semnul negru de o parte a tuburilor indic volumul de umplere de 1mL. Tuburile de colectare a sngelui testului QuantiFERON-TB Gold au fost validate pentru volume de la 0,8 pn la 1,2mL. Dac nivelul sngelui n oricare tub nu este aproape de linia indicatoare, se recomand s se obin o alt prob de snge. Dac se utilizeaz un ac fluture pentru colectarea sngelui, trebuie utilizat un tub de epurare, pentru a asigura c tubul este umplut cu snge nainte ca tuburile QuantiFERON-TB Gold s fie utilizate. 2. Se amestec prin agitare puternic n sus i n jos de 10 ori, pentru a fi sigur c ntreaga suprafa interioar a tubului a fost acoperit cu snge. Este necesar omogenizarea puternic, pentru a asigura omogenizarea complet a sngelui cu coninuturile tubului. 3. Etichetai adecvat tuburile. 4. Tuburile trebuie transferate n incubator la 37C ct mai repede posibil i n decurs de 16 ore de la colectare. Nu pstrai la frigider sau nu congelai probele de snge. Dac sngele nu este incubat imediat dup colectare, agitarea tuburilor trebuie repetat imediat nainte de incubare. 10

6. INSTRUCIUNI PENTRU UTILIZARE

Stadiul nti Incubarea sngelui i recoltarea plasmei

Materiale furnizate
Tuburile de colectare a sngelui QuantiFERON-TB Gold IT (vezi Seciunea 3).

Materiale necesare (dar nu furnizate)

Vezi Seciunea 3.

Procedura
1. Dac sngele nu este incubat imediat dup colectare, agitarea tuburilor trebuie repetat imediat nainte de incubare, dup cum este descris n Seciunea 5. 2. Se incubeaz tuburile N POZIIE VERTICAL, la 37C, timp de 16 pn la 24 ore. Incubatorul nu necesit CO2 sau umidificare. 3. Dup incubare la 37C, tuburile de colectare a sngelui pot fi pstrate ntre 2C i 27C, pn la 3 zile nainte de centrifugare. 4. Dup incubarea tuburilor la 37C, recoltarea plasmei este facilitat de centrifugarea tuburilor timp de 15 minute la 2000 pn la 3000 RCF (g). Dopul de gel va separa celulele de plasm. Dac aceasta nu se ntmpl, tuburile trebuie recentrifugate la o vitez mare. Este posibil s se recolteze plasma fr centrifugare, oricum, este necesar o precauie suplimentar pentru ndeprtarea plasmei fr distrugerea celulelor. 5. Probele de plasm pot fi ncrcate direct din tuburile de colectare a sngelui n placa ELISA a testului QuantiFERON-TB Gold, n special dac sunt utilizate staii de lucru ELISA automate. 6. Alternativ, probele de plasm pot fi pstrate nainte de ELISA, fie n tuburile centrifugate, fie colectate n flacoanele de pstrare a plasmei. De exemplu, se recolteaz >150L n microplci cu lcauri sau n microtuburi n stativ n format cu 96 de lcauri i astupate pentru a preveni revrsrile i evaporarea n cazul n care probele trebuie s fie pstrate. Probele de plasm pot fi pstrate pn la 4 sptmni la 2C pn la 8C sau sub 20C (de preferin la mai puin dect70C) pentru perioade extinse.

11

Stadiul doi - IFN- uman ELISA

Materiale furnizate
Kit-ul ELISA QuantiFERON-TB Gold (vezi Seciunea 3).

Materiale necesare (dar nu furnizate)

Vezi Seciunea 3.

Procedura
1. Toate probele de plasm i reactivii, cu excepia Concentratului Conjugat 100X, trebuie aduse la temperature camerei (22C 5C) nainte de utilizare. Lasai-le cel puin 60 de minute pentru echilibrare. 2. ndeprtai benzile care nu sunt necesare din cadru, reambalai-le n folia pungu i reintroducei-le n frigider, pentru pstrare pn cnd este necesar. Alocai cel puin o band pentru standardele QuantiFERON-TB Gold i suficiente benzi pentru numrul de subieci care trebuie testai (vezi Figurile 2A & 2B pentru formatele 2tub i respectiv 3-tub). Dup utilizare, pstrai cadrul i capacul pentru utilizare cu benzile rmase. 3. Reconstituii Kit-ul Standard liofilizat cu volumul de ap deionizat sau distilat indicat pe eticheta flaconului Standard. Amestecai uor pentru minimizarea spumrii i asigurarea solubilizrii complete. Reconstituirea Standardului la volumul declarat va produce o soluie cu o concentraie de 8,0 UI/mL. Not: Volumul de reconstituire a Kit-ului Standard va diferi ntre serii. Utilizai Kit-ul Standard reconstituit pentru a obine serii de diluie 1 la 4 de IFN- n Diluantul Verde (DV) vezi Figura 1. S1 (Standard 1) conine 4 UI/mL, S2 (Standard 2) conine 1 UI/mL, S3 (Standard 3) conine 0,25 UI/mL, iar S4 (Standard 4) conine 0 UI/mL (doar DV). Standardele trebuie dozate cel puin n duplicat. PROCEDURA RECOMANDAT PENTRU STANDARDELE DUPLICAT a. Etichetai 4 tuburi cu S1, S2, S3, S4. b. Adugai 150L de DV n S1, S2, S3, S4. c. Adugai 150L de Kit Standard n S1 i amestecai viguros. d. Transferai 50L din S1 n S2 i amestecai viguros. e. Transferai 50L din S2 n S3 i amestecai viguros. f. Doar DV servete ca standard zero (S4). PROCEDURA RECOMANDAT PENTRU STANDARDELE TRIPLICAT a. Etichetai 4 tuburi cu S1, S2, S3, S4. b. Adugai 150L de DV n S1. c. Adugai 210L de DV n S2, S3, S4. d. Adugai 150L de Kit Standard n S1 i amestecai viguros.. e. Transferai 70L din S1 n S2 i amestecai viguros. f. Transferai 70L din S2 n S3 i amestecai viguros. g. Doar DV servete ca standard zero (S4).

12

FIGURA 1. Prepararea Curbei Standard 150 L 50 sau 70 L 50 sau 70 L

S1

S2

S3

S4

(Kit Standard) 8.0 UI/mL

Standard 1 4.0 UI/mL

Standard 2 1.0 UI/mL

Standard 3 0.25 UI/mL

Standard 4 0 UI/mL (GD ONLY)

Preparai diluii proaspete de Kit Standard pentru fiecare repriz ELISA. 4. Reconstituii liofilizatul de Concentrat Conjugat 100X cu 0,3mL ap deionizat sau distilat. Amestecai uor pentru minimizarea spumrii i pentru asigurarea solubilizrii complete a Conjugatului. Concentraia de lucru a conjugatului se prepar prin diluarea cantitii necesare de Concentrat Conjugat 100X n Diluant Verde, dup cum este specificat n Tabelul 1 Prepararea Conjugatului.

TABELUL 1. Prepararea Conjugatului NUMRUL DE BENZI 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 VOLUMUL DE CONCENTRAT CONJUGAT 100X 10L 15L 20L 25L 30L 35L 40L 45L 50L 55L 60L VOLUMUL DE DILUANT VERDE 1,0 mL 1,5 mL 2,0 mL 2,5 mL 3,0 mL 3,5 mL 4,0 mL 4,5 mL 5,0 mL 5,5 mL 6,0 mL

Amestecai bine dar cu atenie, pentru evitarea spumrii. Reintroducei orice Concentrat Conjugat 100X neutilizat la 2C pn la 8C, imediat dup utilizare. Utilizai doar Diluant Verde.

13

5. nainte de dozare, plasmele trebuie amestecate, pentru a fi sigur c IFN- este distribuit egal n ntreaga prob. 6. Adugai 50L de conjugat concentraie de lucru proaspt preparat n lcaurile necesare de ELISA utiliznd o pipet multicanal. 7. Adugai 50L din probele de plasm de testat n lcaurile adecvate utiliznd o pipet multicanal (vezi mai jos formatul recomandat al plcii Figurile 2A & 2B). n final, adugai 50L n fiecare dintre Standardele de la 1 la 4. FIGURA 2A. Formatul recomandat al probei pentru tuburile Nil & Antigen TB (44 de teste pentru o plac)
A B C D E F G H 1 1N 1A 2N 2A 3N 3A 4N 4A 2 5N 5A 6N 6A 7N 7A 8N 8A 3 9N 9A 10N 10A 11N 11A 12N 12A 4 13N 13A 14N 14A 15N 15A 16N 16A 5 17N 17A 18N 18A 19N 19A 20N 20A 6 S1 S2 S3 S4 21N 21A 22N 22A 7 S1 S2 S3 S4 23N 23A 24N 24A 8 25N 25A 26N 26A 27N 27A 28N 28A 9 29N 29A 30N 30A 31N 31A 32N 32A 10 33N 33A 34N 34A 35N 35A 36N 36A 11 37N 37A 38N 38A 39N 39A 40N 40A 12 41N 41A 42N 42A 43N 43A 44N 44A

S1 (Standard 1), S2 (Standard 2), S3 (Standard 3), S4 (Standard 4). 1N (Proba 1. plasm Control Nil); 1A (Proba 1. plasm Antigen TB).

FIGURA 2B. Formatul recomandat al probei pentru tuburile Nil, Antigen TB & Mitogen (28 de teste pentru o plac)
A B C D E F G H 1 1N 2N 3N 4N 5N 6N 7N 8N 2 1A 2A 3A 4A 5A 6A 7A 8A 3 1M 2M 3M 4M 5M 6M 7M 8M 4 S1 S2 S3 S4 9N 10N 11N 12N 5 S1 S2 S3 S4 9A 10A 11A 12A 6 S1 S2 S3 S4 9M 7 13N 14N 15N 16N 17N 8 13A 14A 15A 16A 17A 18A 19A 20A 9 13M 14M 15M 16M 17M 10 21N 22N 23N 24N 25N 11 21A 22A 23A 24A 25A 26A 27A 28A 12 21M 22M 23M 24M 25M 26M 27M 28M

10M 18N 11M 19N 12M 20N

18M 26N 19M 27N 20M 28N

S1 (Standard 1), S2 (Standard 2), S3 (Standard 3), S4 (Standard 4). 1N (Proba 1. plasm Control Nil); 1A (Proba 1. plasm Antigen TB); 1M (Proba 1. plasm Control Mitogen).

14

8. Amestecai conjugatul i probele de plasm/standarde viguros, utiliznd o microplac agitator, timp de1 minut. 9. Acoperii fiecare plac cu capac i incubai la temperature camerei (22C 5C) timp de 120 5 minute. Plcile nu trebuie expuse la lumin solar direct n timpul incubrii. 10. n timpul incubrii, diluai o parte Ap tampon 20X Concentrat cu 19 pri ap deionizat sau distilat i agitai viguros. S-a furnizat suficient Ap tampon 20X Concentrat pentru a prepara 2L de Concentraie de lucru ap tampon. Splai lcaurile cu 400L of Concentraie de lucru ap tampon pentru cel puin 6 cicluri. Este recomandat o plac pentru splare automat. Splarea complet este foarte important pentru efectuarea dozrii. Asigurai-v c fiecare lca este umplut complet cu ap tampon pn la vrful lcaului pentru fiecare ciclu de splare. Este recomandat o perioad de nmuiere de cel puin 5 secunde ntre fiecare ciclu. La rezervorul efluent trebuie adugat dezinfectant standard de laborator, iar pentru decontaminarea materialului potenial infecios trebuie urmate procedurile stabilite. 11. Lovii uor plcile cu faa n jos pe prosopul absorbant pentru a ndeprta apa tampon rezidual. Adugai 100L Soluie Substrat Enzim n fiecare lca i amestecai bine, utiliznd o microplac agitatoare. 12. Acoperii fiecare plac cu capac i incubai la temperature camerei (22C 5C) timp de 30 minute. Plcile nu trebuie expuse la lumin solar direct n timpul incubrii. 13. Dup 30 de minute de incubare, adugai 50L Soluie de Oprire a Enzimei n fiecare lca i amestecai. Soluia de Oprire a Enzimei trebuie adugat n lcauri n aceeai ordine i aproximativ la aceeai vitez ca i substratul din etapa 11. 14. Msurai Densitatea Optic (DO) a fiecrui lca n decurs de 5 minute de la terminarea reaciei, utiliznd un cititor microplac cuplat cu un filtru a 450nm i cu un filtru de referin a 620nm pn la 650nm. Valorile DOsunt utilizate pentru calcularea rezultatelor.

15

7. CALCULE I INTERPRETAREA TESTULUI

Software-ul pentru analiza testului QuantiFERON-TB Gold IT, utilizat pentru analiza datelor obinute i pentru calcularea rezultatelor este disponibil de la firma Cellestis. Software-ul efectueaz evaluarea controlului calitii dozrii, genereaz curba standard i furnizeaz rezultatul testului pentru fiecare subiect, aa cum este detaliat n seciunea Interpretarea rezultatelor. Ca o alternativ la utilizarea Software-ul pentru analiza testului QuantiFERON-TB Gold IT, rezultatele pot fi determinate conform urmtoarei metode:

Generarea Curbei Standard

(dac nu este utilizat Software-ul pentru analiza testului QuantiFERON-TB Gold) Determinai media valorilor DO a replicatelor Kit-ului Standard pe fiecare plac. Construii o curb standard log(e)-log(e), reprezentnd grafic log(e) mediei DO (Axa y) n funcie de log(e) concentraiei de IFN- a standardelor n UI/mL (Axa x), omind standardul zero din aceste calcule. Calculai linia care se potrivete cel mai bine pentru curba standard, prin analiza regresiei. Utilizai curba standard pentru determinarea concentraiei de IFN- (UI/mL) pentru fiecare din probele de plasm testate, utiliznd valoarea DO a fiecrei probe. Aceste calcule pot fi efectuate utiliznd pachetele software disponibile cu cititorii microplac, i program de lucru tabelar standard sau software statistic (cum este Microsoft Excel). Este recomandat ca aceste pachete s fie utilizate pentru a calcula analiza regresiei, coeficientul de variation (CV%) pentru standardse i coeficientul de corelare (r) al curbei.

16

Controlul calitaii Testului

Acurateea rezultatelor testului este dependent de generarea cu acuratee a unei curbe standard. Din acest motiv, rezultatele obinute pentru standarde trebuie examinate nainte ca rezultatele probei de testare s poat fi interpretate. Pentru ca ELISA s fie valid: Valorea medie a DO pentru Standard 1 trebuie s fie 0,600. CV% pentru valorile DO replicate pentru Standard 1 i Standard 2 trebuie s fie 15%. Valorile DO replicate pentru Standard 3 i Standard 4 nu trebuie s varieze cu mai mult de 0,040 uniti de densitate optic fa de media lor. Coeficientul de corelare (r) calculat din valorile medii ale absorbanei standardelor trebuie s fie 0,98. Software-ul pentru analiza testului QuantiFERON-TB Gold calculeaz i raporteaz aceti parametric de control ai calitii. Dac criteriile de mai sus nu sunt ndeplinite, analiza este invalidat i ea trebuie s fie repetat. Valoarea medie a DO pentru Standard Zero (Diluant Verde) trebuie s fie 0,150. Dac valoarea medie a DO este > 0,150, procedura de splare a plcii trebuie investigat.

17

Interpretarea Rezultatelor
Rezultatele testului QuantiFERON-TB Gold IT sunt interpretate utiliznd urmtoarele criterii: NOT: Diagnosticarea sau or excluderea bolii tuberculoz i evaluarea probabilitii ILTB necesit o combinare a rezultatelor epidemiologice, istorice, medicale i de diagnostic care trebuie luate n consideraie cnd se interpreteaz rezultatele testului QuantiFERON-TB Gold IT.

DAC S-AU UTILIZAT DOAR TUBURILE NIL & ANTIGEN TB Nil [UI/mL] 8,0 Antigen TB minus Nil [UI/mL] < 0,35 0,35 i < 25% din valoarea Nil 0,35 i 25% din valoarea Nil > 8,02 Oricare QuantiFERON-TB [UI/mL] Raport/Interpretare

Negativ Pozitiv1 Nedeterminat3

Infecia cu M. tuberculosis NU este posibil

Infecia cu M. tuberculosis este posibil Rezultatele sunt nedeterminate pentru rspunsul la Antigen TB

Dac infecia cu M. tuberculosis nu este suspectat, rezultatele iniiale pozitive pot fi confirmate prin retestarea probelor originale de plasm n duplicate n ELISA QuantiFERON-TB Gold. Dac repetarea testrii unuia sau ambelor replicate este pozitiv, individul trebuie considerat c are testul pozitiv. 2 n studiile clinice, mai puin de 0,25% din subieci au avut concentraii de IFN- > 8,0 UI/mL pentru Control Nil. 3 Vezi seciunea Probleme de trasare pentru cauzele posibile.

Magnitudinea concentraiei msurate de IFN- nu poate fi corelat cu stadiul sau gradul infeciei, nivelul rspunsului imunitar sau probabilitatea progresiei ctre boala activ.

18

FIGURA 3. Interpretarea Diagramei de flux cnd sunt utilizate tuburile NIL & ANTIGEN TB

Antigen TB Nil 0,35 UI/mL

INTERPRETARE
Nu Da

Antigen TB Nil 25% din valoarea Nil

Nu

Da

Nu
NEDETERMINAT

Nil 8,0 IU/mL

VALIDARE
Da

NEGATIV

POZITIV

19

DAC S-AU UTILIZAT TUBURILE NIL, ANTIGEN TB I MITOGEN Nil [UI/ mL] 8,0 Antigen TB minus Nil [UI/mL] < 0,35 0,35 i < 25% din valoarea Nil Mitogen minus Nil [UI/mL]1 0,5 Negativ 0,5 Pozitiv2 Oricare QuantiFERON-TB [UI/mL] Raport/ Interpretare

Infecia cu M. tuberculosis NU este posibil Infecia cu M. tuberculosis este posibil Rezultatele sunt nedeterminate pentru rspunsul la Antigen TB

0,35 i 25% din valoarea Nil

< 0,35 0,35 i < 25% din valoarea Nil > 8,04
1

< 0,5 < 0,5 Nedeterminat3

Oricare

Oricare

Rspunsurile la controlul Mitogen pozitiv (i ocazional Antigen TB) pot fi adesea n afara domeniului cititorului microplac. Aceasta nu are impact asupra rezultatelor testului. 2 Dac infecia cu M. tuberculosis nu este suspectat, rezultatele iniiale pozitive pot fi confirmate prin retestarea probelor originale de plasm n duplicate n ELISA QuantiFERON-TB Gold. Dac repetarea testrii unuia sau ambelor replicate este pozitiv, individul trebuie considerat c are testul pozitiv. 3 Vezi seciunea Probleme de trasare pentru cauzele posibile. 4 n studiile clinice, mai puin de 0,25% din subieci au avut concentraii de IFN- > 8,0 UI/mL pentru Control Nil.

Magnitudinea concentraiei msurate de IFN- nu poate fi corelat cu stadiul sau gradul infeciei, nivelul rspunsului imunitar sau probabilitatea progresiei ctre boala activ.

20

FIGURA 4. Interpretarea Diagramei de flux cnd sunt utilizate tuburile NIL, ANTIGEN TB & MITOGEN

Antigen TB Nil 0,35 UI/mL

INTERPRETARE
Da Nu
Antigen TB Nil 25% din valoarea Nil

Nu

Da

Mitogen Nil < 0,50 UI/mL

Da
NEDETERMINAT

Nu
Nil 8,0 UI/mL

i/sau
Nil > 8,0 UI/mL

VALIDARE

Nu
NEGATIV

Da
POZITIV

21

8. LIMITRI
Rezultatele testului QuantiFERON-TB Gold IT trebuie utilizate n conjuncie cu istoricul epidemiologic al fiecrui individ, starea medical curent i alte evaluri diagnostice. Indivizii cu valori Nil mai mari de 8 UI/mL sunt clasificai ca nedeterminat, deoarece un rspuns mai mare cu 25% la Antigenele TB poate fi n afara domeniului de msurare a dozrii. Rezultatele pe care nu te poi baza sau rezultatele nedeterminate pot apare datorit: Deviaiile din procedura descris n Prospect, Nivelele excesive de IFN- circulant sau prezena anticorpilor heterofili, Mai mult de 16 ore de la scoaterea probelor de snge de la incubarea la 37C.

9. CARACTERISTICILE PERFORMANEI Studii clinice

Deoarece nu exist un standard definitiv pentru infecia latent de tuberculoz (ILTB), sensibilitatea i specificitatea estimat pentru testul QuantiFERON-TB Gold IT nu poate fi practic evaluat. Specificitatea testului QuantiFERON-TB Gold IT a fost aproximat prin evaluarea evaluarea ratelor fals pozitive la persoanele cu risc sczut (fr factori de risc cunoscui) pentru infecia de tuberculoz. Sensibilitatea a fost aproximat prin evaluarea grupurilor de pacieni cu cultur confirmat de boal TB activ. Specificitate ntr-un studiu efectuat n SUA care a nrolat 866 voluntari, sngele pentru testul QuantiFERON-TB Gold IT a fost recoltat cnd a fost plasat TST. Informaiile demografice i factorii de risc pentru TB au fost determinai utiliznd un studiu standard la timpul de testare. Din 432 voluntari fr factori de risc cunoscui pentru infecia cu M. tuberculosis, rezultatele testului QuantiFERON-TB Gold IT i TST au fost disponibile pentru 391. Nici unul nu a fost vaccinat BCG. Un al doilea studiu de specificitate a fost efectuat cu QuantiFERON-TB Gold IT la indivizi cu risc sczut din Japonia, din care aproximativ 90% au fost vaccinai BCG. Rezultatele din ambele studii de specificitate sunt prezentate n Tabelul 2.

22

TABEL 2. Specificitatea QuantiFERON-TB Gold IT: Rezultatele pentru persoanele fr risc raportat infecia cu M. tuberculosis. STUDIUL Vaccinar e BCG % Total Nr. testai QFT-G Nedeterminat Nr. QFT-G Pozitiv / Nr. Testelor Valide Specificitatea QFT-G (95% IC) Nr. TST Pozitiv / Nr. Testai 6 / 391 Specificitatea TST* (95% IC)

SUA (nepublicat) Japonia (nepublicat) TOTAL

0% ~ 90%

391 190 581

1 4 5 / 584 (0,9%)

3 / 390 3 / 186 6 / 576

99,2% (97,6-99,8) 98,4% (95-99,6) 99,0%

98,5% (96,5-99,4) -

*Utiliznd o limit a 10mm TST. Specificitatea TST estimat este 99,1%, dac se utilizeaz o limit de 15mm. Sensibilitatea pentru TB activ Suspecii TB din Australia i Japonia care au fost ulterior confirmai cu infecie de M. tuberculosis prin cultur, au fost testai pentru evaluarea sensibilitii la QuantiFERON-TB Gold IT. Deoarece nu exist un test standard definitiv pentru infecia latent de tuberculoz (ILTB), un surogat adecvat este cultura microbiologic a M. tuberculosis, deoarece pacienii cu boal sunt prin definiie infectai. Pacienii au primit tratament mai puin de 8 zile naite de colectarea sngelui pentru testul QuantiFERONTB Gold IT. Tabelul 3 rezum rezultatele de la cele dou grupuri de pacieni cu cultur pozitiv de M. tuberculosis. Sensibilitatea global a QuantiFERON-TB Gold IT pentru boala activ TB a fost 89% (48/54). TABEL 3. QuantiFERON-TB Gold IT: Subiecii cu cultur confirmat de infecie cu M. tuberculosis. STUDIU Boal Nr. QFT-Gold Sensibilitatea confirmat Pozitiv / Nr. QFT-Gold de Testelor Valide (95% IC) Pacieni TB Japonezi Studiu de validare Pacieni TB Pulmonar Australieni Studiu de Extrapulmonar validare TOTAL Cultur 24 / 27 7 / 10 Cultur 17 / 17 48 / 54 89% (72-96%) 70% (40-89%) 100% (82-100%) 89% (78-95%)

23

Diagnosticul de ILTB Un numr de studii care au fost publicate demonstreaz performana QuantiFERON-TB Gold IT la populaii variate cu risc de ILTB. n principiu, rezultatele ctorva studii selectate sunt prezentate n Tabelul 4. TABEL 4. Studii publicate selectate privind QuantiFERON-TB Gold IT la populaii cu risc de ILTB.
STUDIUL Indieni HCW (Pai et al 2005)26 Total testai 726 Rezultate Aflare la rate TB foarte mari. 40% QFT-Gold IT pozitivi cf 41% TST pozitivi la 10mm. Mare concordan cu TST, nici un efect al BCG pe nici un test. Ambele teste legate de factorii de risc de vrst i perioada de lucru n domeniul profesionitilor din sntate. Prevalena global a ILTB cu QFT-Gold IT a fost 4,6% (27/590) la HIV+ persoane. Rezultatele pozitive au fost asociate cu riscurile TB. Doi subieci pozitivi la QFT-Gold IT au progresat la TB activ n decurs de un an. Rspunsurile nedeterminate (n=20, 3,4%) au fost semnificativ asociate cu un numr CD4 <100 / L. Copiii la care TB a fost suspectat sau au avut un istoric de contact TB au fost testai cu QFT-Gold IT and TST. 10,5% QFT-Gold IT pozitivi cf 9,5% TST pozitivi la 10mm. Acordul ntre teste a fost 95,2% global i 100% la nevaccinai BCG. Contactele strnse a 15 cazuri diferite au fost testate. 51% au fost vaccinai BCG, 27% nscui n strintate. 70% dintre cei vaccinai BCG i 18% dintre cei nevaccinai au fost pozitivi TST (5mm), n timp ce 9% i respectiv 11% au fost pozitivi QFT-Gold IT. QFT-Gold IT a fost asociat cu riscul TB. TST a fost asociat doar cu vaccinarea BCG.

Danezi cu HIV (Brock et al 2006)5

590

Copii spitalizai (Dogra et al 2006)12

105

Contacte Germane (Diel et al 2006)11

309

Mult mai multe publicaii descriu performana mai puin senzitiv a unei versiuni de antigen lichid a QuantiFERON-TB Gold (precursor al QuantiFERON-TB Gold IT) i a testului QuantiFERON-TB Gold IT. Aceste studii includ utilizarea testului(testelor) la contacte ale cazurilor de TB activ9,11,19,25, copii6-10,25,28, HIV pozitivi2,5,20, profesioniti din domeniul medical13,26,32, deprimai din punct de vedere imunologic3,4,22,23,27,30,31, precum i suspeci TB7,8,10,18 i indivizi cu risc sczut15. Repetabillitatea i efectul TST asupra testrii ulterioare cu QuantiFERON-TB Gold IT Ca parte a studiului de specificitate SUA, un subset de voluntari s-au odihnit ntre 4 i 5 sptmni dup testul original QuantiFERON-TB Gold IT i TST. Rezultatele QuantiFERON-TB Gold IT pentru 260 recrutai au fost disponibile la ambele puncte de timp, iar acordul a fost 99.6% (259/260). Un TST anterior nu a indus rspunsuri pozitive did la QuantiFERON-TB Gold IT.

24

10. INFORMAII TEHNICE Rezultate nedeterminate

Rezultatele nedeterminate vor fi nefrecvente i pot fi legate de starea imunitar a individului care este testat, dar pot fi, de asemenea, legate de un numr de factori tehnici: Mai mult de 16 ore de la scoaterea s\ngelui de la incubarea la 37C, Pstrarea sngelui n afara domeniului de temperatur recomandat (22C 5C), Amestecarea insuficient a tuburilor de colectarea a sngelui, Splarea incomplet a plcii ELISA. Dac sunt suspectate probleme tehnice legate de colectarea sau manipularea probelor de snge, repetai ntregul test QuantiFERON-TB Gold IT cu un nou specimen de snge. Repetarea testrii ELISA a plasmelor stimulate poate fi efectuat dac sunt suspectate splarea inadecvat sau alte deviaii de procedur ale testului ELISA. Testele nedeterminate care rezult din valori Mitogen sczute sau valori Nil mrite nu sunt de ateptat s se schimbe la repetare, dect dac a fost o eroare la testarea ELISA. Rezultatele nedeterminate trebuie raportate ca atare. Medicii pot alege s retraseze un specimen sau s efectueze alte proceduri dup cum este adecvat. Physicians may choose to redraw a specimen or perform other procedures as appropriate.

Probele de plasm coagulat

Dac la pstrarea pe termen ndelungat a probelor de plasm se formeaz cheaguri de fibrin, centrifugai probele pentru sedimentarea materialului coagulat i pentru facilitarea pipetrii plasmei.

25

Probleme de trasare ELISA Dezvoltarea nespecific a coloraiei

CAUZA POSIBIL Splarea incomplet a plcii. SOLUIA Splai placa de cel puin 6 ori cu 400L/lca tampon de splare. Mai mult de 6 cicluri de splare pot fi necesare, n funcie de lichidul de splare utilizat. Trebuie utilizat un timp de nmuiere de cel puin 5 secunde ntre cicluri. Avei grij la pipetarea i amestecarea probei, pentru minimizarea riscului. Asigurai-v c kit-ul este utilizat pn la data de expirare a acestuia. Asigurai-v c Standardul i Concentratul Conjugat 100X reconstituite sunt utilizate n decurs de trei luni de la data reconstituirii acestora. Aruncai substratul dac exist o coloraie albastr. Asigurai-v c sunt utilizate rezervoarele curate de reactiv.

Contaminarea ncruciat a lcaurile ELISA. Kit-ul / Componentele au expirat.

Soluia Enzim Substrat este contaminat.

Citiri penttru standarde cu densitate optic mic

CAUZA POSIBIL Eroare privind diluia Standardului. SOLUIA Asigurai-v c diluiile Kit-ului Standard sunt preparate corect, conform Prospectului. Asigurai-v c pipetele sunt calibrate i utilizate conform instruciunilor productorului. Incubarea ELISA trebuie efctuat la temperatura camerei, ntre 17C i 27C. Incubarea plcii cu conjugat, a standardelor i probelor trebuie s aib loc 120 5 minute. The Soluia Enzim Substrat este incubat pe plac timp de 30 minute. Placa trebuie citit la 450 nm, cu un filtru de referin ntre 620 i 650nm. Toi reactivii, cu excepia Concentratului Conjugat 100X, trebuie adui la temperatura camerei nainte de nceperea dozrii. Aceasta dureaz aproximativ o or. Asigurai-v c kit-ul este utilizat pn la data de expirare. Asigurai-v c Standardul i Concentratul Conjugat 100X reconstituite sunt utilizate n decurs de trei luni de la data reconstituirii acestora.

Eroare de pipetare.

Temperatura de incubare este prea sczut. Timpul de incubare este prea scurt.

Filtrul de citire a plcii este incorect utilizat. Reactivii sunt prea reci.

Kit-ul / Componentele au expirat.

26

Background ridicat
CAUZA POSIBIL Splarea incomplet a plcii. SOLUIA Splai placa de cel puin 6 ori cu 400L/ lca tampon de splare. Mai mult de 6 cicluri de splare pot fi necesare, n funcie de lichidul de splare utilizat. Trebuie utilizat un timp de nmuiere de cel puin 5 secunde ntre cicluri. Incubarea ELISA trebuie efctuat la temperatura camerei, ntre 17C i 27C. Asigurai-v c kit-ul este utilizat pn la data de expirare. Asigurai-v c Standardul i Concentratul Conjugat 100X reconstituite sunt utilizate n decurs de trei luni de la data reconstituirii acestora. Aruncai substratul dac exist o coloraie albastr. Asigurai-v c sunt utilizate rezervoarele curate de reactiv.

Temperatura de incubare prea ridicat. Kit-ul / Componentele au expirat.

Soluia Enzim Substrat este contaminat.

Curba standard neliniar i variabilitatea duplicatului

CAUZA POSIBIL Splarea incomplet a plcii. SOLUIA Splai placa de cel puin 6 ori cu 400L/ lca tampon de splare. Mai mult de 6 cicluri de splare pot fi necesare, n funcie de lichidul de splare utilizat. Trebuie utilizat un timp de nmuiere de cel puin 5 secunde ntre cicluri. Asigurai-v c diluiile Kit-ului Standard sunt preparate corect, conform Prospectului. Amestecai reactivii complet, prin rsturnare sau agitare nainte de adugarea lor la plac. Adugarea probei i a standardului trebuie efectuat ntr-o manier continu. Toi reactivii trebuie preparai nainte de nceperea dozrii.

Eroare privind diluia Standardului. Amestecare insuficient. Inconsistena tehnicii de pipetare sau ntreruperea n timpul pregtirii dozrii.

Procedura de dozare video i soluia la majoritatea problemelor tehnice pot fi gsite n Informaiile Produsului i Ghidul Tehnic de pe CD-ROM, disponibile gratuit de la Cellestis sau prin distribuitorul dvs.

27

11. BIBLIOGRAFIE
1. 2. Andersen, P., et al. Specific immune-based diagnosis of tuberculosis. Lancet 2000. 356; 1099-104. Balcells, M.E., et al. A comparative study of two different methods for the detection of latent tuberculosis in HIV-positive individuals in Chile. Int J Infect Dis. 2008. 12; 645-52. Bartalesi, F., et al. QuantiFERON-TB Gold and TST are both useful for latent TB screening in autoimmune diseases. Eur Respir J. 2008. [Epub ahead of print]. Bocchino, M., et al. Performance of two commercial blood IFN-gamma release assays for the detection of Mycobacterium tuberculosis infection in patient candidates for anti-TNF-alpha treatment. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2008. 27; 907-13. Brock, I., et al. Latent tuberculosis in HIV positive, diagnosed by the M. tuberculosis specific interferon-gamma test. Respir Res. 2006. 7; 56. Chun, J.K., et al. The role of a whole blood interferon gamma assay for the detection of latent tuberculosis infection in bacille Calmette-Guerin vaccinated children. Diagn Microbiol Infect Dis. 2008. 62; 389-94. Connell, T.G., et al. A three-way comparison of tuberculin skin testing, QuantiFERON-TB Gold and T-SPOT.TB in children. PLoS ONE 2008. 3; e2624. Detjen, A.K., et al. Interferon-gamma release assays improve the diagnosis of tuberculosis and nontuberculous mycobacterial disease in children in a country with a low incidence of tuberculosis. Clin Infect Dis. 2007. 45; 322-8. Diel, R., et al. Comparative performance of tuberculin skin test, QuantiFERON-TB Gold In Tube assay, and T-Spot.TB test in contact investigations for tuberculosis. Chest. 2008. [Epub ahead of print]. Diel, R., et al. Predictive value of a whole-blood IFN- assay for the development of active TB disease. Am J Respir Crit Care Med. 2008. 177; 1164-70. Diel, R., et al. Tuberculosis contact investigation with a new, specific blood test in a low-incidence population containing a high proportion of BCG-vaccinated persons. Respir Res. 2006. 7; 77. Dogra, S., et al. Comparison of a whole blood interferon-gamma assay with tuberculin skin testing for the detection of tuberculosis infection in hospitalized children in rural India. J Infect. 2007. 54; 267-76. Drobniewski, F., et al. Rates of latent tuberculosis in health care staff in Russia. PLoS Med. 2007. 4; e55. Gerogianni, I., et al. Whole-blood interferon-gamma assay for the diagnosis of tuberculosis infection in an unselected Greek population. Respirology. 2008. 13; 270-4. Harada, N., et al. Comparison of the sensitivity and specificity of two whole blood interferon-gamma assays for M. tuberculosis infection. J Infect. 2008. 56; 348-53. Higuchi, K., et al. Comparison of performance in two diagnostic methods for tuberculosis infection. Med Microbiol Immunol. 2008. [Epub ahead of print].

3. 4.

5. 6.

7. 8.

9.

10. 11.

12.

13. 14.

15. 16.

28

17.

Kang, Y.A., et al. Discrepancy between the tuberculin skin test and the wholeblood interferon gamma assay for the diagnosis of latent tuberculosis infection in an intermediate tuberculosis-burden country. JAMA. 2005. 293; 2756-61. Katiyar, S. K.. et al. Use of the QuantiFERON-TB Gold In-Tube test to monitor treatment efficacy in active pulmonary tuberculosis. Int J Tuberc Lung Dis. 2008. 12; 1146-52. Kipfer, B., et al. Tuberculosis in a Swiss army training camp: contact investigation using an Interferon gamma release assay. Swiss Med Wkly. 2008. 138; 267-72. Luetkemeyer, A., et al. Comparison of an interferon-gamma release assay with tuberculin skin testing in HIV-infected individuals. Am J Respir Crit Care Med. 2007. 175; 737-42. Mackensen, F., et al. QuantiFERON-TB Gold - A new test strengthening longsuspected tuberculous involvement in serpiginous-like choroiditis. Am J Ophthalmol. 2008. 146; 761-6. Manuel, O., et al. Comparison of QuantiFERON-TB Gold with tuberculin skin test for detecting latent tuberculosis infection prior to liver transplantation. Am J Transplant. 2007. 7; 2797-801. Matulis, G., et al. Detection of latent tuberculosis in immunosuppressed patients with autoimmune diseases performance of a Mycobacterium tuberculosis antigen specific IFN-gamma assay. Ann Rheum Dis. 2007. 67; 84-90. Mirtskhulava, V., et al. Prevalence and risk factors for latent tuberculosis infection among health care workers in Georgia. Int J Tuberc Lung Dis. 2008. 12; 513-519. Nakaoka, H., et al. Risk for tuberculosis among children. Emerg Infect Dis. 2006. 12; 1383-8. Pai, M., et al. Mycobacterium tuberculosis infection in health care workers in rural India: comparison of a whole-blood, interferon-g assay with tuberculin skin testing. JAMA. 2005. 293; 2746-55. Ponce de Leon, D., et al. Comparison of an interferon-gamma assay with tuberculin skin testing for detection of tuberculosis (TB) infection in patients with rheumatoid arthritis in a TB-endemic population. J Rheumatol. 2008. 35; 776-81. Richeldi, L., et al. Prior tuberculin skin testing does not boost QuantiFERON-TB results in paediatric contacts. Eur Respir J. 2008. 32; 524-5. Rothel, J.S. and Andersen, P. Diagnosis of latent Mycobacterium tuberculosis infection: is the demise of the Mantoux test imminent? Expert Rev Anti Infect Ther. 2005. 3; 981-93. Schoepfer, A.M., et al. Comparison of interferon-gamma release assay versus tuberculin skin test for tuberculosis screening in inflammatory bowel disease. Am J Gastroenterol. 2008. 103; 2799-806. Silverman, M.S., et al. Use of an interferon-gamma based assay to assess bladder cancer patients treated with intravesical BCG and exposed to tuberculosis. Clin Biochem. 2007. 40; 913-5. Stebler, A., et al. Whole-blood interferon-gamma release assay for baseline tuberculosis screening of healthcare workers at a Swiss university hospital. Infect Control Hosp Epidemiol. 2008. 29, 681-3.

18.

19. 20.

21.

22.

23.

24. 25. 26.

27.

28. 29.

30.

31.

32.

29

12. SERVICII TEHNICE

Pentru serviciul tehnic v rugm s contactai: Cellestis International Pty Ltd: Phone: +61 3 9571 3500 Fax: +61 3 9571 3544 E-mail: quantiferon@cellestis.com Website: www.cellestis.com

Cellestis GmbH: (Europa)

Phone: +49 6151 428 59-0 Fax: +49 6151 428 59-110 Email: europe@cellestis.com

30

13. PROCEDURA DE TESTARE REZUMAT

STADIUL 1 INCUBAREA SNGELUI

1. Colectai sngele pacientului n tuburile de colectare a sngelui i amestecai viguros, prin agitarea tuburilor n sus i n jos de 10 ori, pentru a fi siguri c ntreaga suprafa interioar a tubului a fost acoperit cu snge.

2. Incubai tuburile n poziie vertical la 37C timp de 16 24 ore.

3. Dup incubare, centrifugai tuburile timp de 15 minute la 2000 - 3000 RCF (g), pentru a separa plasma i hematiile.

4. Dup centrifugare, recoltai proba de plasm din fiecare tub pentru cuantificarea IFN-.

31

STADIUL 2 IFN- ELISA

1. Echilibrai componentele ELISA, cu excepia Concentratului Conjugat 100X, la temperatura Camerei, pentru cel puin 60 minute.

2. Reconstituii Kit-ul Standard la 8,0 UI/Ml, cu ap distilat sau deionizat. Preparai patru (4) diluii standard

3. Reconstituii liofilizatul de Concentrat Conjugat 100X cu ap distilat sau deionizat.

4. Preparai conjugatul concentraie de lucru n Diluant Verde i adugai 50 L n toate lcaurile.

5. Adugai 50 L din probele de plasm pentru testare i adugai 50 L de standarde n lcaurile adecvate. Amestecai utiliznd agitatorul.

6. Incubai pentru 120 minute la temperatura camerei.

32

STADIUL 2 IFN- ELISA (Continuare)

7. Splai lcaurile de cel puin 6 ori cu 400 L/pe lca cu ap tampon.

8. Adaugai 100 L Soluie Substrat Enzim n lcauri. Amestecai utiliznd agitatorul.

9. Incubai pentru 30 minute la temperatura camerei.

10. Adaugai 50 L Soluie de oprire a Enzimei n toate lcaurile. Amestecai utiliznd agitatorul.

11. Citii rezulatetele la 450 nm cu ajutorul unui filtru de referinde 620-650 nm.

12. Analiza rezultatelor.

33

Fabricat pentru: Cellestis Limited (Australia) and Cellestis GmbH (Europa) 1046A Dandenong Road, Carnegie, Victoria, 3163, Australia Telefon: (Australia) +61 3 9571 3500; (Europe) +49 6151 428 59-0 E-mail: quantiferon@cellestis.com Website: www.cellestis.com

Doc. No. 05990301C August 2009

EC REP MDSS GmbH Schiffgraben 41 30175 Hannover Germany

34