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Desarrollada por Mikhail Tswett, en 1906 con el fin de separar los colorantes que componen a las plantas.
Comienzos
Consista en una columna de vidrio rellena de CaCO3 a la cul se le colocaba la muestra en la parte superior y se le circulaba ter de etilo, logrando que las sustancias ms afines al solvente salieran de la columna ms rpidamente que las menos afines.
Definicin
La cromatografa es una tcnica que permite separar los diferentes componentes de una mezcla compleja. La separacin se logra por diferencias en la movilidad relativa de los solutos, lo cual se logra por las distintas interacciones fsicas y qumicas entre los componentes de la cromatografa.
Clasificacin
Se aplican varios criterios De acuerdo al soporte Al tipo de equilibrio que se establece en la separacin Al estado de agregacin de la fase mvil
Segn el soporte
Cromatografas Planas Ventajas
Sencillas Rpidas Bajo costo
Cromatografas Planas Desventajas Solo con fines analticos Poca eficiencia en la separacin No se adapta a sistemas automatizados
Segn el soporte
Cromatografas en columna
Ventajas
Mas verstiles Se adaptan a sistemas automatizados Mayor resolucin Mayor capacidad de carga Posibilidad de escalado a nivel productivo
Cromatografas en columna
Desventajas
Necesidad de equipamiento Alto costo inicial Requiere personal capacitado
Fase estacionaria
Lquido adsorbido sobre un slido Slido
Tipo de equilibrio
Distribucin entre lquidos inmiscibles Adsorcin
Lquido - slido
Intercambio inico
Exclusin
Slidos/gel
Afinidad
Cromatografa de reparto: El soluto est en equilibrio entre el lquido de la fase mvil y el de la fase estacionaria por diferencias de solubilidades. Cromatografa de adsorcin: Fenmeno superficial en el cual las partculas del soluto son adsorbidas por la fase estacionaria.
Cromatografa de intercambio inico: Los iones del soluto son retenidos por los grupos funcionales que se encuentran en la fase estacionaria. Cromatografa de exclusin molecular: No hay equilibrio de separacin . Se separan por el tamao partculas. Cromatografa de afinidad: reaccin inmunolgica donde el soluto es el antgeno y los anticuerpos se encuentran adsorbidos en la fase estacionaria.
Tiempo muerto= es el tiempo necesario para que una especie que no se retiene en la fase estacionaria alcance el detector
Ancho del pico en la base= es el tiempo transcurrido desde que el soluto alcanza el detector hasta que lo abandona
Ejemplo 1
Se realizo un cromatografa en capa delgada para determinar la presencia de rojo cobalto en una muestra de pigmentos textiles. Para tal caso se corri junto con las muestras un patrn de colorantes que contena la muestra problema . Una vez terminada la cromatografa se midi la distancia recorrida por el solvente arrojando un valor de 8,6 cm; la muestra presento una distancia recorrida de 5,6cm y 7,4cm mientras que el patrn presento medidas de 2.9 cm, 5,7cm y 6,8cm.cual es el valor de Rf de las muestras y el patrn de colorantes? se encuentra el colorante en cuestin en la muestra? Patrones Rf= d muestra/d solvente 2.9/8.6=0.33 5.7/8.6=0.66 6.8/8.6=0.79 Muestras Rf= d muestra/d solvente 5,6/8,6=0.65 7,4/8,6=0.86
Constante de distribucin(Kc)= Valor terico que relaciona la concentracin de un soluto entre la fase mvil y la fase estacionaria. Kc=Cs Cm
Concentracin molar del analito en la fase mvil Concentracin molar del analito en la fase estacionaria
Factor de retencin (k) = factor que se puede determinar experimentalmente y permite comparar la velocidad de migracin de los diferentes solutos.
k= Tr Tm Tm
IMPORTANTE:k <<<<< a 1 soluto muy poco retenido k entre 1 y 5 valor ideal k 20 o mayor cromatografas muy largas
Factor de selectividad ( )= relaciona los tiempos de retencin de dos solutos y por lo tanto me permite saber la eficacia de la columna para separarlos.
= (Trb) Tm = Valor siempre > 1 (Tra)-Tm
IMPORTANTE= ESTE FACTOR NO TOMA EN CUENTA EL ANCHO DE PICO
Ejemplo 2
Cual ser el nmero de platos tericos y la altura equivalente de un plato para una columna de 30cm si el cromatograma para la determinacin de dichos parmetros mostr los siguientes resultados: Tr=22,3 N=16(Tr/W)2 W=1.12 N=16 x(22.3/1.12)2=6342
HEPT=L/N=30/6342 H=0.004 cm
ASIMETRIA =As
RESOLUCION = R
RESOLUCION (R)
Ejemplo 3
Determinar la resolucin de una columna que presenta los siguientes valores de corrida:
TrA=16.40 WA=1.11 Tr B= 17.63 WB= 1.21 Rs= 2 x 17,63-16.40 1.11 + 1.21 Rs=1.10
ndice de polaridad
Magnitud que permite cuantificar la polaridad relativa de una mezcla de solventes que componen la fase mvil
ndice de polaridad
El valor de IP de cada solvente lo obtengo de tabla. Es conveniente trabajar, como mnimo, con dos solventes de polaridad diferente. Es un parmetro a considerar cuando necesito aumentar la resolucin, por ejemplo, en una cromatografa de adsorcin.
ndice de polaridad
Difusin longitudinal
Difusin
Tamao de partcula de la fase estacionaria Sobrecarga del sistema Uniformidad del sistema
REDUCIR LA ALTURA DE PLATO MODIFICAR LA FASE MOVIL AUMENTAR LA VELOCIDAD DE FLUJO AUMENTAR EL DIAMETRO DE LA COLUMNA
HPLC
El HPLC (High Performance Liquid Chromatography) o CLAR (Cromatografa Lquida de Alta Resolucin) es el mtodo ms moderno para realizacin de cromatografas.
Tiene una alta sensibilidad: en la cromatografa en columna de vidrio se utilizaban grandes cantidades de solvente, lo que dilua la muestra, disminuyendo la sensibilidad del mtodo. Excelente para la cuantificacin debido a los detectores on-line que utiliza.
Fase mvil
El tipo y la composicin de la fase mvil (eluyente) son variables que influyen en la separacin. Las propiedades comunes a los diversos disolventes que se emplean son:
Fase mvil
Alta pureza (del orden de 99,999%). Compatibilidad con el detector. Solubilidad de la muestra. Baja viscosidad. Inercia qumica. Precio razonable
Instrumentacin
Instrumentacin
Son 8 componentes bsicos: Reservorios de la fase mvil. Sistema de suministro de solvente. Elemento para introducir la muestra. Columna. Detector. Reservorio de residuos. Tuberas de conexin. Integrador o computadora.
Fase mvil
En la cromatografa se pueden usar eluciones con un solo solvente (elucin ISOCRATICA) o con diferentes solventes que varan sus concentraciones con el tiempo (elucin en GRADIENTE). Esta segunda forma de suministrar solvente suele generar mejores separaciones. Para poder realizar una elucin en gradiente es necesario contar con una computadora para programar la variacin de solventes en funcin del tiempo de corrida.
Fase mvil
Las propiedades de los eluyentes que se pueden variar para producir elucin en gradiente son: Fuerza inica. pH. Constante dielctrica.
Bombas
Sistema de suministro de disolvente. Debe asegurar un suministro de caudal libre de pulsos, constante, reproducible y preciso. Si se provocan pulsos en los flujos, estos son indeseables pues: Causan problemas a la hora de la deteccin. Impiden un buen anlisis cuantitativo. Conducen a una temprana falla de la columna.
Bombas
Existen actualmente 3 tipos de bombas para los equipos de HPLC: Reciprocantes o a pistn. Tipo jeringa o de desplazamiento. Neumtica o de presin constante.
Bomba de pistn
Se usan en el 90 % de los equipos y consisten generalmente en una cmara pequea (35 L a 400 L), en la que el disolvente se bombea hacia delante y hacia atrs mediante un pistn movido por un motor. Dos vlvulas que se abren y cierran alternadamente, controlan el flujo del disolvente hacia adentro y fuera de un cilindro.
Bombas de pistn
En el movimiento hacia atrs, el pistn aspira el eluyente desde el reservorio y debido a las vlvulas de chequeo se cierra la salida a la cmara de separacin. Durante el avance, el eluyente es empujado dentro de la columna y la entrada del reservorio se cierra. El movimiento de bombeo del pistn produce un flujo de pulsos que requiere atenuacin. Estas bombas generan una alta presin de salida con caudales constantes y la posibilidad de usar la elucin por gradiente.
Bomba de pistn
Muestras
Antes de inyectar la muestra en el equipo, hay que tenerla en estado lquido o en solucin, y tener en claro que sea compatible tanto con la fase mvil como con la fase estacionaria. Se pueden inyectar cantidades que varan entre 1 l a 100 l; generalmente se inyectan entre 5 l y 10 l. Las cantidades inyectadas varan dependiendo de la sensibilidad y el rango dinmico del detector.
Muestras
El tiempo de anlisis puede variar entre 5 min y 2 hs dependiendo del tiempo de preparacin de la muestra, entre otras cosas. La preparacin de cada muestra es totalmente diferente, y puede consistir en una hiperfiltracin, dilucin, preconcentracin, extraccin, etc.
Precolumnas
Se colocan antes de la columna analtica para incrementar su vida, eliminando el material particulado y los contaminantes del solvente. Adems, sirven para saturar la fase mvil con la fase estacionaria de manera de minimizar las prdidas del solvente de la columna analtica.
Precolumnas
La composicin del relleno de la columna de guardia debe ser similar a la de la columna analtica, pero el tamao de partculas es generalmente ms grande Cuando se contamina, se rellena nuevamente o se descarta y reemplaza por una nueva delmismo tipo.
Columnas
Se construyen de acero inoxidable, plstico, aunque a veces hay de vidrio. En el caso de ser de vidrio (menos comn), la presin mxima de trabajo es 600 psi. Los precios de la columnas rellenas varan de 200 a 500 dlares.
Columnas analticas
La mayora de la columnas tiene entre 10 cm y 30 cm. Normalmente son rectas y pueden tener largos adicionales como acoples de una o ms columnas. El dimetro interior est comprendido entre 4 mm y 10 mm. Los tamaos de partcula del relleno ms comunes son 3 m, 5 m 10 m.
Columnas analticas
Las columnas ms comunes miden 25 cm de largo, 4,6 mm de dimetro interior y con relleno de partculas de 5 m, tienen entre 40 000 platos/m y 60 000 platos/m. Se han producido columnas an ms pequeas, con largos de 3 cm a 7,5 cm. Pueden tener hasta 100 000 platos/m, con mucha velocidad y consumo mnimo de solvente.
Rellenos de columnas
Existen dos tipos de relleno en las columnas de cromatografa: Pelicular. Partcula porosa.
Relleno pelicular
Consiste de bolillas esfricas, no porosas, de vidrio o polmero, con dimetros tpicos de 30 a 40 m. Se deposita una delgada capa porosa de slice, almina, una resina sinttica de poliestireno divinil benceno o una resina de intercambio inico, sobre la superficie de estas bolillas.
Relleno pelicular
Para algunas aplicaciones, se aplica un recubrimiento adicional, que consiste de una fase estacionaria lquida que se mantiene adsorbida. Pueden tambin ser tratadas qumicamente para dar una capa de superficie orgnica. Se emplean ms para las precolumnas y no tanto para las columnas analticas.
Relleno poroso
Consiste de micropartculas porosas que tienen dimetros entre 3 m a 10 m. Las partculas son comunmente de slice, pero tambin pueden ser de almina, una resina sinttica de poliestiereno divinil benceno o una resina de intercambio inico.
Relleno poroso
Se preparan las partculas de slice aglomerando sub-micropartculas de slice bajo condiciones que conducen a partculas ms grandes que tiene dimetros muy uniformes. Las partculas resultantes se recubren a menudo con pelculas orgnicas delgadas, que son unidas qumica o fsicamente a la superficie.
Detectores
El rol ms importante del detector de HPLC es monitorear los solutos a medida que eluyen. Genera una seal elctrica, proporcional al nivel de alguna propiedad de la fase mvil o de solutos.
Detectores
Las caractersticas necesarias de un buen detector de HPLC son: Sensibilidad. Linealidad. Confiabilidad. Fcil de usar. Bajo volumen muerto.
Detectores
Existen dos grandes grupos de detectores: De propiedades masivas, moduladas por la presencia de solutos, como por ejemplo, el ndice de refraccin o la densidad de la fase mvil. De propiedades del soluto, como por ejemplo absorbancia de radiacin UV, fluorescencia o corriente de difusin. Estos son ms sensibles que los primeros en el orden de 1000 veces o ms.
Detector de absorbancia al UV
Es utilizado en ms del 70 % de los equipos HPLC. La seal es proporcional a la concentracin del soluto. Se detectan alquenos, compuestos aromticos y aqullos que tienen uniones mltiples de C, O, N, y S. La fase mvil no debe interferir en la deteccin.
Detector de absorbancia al UV
Se mide la absorbancia de los eluyentes de una columna y para minimizar el ensanchamiento de banda, se mantiene el volumen lo ms pequeo posible, entre 1 l y 10 l y largos de celda entre 2 mm y 10 mm. Estn restringidos a presiones debajo de 600 psi, por lo que se requiere un reductor de presin.
Solventes en el UV
Otros detectores
De conductividad: es un detector universal de iones, pero no sirve para elucin en gradiente. Electroqumicos: miden la corriente electrica asociada a la oxidacin o reduccin de los solutos a la salida de la columna, y son especialmente sensibles, pero no sirven para elucin en gradiente.
Cromatografa de reparto
La ms antigua es la de equilibrio lquido lquido pero actualmente es mas utilizada la de fase enlazada . La desventaja ms importante de la lquido lquido es la prdida de fase estacionaria por disolucin en la fase mvil, lo que requiere recubrimientos peridicos del soporte