Imunitatea specifica si nespecifica

13.06.2003, 18:27
Daniela Badea*, M. Badea Observatia, care a condus la dezvoltarea imunologiei ca disciplina medicala, a fost aceea ca un individ devine rezistent pana la moarte la unele boli infectioase, odata ce a intrat o singura data in contact cu agentul patogen (a facut boala). Termenul de imunitate deriva din latinul "immunis" si se refera la protectie naturala impotriva unor boli infectioase, ca de ex., rujeola sau variola. I. CONCEPTE GENERALE 1. Apararea specifica si nespecifica. Protectia organismului impotriva agentilor infectiosi implica mai multe mecanisme, unele nespecifice (generale, comune pentru mai multe microorganisme) si altele specifice (efectul protector este directionat strict numai catre un singur agent patogen). a. Apararea nespecifica este innascuta si include: - barierele mecanice (integritatea epidermei si a mucoaselor); - barierele fizico-chimice (aciditatea sucului gastric); - substante antibacteriene (imunoglobulinele si lizozimul, prezente in secretiile externe); - tranzitul intestinal, fluxul secretiilor bronsice si al urinii (contribuie continuu la eliminarea agentilor infectiosi); - ingestia si distrugerea bacteriilor si particulelor, care au depasit barierele cutaneomucoase de catre granulocite. b. Apararea specifica se dezvolta in timpul vietii individului, ca urmare a unui proces secvential deosebit de complex, cunoscut sub numele de raspuns imun. 2. Caracteristicile raspunsului imun. Raspunsul imun are 2 caracteristici majore: specificitatea si memoria imuna. a. Specificitatea. Imunitatea cu virus polio protejeaza organismul uman numai impotriva poliomielitei, dar nu si impotriva gripei. Specificitatea raspunsului imun este datorata existentei pe suprafata limfocitelor a receptorilor pentru antigen, extrem de sensibili in a sesiza diferentele intre agentii infectiosi. Receptorii pentru antigen ai unui limfocit dat, recunosc un singur antigen sau un numar limitat de structuri similare. Interreactia receptorilor pentru antigen cu structura lui antigenica specifica determina un semnal, capabil sa initieze activarea celulara. b. Memoria imuna. Expunerea repetata la acelasi antigen determina un raspuns imun specific, mai rapid, mai intens si mai adecvat. La prima expunere la un antigen, in organism exista un numar redus de limfocite care recunosc si declanseaza raspunsul imun, asigurand eliminarea agresiunii. In urma primului raspuns imun, in organism persista o populatie limfoida specifica mai numeroasa, capabila sa ofere o protectie superioara (raspuns imun mai rapid, mai intens si mai adecvat), la o noua expunere la acelasi antigen. Mentinerea imunizarii pe perioade lungi de timp, necesita administrari repetate ale antigenului (imunizari). 3. Etapele raspunsului imun. Patrunderea unui micr oorganism in organism determina initierea raspunsului imun. Antigenul este preluat de celulele prezentatoare de antigen (CPA), care au rolul de a prezenta pe suprafata lor antigenul sau fragmente rezultate din procesarea acestuia, recunoscute de un numar redus de limfocite. Aceste limfocite sufera un proces de proliferare si diferentiere controlat de CPA si subpopulatii de celule T (T helper, definite mai jos). In

final, apar molecule efectoare (anticorpi) sau/si celule efectoare specifice (celule care direct sau indirect, elimina agentul infectios). II. CELULELE SISTEMULUI IMUN Sangele periferic contine 2 mari populatii celulare: eritrocitele (hematiile), al caror rol fiziologic este de a transporta oxigenul catre tesuturi, si celulele albe (leucocitele), care asigura eliminarea microorganismelor potential periculoase si/sau a compusilor acestora. In familia leucocitelor, intra granulocitele eozinofile, neutrofile si bazofile, macrofagele si monocitele, precum si limfocitele. Limfocitele sunt o populatie heterogena functional, cu rol primordial in derularea raspunsului imun. Au fost bine definite mai multe subpopulatii de limfocite: a. Limfocitele B sunt precursorii celulelor producatoare de anticorpi, care poarta numele de plasmocite; b. Limfocitele T (celulele T) se impart in 2 subpopulatii (fig. 1): T helper si T citotoxice. Limfocitele T helper (TH) sustin initierea si derularea raspunsului imun; la soareci, se disting 2 subpopulatii de limfocite TH, raportat la capacitatile lor functionale: - limfocitele TH1, cu rol in diferentierea celulelor citotoxice si activarea macrofagelor; ambele tipuri celulare sunt implicate in faza finala (efectorie) a raspunsului imun de tip celular; - limfocitele TH2 au acelasi rol pentru limfocitele B, responsabile de latura umorala a raspunsului imun (sinteza de anticorpi). Semnalele limfocitelor T helper sunt oferite fie prin interleukine, molecule solubile cu actiune strict locala, fie prin interrelatii intercelulare stabilite la nivelul receptorilor de suprafata. Ambele mecanisme necesita un contact intercelular strans. Limfocitele T citotoxice asigura eliminarea celulelor "non-self" sau a celulelor infectate viral.

Fig. 1 - Interreactia celula prezentatoare de antigen - limfocit T: subtipuri limfoide T helper si rolul acestora in imunitate. Celula prezentatoare de antigen (CPA) prezinta limfocitului T (LT) CD4 (helper) fragmente polipeptidice, rezultate din procesarea antigenului. Asociat, CPA ofera limfocitelor T o multitudine de alti stimuli (co-stimuli), atat prin intermediul receptorilor de suprafata, cat si prin sinteza de citokine. Exista mai multe subpopulatii limfoide T CD4 cu rol bine definit in imunitate. Limfocitele TH1 participa la activarea macrofagelor, a limfocitelor T citotoxic si a celulelor NK, in timp ce TH2 asigura activarea limfocitelor B (LB). c. Celulele prezentatoare de antigen (CPA) apartin in principal sistemului monocitomacrofagic. Rolul lor principal este acela de a prelua antigenele si de a le expune pe

suprafata, fie in stare nativa, fie sub forma de fragmente polipeptidice. Macrofagul ofera limfocitelor, care poseda receptori specifici pentru antigenul prezentat, semnale de activare, atat prin intermediul receptorilor de suprafata, cat si prin eliberarea de interleukine (IL-12 si Il-1). d. Fagocitele si celulele citotoxice. Fagocitoza reprezinta capacitatea unor celule de a prelua din mediu microorganisme sau alte particule. Granulocitele si macrofagele poseda o intensa activitate fagocitara. In timp ce granulocitele se afla in primele linii ale apararii nespecifice, monocitele si macrofagele, si mai rar granulocitele, actioneaza ca celule efectorii in raspunsul imun, deci in etapa finala a acestuia. Opsonizarea defineste acoperirea microorganismelor cu anticorpi sau fractiuni ale complementului, fapt care faciliteaza fagocitoza acestuia. e. Celulele natural killer (NK) efectoare distrug celule maligne sau infectate. Recunoasterea celulelor-tinta are loc prin 2 mecanisme; unul direct, inca incomplet elucidat si celalalt prin intermediul anticorpilor atasati pe suprafata celulei anormale (citotoxicitate celulara dependenta de anticorpi - CCDA). III. LIMFOCITELE SI IMUNITATEA MEDIATA CELULAR Limfocitele actioneaza ca celule efectoare in 2 situatii majore: distrugerea celulelor infectate si raspunsul imun in infectiile intracelulare. a. Distrugerea celulelor infectate. Aceasta se bazeaza pe dubla recunoastere a antigenelor non-self pe suprafata celulei-tinta (fig. 2), dar si a antigenelor complexului major de histocompatibilitate (CMH). CMH este un sistem genetic polimorf cu sute de alele, aflat in prezent in atentia generala, datorita rolului lui in rejetul de organ. Organismele intracelulare (exemplul clasic sunt virusurile) folosesc aparatul de sinteza al gazdei pentru producerea componentelor lor. Proteinele virale sintetizate sunt clivate de enzime proteolitice celulare (proces normal, in care sunt implicate si proteinele celulare), peptidele rezultate fiind preluate de antigenele de histocompatibilitate si expuse pe suprafata celulei. Sistemul imun nu raspunde la complexul CMH-antigen self, dar recunoaste si amorseaza raspunsul imun, in cazul in care CMH poarta un peptid non-self (viral). Mecanisme generale similare sunt implicate in eliminarea celulelor infectate de bacterii, paraziti si fungi.

Fig. 2 - Citotoxicitatea mediata celular; rolul limfocitelor T CD4 (helper). Celula prezentatoare de antigen prezinta fragmentul polipeptidic limfocitelor T (LT) CD4 (subtipul TH1), care ofera semnale stimulatoare (help) limfocitelor TCD8 (citotoxic). Acestea recunosc peptidul non-self (in cupa CMH cls. I) de pe suprafata celulei-tinta, initiind distrugerea acesteia.

b. Raspunsul imun in cazul infectiilor intracelulare. Acesta implica mai multe mecanisme efectorii: - limfocitele T citotoxice specifice sunt capabile sa distruga celulele infectate, care exprima pe suprafata complexe CMH si fragmente polipeptidice derivate din agentul infectios. - limfocitele TH recunosc peptide microbiene, exprimate pe membrana celulelor infectate, in special pe CPA. Limfocitele TH1 elibereaza citokine, precum y-interferon, care activeaza macrofagele, amplificand abilitarea acestora de a distruge agenti infectiosi intracelulari fagocitati. Mecanismele descrise au ca elemente efectorii principale limfocitele si macrofagele, constituind latura mediata celular a imunitatii, eliminarea agentilor infectiosi intracelulari fiind rolul fiziologic major al acesteia. Reactii imune mediate celular pot participa in patogenia unor afectiuni umane. Procese inflamatorii de la nivelul tegumentului, cunoscute sub numele de hipersensibilitate cutanata, sunt induse de contactul direct al antigenului cu pielea sau prin injectarea intradermica a acestuia. Hipersensibilitatea cutanata tardiva este mediata de limfocitele T, necesita sensibilizare anterioara cu acelasi antigen si are o perioada de latenta de 24 pana la 48 ore. Reprezinta o manifestare patologica a imunitatii celulare, iar perioada lunga de latenta, in comparatie cu reactiile de sensibilitate mediate umoral (prin anticorpi), le-au adus numele de reactii de hipersensibilitate intarziata. Transplantul de tesuturi intre indivizi diferiti genetic, apartinand aceleasi specii sau la specii diferite, este urmat de respingerea grefei. Imunitatea mediata celular declansata de diferentele CMH intre primitor si donator este responsabila de acest fenomen. IV. RELATIA SISTEM IMUN/RASPUNS IMUN Complexitatea si numarul mare de circuite reglatoare, implicate in raspunsul imun, face extrem de dificila integrarea cunostiintelor si intelegerea lor aprofundata. a. Depasirea barierelor naturale si a imunitatii nespecifice de un microorganism este urmata de preluarea si prelucrarea lui de o CPA (macrofag sau celula Langerhans). Procesarea (prelucrarea) antigenului se deruleaza pe perioada "excursiei" pe care CPA o face de la locul de penetrare al agentului infectios, pana la organul limfoid regional (ganglion limfatic). b. Celulele prezentatoare de antigen preiau antigenul, il proceseaza in fragmente polipeptidice cu identitate antigenica. Intracelular, aceste polipeptide sunt preluate de CMH, complexul rezultat fiind transportat la suprafata celulei. La nivelul organului limfoid secundar, exista mari oportunitati ca acest CPA sa intalneasca limfocite T helper, care sa posede receptori specifici pentru epitopii antigenului procesat. c. Interactiunea la nivelul receptorilor de suprafata intre CPA si limfocitele T, precum si eliberarea in micromediu de interleukine sintetizate de CPA (semnale costimulare), determina activarea, proliferarea si diferentierea celulelor T helper (fig. 3). d. Activarea celulele T helper induce proliferarea si diferentierea acestei populatii capabila sa sustina diferentierea si activitatea celulelor imune efectoare (fig. 3 si fig. 1):

Fig. 3 - Stimularea completa a limfocitului T (LT) determina proliferarea clonala a acestuia si diferentierea ulterioara catre limfocitul T efector, indiferent daca acesta este de tip helper (cazul de fata) sau citotoxic. - limfocitele helper TH1 activate secreta interleukine care influenteaza: macrofagele (amplifica gradul de activare si abilitatea de a distruge sau fagocita agentii patogeni, mecanism care contribuie la eliminarea germenilor intracelulari) si celulele T citotoxice, (foarte eficiente in eliminarea celulelor proprii infectate viral). - limfocitele helper TH2 activate secreta un set de citokine, care asista proliferarea si diferentierea limfocitelor B stimulate de antigen, catre plasmocit (plasmocitele au capacitatea de a sintetiza mari cantitati de anticorpi). e. Anticorpii specifici se leaga de membrana microorganismului, contribund la eliminarea acestora, prin unul sau mai multe mecanisme (liza mediata de complement, fagocitoza, CCDA). f. Raspunsul imun specific este un proces complex, care angreneaza mai multe tipuri de celule. Limfocitele raman insa "actorii principali", proliferarea, diferentierea acestora asigura specificitatea raspunsului imun si controlul activitatii celorlalte celule imune (macrofage), determinand in final indepartarea agresorului. Odata microorganismul indepartat, mecanismele de amplificare ale raspunsului imun dispar si prin feedback negativ, acesta diminua treptat. Stingerea raspunsului imun apare in principal ca rezultat a 2 factori, eliminarea stimulilor pozitivi generati de prezenta microorganismelor si activarea limfocitelor supresoare (limfocite T supresoare). g. Dupa stingerea raspunsului imun, va persista o populatie reziduala de limfocite, celule de memorie, cu specificitate inalta pentru antigenul implicat, care au o durata lunga de viata. Limfocitele de memorie sunt atat de linie B, cat si de linie T. Ambele subtipuri celulare asigura: protectia oferita de vaccinare, raspunsul imun secundar si rejectia accelerata a grefei la primitorii de grefe multiple. V. IMUNOLOGIA SI MEDICINA Imunologia ofera numeroase aplicatii in medicina: diagnostic, tratament, profilaxie si explicatii etiopatogenice. a. Specificitatea deosebita a reactiei antigen/anticorp este larg aplicata in identificarea unui numar considerabil de substante, cu #### antigena. b. Obtinerea anticorpilor monoclonali si largirea continua a paletei acestora, a avut un impact enorm in domeniul imunodiagnosticului si al imunoterapiei. c. Utilizarea terapeutica a interleukinelor, a celulelor citotoxice activate, a anticorpilor monoclonali, a anticorpilor antiidiotip si imunotoxinelor, intr-un cuvant, imunoterapia este asiduu investigata in oncologie si transplantul de organe. d. Studiul imunodeficientelor umane mostenite si dobandite a furnizat informatii, care au

contribuit la intelegerea sistemului imun uman, oferind oportunitati pentru dezvoltarea terapiilor corectoare. Sindromul de imunodeficienta dobandita (SIDA) subliniaza alterarea profunda a sistemului imun, responsabila de incidenta crescuta a infectiilor oportuniste (germeni care in mod normal nu determina infectii la un organism sanatos) si a unor neoplazii, precum sindromul Kaposi si limfoamele maligne agresive cu localizari particulare. e. Importanta mentinerii tolerantei la self in viata adulta, poate fi inteleasa numai prin discutarea consecintelor pe care le poate avea pierderea acesteia. Multe boli, unele afectand un singur organ, altele cu afectare multisistemica au fost clasificate ca boli autoimune. Patogenia lor este legata de ruperea tolerantei la self si amorsarea unui raspuns imun impotriva celulelor si tesuturilor proprii. Autoimunitatea poate avea caracter primar sau poate fi factor de agravare in evolutia unei boli. Modificarile patologice pot fi legate de o injurie autoimuna primara si de sechelele acesteia asupra unui organ (tiroiditele autoimune), fie pot reprezenta un factor asociat de agravare a bolii (hepatitele cronice, glomerulonefritele cronice, etc.). Noile ipoteze si date privind lipsa de raspuns a sistemului imun la unele antigenele administrate per os, ofera sperante in terapia bolilor autoimune. f. Reactiile de hipersensibilitate reprezinta un exemplu, care demonstreaza ca nu toate reactiile imune impotriva antigenelor non-self sunt benefice. Ori de cate ori delicata balanta a sistemului imun, raspunzatoare de modularea intensitatii reactiilor la anumite antigene, este rupta, apar alergii cutanate, astm bronsic, febra de fan, boli care au la baza reactii de hipersensibilitate de tip imediat. Manipularea raspunsului imun la bolnavii cu reactii de hipersensibilitate de tip imediat (desensibilizarea) a fost incununata de succes, dovedind viabilitatea imunoterapiei in acest domeniu. g. Toleranta imuna la antigenele non-self, care apare in timpul sarcinii normale, continua sa fie o tema de cercetare intensa, in speranta descoperirii unor metode de manipulare a raspunsului imun, aplicabile la bolnavii care necesita transplant de organe si in tratamentul unor forme de infertilitate feminina. h. Ipoteza ca celulele maligne sunt eliminate de sistemul imun (conceptul de supraveghere imuna antineoplazica) si ca malignitatile se dezvolta cand celulele anormale scapa de sub controlul protector al sistemului imun, nu a fost dovedita. Majoritatea neoplaziilor solide umane (san, bronhopulmonar, digestive) apar la persoane fara anomalii imune semnificative. Incercarile de amplificare a raspunsului imun la antigene tumorale prin manipulare in vivo sau in vitro, sunt evaluate in unele neoplazii. Bibliografie selectiva Aderem A, Underhill DM - Mechanisms of phagocytosis in macrophages, Annual Rev Immunol, 1999, 17, p 593-623. Catherine Sheehan - Introduction to immunology, In: Clinical Immunology, Principles and Laboratory Diagnosis 2nd, ed., MS Lippincott-Raven 1997. Hammerling GJ, Vogt AB, Kropshofer H - Antigen processing and presentation-towards the millennium, Immunol Rev, dec, 1999, 172, p 5-9. Ivan Roitt, Jonathan Brostoff, David Male - Cells involved in the immune response, In: Immunology, 5th ed., Mosby, 1998. Mekori YA, Metcalfe DD - Mast cells in innate immunity, Immunol Rev, feb. 2000, 173, p 131-40. Klein L, Kyewski B - Self-antigen presentation by thymic stromal cells: a subtle division of labor, Curr Opin Immunol, apr 2000, 12(2), p 179-86. Rolink AG, Melchers F, Andersson J - The transition from immature to mature B cells, Curr Topics Microbiol Immunol, 1999, 246, p 39-43. Scapini P, Lapinet-Vera JA si colab. - The neutrophil as a cellular source of chemokines,

Immunol Rev, 1999, 177, p 195-203. Song WC, Sarrias MR, Lambris JD - Complement and innate immunity, Immunopharmacol, 1999, 49(1-2), p 187-98. Walport MJ - Complement. First of two parts, New Engl J Med, 2001, 344(14), p 1058-66.

The key to a healthy immune system is its remarkable ability to distinguish between the bodys own cells (self) and foreign cells (nonself). The bodys immune defenses normally coexist peacefully with cells that carry distinctive "self" marker molecules. But when immune defenders encounter cells or organisms carrying markers that say "foreign," they quickly launch an attack.

Anything that can trigger this immune response is called an antigen. An antigen can be a microbe such as a virus, or even a part of a microbe. Tissues or cells from another person (except an identical twin) also carry nonself markers and act as antigens. This explains why tissue transplants may be rejected. Antibodies are the proteins that can recognize (match) specific antigens. An antibody matches an antigen much as a key matches a lock. Whenever antigen and antibody interlock, the antibody marks the antigen for destruction. Each antibody is made up of two identical heavy chains and two identical light chains, shaped to form a Y. The sections that make up the tips of the Y's arms vary greatly from one antibody to another; this is called the variable region. It is these unique contours in the antigen-binding site that allow the antibody to recognize a matching antigen. The stem of the Y links the antibody to other participants in the immune defenses. This area is identical in all antibodies of the same class--for instance, all IgEs--and is called the constant region.

Antibodies belong to a family of large protein molecules known as immunoglobulins. Different classes play different roles in the immune defense strategy. Scientists have identified nine chemically distinct classes of human immunoglobulins: four kinds of IgG and two kinds of IgA, plus IgM, IgE, and IgD. Immunoglobulins G, D, and E are similar in appearance. IgG, the major immunoglobulin in the blood, is also able to enter tissue spaces; it works efficiently to coat microorganisms, speeding their destruction by other cells in the immune system. IgD is almost exclusively found inserted into the membrane of B cells, where it somehow regulates the cell's activation. IgE is normally present in only trace amounts, but it is responsible for the symptoms of allergy. IgA--a doublet--guards the entrance to the body. It concentrates in body fluids such as tears, saliva, and secretions of the respiratory and gastrointestinal tracts. IgM usually combines in star-shaped clusters. It tends to remain in the bloodstream, where it is very effective in killing bacteria.

Themes > Science > Life Sciences > General Biology > Physiology > Lymphatic System and Immunity > Antibody-mediated Immunity

Stages in this process are:

1. antigen detection 2. activation of helper T cells 3. antibody production by B cells

Each stage is directed by a specific cell type. Macrophages Macrophages are white blood cells that continually search for foreign (nonself) antigenic molecules, viruses, or microbes. When found, the macrophages engulfs and destroys them. Small fragments of the antigen are displayed on the outer surface of the macrophage plasma membrane.

The role of macrophages in the formation of antibodies. Image from Purves et al., Life: The Science of Biology, 4th Edition, by Sinauer Associates (www.sinauer.com) and WH Freeman (www.whfreeman.com), used with permission. Helper T Cells Helper T cells are macrophages that become activated when they encounter the antigens now displayed on the macrophage surface. Activated T cells identify and activate B cells.

The display path of an antigen as accomplished by a macrophage. Image from Purves et al., Life: The Science of Biology, 4th Edition, by Sinauer Associates (www.sinauer.com) and WH Freeman (www.whfreeman.com), used with permission. B Cells B cells divide, forming plasma cells and B memory cells. Plasma cells make and release between 2000 and 20,000 antibody molecules per second into the blood for the next four or five days. B memory cells live for months or years, and are part of the immune memory system.

The activation of T cells by the action of macrophages and interleukin-2. Images from Purves et al., Life: The Science of Biology, 4th Edition, by Sinauer Associates (www.sinauer.com) and WH Freeman (www.whfreeman.com), used with permission. Antibodies Antibodies bind to specific antigens in a lock-and-key fashion, forming an antigenantibody complex. Antibodies are a type of protein molecule known as immunoglobulins. There are five classes of immunoglobulins: IgG, IgA, IgD, IgE, and IgM.

The five classes of Ig antibodies. Image from Purves et al., Life: The Science of Biology, 4th Edition, by Sinauer Associates (www.sinauer.com) and WH Freeman (www.whfreeman.com), used with permission. Antibodies are Y-shaped molecules composed of two identical long polypeptide (Heavy or H chains) and two identical short polypeptides (Light or L chains). Function

of antibodies includes:

1. Recognition and binding to antigens 2. Inactivation of the antigen

Structural regions of an antibody molecule. Image from Purves et al., Life: The Science of Biology, 4th Edition, by Sinauer Associates (www.sinauer.com) and WH Freeman (www.whfreeman.com), used with permission. A unique antigenic determinant recognizes and binds to a site on the antigen, leading to the destruction of the antigen in several ways. The ends of the Y are the antigen-combining site that is different for each antigen. Click here to learn more about the different classes of antibodies.

Formation of an antigen-antibody complex. Image from Purves et al., Life: The Science of Biology, 4th Edition, by Sinauer Associates (www.sinauer.com) and WH

Freeman (www.whfreeman.com), used with permission. Helper T cells activate B cells that produce antibodies. Supressor T cells slow down and stop the immune response of B and T cells, serving as an off switch for the immune system. Cytotoxic (or killer) T cells destroy body cells infected with a virus or bacteria. Memory T cells remain in the body awaiting the reintroduction of the antigen. A cell infected with a virus will display viral antigens on its plasma membrane. Killer T cells recognize the viral antigens and attach to that cell's plasma membrane. The T cells secrete proteins that punch holes in the infected cell's plasma membrane. The infected cell's cytoplasm leaks out, the cell dies, and is removed by phagocytes. Killer T cells may also bind to cells of transplanted organs. The immune system is the major component of this defense. Lymphocytes, monocytes, lymph organs, and lymph vessels make up the system. The immune system is able to distinguish self from non-self. Antigens are chemicals on the surface of a cell. All cells have these. The immune system checks cells and identifies them as "self" or "non-self". Antibodies are proteins produced by certain lymphocytes in response to a specific antigen. B-lymphocytes and T-lymphocytes produce the antibodies. B-lymphocytes become plasma cells which then generate antibodies. T lymphocytes attack cells which bear antigens they recognize. They also mediate the immune response. The immune system and memory of infections Secondary immunity, the resistance to certain diseases after having had them once, results from production of Memory B and T cells during the first exposure to the antigen. A second exposure to the same antigen produces a more massive and faster response. The secondary response is the basis for vaccination. Vaccination Vaccination is a term derived from the Latin vacca (cow, after the cowpox material used by Edward Jenner in the first vaccination). A vaccine stimulates the antibody production and formation of memory cells without causing of the disease. Vaccines are made from killed pathogens or weakened strains that cause antibody production but not the disease. Recombinant DNA techniques can now be used to develop even safer vaccines. The immune system can develop long-term immunity to some diseases. Man can use this to develop vaccines, which produce induced immunity. Active immunity develops after an illness or vaccine. Vaccines are weakened (or killed) viruses or bacteria that prompt the development of antibodies. Application of biotechnology allows development of vaccines that are the protein (antigen) which in no way can cause the disease. Passive immunity is the type of immunity when the individual is given antibodies to combat a specific disease. Passive immunity is short-lived.
Information provided by: http://gened.emc.maricopa.edu

IV/SIDA: receptori, coreceptori si terapiile cu inhibitori de intrare (E.I.)

REZUMAT Dezvoltarea unor tulpini de HIV multi -drog rezistente fata de t erapia antiretrovirala (TARV) impune cautarea unor noi clase de medicamente capabile sa inhibe penetrarea intracelulara a HIV. Lucrarea de fata reprezinta o trecere actuala in revista a noilor clase de ARV denumite generic inhibitori de intrare (E.I.). C uvinte-cheie: ARV, inhibitori de intrare, HIV, gp120, gp41 ABSTRACT The development of HIV samples multi -drug resistantes to the ARV therapy, imposed the research of new classes of antiviral drugs, wich are able to inhibit the entry mechanisms of virus into host-cells. This work represent a general review on these new drugs, named the entry inhibitors(E.I.). Keywords: ARV, entry inhibitors, HIV, gp120, gp41 INTRODUCERE Datorita dezvoltarii rezistentei multiple si progresive a HIV fata de multiplele clase de medicamente antiretrovirale (ARV) utilizate la ora actuala, al caror mod de actiune inhibitorie se efectueaza, intracelular, asupra enzimelor virale de tipul reverstranscriptazelor, proteazelor etc. a devenit necesara gasirea unor noi modalitati de abordare terapeutica - prin blocarea atasarii si penetrarii intracelulare a HIV, deci inainte ca acesta sa poata patrunde si sa se replice in interiorul celuleiga zda. Pe de alta parte, aparitia unui numar tot mai mare de infectii noi cu HIV se datoreaza si multiplicarii unor tulpini virale care prezinta rezistenta la tot mai multi inhibitori de reverstranscriptaza (IRT) sau de proteaza (IP) virala. Dezvoltarea unor no i clase de ARV care vizeaza si actioneaza in anumite momente ale ciclului de multiplicare virala a facut si va face posibila supresia tulpinilor rezistente la IRT si IP, iar, pe de alta parte, atunci cnd le folosim in combinatie cu ARV existente, se va putea obtine mult mai usor un efect antiviral sustinut. Att anvelopa, ct si proteinele celulare de suprafata implicate in intrarea HIV in celula -gazda se constituie in tinte terapeutice pentru noile clase de antiretrovirale, denumite global inhibitori de intrare (entry inhibitors; E.I.). Pentru a intelege mecanismele prin care actioneaza noii E.I., e necesar un scurt rapel asupra complexelor etape de atasare, aderenta, fuziune si intrare parcurse de HIV in procesul de infectare a celulei -gazda. STRUCTURA HIV SI VULNERABILITATEA CELULARA

HIV este un virus cu anvelopa, fiind inconjurat de o membrana lipidica. La fel ca oricare alt virus prevazut cu anvelopa, HIV poate fi transmis prin fluidele corpului, din cauza ca membranele biologice sunt sensibile la deshid ratare si la alte modificari nonfiziologice ale mediului. Pentru ca HIV sa infecteze celula -gazda, el isi va introduce genomul de ARN si propriile structuri ale anvelopei, precum si aparatul sau replicativ in

citoplasma acesteia, invingnd bariera reprezen tata de membrana celulara.

In acest scop, HIV foloseste o singura proteina care proemina in exteriorul membranei virale, numita proteina de anvelopa Env. Inhibitorii de intrare blocheaza diverse etape ale acestui proces, fie prin legare de proteina env ., fie prin legarea si blocarea receptorilor corespunzatori acesteia (figura 1). DINAMICA INFECTIEI CELULARE CU HIV (figura 2) Schematic, infectia cu HIV a celuleigazda parcurge mai multe etape: 1. Atasarea HIV la membrana celulei - gazda prin cuplarea proteinei virale env- domeniul gp120 - cu receptorul membranar CD4. Molecula de CD4 este considerata principalul receptor pentru cuplarea HIV cu celula -gazda. 2. Cuplarea gp 120 se face cu unul din cei 2 coreceptori chemokinici ai gazdei, in functie de tropi smul tulpinii HIVinfectante: CCR5- tulpini numite R5-tropice, respectiv pacienti R5; CXCR4 - tulpini numite X4-tropice, respectiv pacienti X4; exista pentru anumite grupe populationale, determinate genetic, tulpini de HIV -1 care leaga att receptorii R5, ct si pe cei X4 - tulpinile dual tropice. Coreceptorii chemokinici sunt veritabili triggeri pentru realizarea modificarilor conformationale finale ce vor media fuziunea dintre membranele celulare si cele virale. In 1996, s -a identificat un izolat genetic: doi subiecti nu au fost infectati cu HIV, in ciuda unor expuneri repetate la acest virus. S -a demonstrat ca ambii subiecti mostenisera un defect genetic, constnd in deletia a 32 de nucleotide din gena ce codeaza CCR5. Ca urmare, la acesti indivizi, proteina CCR5 - coreceptorul preferential al HIV - nu se exprima. Ei mostenisera doua gene CCR5 deficitare, cte una de la fiecare parinte.

Actualmente, subiectii se clasifica in 3 grupe CCR5: - prima, descrisa mai sus, reprezinta indivizii 32 homozigoti. Ei sunt foarte rezistenti la infectia cu HIV - non-progresori??; - a doua - indivizii 32 heterozigoti. Ei mostenesc o singura gena CCR5 deficitara si, desi sunt receptivi la infectia cu HIV, progreseaza mai lent catre SIDA - progresori lenti; - a treia cuprinde indivizii cu doua copii wild -type a genei CCR5, ceea ce determina prezenta unui numar normal de coreceptori;

Indivizii - 32 homozigoti se intlnesc printre caucazienii cu descendenta nord -europeana, reprezentnd aproximativ 1% din populatie, iar cei 32 heterozigoti - aproximativ 15%. Gena 32 este absenta in rndurile populatiei africane si asiatice. Alti receptori chemokinici utilizati de HIV pentru a realiza intrarea in celula - gazda sunt: CCR3, BOB/GPR15, Bonzo/ STRL33/TYMSTR, CCR2, CCR8, CX3CR1/V28 & GPR1 etc. Distributia receptorilor R5 si X4 are un determinism genetic populational, transmis sub forma heterozigota sau homozigota, fapt ce determina evolutia sub terapie a pacientilor, in unul din modelele: normo, mediu sau lon g progresori. Cuplarea HIV la celula-gazda se face in prezenta Ag celulare HLA - clasa II. 3. Fuziunea intermembranara si penetrarea in celula-gazda implica participarea celor doua domenii ale glicoproteinelor membranare ale HIV:

y y y

- subunitatea/domeniul gp120 al env este responsabila de legarea de receptor; - subunitatea gp41 traverseaza membrana/anvelopa virala si formeaza baza subunitatii gp120, pe care sunt pozitionate subunitatile gp120; - subunitatea gp41 produce reactia si complexul de fuziune prin care anvelopa HIV se contopeste cu membrana gazdei, deversndu-si continutul in citoplasma celulei-gazda. Terapia cu E.I. determina, in timp, conversii selective ale coreceptorilor utilizati de HIV, de obicei switch -uri - de la R5 (dominant in stadiile precoce ale infectiei) - la X4, limitnd progresiv, eficacitatea medicamentelor.

Pentru a intelege modul de actiune a inhibitorilor de intrare (E.I.), e necesara prezentarea ceva mai detaliata a procesului si a structurilor implicate in dinamica infectiei virale ce va conduce, in final, la atasarea si fuziunea HIV cu celulele -gazdei.

1. STRUCTURILE IMPLICATE: PROTEINA ENV SI SUBUNITATILE SALE In structura normala a HIV (figura 3), proteina Env traverseaza membrana virala, o mare parte din masa sa aparnd ca o protuberanta a suprafetei anvelopei/membranei virale, sub forma unor spiculi . Structura proteinei Env este una trimerica si contine trei subunitati identice strns asociate cu altele. Fiecare subunitate este alcatuita din cte doua glicoproteine (gp ), denumite gp120 si gp41. Deci, fiecare trimer al Env contine 3 gp120 si 3 gp 41.

1. Intr-o prima faza, proteina trimerica Env se leaga de receptorul CD4 de suprafata al celulelor-gazda (macrofage, limfocite T etc) . Acest mecanism poate fi blocat terapeutic prin Ac anti gp120 sau anti-CD4, precum si prin alte molecule terapeutice aflate in experimentare. Structura cristalografica a gp120 arata ca, in conditiile in care fiecare receptor CD4 se leaga de gp120, aceasta modificarea conformationala - indusa de receptorul CD4 devine semnificativa: portiuni ale sitului de legare al coreceptor ului sunt separate in proteina nativa gp120, dar actioneaza impreuna asupra legarii receptorului CD4. Daca este prevenita sau blocata legarea receptorului CD4 sau daca modificarile conformationale induse de receptorul CD4 vor fi prevenite/ blocate, protein a Env nu se va mai putea lega de coreceptorul corespunzator, iar HIV nu va mai putea infecta celula. Dupa legarea HIV de receptorul principal - CD4, al gazdei, urmeaza: 2. A II-a faza consta in legarea/atasarea glicoproteinelor HIV de coreceptorii celulari chemokinici. Ca urmare, gp120 se poate lega, fie de coreceptorul CCR5, fie de coreceptorul CXCR4, in functie de tipul tulpinii HIV. Subunitatea gp120, care constituie portiunea externa a anvelopei virale, ramne atasata de virion prin legaturi necovalente, prin intermediul unitatii transmembranare a HIV - gp 41. Legarea de coreceptori induce modificari importante ale gp41, constnd in rearanjari alosterice ale structurii gp41. Aceste rearanjari implica asocierea antiparalela a unor heptade helicale infa surate, numite H1 si H2, localizate in ectodomeniul complexului trimeric gp41, deja mentionat. Domeniile helicale HR1 si HL2 ale gp41 se vor infasura unul in jurul celuilalt, formnd o proeminenta structurala (un ghem) cu 6 helixuri. Aceste infasurari sau structuri fermoar vor determina ambele membrane sa fuzioneze (figura 4). Etapa de realizare a fermoarului, ce se inchide intre cele doua domenii - HR1 si HR2 - poate fi blocata terapeutic prin Enfuvirtide sau prin produse aflate in experiment de labora tor, de ex. T-1249. Legarea de coreceptori este declansatorul ce va induce fuziunea cu membranele celulare. Consecutiv cuplajului va fi exprimat si expus capatul amino-terminal al gp41 numit peptid de fuziune, care se insereaza in membrana celulara, cont ribuind la cuplajul si fuziunea dintre anvelopa virala si membrana celulei.

3. Procesul de fuziune. Pasul fundamental in procesul de fuziune implica interactiunea dintre cele doua motive peptidice diferite (HR1 si HR2). Dezvoltarea inhibitorilor de fuziu ne are tendinta de a se concentra pe acele molecule care actioneaza ca peptide mimetice, blocnd interactiunile necesare intrarii HIV in celula. Inainte de formarea structurii hairpin - care promoveaza fuziunea de membrana -, o structura pre-hairpin a gp41 intermediaza formarea complexului peptidic de fuziune si expune cele doua portiuni separate ale structurii 6 -helicale. Peptidul mimetic al unui inhibitor de fuziune actioneaza tocmai in acest stadiu prin legarea prelungirilor hidrofobice ale regiunii tr imerice infasurate HR1, blocnd structura gp41 aflata in forma tranzitionala de pre -hairpin si prevenind, astfel, formarea ghemului 6-helical al structurii hairpin prin care, aidoma unui ac de par sau a unui harpon, virusul va traversa membrana celular a si va patrunde in citoplasma acesteia. Peptidele de fuziune se vor insera in membranele celulelor gazdei si din acest moment subunitatile gp41 devin componente integrale ale celor doua membrane: membrana celulara - in virtutea peptidului de fuziune si membrana virala - in virtutea domeniului transmembranar al proteinei gp41. Structura rezultata poate fi asemanata unui ac de par (structura hairpin). INHIBITORII DE INTRARE AI HIV (figura 6) Medicamentele ARV folosite pna acum actioneaza asupra virusului care a penetrat deja in celula gazda, prin mecanisme ce inhiba enzimele utilizate de HIV pentru replicarea si multiplicarea sa, respectiv reverstranscriptaza virala/RT si polimerazele virale/I.P. In consecinta, datorita modului de actiune, medicatia ARV se clasifica in:

y - inhibitori de RT, ce contin doua subtipuri, inhibitori nucleozidici/INRT si inhibitori

non-nucleozidici/ INNRT; y - inhibitori de polimeraze/IP. La ora actuala sunt in studii clinice sau au intrat pe piata medicamentului o serie de molecule terapeutice care actioneaza asupra HIV in afara celuleigazda, impiedicnd fixarea sa pe receptorii membranari ai gazdei sau

blocnd fuziunea anvelopei virusului, cu membrana celulei-gazda si intrarea virusului in celula-gazda. Pna acum, din aceasta clasa se cunosc urmatoarele tipuri de molecule terapeutice, numite inhibitori de intrare

y y y y

(E.I.): - blocanti ai receptorului CD4; - inhibitori ai coreceptorilor HIV, respectiv ai coreceptorului CCR5 si ai coreceptorului CXCR4; - inhibitorii de fuziune; - alti inhibitori, non-CCR5, non- CXCR4.

NOII INHIBITORI DE INTRARE: DE CE? Necesitatea inovarii unor noi concepte de actiune terapeutica anti-HIV se impune azi intr -un mod deosebit de acut, din varii cauze, pe care le vom enumera mai jos:

y 1. Pentru ca terapia actuala se limiteaza doar la asocieri de ARV (IRT si IP), ce produc doar inhibarea ctorva enzime necesare replicarii intracelulare a HIV, fata de care
s-au produs, in timp, multiple mutatii de rezistenta. De exemplu: (AZT/3TC/ABC) combinatie mai putin durabila dect AZT/3TC/(PI sau NNRTI) y 2. O serie de efecte secundare ale TARV utilizate pna acum pot conduce la evenimente indezirabile, precum:

y y y

3. Rezistenta la HAART si efecte toxice secundare si metabolice care vor induce progresiv situatii c ritice pentru pacienti. 4. La acestea se adauga: - rezistenta incrucisata tot mai frecventa - (TAM, NNRTI etc.);

- intoleranta incrucisata tot mai accentuata (neuropatie, tulburari gastrointestinale, efecte metabolice secundare, reactii adverse); - combinatiile terapeutice compatibile de tip HAART sunt relativ limitate prin intreferente si efecte toxice/metabolice cumulative, fiind reduse numeric. Ca urmare, solutiile TARV actuale converg spre sinteza unor noi ARV cu mecanisme potente de actiune (figura 7). Noile molecule terapeutice inhibitoare ale diverselor etape de atasare, cuplaj, fuziune si penetrare a HIV in celulele-gazdei sunt foarte multe. Unele din acestea se afla in stadiul experimentelor de laborator, pe culturi de celule animale sau umane sau in experiment clinic pe animale vii ori in experiment clinic uman. Inhibitorii de intrare reprezinta, poate, terapia viitorului in infectia HIV/boala SIDA. E.I. realizeaza in practica un concept nou: blocarea intrarii HIV in celula -gazda, fapt ce prezinta avantaje deosebite fata de medicamentele folosite pna acum. Dar blocarea receptorilor CD4 si a celor chemokinici ar putea induce, in timp, sindroame imuno-clinice noi, prin anihilarea competitionala a actiunii chemokinelor asupra efectorilor celulari imuni. Daca va fi asa, vom vedea in anii ce vin. In tabelul 1 se afla un scurt inventar al E.I. sintetizati pna in pr ezent. Din toti inhibitorii de intrare utilizati in clinica umana pna acum, au ramas in cursa doar ctiva, pe care ii prezentam in tabelul 2. INHIBITORII DE ATASARE Desi studiile mai vechi ce utilizau ca inhibitori molecule CD4 solubile au esuat, inhibi torii formati din molecule mici ce blocheaza interactiunile dintre CD4 si gp120 reprezinta azi o mare promisiune terapeutica. Molecula-prototip BMS-378806 prezinta, in vitro, o puternica activitate fata de virusurile R5 si X4 ale subtipului B, dar o acti vitate redusa sau absenta fata de virusul HIV-2. Studierea sitului de mutageneza directa arata ca respectivul compus leaga specific receptorul CD4 de buzunarulgp120. Folosit la macac, prin administrare intravaginala - ca microbicid - inhiba infectarea limfocitelor T si in secretia tesutului cervical, ex vivo, iar in vivo asigura o protectie daca e aplicat cu 6 ore inainte de administrarea intravaginala. PRO-542 - un inhibitor de atasare, aflat in faza a III de studiu, este o combinatie dintre o proteina de fuziune si un Ac monoclonal uman, care se leaga de gp120 prevenind atasarea env de CD4. Are un timp 1/2 de 3 -4 zile. Compusul BMS-488043 a redus cu 1 log 10 nivelul plasmatic ARN al HIV - 1, in administrare la subiecti naivi, dupa 10 zile de terapie. Din pacate, pentru obtinerea acestui rezultat, au fost necesare doze mari: 1.800 mg; din acest motiv studiul a fost oprit. INHIBITORI DE POST-ATASARE Anticorpii monoclonali (mAb) TNX 355 - o Ig G4- mAb, umanizata, care inhiba intrarea HIV -1 intr-un mod particular, legnd domeniul extracelular 2 al CD4 provenind de la maimute sau om si prevenind, astfel, intrarea postlegare a HIV -1 de CD4. Acest compus ce actioneaza pe domeniul 1 nu trebuie sa interfereze cu functia imuna de prezentare a antigenului. Datele preliminare asupra studiului de faza II prezentate la cea de -a 13 Conferinta privind retrovirusurile si infectiile oportuniste - CROI 2006, releva urmatoarele: IC50 al medicamentului a fost de 10 -280 ng/ml, TNX355 parnd ca nu depinde ca efect de tropismul coreceptorilor pentru HIV. In saptamna a 9 -a, 3 dintre cei 19 subiecti tratati au ramas total susceptibili fata de acest agent, in timp ce ceilalti 16, experimentati ARV, au prezentat o reducere a activitatii drogului c u 19-60%. Au fost izolate subclonele virale, fiind clasificate in raport cu sensibilitatea la drog. Exista un risc de neutralizare a efectului produs de drog care creste pe masura expunerii la acesta. INHIBITORII DE CORECEPTORI A. Inhibitorii de CCR5 (CCR5 -i)

Pentru ca majoritatea pacientilor aflati in stadiile timpurii ale infectiei cu HIV sunt R5, este logic ca ei sa fie primii candidati pentru terapia cu inhibitori de CCR5. PRO 140 este un Ac monoclonal umanizat, inhibitor de CCR5, ce contine imunoglobulina G4. A fost administrat i.v. la voluntari de sex masculin sanatosi, in doze unice de: 0,1, 0,5, 1,0 si 5 mg/kgc - in comparatie secventiala cu un placebo, in raport 4:1. Toti cei 20 de subiecti inclusi in studiu nu au prezentat la finele acestuia efecte secundare. Concentratiile serice de drog au crescut proportional cu doza, timpul 1/2 fiind de circa 2 saptamni. Recoltarea de limfocite CCR5 de la subiectii ce au primit o doza de 5 mg/kgc a aratat un grad de acoperire a receptorilor CCR5 - prin drog, de peste 60 de zile. mAb004, un alt Ac. uman monoclonal inhibitor, a fost experimentat in vitro timp de 24 de saptamni, demonstrnd o tendinta redusa de a dezvolta rezistenta. Actualmente este in studiu clinic de faza I, fiind administrat la pacienti naivi. Un alt compus inhibito r de CCR5 a fost comunicat de Kazuhisa Yoshimura si col. (Kumamoto University, Japan). Acesti cercetatori au produs Ac monoclonal KD-247 dirijat contra secventelor conservate - V3 ale buclei variabile, aratnd ca prezinta un grad inalt de sinergism cu inhibitorii CCR 5 disponibili actual. La concentratii mari de drog de 1.000 g/ml a fost posibil sa se selecteze o mutatie la nivelul buclei V3 - G314E - care confera rezistenta completa fata de drog, dar care il face hipersensibil fata de alti agenti terapeutici. B. Inhibitorii cu molecula mica: Aplavirocul, Maravirocul si Vicrivirocul sunt mici molecule inhibitorii care blocheaza semnalul de raspuns la stimularea cu liganzii naturali (MIP -1 , MIP-1 , RANTES) la concentratii nanomoleculare, impiedicnd astfel, in vitro, infectia cu HIV-1, la concentratii similare. Studii efectuate la pacientii infectati cu HIV -1 au aratat o prompta reducere a viremiei cu 1,5 -1,7 log10 copii/ml, dupa 10-14 zile de administrare a unei singure doze. Desi introduse recent, administrarea clini ca a CCR5-i a produs deja unele probleme: - aplavirocul a fost retras din cauza hepatotoxicitatii, evidentiindu -se necroza hepatocelulara insotita de niveluri mari ale ALT si bilirubinei; - s-a raportat recent un caz de toxicitate la Maraviroc, dar care ar fi putut fi indus de asocierea terapeutica cu izoniazida si acetaminofen; finalizarea unui studiu de faza II cu vicriviroc efectuat pe pacienti naivi, ce primeau doze fixe de zidovudin/ lamivudin + vicriviroc sau efavirenz a aratat ca bratul de studiu c e asocia vicrivirocul a avut performante inferioare, in raport de bratul cu efavirenz. Ca urmare, studiul a fost oprit; - studii de terapie cu Vicriviroc au aratat o asociere crescuta cu aparitia de limfoame. Se pare ca emergenta de tulpini virale X -tropice, dupa terapia cu CCR5-I, nu reprezinta un mecanism major de rezistenta, numarul estimat al acestor tulpini de switch fiind inca redus. Maravirocul este un antagonist CCR5 reversibil si selectiv, aflat in faze II/III de studiu. La fel ca si vicrivirocul, este biodisponibil oral. Cele mai noi informatii asupra Maravirocului, raportate la cea de-a 13 Conferinta asupra retrovirusurilor si infectiilor oportuniste CROI, 2006, de Pulen

si col., prezinta rezultatele aplicarii maravirocului in clinica umana, c omparativ cu un alt antagonist al CCR5 benzimidazolul: maravirocul exhiba markerii supresiei virale si poseda o lunga disociatie a T1/2. Datele sugereaza ca aceasta activitate mai buna se datoreaza preponderent timpului prelungit de ocupare a receptorulu i CCR5.

Maravirocul are urmatoarele caracteristici:

y y y

y y y y y y

- se leaga selectiv de CCR5; - nu are efect asupra altor functii imune, inclusiv a celor legate de activitatea receptorilor de tip chemokinic (ex. cele legate de activitatea CCR2); - nu modifica semnificativ farmacologic activitatea enzimelor si a canalelor ionice, inclusiv a activitatii genei go-go (hERG), care codeaza canalele ionice utilizate pentru predictia interferentei cu sistemul de conducere al miocardului; - blocheaza selectiv legarea de liganzii naturali ai receptorilor (macrofage, proteinele inflamatorii MIP -1 si , RANTES); - nu induce suprareglarea exprimarii pe suprafata celulelor a CCR5 si nu interfereaza cu semnalul intracelular mediat-chemokinic. Pe de alta parte, activitatea antivirala a maravirocului arata ca: - este activ la concentratii de aplicare clinica fata de diverse subtipuri virale CCR5 -tropice provenite din diverse areale geografice: A-G, J,O; pentru o IC50 = 2.0 nM- 0,5-13,4 nM; - este activ fata de izolate clinice rezistente la alte TARV de uz curent; - prezinta efecte sinergice sau aditive in combinatie cu ARV existente, inclusiv cu enfuvirtide; Administrat la animal a dovedit o buna biodisponibilitate orala si o posologie redusa.

Vicrivirocul (SCH417690) (VIC) Studiile in vitro au aratat ca VIC previne activarea coreceptorilor CCR5 prin intermediul liganzilor naturali ai acestora, in concentratii nanomoleculare mici. VIC s -a testat contra a 30 de izolate virale HIV -1, provenite din diverse regiuni ale lumii, drogul dovedindu -se un puternic inhibitor si prezentnd o buna sinergie cu alte TARV. Utiliznd celule provenite de la aceeasi donori, in inoculi similari, VIC s -a dovedit de 2-40 de ori mai potent dect antagonistul SCH-C. VIC poseda o puternica activitate antivirala fata de acele izolate CCR5 -tropice, care prezinta multiple mutatii de rezistenta fata de inhibitorii de RVT si/sau IP si chiar fata de tulpinile virale rezistente la enfuvirtide. VIC n u afecteaza metabolismul cit ocromului 450, nu prezinta un grad ridicat de legare de proteinele plasmatice (16%) si are biodisponibilitate foarte buna (89 -90%) pe cale orala. In primele studii cu SCH -C (un antagonist derivat-VIC) s-au constatat efecte secundare cardiace datorate inhib itiei fluxului de K+ mediat de gena ether -ago- go, ce codeaza aceste canale. Compararea efectelor cardiace ale VIC cu SCH -C arata ca primul este de 6 ori mai putin activ in blocarea acestor canale. Actualmente, VIC este testat in terapia clinica a pacient ilor cu HIV-1 prin trialuri de faza II/III. Farmacocinetica VIC, asociata in regimuri cu atazanavir, indinavir, nelfinavir, saquinavir sau fosamprenavir, a fost studiata pe cohorte formate d in cte 8 voluntari sanatosi. Prezentam rezultatele studiului de f aza II, randomizat, placebo-controlat - PO3802 - efectuat pe pacienti naivi, CCR5 -tropici. Ratele privind esecul virologic in bratul cu VIC, comparate cu cele din bratul placebo au fost de 56% in bratul ce primea 25 mg/doza (13 dintre 23 pacienti; p<0,001 vs control) si 17% in bratul ce cuprindea subiectii cu doze de 75 mg (4 din 23 pacienti; p= 0,188 vs control). La terminarea studiului nu s -a constatat o mare diferenta privind breaktrough-ul viral, intre bratul cu doza de 75 mg si bratul -control ce a utilizat efavirenz/zidovudin/lamivudin. Se pare ca doza de VI folosita a fost prea mica. La 22 dintre cei 26 de pacienti cu esec viral a fost efectuata genotiparea: 100% dintre acestia au prezentat mutatia M41L. Nu s -au putut face corelatii cu IC50 si nu s -au constatat mutatii consistente in anvelopa. VIC nu pare a fi cardio- sau hepato-toxic. Un alt studiu, randomizat, dublu orb, ACTG -5211, aflat in faza a II-a, a evaluat siguranta si eficacitatea VIC in terapia pacientilor multiexperimentati, supusi regimuril or continnd ritonavir. Acesti pacienti cu virus CCR5-tropic prezentau VL > sau = 5.000 genocopii/ ml. VIC a fost administrat 1 data/zi, timp de 14 zile, in doze de 5, 10 sau 15 mg, dupa ce fondul pacientilor a fost optimizat (OB). Doza de 5 mg/zi a fost d iscontinua din cauza potentei

discutabile. Fara a intra in detalii, vom arata ca la 14 zile mediana reducerii viremiei a fost de 0,7, 1,15 si 0,92 log10, i n raport cu dozele respective, VIC de: 5, 10 si 15 mg utilizate vs o crestere de 0,06 log in bratul c u placebo. Dupa 24 de saptamni, scaderea viremiei a fost de 1,51, 1,86, 1,68 si 0,29, log10, pentru fiecare din aceste grupuri. Reactiile adverse au fost acelea si in toate bratele, iar raspunsul virusologic sustinut a fost evident dupa 24 de saptamni la cei cu background optimizat (OB). Nu e clar de ce 5 pacienti au dezvoltat malignitati. S -a constatat ca unii subiecti tratati initial cu doze mici de VIC - 5 mg/zi CCR5- tropici sau cu tropism dual mixt au facut conversii, de la CCR5 la CXCR4. Aplavirocul (APL) este un derivat de spirodiketopiperazina. Studiile au fost efectuate pe 19 pacienti naivi si 21 multi -experimentati, ce prezentau viremie de peste 5.000 de copii/ml si CD4 >200 cel./mm3. Pacientii au facut monoterapie cu AP, timp de peste 10 zile; dozele: 200 mg/zi, 2x200 mg/zi, 400 mg/zi sau 600 mg/zi (per grup, 8 pacienti au primit drogul activ si 2 placebo). Din grupul total de pacienti, 35 au fost femei, 50% non -caucazieni si 8 coinfectati cu virusul hepatitei C. Nivelul viremiei a scazut dupa 2 zile de tratament, probabil drept consecinta a legarii prelungite a APL de CCR5. Dupa ziua a 10 -a au aparut cteva tulpini virale cu switch de la CCR5 la CXCR4. Medicamentul a fost bine tolerat, cu exceptia unor minore efecte gastrointestinale; fara efecte toxice sau modificari de laborator pe termen scurt, dar dupa un timp s -au semnalat primele efecte toxice grave si progresive hepatice, determinnd, in final, oprirea studiului. Aprepitant este un antiemetic aprobat de FDA (antagonic al recepto rilor pentru neurokinina-1) care se dovedeste a produce o subreglare a exprimarii CCR5 pe suprafata monocitelor si macrofagelor. Experimentat recent in SUA, s -a dovedit activ fata de tulpinile HIV rezistente la zidovudin, inhibnd, insa, doar variantele R5 si nu pe cele X4. Inhibitorii CCR5 microbicide sunt folositi ca potentiali agenti pentru prevenirea infectiei cu HIV -1. Ei blocheaza intrarea HIV-1 la nivelul mucoaselor vaginale si anale. Pentru ca sunt formulate ca topice, microbicidele ridica probl eme privind biodisponibilitatea orala. Studiile efectuate pe maimute, utiliznd virusuri himerice SIV/HIV sunt promitatoare. Zinc -finger protein nucleaza (ZNF) Elena Perez si col. raporteaza o noua strategie privind inhibarea CCR5 utiliznd ZNF, care actio neaza asupra genei CCR5 care blocheaza introducerea dublei catene pentru anumite secvente predeterminate. Acest blocaj este subsecvent reparat de mecanismele de reparare ale ADN -ului gazdei, dar gena-tinta ramne permanent disrupta. Molecula ZNF, nou creata, poate actiona asupra oricarei secvente a genomului si produce intreruperea transcriptiei. Perez si col. au aratat ca o linie celulara, modificata prin actiunea ZNF asupra CCR5, a devenit rezistenta fata de infectarea cu HIV, dar aceasta rezistenta poate deveni reversibila prin restaurarea CCR5 - produsa prin nucleoinfectia plasmidica. Grupul de cercetare continua studiul in vederea optimizarii acestei noi strategii. Inhibitori CXCR4: AMD 070

y y

- este un compus din familia ciclamilor, aflat in faze de s tudiu clinic: - studiu de faza I pentru stabilirea dozelor, efectuat pe voluntari sero -negativi; - debutul studiilor de faza II.

AMD 3100 este un compus din familia biciclamilor; a fost administrat pe cale i.v. la pacienti infectati cu HIV. Studiul clinic a cunoscut discontinuitati - rezultatele obtinute pna acum sugereaza o puternica activitate anti X -4. AMD 3456 este un compus monociclamic, antagonist monomacrociclic - blocant al tipului X4 de HIV -1; posibila alternativa pentru AMD 3100 - care nu poate fi administrat oral. Compusul pare ca nu induce efectele secundare ale primilor biciclami blocanti de CXCR4 (afectarea potentei, efecte metabolice). Este de 10 ori mai activ dect AMD3100 (IC50 1 10nM). Nu are efect pe coreceptorii CCR5; preparatul nu e inca biodisponibil. Aceste produse prezinta dificultati tehnice de conditionare medicamentoasa (de exemplu, administrarea p.o.). INHIBITORII DE FUZIUNE

1. Enfuvirtide (T-20) este deocamdata singurul EI de administrare subcutanata aprobat de FDA- SUA si ISOEuropa. 2. T-1249 este un peptid similar, cu timp lung de injumatatire, este format din 39 aa (neintrat inca in studiu clinic); drogul se leaga de o regiune a domeniului HR1 ce se suprapune cu situl de legare al enfuvirtidului, devenind activ fata de HIV-1 si HIV-2 sau fata de virusul SIV. 3. Produsul 873140 - un nou antagonist CXCR4; a fost administrat pe voluntari in monoterapie

y y y

- studiu dubluorb, randomizat, controlat placebo, timp de 10 zile: - dozele de 2 x 600 mg/zi, p.o., au redus viremia cu peste 1,66 lg; - bine tolerat, cu exceptia unor efecte gastrointestinale.

Enfuvirtide (Fuzeon) Unicul E.I. al HIV aprobat de organismele europene si FDA si intrat in uz clinic curent este Enfuvirtide (T-20, enf). Este un peptid derivat din domeniul HR2 al gp41 -env al HIV. Rezistenta la terapie e conferita de aminoacizii 36-45 ai gp41, mutatiile din pozitia 38 crend probleme pentu utilizarea in viitorul apropiat. Enf se administreaza subcutan. Enf a fost experimentat prealabil prin 2 studii clinice importante: TORO 1/TORO 2, concluziile formulate consecutiv studiilor priveau: Subiectii: RNA -HIV (mediana): 5,2 - 5,1 lg copii/ml; CD4 (mediana): 80 -98 cel/mm3, PSS (semnificativ) 1,7 -1,4. Siguranta: Reactiile cutanate locale apar la aproape toti pacientii, dar limiteaza tratamentul doar la 3%. Pe parcursul terapiei pot aparea si alte efecte secundare. Eficacitate primara: Enf + OB vs OB: - TORO 1: -1,7 vs -0,76; Delta = 0,93; p<0,0001; - TORO 2: -1,43 vs -0,65; Delta = 0,78; p<0,0001;

ENFUVIRTIDE: LUMINI SI UMBRE Lumini 1. International AIDS Society SUA recomanda enf, pe baza unor recente studii -pivot: - Enfuvirtide + Darunavir (nou IP) - pe baza rezultatelor obtinute prin studiul POWER; - Enfuvirtide + Tipranavir la pacientii multi-experimentati pentru obtinerea unor niveluri HIV nedetectabile (sub 50 copii/ml) - pe baza studiului RESIST.

2. Enfuvirtide + MK-0518 (inhibitor de integraza-HIV) administrat la pacienti experimentati a produs o scadere a vi remiei sub 400 de copii/ml (ICAACSan Francisco, Oct. 2006). Umbre Sub presiunea selectiva a drogului, rata inalta de replicare virala si joasa fidelitate a RT -HIV pot conduce la dezvoltarea rezistentei vs enf; Studiile initiale in vitro, au aratat difere nte de susceptibilitate la enf. si dezvoltarea de rezistente - asociate cu modificari ale triadei aminoacidice (GIV) in pozitiile 36 -38 ale regiunii HR1 al gp41; Aceste mutatii au fost confirmate apoi, in vivo, extinznd aria mutagenezei - core pentru aa 36-45; Interesant este ca regiunile asociate cu specificitatea coreceptorului la enf - regiunea buclei V3 a gp120 - nu sunt selectate sub presiunea drogului, indicnd faptul ca aceste regiuni nu joaca un rol primar in dezvoltarea rezistentei clinice; Recent, se comunica noi date privind rezistenta clinica la enf, administrat in regimuri cu 4 ARV, la pacienti experimentati (doza de enf. 90mg/zi); Primele mutante de rezistenta au aparut dupa 16 saptamni de terapie combinata:

y y y

- duble mutatii in N42T si N43V; - substitutii in regiunea HR2; - rebound viral asociat cu emergenta mutatiilor G36D si N42T - dupa 12-42 saptamni de terapie.

CONCLUZIA: HR2 -S138A (o noua arie de rezistenta, neremarcata initial de analiza TORO -1&2), este implicata in rezistent a fenotipica la enf, insotind esecul clinic si virusologic (C. Najera, Insitudo de Salud Carlos III, Madrid; Jour. of Med. Virology, Febr. 2006) ; The Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections, USA, February 2006. Compusul T-1249 s-a dovedit foarte activ, mentinndu -si activitatea fata de multe izolate, rezistente la enf, dar acest drog nu va intra in productie din cauza unor probleme de formulare. SUCCESORII ENFUVIRTIDULUI: TRI -999 si TRI-1144 sunt construiti pentru a avea un timp de1/2 m ult mai lung; par a detine o excelenta activitate, att contra tulpinilor virale rezistente la enf, ct si contra tulpinilor rezistente la T -1249. Experimentele de selectie efectuate in vitro pentru precizarea emergentei rezistentei la drog, ce poate apare a dupa mai multe pasaje, in prezenta unor doze subterapeutice, arata doar o slaba emergenta a virusurilor rezistente pentru cele doua produse. La fel ca enf, acesti agenti sunt de administrare parenterala, prin injectii subcutane. Fiecare din cei 2 agenti poseda o activitate antivirala puternica, o bariera genetica inalta la rezistenta si o farmacocinetica superioara enf. Ambele droguri sunt derivate din domeniul HR2 al gp41 al anvelopei virale si au fost testate clinic. TRI -1144 si TRI-999 au o valoare a IC50 de 7 nm, respectiv 1 nm. Se elimina de aproximativ 6 ori mai lent dect enf. In domeniul crearii de inhibitori de fuziune (I.F.), producerea de noi molecule cunoaste o evolutie extre m de rapida. In luna mai a acestui an, Trimeris/Roche comunica testare a altor 2 produse: TR-290999 si TR-291144, iar Mary Delmedico, de la acelasi grup de cercetare al Trimeris, prezinta 2 noi generatii de I.F., dintre care unul este intr -o faza de testare avansata: - T651 acopera mai bine dect enf domeniul 2 al heptadei re petitive a gp41, domeniu/regiune ce reprezinta o portiune optimala a drogului in vederea legarii si disruptiei respectivei regiuni (domeniu).

Acest agent se administreaza intr -o singura doza/saptamna si are o actiune anti -HIV mult mai puternica dect enf . In perspectiva imediata, grupul de la Trimeris are in vedere crearea unei noi serii de TRI -1144, prin aditia la vechiul produs a unui motiv stabilizator al helixului si realizarea unei acilari a unui acid gras pentru crearea unei noi serii derivate din T RI999. Aceste modificari ale moleculelor de baza ar permite ameliorarea parametrilor farmacocinetici ai drogurilorbaza. Noile generatii de I.F. vor creste sensibilitatea la drog a mutantelor virale ce prezinta modificari la nivelul a mai mult de 4 cod oni ai gp41. In plus, noii agenti vor avea o bariera de rezistenta genetica inalta, permitnd administrarea lor att la pacienti naivi, ct si la experimentatii ce prezinta deja rezistenta cstigata la alte droguri. La fel ca enf, noii I.F. nu dau rezistenta incrucisata cu alte ARV. Exista in diverse stadii ale experimentarii in vitro sau in vivo (animale de laborator) si alte molecule terapeutice cu functie inhibitorie asupra mecanismelor de intrare intracelulara ale HIV. Din acestea, amintim: DERIVATII BETA-CHEMOKINICI: RANTES, MIP-1-alpha, MIP-1-beta - inhiba HIV in vitro. Sunt mediatori ai inflamatiei & chemotaxici si liganzi ai receptorului CCR5 in vitro (Cocchi/Science 1995; Pal/Science 1997; Arenzana /Nature 1996). Alti I.F. Au fost studiati si alti i nhibitori de fuziune - peptide mimetice - spre exemplu: T-649 - prezinta omologie cu regiunea HR2 a gp41, blocnd formarea structurilor hairpin, similar ca actiune enfuvirtidului. Peptidul C34 - prezinta omologie cu o regiune ce realizeaza bucla 6 - helix, blocndu-i astfel formarea. Peptidul D - o molecula ciclica creata pentru a se lega de regiunea -buzunar situata intre structurile 6 helicale. Peptidul DP-107 - prezinta omologie cu domeniul HR1 ce se leaga de HR2, blocnd formarea fermoarului - prefuziune.

ALTI INHIBITORI NON -MIMETICI: - 5 helix - previne formarea buclei 6 helix prin sechestrarea uneia din elicele necesare pentru formarea 6 helixului. - RPR 103611 - compus triterpenic, non-peptidic, care tinteste regiuneabucla a celor 2 componente ale fermoarului de leucina din componenta gp41 si disrupe asocierea dintre gp120 - gp41 a virusurilor HIV-CXCR4 tropice.

COMPUSII DE TIP CADA CADA sunt o noua clasa de molecule de mici dimensiuni, ce fac parte din familia cyclotriazo -disulfonamidelor, actionnd ca agenti antivirali. Componentul principal al acestei familii, CADA, contine un macrociclu sintetic cu puternica activitate adaptata, in vitro, fata de izolatele clinice de HIV -1, fara a tine cont de tipul de receptori chemokinici (figura 8). CADA este un activ inhibitor fata de toate virusurile drog -rezistente (ex. virusuri rezistente la NRTI/NNRTI, PI si chiar la enfuvirtide), fata de diferite subtip uri de HIV-1 (A,B,C,D, A/E, F, H,O ) si fata de variate tulpini de HIV -2 sau SID. S-a descoperit ca mecanismul anti-HIV prin care actioneaza CADA implica interactiuni specifice cu receptorii celulari CD4, inducnd o reducere a gradientului de densitate a r eceptorilor CD4 de pe suprafata si interiorul celulei, mecanism aproape unic si nedescris pentru ceilalti compusi chimici din aceeasi clasa. Moleculele CADA prezinta imunologic o serie de proprietati care le confera o larga paleta de utilizare in testele d e laborator si, probabil, intr -un viitor nu prea indepartat si in clinica.

CONCLUZII 1. Inhibitorii de intrare reprezinta o mare promisiune terapeutica pentru viitorul imediat, mai ales in contextul actual, tot mai grevat de efectele secundare si de rezi stenta fata de actuala terapie ARV. 2. In ciuda unor rezistente decelate in vitro, dar si in vivo, inclusiv fata de enfuvirtid, solutia blocarii penetrarii HIV i n celulele-gazda pare a fi o modalitate de evitare a aparitiei rezistentelor incrucisate dintre ARV. 3. Rezultatul celor mai recente studii prezentate la Congresul Mondial HIV/SIDA de la Toronto, august 2006, privind regimurile HAART, ce asociaza Enfuvirtid + Darunavir sau Tipranavir, la pacientii multi -experimentati arata ca acestea au produs reduceri ale viremiei sub 50 de copii/ml, deschiznd calea spre noi abordari terapeutice. BIBLIOGRAFIE 1. Wensing A.M., van de Vijver D.A., Angarano G. et al. Prevalence of drug-resistant HIV-1 variants in untreated individuals in Europe: implications fo r clinical management. J. Infect Dis 2005; 192: 958- 66. 2. Veazey R.S., Klasse P.J., Schader S.M. et al. Protection of macaques from vaginal SHIV challenge by vaginally delivered inhibitors of virus-cell fusion. Nature 2005; 438; 99-102. 3. Negrutiu L., Rosca O., Szilagyi Monica. Terapia AIDS cu noii inhibitori de intrare. Al IV -lea Congres National privind Infectia SIDA, Bucuresti, Romnia, 2006. 4. Melby T., Despirito M., Demasi R. et al. HIV-1 coreceptor use in triple-class treatment experienced patients: baseline prevalence, correlates and relationship to enfuvirtide response. J Infect Dis 2006; 194: 238 -46. 5. Dragic T., Litwin V., Allway G.P. et al. HIV-1 entry into CD$ cells is mediated by the chemokine receptor CC CKR-5.Nature 1996; 381: 667-73. 6. Wyatt R., Sodroski J. The HIV-1 envelope glycoproteins: fusogens, antigens and immunogens. Science 1998; 280: 1.884-8. 7. Kuritzkes D.R., Jacobson J., Powderly W.G. et al. Antiretroviral activity of the anti -CD4 monoclonal antibody TNX-355 in patients infected with HIV type 1. J. Infected Dis 2004; 189:286-91. 8. Duensing T., Fung M., Lewis S. et al. In vitro characterization of HIV isolated from patients treated with the entry inhibitor TNX-355. 13th Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections. Denver, CO, USA, 5-8 February, 2006. Abstract 158LB. 9. Madani N., Perdigoto A.L., Srinivasan K. et al. Localiyed changes in the gp 120 envelope glycoprotein confer resistence to human immunodeficiency virus entry inhibitors BMS -806 and #155. J Virol 2004; 78: 3742-52. 10. Dorr P., Westby M., Dobbs S. et al. Maraviroc (UK-427, 857), a potent, orally bioavailable, and selective small-molecule inhibitor of chemokine receptor CCR5 with broad-spectrum anti-human immunodeficiency virus type 1 activity. Antimicrob Agents Chemother 2005; 49: 4.721-32. 11. Delmedico M., Bray B., Cammack N. et al. Next generation HIV peptide fusion inhibitor candidates achieve potent, durable suppression of virus replication in vitro and improved pharmacokinetic proprietie s. 13th Conference on Retroviruses and and Opportunistic Infections. Denver Colorado, 2006. Abstract 48. 12. Jouvenot Y., Perez E. et al. Toward gene knockout therapy for AIDS/HIV targeted disruption of CCR5 using engineered zinc finger protein nucleases.! 3-th CROI, Denver, CO, USA, 5-8 February, 2006 (Abstr. 51). 13. Tanaka Y., Okuma K., Tabaka R. et al. Development of novel orally biovailable CXCR4 antagonists, KRH3955 and KRH-3140: binding specificity, pharmacokinetics, and anti HIV-1 activity in vivo. 13th Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections. Denver, CO, USA, 5- 8 February, 2006. Abstract 49LB. 14. Briz, Poveda E., Soriano V. Entry inhibitors: mechanisms of action and resistance pathways. J Antimicrob Chemother 2006; 57:619-27. 15. Tsamis F., Gavrilov S., Kajumo F. et al. Analysis of the mechanism by which the small -molecule CCR5 antagonists SCH-351125 and SCH-35081 inhibit human immunodeficiency virus type 1 entry. J Virol 2003; 77:5.201-8.

y y y y y

y y y

y y

y y

y y

y y y

16. McDermott D.H., Zimmerman P.A., Guignard F. et al. CCR5 promoter polymorphism and HIV-1 disease progression. Multicenter AIDS Cohort Study (MACS). Lancet 1998; 352:866-70. 17. Rosenkilde M.M., Gerlach L.O., Jakobsen J.S. et al. Molecular mechanism of AMD3100 antagonism in the CXCR4 receptor: transfer of binding site to the CXCR3 receptor. J Biol Chem 2004; 279: 3.033 -41. 18. Donahaue J. D Aquila R., Haas D. et al. Peptide inhibitors of in vitro binding of HIV-1 Vif to human APOBEC3G. 13th Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections. Denver, CO, USA, 5-8 February, 2006. (Abstr. 200). 19. Vyakarnam A., Alvarez R., King D. HIV Infection is suppressed by G8, a novel innate effector protein.. 13th Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections. Denver, CO, USA, 5-8 February, 2006 (Abstr. 210). 20. Suzuki K., Ishida T., Lim H. et al. Promoter targeted siRNAs silence HIV-1 by transcriptional gene silencing, with minimal contribution from a posttranscriptional mechanism. 13th Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections. Denver, CO, USA, 5-8 February, 2006. (Abstr. 266). 21. Duensing T., Fung M., Lewis S. et al. In vitro characterization of HIV isolated from patients treated with the entry inhibitor TNX-355. 13th Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections. Denver, CO, USA, 5-8 February, 2006. (Abstr.158LB0). 22. Mosley M., Smith-Burchnell C., Mori J. et al. Resistance to the CCR5 antagonist maraviroc is characterized by dose-response curves that display a reduction in maximal inhibition. 13th Confere nce on Retroviruses and Opportunistic Infections. Denver, CO, USA, 5-8 February, 2006. (Abstr. 598). 23. Greaves W., Landovitz R., Fatkenheue G. et al. Late virologic breakthrough in treatment-na?ve patients on a regimen of combivir +vicricviroc. 13th Con ference on Retroviruses and Opportunistic Infections. Denver, CO, USA, 5-8 February, 2006 (Abstr. 161LB). 24. Olson W.C., Doshan H., Zhan C. et al. Prolonged coating of CCR5 lymphocytes by PRO 140, a humanized CCR5 monoclonal antibody for HIV-1 therapy. 13th Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections. Denver, CO, USA, 5- 8 February, 2006 (Abstr. 515). 25. The Journal of Viral Entry. University of Kentucky, SUA,Vol.2. no.1, 2006. 26. Giguel F., Beebe L., Migone T.S. et al. The anti- CCR5 mAb004 inhibits HIV-1 replication synergistically in combination with other antiretroviral agents but does not s elect for resistance during in vitro passage. 13th Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections. Denver, CO, USA, 5-8 February, 2006 (Abstr. 505). 27. Tanaka Y., Okuma K., Tanaka R. et al. Development of novel orally bioavailable CXCR4 antagonists, KRH3955 and KRH-3140: binding specificity, pharmacokinetics and anti HIV-1 activity in vivo and in vitro. 13th Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections. Denver, CO, USA, 5-8 February, 2006 (Abstr. 49LB). 28. Boffito M., Winston A., Fletcher C. et al. Pharmacokinetics and ART response to TMC114/r and TMC125 combination in patients with highlevel viral resistence. 13th Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections. Denver, CO, USA, 5-8 February, 2006 (Abstr. 575c). 29. Scholler M., Kraft M., Hoetelmans R. et al. Significant decrease in TMC125 exposures when co -administred with tipranavir boosted with ritonavir in healthy subjects. 13th Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections. Denver, CO, USA, 5-8 February, 2006 (Abstr. 583). 30. Haarris M., Zala C., Ramirez S. et al. Pharmacokinetics and safety of adding TMC125 to stable regimens of saquinavir, lopinavir, ritonavir, and NRTI in HIV adults. 13th Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections. Denver, CO, USA, 5-8 February, 2006 (Abstr. 575b). 31. Yoshimura K., Shibata J., Honda A. et al. Resistance profile of a novel broadly neutralizing anti-HIV-1 monoclonal antibody Kd-247, that has favorable-synergism with anti-CCR5 inhibitors in vitro. 13-th CROI, Denver, Colorado; USA, 5-8 February 2006 (Abstr. 506).

y y

y y