COLEGIUL FARMACITILOR DINROMNIA

LIPOZOMIIVECTORI MEDICAMENTOIICOSMETICI
Prof.univ.DumitruLupuliasa,Prof.univ.VictoriaHrju

Organizator:

Parteneri:

Martie 2011

1. Introducere Cercetrile extinse din domeniul tiinelor farmaceutice au condus n ultimele decenii la dezvoltarea unor sisteme inovative de eliberare a ingredientelor active, capabile s mbogeasc posibilitile de tratament aflate n prezent la dispoziia farmacoterapiei. n acest sens, se pot meniona sistemele de transport i eliberare la int (vectorizate) de tip micro- i nanoparticule, microemulsii, emulsii multiple, cristale lichide, lipozomi etc. Lipozomii sunt sisteme veziculare sferice constituite din unul sau mai multe straturi duble de lipide amfifile (n principal fosfolipide) dispuse concentric, care nglobeaz un numr egal de spaii sau compartimente apoase. Au dimensiuni ce pot fi cuprinse de la 30-50 nm pn la civa m. Denumirea provine din limba greac (lipos grsime i soma corpuscul), cu referire la compoziia i forma lor.

Figura 1. Seciune transversal n structura unui lipozom unilamelar

Figura 2. Reprezentarea schematic a structurii unui lipozom multilamelar

Lipozomii au fost inventai de Alec Bangham n anii 70, fiind folosii ca modele ale membranelor biologice n studii de biofizic. nc de la nceput, asemenea structuri de dimensiuni coloidale au fost considerate de farmacologi ca fiind sisteme mai mult sau mai puin biomimetice, capabile s serveasc la administrarea unor substane medicamentoase. Ulterior, lipozomii au fost extensiv cercetai ca sisteme de eliberare sau ca sisteme de transport i eliberare la int (vectori medicamentoi) a unei game largi de ageni terapeutici de mare interes medical, utili n tratamentul unor boli, prin modularea farmacocineticii i/sau a biodistribuiei substanei active, n beneficiul cii de administrare. ncercrile iniiale de folosire a lipozomilor ca sisteme de eliberare a substanelor medicamentoase au scos n eviden principalul dezavantaj al acestora, i anume clearance-ul nespecific i rapid din circulaia sistemic de celulele sistemului reticulo-endotelial (SRE). S-a considerat ns c recunoaterea de macrofagele SRE ar putea fi util pentru transportul antigenelor, activarea macrofagelor i combaterea infeciilor parazitare. Ulterior, prin controlul caracteristicilor fizico-chimice ale straturilor duble lipidice i a interaciilor cu mediul biologic s-au investigat i obinut diverse tipuri de lipozomi, care pot prezenta interes i pentru alte aplicaii n terapeutic. Tabel 1. Domenii de cercetare i aplicare terapeutic a lipozomilor Domeniu de aplicare Deficiene enzimatice Compui ncapsulai Lizozim, -glucozidaz, -glucozidaz Cromozomii care exprim sinteza de HGPRT Citozin-arabinoz, creterea vinblastin, actinomicin D,

Inginerie genetic Chimioterapia cancerului Coadjuvani imunitii Terapia antimicrobian Tratamentul intoxicaiei cu metale Tratamentul artritei reumatoide Coadjuvani pentru absorbie oral Tratamentul infeciilor parazitare pentru

daunorubicin, metotrexat Virus influenzae, antigen pentru hepatita B, toxin difteric Antibiotice beta-lactamice, cloramfenicol EDTA-fosfatidiletanolamin, desferioxamina Corticosteroizi Insulin, heparin Primachin, clorochin, ketoconazol, compui cu stibiu di- i trivalent 3

2. Avantajele lipozomilor ca sisteme de eliberare a substanelor medicamentoase Avantajele principale ale lipozomilor ca vectori medicamentoi sunt urmtoarele: au structur versatil care poate fi uor adaptat prin formulare i/ sau preparare, n scopul conferirii unor proprieti necesare pentru o aplicaie specific; pot fi utilizai pentru a include numeroase substane medicamentoase lipofile (n stratul dublu lipidic), hidrofile (n compartimentul apos) sau amfifile (n ambele); sunt ineri din punct de vedere biologic i complet biodegradabili, deoarece fosfolipidele din structura lor sunt constitueni naturali ai membranelor celulare; prin ncapsulare n straturile duble lipidice sau n compartimentele apoase, substanele medicamentoase sunt protejate fa de aciunea distructiv a unor factori de mediu extern (aer, lumina) sau intern (enzime sau inhibitori prezeni n mediile biologice); ofer noi posibiliti pentru furnizarea agenilor terapeutici ncapsulai la inta vizat din organism (organ, esut, celul), acetia avnd aceeai evoluie ca lipozomii i fiind eliberai doar la locul lor de desfacere; ca vectori medicamentoi permit administrarea unor compui activi a cror administrare ridic probleme: indice terapeutic sczut, specificitate redus, numeroase efecte secundare (antitumorale), stabilitate redus (proteine), inaccesibilitatea locului de aciune (ADN). 3. Dezvantajele lipozomilor ca sisteme de eliberare a substanelor medicamentoase Lipozomii prezint i unele dezavantaje poteniale comparativ cu alte sisteme farmaceutice, care le limiteaz folosirea i anume: - prepararea poate fi mai costisitoare; - pstrarea mai dificil i de scurt durat; - incapacitatea de a traversa peretele capilar (cu excepia esuturilor inflamate), avnd predispoziia de a se acumula la nivelul SRE; - capacitate de ncapsulare redus a substanelor active; - tropism accentuat pentru ficat i splin, dup injectare intravenoas; - dirijarea selectiv dificil a substanei medicamentoase ctre esuturi-int; - nu constituie un sistem transportor (cru) medicamentos universal, ci prezint avantaje specifice doar pentru anumite aplicaii farmaceutice i cosmetice.

4. Obiectivele utilizrii lipozomilor Avantajele menionate anterior justific pe deplin obiectivele urmrite prin folosirea lipozomilor ca vectori medicamentoi: - dirijarea (intirea, vectorizarea) substanei active ctre locul de aciune din organism, crescndu-i eficacitatea terapeutic; - prelungirea duratei de eliberare a substanei active ncorporate; lipozomii constituie un fel de rezervor care cedeaz n timp respectivul compus, fapt ce menine nivelele terapeutice plasmatice sau tisulare ale substanei active un timp mai ndelungat i permite reducerea frecvenei administrrilor; - protejarea compusului activ, n special a celui nglobat n compartimentul intern apos al lipozomilor, fa de poteniale degradri sub aciunea unor factori ostili din mediul ambiental; - protejarea pacientului de efectele toxice ale unor substane active (nefrotoxicitate, cardiotoxicitate etc.) ca urmare a eliberrii acestora chiar n aria patologic/la locul de aciune; - posibilitatea eliberrii intracelulare a unor molecule active ca urmare a interaciunii lipozomilor cu celulele int, molecule care n mod normal nu pot ptrunde ca atare n celule din cauza unor proprieti fizico-chimice restrictive (de exemplu, o mas molecular mare); amplificarea rspunsului imun; lipozomii se pot comporta ca adjuvani imunologici n formulrile vaccinurilor. 5. Clasificarea lipozomilor Se pot distinge mai multe criterii de clasificare a lipozomilor: dup dimensiune i organizare; dup natura lipidelor care formeaz stratul dublu lipidic; dup sarcina superficial a veziculei lipozomale; dup metoda de preparare; dup comportamentul in vivo.

n continuare sunt prezentate clasificrile n funcie de dimensiune i organizare i dup aplicaiile in vivo. 5.1. Clasificarea dup dimensiune i organizare n funcie de numrul de bistraturi (lamelaritate) i de mrime, se disting lipozomi multilamelari i unilamelari. 5

Lipozomi multilamelari (MLV - multilamellar vesicles) Sunt alctuii din mai multe starturi duble (lamele) concentrice lipidice ce nconjoar un compartiment intern apos relativ mic. Au un diametru cuprins ntre 0,4 i 3,5 m.

Figura 3. Seciune n structura schematic a unui lipozom multilamelar Lipozomi unilamelari (ULV - unilamellar vesicles) n aceti lipozomi exist doar o singur structur bistratificat ce nconjoar un nucleu apos intern.

Figura 4. Seciune n structura schematic a unui lipozom multilamelar n cadrul acestui grup se disting cteva subcategorii, n funcie de mrime: - lipozomi unilamelari mici (SUV - small unilamellar vesicles), cu o dimensiune a veziculelor cuprins ntre 20 i 40 nm; au o capacitate redus de ncapsulare (0,1-1%), dependent de concentraia lipidic, care le limiteaz aplicabilitatea ca sisteme de eliberare a substanelor medicamentoase; 6

- lipozomi unilamelari medii (MUV - medium unilamellar vesicles), cu o mrime a veziculelor cuprins n domeniul 40-80 nm; - lipozomi unilamelari mari (LUV - large unilamellar vesicles), cu un nucleu intern apos mare, avnd o dimensiune de la 10 la 1.000 nm , fapt ce permite ncapsularea unor cantiti mai mari de substane active dect SUV; - lipozomi unilamelari gigani (GUV - giant unilamellar vesicles), a cror dimensiune depete 1.000 nm i care sunt, probabil, cei mai instabili din considerente fizico-mecanice. Lipozomi multiveziculari (MVV - multivesicullar vesicles) n care o vezicul mare conine vezicule mai mici, n mod obinuit unilamelare.

Figura 5. Tablou sinoptic al reprezentrii structurilor lipozomale Mrimea i modul de organizare ale lipozomilor sunt determinate de metoda folosit pentru obinerea lor. 5.2. Dup compoziie i aplicaiile in vivo Se disting: lipozomi convenionali; lipozomi de lung circulaie (PEG-ylai , ascuni, disimulai); imunolipozomi; 7

lipozomi cationici.

Ultimele trei tipuri de lipozomi au fost concepui pentru a rspunde unor cerine terapeutice specifice prin schimbarea caracteristicilor lor structurale i fizico-chimice. Aceste schimbri permit modificarea comportamentului in vivo al lipozomilor cu scopul de a atinge obiective bine definite. Tabel 2. Clasificarea lipozomilor n funcie de evoluia in vivo Tip de lipozomi Lipozomi convenionali Utilizarea principal intirea macrofagelor Depozit localizat Vaccinare Lipozomi cu circulaie ndelungat Imunolipozomi Lipozomi cationici Lipozomi convenionali Sunt lipozomi alctuii doar din fosfolipide (neutre i/sau ncrcate negativ) i/sau colesterol. Au un timp de circulaie n fluxul sangvin relativ scurt. Biodistribuia lor depinde n mare msur de proprietile lor fizico-chimice (mrime, potenial zeta, compoziie) i de condiiile fiziologice i patologice ale organismului. Aceti lipozomi realizeaz o intire pasiv a moleculelor medicamentoase. Cnd sunt administrai pe cile parenterale (foarte des pe cale i.v.) prezint o tendin puternic de acumulare rapid n celulele sistemului fagocitar mononuclear (MPS) i frecvent, n sistemul reticuloendotelial (SRE). Splina i ficatul, datorit abundenei de macrofage MPS i a unei irigri sangvine bogate, reprezint organele principale de acumulare. De aceea, acest tip de lipozomi sunt candidai potrivii pentru eliberarea substanelor medicamentoase n macrofagele sistemului fagocitar mononuclear, putnd fi incrcai cu substane antimicrobiene sau imunomodulatoare. Au dezavantajul c sunt rapid eliminai din circulaie de macrofage, fapt ce compromite n mare msur utilizarea lor n tratamentul bolilor care sunt extinse i la alte arii ale organismului. intirea selectiv a ariei patologice Microrezervor circulant intire specific; pilotai de anticorpi Eliberarea la int a genelor

Lipozomi cu circulaie ndelungat (PEG-ylai , ascuni) S-au dezvoltat cu scopul de a evita preluarea lor de SRE i implicit de a prelungi timpul de circulaie a acestora n organism (T1/2 la om este de aproximativ 48 de ore). S-au obinut prin grefarea pe suprafaa lor a unor lanuri liniare de polietilenglicoli (PEG-uri), polimeri hidrofili ineri.

Figura 6. Reprezentarea schematic a lipozomilor cu circulaie lung Lipozomii pe care sunt grefate moleculele de PEG (stabilizai steric) evit recunoaterea de sistemul imunitar. Stabilizarea steric rezult din concentrarea local la suprafaa lipozomilor a gruprilor PEG nalt hidratate, care confer o barier steric ntre lipozomii pe care s-au grefat PEG-urile mpotriva interaciunilor cu componentele moleculare i celulare din mediul biologic. Moleculele de PEG neutralizeaz sarcina electric a veziculelor i previne astfel opsonizarea lor. De asemenea, opsonizarea lipozomilor este redus din cauza inabilitii opsoninelor de a lega de suprafee hidrofile. n plus, grosimea stratului de PEG (dependent de masa molecular i de procentul ncorporat n compoziia lipozomilor) influeneaz interacia lipozomilor cu macrofagele. Apariia acestui tip de vezicule a dus la un reviriment al interesului fa de sistemele de eliberare lipozomale i a deschis oportuniti terapeutice noi n raport cu lipozomii convenionali.

Cea mai important caracteristic a lipozomilor de lung circulaie este faptul c sunt capabili s extravazeze n locurile din organism n care permeabilitatea peretelui vascular este ridicat, incluznd tumori solide i arii infectate sau inflamate. Produsele autorizate pentru uz clinic, Doxil- doxorubicin i DaunoXome - daunorubicin, reprezint exemple de formulri lipozomale de acest tip. Imunolipozomii Imunolipozomii conin pe suprafaa bistratului lipidic anticorpi specifici sau fragmente de anticorpi, cu scopul de a mri legarea de locul-int. Dei imunolipozomii au fost cercetai pentru diverse aplicaii terapeutice, interesul a fost n principal centrat pe eliberarea la int a agenilor antitumorali. Totui, accesul lor din circulaia sangvin n alte locuri dect ficatul i splina este dificil, administrarea local n cavitile organismului prezentnd un interes mai mare. Aceti lipozomi sunt potrivii pentru inducerea imunitii umorale i celulare in vivo, putnd fi folosii n procedurile de imunizare ca vehicule ideale pentru vaccinuri.

Figura 7. Reprezentarea schematic a unui imunolipozom Lipozomi cationici Lipozomii cationici, denumii i catezomi, sunt cei mai noi reprezentani, fiind cercetai pentru mbuntirea cedrii materialului genetic. Sunt constituii dintr-un compus amfifil cationic i lipide neutre. 10

Transferul genei este mediat de interacia electrostatic a lipozomilor ncrcai electric pozitiv cu secvenele oligonucleotidice ale ADN-ului ncrcat negativ. Se formeaz compleci capabili s ptrund n celul, unde ADN-ul este cedat lent nucleului acesteia. Din aceast categorie sunt disponibile comercial produsele LipofectAMINE, LipofectAce, Lipofectine (GIBCO/BRL), Transfectam (Promega) i DOTAP (Boeringer). 6. Formularea lipozomilor n formularea lipozomilor se gsesc urmtoarele categorii de componente: componentele stratului dublu lipidic; componentele compartimentului apos; substana activ.

Componentele care intr n formularea lipozomilor joac un rol important n stabilizarea i n modul lor de aciune. 6.1. Fosfolipide Fosfolipidele reprezint componenta principal, elementul constructiv al lipozomilor. Sunt biomacromolecule naturale care joac un rol important n fiziologia uman, fiind componente structurale ale membranelor biologice. Aceste molecule amfifile constau dintr-o parte polar, hidrofil, i una hidrofob, avnd dimensiune i sarcin variabile, precum i un lan dublu hidrocarbonat saturat sau nesaturat format din 12-24 de atomi de carbon. Componentele bistratului lipidic

11

Figura 8 n procesul de formare a lipozomilor, moleculele se autoorganizeaz prin orientarea prilor polare ctre faza apoas, n timp ce lanurile hidrocarbonate ader unele de altele sub forma unui bistrat. Aceasta se datoreaz probabil structurii lor constituit din lanuri de acizi grai nesaturai, care imprim moleculei o form tubular adecvat pentru aranjarea n folii plane, deosebindu-se de lipidele monocatenare care au tendina de a se organiza sub forma de micele

12

Figura 9. Modele geometrice de organizare a lipidelor la dispersarea n ap n prezent, este disponibil un numr mare de lipide amfifilice naturale, de semisintez sau sintez, care poate fi inclus n formularea lipozomilor, redate n tabelul urmtor:

13

Tabel 3 Abreviere DMPC DPPC DSPC DLPC DOPC DGPC DMPE DPPE DSPE DPPG DSPG DPPA DPPS DSPS Denumire Dimiristoil-fosfatidilcolin Dipalmitoil-fosfatidilcolin Distearil-fosfatidilcolin Dilauril-fosfatidilcolin Dioleoil-fosfatidilcolin Diglicerilil-fosfatidilcolin Dimiristoil-fosfatidiletanolamin Dipalmitoil-fosfatidiletanolamin Distearil-fosfatidiletanolamin Dipalmitoil-fosfatidilglicerol Distearil-fosfatidilglicerol Acid dipalmitoil-fosfatidic Dipalmitoil-fosfatidilserin Distearil-fosfatidilserin

Dintre acestea, cele mai folosite sunt fosfatidilcolinele, cunoscute i sub denumirea de lecitine, obinute din surse naturale sau prin sintez. Dintre fosfolipide naturale, uzual se folosesc lecitina de ou i lecitina de soia, care sunt ieftine, lipsite de sarcin i inerte chimic. n tabelul urmtor sunt redate unele caracteristici ale unor lipide folosite la prepararea lipozomilor.

14

Tabel 4. Caracteristicile unor fosfolipide utilizate n formularea lipozomilor Lipide Fosfatidilcolina din glbenu de ou (PC) Dipalmitilfosfatidilcolina (DPPC) Distearilfosfatidilcolina (DSPC) Caracteristici principale - component majoritar utilizat frecvent n formularea lipozomilor - fosfolipid sintetic saturat - fosfolipid sintetic saturat, mai puin premeabil Sfingomielina (SM) Colesterol (CH) pentru faza apoas dect fosfatidilcolina - crete stabilitatea lipozomilor ,,in vitro - reduce permeabilitatea veziculelor de fosfatidilcolin - proporia maxim de ncorporat este de 50 moli % Stearilamina (SA) - confer suprafeei lipozomului sarcin electric pozitiv - poate fi toxic pentru pereii celulari Diacetilfosfat (DACP) - confer suprafeei lipozomului sarcin electric negativ - poate fi toxic pentru pereii celulari Acid fosfatidic (PA) Fosfatidilserina (PS) Cardiolipida (CL) Fosfatidildiletanolamina (PE) - confer bistratului sarcin electric negativ - confer bistratului sarcin electric negativ - lipid antigenic care se utilizeaz n aplicaii imunologice - nu formeaz vezicule nchise - se utilizeaz, cnd este necesar ca un material capabil s se cupleze cu lipozomii - derivaii substituii se utilizeaz n studii imunologice Lizofosfatidilcolina (LPC) - crete permeabilitatea lipozomal - poate mri fuziunea lipozomilor cu celulele 15

Ali aditivi n bistraturile lipidice Lipozomii alctuii doar din fosfolipide nu sunt suficient de rigizi, n principal din cauza temperaturilor de tranziie de faz mai joase i/sau nesaturrii lanurilor acil prezente n structur, care determin imperfeciuni n aranjarea sub forma de bistraturi lipidice. De aceea, din asemenea lipozomi are loc aproape ntotdeauna scurgerea (pierderea) substanei medicamentoase ncapsulate n timpul conservrii. Pentru a preveni acest neajuns, n compoziia lipozomilor sunt inclui unul sau mai muli aditivi (de exemplu colesterol sau -tocoferol) care mbuntesc rigiditatea i hidrofobicitatea membranei, reducndu-i permeabilitatea. Colesterolul, cel mai utilizat sterol, poate fi uor inserat n straturile duble lipidice, ca urmare a interaciilor cu fosfolipidele din membranele lipidice, cu modificarea conformaiei lanului acil-lipidic din membrana lipozomal. Colesterolul inserat n membrana lipozomal, datorit nucleului steroid rigid, realizeaz o mpachetare strns a stratului dublu lipidic i o diminuare/evitare a scurgerii substanei active nglobate n bistrat sau n compartimentul apos.

-tocoferolul acioneaz att pentru consolidarea membranei, ct i ca antioxidant, protejnd

lipidele de procesul oxidativ. S-au obinut i compui conjugai ai lipidelor cu polietilenglicoli, care se utilizeaz frecvent n formulrile lipozomale. De asemenea, se folosesc i fosfolipide funcionalizate (obinute prin conjugare, cu formarea de legturi amidice, disulfidice sau tioeter) utilizate pentru ataarea covalent sau necovalent a proteinelor, peptidelor sau a altor substane active la suprafaa lipozomilor. 6.2. substane active. n faza hidrofil se pot dizolva sisteme sau substane tampon, n cazul lipozomilor care se obin printr-o metod bazat pe existena unui gradient de pH ori a formulrilor care necesit ajustarea pH-ului pentru asigurarea stabilitii substanei medicamentoase i a lipozomilor. Componentele compartimentului apos

Aceasta faz poate fi reprezentat de ap distilat sau purificat sau de soluia apoas a unei

16

6.3.

Alte componente

Pentru formarea i stabilizarea lipozomilor este deseori necesar adugarea i a altor componente. Astfel, atunci cnd se prepar lipozomi cu sarcin superficial, se adaug, de exemplu, stearilamin i dicetilfosfat. Dac la preparare se folosesc lipide nesaturate, pot fi ncorporai antioxidani precum butilhidroxitoluen, -tocoferol i -hidroxiacizi. Alegerea acestora se face cu atenie pentru a nu interfera cu lipozomii i a nu ptrunde n interiorul lor. Agenii de chelatare (EDTA) sunt inclui pentru a reduce oxidarea catalitic a lipidelor ce poate fi indus de contaminarea cu ioni metalici. Pentru a menine izotonicitatea este esenial adugarea clorurii de sodiu sau a unor sruri similare. Unele metode de preparare (liofilizarea sau criodesicarea) necesit aditivi speciali, precum agenii crioprotectori, destinai s asigure stabilitatea lipidelor i a substanelor medicamentoase instabile n ap n timpul preparrii (rehidratrii). Agenii antifungici i antimicrobieni pot fi adugai cu scopul de a asigura stabilitatea microbiologic a preparatelor lipozomale. Parfumuri i colorani se pot include n lipozomi cosmetici. Aadar, lipozomii sunt sisteme farmaceutice care prezint o mare flexibilitate n design prin modificarea structurii i a proprietilor fizico-chimice. Prin selectarea atent a componentelor incluse n formulare se pot modela unele proprieti ale lipozomilor (sarcina superficial, randamentul de ncrcare cu substan activ etc.) ca i comportarea in vivo, astfel nct acesta s satisfac o aciune terapeutic specific. 6.4 Substane active Lipozomii pot conine i vehicula substane active diverse, cu caracter hidrofil, lipofil sau amfifil. n tabelul urmtor sunt trecute n revist exemple de substane active investigate pentru includerea n lipozomi.

17

Tabel 5. Substane medicamentoase investigate pentru a fi incorporate n lipozomi Enzime hexozaminidaza A, amiloglucozidaza, peroxidaza, dextranaza, hexochinaza, Substane antitumorale Vectori de imunomodulare Insulinoterapice Substane antiparazitare Ageni chelatani Antiinflamatoare Polinucleotide Adjuvani imunizare Substane diverse: insulin derivai de antimoniu, grizeofulvin, amfotericin B, 5fluorouracil EDTA hidrocortizon, prednison, triamcinolon, dexametazon interferon de antigeni, vaccinuri, anatoxin difteric, virus gripal, agentul HB al hepatitei virale, antigeni din Plasmodium falciparum antipaludic, antigeni din celule tumorale (limfocitomi) - antiinfecioase - interferon - hormoni steroidici - angiostensina II - heparin - substane pentru tratamentul infarctului miocardic - factor VIII - hemoglobin - substane pentru tratamentul insuficienei respiratorii substane de contrast: acid diatrizoic (renografina), hidroxitalamat de sodiu - produse radiofarmaceutice pentru diagnostic: 99Tc (n limfoscintigrafie i studiul distribuiei lipidelor n organism) - produse ca: citocrom b5; hidroxicobalamina, clorura de litiu, procaina 18 actinomicina -galactozidaza, D, bleomicina, elastaza, cisplatina, ATP-sintetaza, daunorubicina, superoxid dismutaza, catalaze doxorubicina, amfotericina B, fluoxuridina, 5-fluorouracil, mercaptopurina, metotrexat, vinblastina, vincristina interferon, interleukine

Vitamine 6.4.

A, E, F, D, K ( mai ales n produsele cosmetice) Obiectivele principale ale formulrii lipozomilor

n ceea ce privete obiectivele principale ale formulrii lipozomilor, acestea constau n: formarea i stabilizarea structurilor veziculare bistratificate; ncorporarea i/sau ncapsularea substanelor active n lipozomi; asigurarea stabilitii fizice, chimice, microbiologice i biologice pe perioada de valabilitate a formulrii lipozomale; realizarea unor caracteristici specifice formei farmaceutice, dependent de calea de administrare; asigurarea inocuitii, toleranei i eficacitii terapeutice. 6.5.1. Formarea i stabilizarea lipozomilor Formarea i stabilizarea lipozomilor au la baz proprietile unor lipide i a altor compui amfifili care prin dispersare n ap pot produce, aa cum s-a menionat deja, structuri coloidale diverse (vezicule, micele, nano-emulsii) n funcie de preponderena prii hidrofile sau lipofile a moleculei. Atunci cnd predomin partea hidrofil, exist tendina de formare a micelelor, iar dac predomin partea lipofil (hidrofob), se manifest capacitatea de a forma n mod spontan structuri bistratificate (lipozomi) atunci cnd se adaug cantiti mici de ap.

Figura 10. Etapele formrii lipozomilor n formarea i stabilizarea lipozomilor intervin o serie de factori precum: - proprietile structurale ale substanelor lipofile amfifilice; - proprietile superficiale i electrice ale componentelor; - proprietile dimensionale i optice; 19

- proprietile reologice. La acestea se adaug i: raportul molar fosfolipide/ap, temperatura, prezena ionilor de Ca2+, metoda de preparare a lipozomilor. Dintre factorii de mai sus, relevani sunt mrimea i distribuia dup mrime a lipozomilor i sarcina superficial a acestora. Dimensiunea i distribuia dup mrime a veziculelor lipozomale Dimensiunile lipozomilor depind de metoda de preparare i de aparatura utilizat. Sunt proprieti importante care influeneaz: proprietile fizice ale lipozomilor; capacitatea de ncapsulare a substanei active; comportarea biologic.

Lipozomii trebuie s fie mai mici dect porii vasculari pentru a extravasa i a ajunge n tumorile solide. Totodat, lipozomii cu dimensiuni mai mici (0,001-10m) asigur o stabilitate mai mare, iar veziculele mai mici de 100 nm necesit strategii suplimentare pentru a preveni opsonizarea i pentru a prelungi semiviaa biologic (sau durata de circulaie n fluxul sangvin). Sarcina superficial a lipozomilor Proprietile electrice ale suprafeei membranare a lipozomilor pot influena stabilitatea fizic a dispersiilor lipozomale pe durata stocrii ca i comportamentul lipozomilor n mediul biologic i interacia lor cu celulele. Agregarea lipozomilor, adic modificarea dimensiunilor originare, in vitro i in vivo reprezint o problem major de stabilitate. De aceea, este preferabil ca sarcina superficial a lipozomilor s fie mare pentru a mpiedica fenomenul de reunire a lipozomilor. Introducerea unor molecule naturale (glicolipide, lectine, anticorpi) pe suprafaa lipozomilor le confer stabilitate fa de autoagregare i interacii nespecifice. Un efect similar se obine i prin grefarea pe suprafaa lipozomilor a unor polimeri hidrofili (PEG-uri), care protejeaz lipozomii cu o barier steric ce inhib adsorbia componentelor sangvine. n tabelul de mai jos sunt redate metodele de modelare a proprietilor fizico-chimice ale lipozomilor i consecinele modificrilor rezultate asupra stabilitii i comportamentului biologic al lipozomilor.

20

Tabel 6. Metode i rezultate ale modificrii proprietilor fizico-chimice ale lipidelor Proprieti fizico-chimice Distribuia particulelor Permeabilitatea membranei Metoda aplicat Rezultatul modificrii extrudere, controlul timpului de

mrimii sonicare, microfluidizare modificarea

circulaie - creterea extravazrii compoziiei creterea stabilitii

lipidice (colesterol)

lipozomilor - sensibilitate indus de pH sau temperatur

Tendina de agregare sau modificarea fuziune Hidrofobicitatea suprafeei lipidelor, cationic stabilizarea grefarea hidrofile lipozomilor pe

compoziiei -formarea adugarea steric

structurii

care

de poate transporta antigene, ADN, vaccinuri prin -creterea circulaie -modificarea farmacocineticii distribuirii ncapsulate tisulare i a timpului de

moleculelor suprafaa (dextrani

lineari, derivai lipidici de polimeri hidrofili)

lipozomilor i substanelor

Randament de ncrcare a ncrcare activ sau de la - ncapsularea lipozomilor substanei active distan stabili rapoarte cu mari substane (n ntre medicamentoase

substan medicamentoas: component lipidic) Elasticitate, rigiditate introducerea de detergeni creterea penetraiei absorbiei sau activatori marginali i cutanate i retenia n piele, lipide cutanate (ceramide) (favorabil n preparate lipozomice medicamentoase lipozomale) Proprieti superficiale, adiia unor liganzi specifici - potenial crescut pentru 21 transdermice a substanelor

stabilitatea lipozomilor i pe suprafaa lipozomilor, intire eficace alte proprieti asociat steric 6.5.2. ncorporarea sau ncapsularea substanelor active n lipozomi Substanele active pot fi incluse n lipozomi pe trei ci: prin ncorporare n structura lipozomilor; prin asociere cu lipozomii preformai; prin formarea unui sistem compatibil cu acetia. ncapsularea substanei hidrofile n compartimentul apos al lipozomilor; interaciunea electrostatic cu lipidele ncrcate electric din compoziia stratului dublu electric; interacia hidrofob cu lipidele constituente ale bistratului; legtura chimic cu lipidele bistratului; combinarea acestor mecanisme. cu stabilizarea

Toate aceste forme se pot obine prin procedee diferite i anume: -

ncapsularea substanelor active hidrofile Este o faz critic a preparrii, care se evalueaz prin 2 parametri: eficacitatea (randamentul) de ncapsulare, respectiv procentul de substan activ ncapsulat n compartimentul apos, parametru ce depinde de cantitile relative de lipide i ap din formularea lipozomilor; volumul compartimentului apos, care depinde de dimensiunea i numrul de bistraturi din vezicula lipozomal. Randamentul de ncorporare a substanei active n lipozomi, esenial pentru eficacitatea clinic a formulrilor lipozomale, depinde de o serie de factori: - concentraia de substan hidrosolubil. Dac ncapsularea substanei este pasiv, adic nu interfereaz cu nici un alt proces, atunci concentraia n compartimentul apos intern este identic cu cea din exterior. Cnd concentraia de substan iniial este mare, cantitatea de substan activ ncapsulat va fi crescut. Se pot aplica i tehnici de ncapsulare prin transportul activ al substanei active n lipozomi, de exemplu prin crearea unui gradient de pH. tipul i mrimea veziculelor. 22

Randamentul de ncapsulare a substanei hidrofile este mai mare n cazul lipozomilor mari multilamelari, deci coninnd mai multe compartimente apoase. sarcina electric a lipidelor. Volumul compartimentului care separ bistraturile lipozomilor multilamelari este, n general, mai mic de 0,01 m. Adugarea de lipide ncrcate cu sarcini electrice antreneaz respingerea electrostatic ntre straturile duble electrice adiacente, rezultnd mrirea compartimentului apos chiar i pn la 50%. tria ionic a mediului apos. Dac veziculele lipozomale nu sunt ncrcate cu sarcini electrice (de exemplu cele formulate pe baz de fosfatidilcolin), compartimentul apos nu este influenat de tria ionic a mediului. n cazul n care bistratul este ncrcat electric (conine fosfatidilglicerol) compartimentul apos este redus prin creterea triei ionice (respectiv prin neutralizarea sarcinilor electrice de ionii prezeni n mediu). natura fosfolipidelor. concentraia de cholesterol. Aceast parametru influeneaz rigiditatea i deci, permeabilitatea bistraturilor lipozomilor. Colesterolul mrete rigiditatea i permeabilitatea stratului dublu lipidic. Coninutul de colesterol din bistrat influeneaz nivelul de ncapsulare a substanei active pn la o anumit valoare, peste care colesterolul nsui nu mai poate fi inclus n bistrat i tinde s cristalizeze. condiiile de fabricare/preparare a lipozomilor. Influeneaz tipul, mrimea i distribuia dup mrime a lipozomilor. ncorporarea substanelor lipofile i ncorporarea substanelor active lipofile n bistratul lipidic este influenat de o serie de factori: natura substanei lipofile. concentraia substanei lipofile. Cu ct lipofilia unei substane este mai mare, cu att procentul de ncorporare este mai mare. ncorporarea crete cu creterea concentraiei substanei active lipofile pn la o limit i la un anumit raport substan lipofil/lipidele din bistratul lipozomal. - natura fosfolipidelor, concentraia de colesterol i condiiile de fabricare. 23

n general, ncapsularea unei substane lipofile este favorizat dac bistraturile lipidice prezint o oarecare fluiditate; adugarea de colesterol scade procentul de substan lipofilic ncorporat. Temperature. Este un parametru care influeneaz n mod diferit ncapsularea unei substane lipofile; pentru unele substane active asocierea este maxim la temperatura de tranziie de faz a componentei lipidice. Tehnici de ncorporare a substanelor active n lipozomi Pentru ncorporarea lipozomilor cu substane medicamentoase se folosesc strategii de ncrcare pasiv sau activ. ncrcarea pasiv se efectueaz n timpul formrii lipozomilor sau n condiiile n care structura lipozomilor nu este consolidat n procesul de obinere. Produsul rezultat poate conine proporii mari de substan medicamentoas nencorporat, a crei ndeprare din suspensia lipozomal este laborioas. De asemenea, dup ndeprtarea complet a substanei active rmas nencrcat, datorit dezechilibrului osmotic creat (gradientului de concentraie), substana medicamentoas ncorporat se scurge din lipozomi n timpul pstrrii. ncorporarea prin strategii active sau de la distan se refer la tehnici de ncrcare a substanei active dup formarea veziculelor, fr afectarea integritii bistratului lipozomal. Acest procedeu se bazeaz n principiu pe crearea unei diferene ntre mediul interior i cel exterior al lipozomilor, prin intermediul creia se asigur un singur sens de pasaj (de la exterior la interior) pentru moleculele de substan medicamentoas. Datorit acestei diferene, poate fi obinut o ncrcare de aproape 100%, evitndu-se necesitatea ndeprtrii substanei nencapsulate. Metodele de ncrcare activ se bazeaz pe crearea unei gradient de pH, pe folosirea perechilor de ioni sau a complexrii cu liganzi. ncrcarea activ reprezint un avantaj pentru substanele medicamntoase labile care se pot ncrca chiar nainte de utilizarea preparatelor lipozomale. 24

Metoda deshidratrii lipozomilor prin liofilizare (criodesicare) Este o metod simpl de obinere a lipozomilor cu volume apoase de ncapsulare mari, care se desfoar n condiii blnde. n aceast metod, o suspensie de vezicule unilamelare mici, mpreun cu materialul de ncapsulat, este liofilizat prin mijloace convenionale. Se formeaz o structur asemntoare unei spume afnate, avnd o arie a suprafeei mare. Hidratarea eficient a acestei spume se poate realiza cu ajutorul unui volum mic de ap distilat ori soluie tampon, rezultnd vezicule multilamelare cu o mare eficacitate de ncapsulare. Pe lng avantajul unor condiii blnde de preparare, lipozomii obinui prin aceats metod pot fi pstrai o perioad de timp relativ mai lung, rehidratarea fcndu-se chiar nainte de utilizarea suspensiei lipozomale.

n acest procedeu modern de preparare, intervin compoziia lipidic, asocierea de ageni crioprotectori, condiiile de congelare (viteza de congelare nu trebuie s fie prea rapid sau prea lent). Agenii crioprotectori au rolul de a preveni fuziunea, agregarea i pierderea componentelor ncapsulate prin formarea unor structuri amorfe i/sau interacia cu grupele fosfolipidice. Crioprotectorii (dizaharide precum maltoza, zaharoza, lactoza sau dextran i polividon) menin integritatea fizic a lipozomilor n cursul liofilizrii, ca i n cursul rehidratrii lipozomilor chiar nainte de utilizare. Aplicarea liofilizrii ca modalitate de stabilizare a lipozomilor este convenabil n cazul ncapsulrii substanelor medicamentoase liposolubile (amfotericina B, doxorubicina) care, dizolvndu-se n dublul strat lipidic, rmn la acest nivel i dup rehidratarea lipozomilor nainte de administrare, fr ca localizarea lor s fie influenat de rehidratare.

25

Reconstituirea lipozomilor liofilizai este mai dificil n cazul substanelor active hidrosolubile, datorit partiiei acestora ntre faza apoas extern i compartimentul apos intern al veziculelor lipozomale. Este un procedeu de ncrcare in situ a substanei active care necesit anumite manipulri tehnice, de aceea personalul farmaceutic i medical trebuie s fie bine informat i pregtit pentru a evita ncrcarea necorespunztoare a lipozomilor.

6.5.3. Asigurarea stabilitii fizice, chimice i microbiologice a lipozomilor Asigurarea stabilitii fizico-chimice i microbiologice a lipozomilor, ca n cazul tuturor formelor farmaceutice, reprezint un obiectiv esenial al formulrii, cu consecine directe n asigurarea calitii acestora. Structura vezicular i compoziia complex confer lipozomilor un potenial mare de instabilitate. n cazul lor, stabilitatea implic: urmtor: Tabel 7. Tipuri de instabilitate a lipozomilor Tipuri instabilitate Fizic - pierderea substanei medicamentoase - modificarea structurii i dimensiunii veziculelor - modificarea permeabilitii membranei - agregarea-fuziunea lipozomilor - influenarea compoziiei lipidice - influenarea tehnologiei de fabricare Chimic - oxidarea lipidelor nesaturate 26 de Efecte produse meninerea structurii i dimensiunii lipozomilor; reinerea substanei active ncorporate n bistratul lipidic sau n faza apoas; meninerea stabilitii fizico-chimice; meninerea stabilitii n mediile biologice ntlnite; mpiedicarea contaminrii microbiene.

Principalele tipuri de instabilitate ntlnite n cazul lipozomilor sunt rezumate n tabelul

- hidroliza componentelor lipidice - degradarea substanei medicamentoase ncapsulate Microbiologic - contaminarea microbian - influenarea tehnicilor de sterilizare - interaciunea cu conservanii Stabilitatea fizic Factorii care influeneaz stabilitatea fizic a lipozomilor i consecinele asupra acestora sunt rezumate n tabelul urmtor. Tabel 8 Factori Lumina Acizi Baze Ioni metalici Electrolii concentrai Efecte produse - pot desface sau pot sparge veziculele (dac membrana a fost n prealabil deteriorat prin depozitare sau de substane strine) - deterioreaz veziculele lipozomale

Unele molecule organice (ncorporate n - modificare permeabilitii membrana lipozomal)

Stabilitatea chimic Asigurarea stabilitii chimice a lipozomilor vizeaz evitarea degradrii chimice att a lipidelor, ct i a substanei active. Degradarea chimic a componentelor lipidice Compoziia n acizi grai nesaturai a fosfolipidelor din formulare predispune lipozomii la degradare prin autooxidare sau hidroliz. Lanurile acil-nesaturate din structura lipidelor sunt vulnerabile la degradare oxidativ (peroxidare lipidic). Reaciile de oxidare se produc rapid i sunt accelerate de metale, lumin, un pH crescut. Degradarea poate fi produs i prin hidroliza legturilor esterice covalente care leag acizii grai de glicerol din molecula fosfolipidelor. Aadar, preparatele lipozomale coninnd 27

fosfolipide sunt sensibile la degradarea hidrolitic att n domeniul acid (pH <5), ct i n cel alcalin (pH >8). De asemenea, procedeele de preparare (sonicarea) sau condiiile de depozitare (expunerea la diferite valori de pH) pot afecta viteza de descompunere a lipidelor lipozomale. Compuii de oxidare i hidroliz ai componentelor lipidice din lipozomi produc modificri importante ale permeabilitii stratului dublu lipidic. Degradarea chimic a substanei active Procesul de degradare chimic a substanei active crete pe msura creterii concentraiei componentelor lipofile, deoarece stabilizarea lor se efectueaz prin cuplare la structurile membranare (bistratul lipidic). Stabilitatea microbiologic Datorit compoziiei complexe, dispersiile lipozomale reprezint medii prielnice pentru dezvoltarea microorganismelor. n cazul lipozomilor administrai extern (cutanat/pe piele i pe mucoase), stabilitatea microbiologic este asigurat prin adugarea n formulare a conservanilor antimicrobieni (alcool benzilic, acid sorbic, acid benzoic, sorbat de potasiu, nipaesteri). n selectarea agenilor conservani se va ine seama de interaciile acestora cu bistratul lipozomal. n cazul lipozomilor destinai administrrii parenterale sau oculare este obligatorie asigurarea sterilitii, un demers dificil de realizat, innd seama de procedeele uzuale de sterilizare a preparatelor farmaceutice. Sterilizarea se efectueaz cu radiaii gamma, deoarece sterilizarea prin filtrare are inconvenientul c nu poate fi aplicat dect n cazul microveziculelor de mici dimensiuni, iar alte procedee de sterilizare, ndeosebi cele termice influeneaz negativ stabilitatea fizico-chimic a lipozomilor. Pentru asigurarea stabilitii lipoziomilor se recurge la diverse procedee de stabilizare: selectarea adecvat a componentelor stratului dublu lipidic, inclusive folosirea de lipide saturate la formulare/preparare; adugarea de colesterol n stratul dublu lipidic (pn la 25%) n momentul preparrii lipozomilor (care rigidizeaz membrana lipozomal); ncrcarea membranei lipozomale cu sarcini electrice (poate evita agregarea lipozomilor prin respingere electrostatic); adaosul de antioxidani n formulare; 28

adugarea de conservani antimicrobieni; prepararea prin liofilizare; ncrcarea lipozomilor chiar nainte de administrare, prin tehnici de ncrcare activ; evitarea nclzirii i lucrnd la pH = 6-7 n cursul fabricaiei (pentru diminuarea proceselor de hidroliz); - depozitare adecvat (de exemplu, la +40C, n recipiente sigilate, sub gaz inert).

Lipozomii trebuie s fie stabili n suspensie sau n stare deshidratat timp de 1,5-2 ani, la temperatura ambiant.

6.5.4. Realizarea caracterelor specifice, formelor farmaceutice, n funcie de calea de administrare Formularea lipozomilor urmrete obinerea unor preparate cu caracteristici organoleptice, fizico-chimice sau farmacotehnice bine definite i corelate cu calea de administrare: caracteristici organoleptice: aspect, miros, culoare; pentru formulrile lipozomale parenterale: sterilitate i apirogenitate; pentru formulrile dermatologice sau cosmetice: aspect elegant, consisten. 7. Prepararea lipozomilor Aa cum s-a menionat anterior, formarea lipozomilor are loc spontan atunci cnd fosfolipidele se disperseaz n ap. Totui, prepararea lipozomilor ncrcai cu substane active cu nivele crescute de ncapsulare i o anumit mrime i structur (lamelaritate) este un proces dificil de realizat. n literatur sunt descrise numeroase metode de preparare a lipozomilor, a cror alegere necesit o mare atenie deoarece metoda de preparare influeneaz proprietile lipozomilor (tipul, mrimea i distribuia mrimiii ca i capacitatea de ncrcare i de reinere a substanei medicamentoase). Tehnicile propuse sunt conceptual distincte, nici una dintre ele nu ofer avantaje absolute i nu poate fi utilizat ca o procedur universal. Unele dintre metode se pot aplica doar la scar de laborator, altele se pot transpune la scar industrial.

29

Etapele preparrii lipozomilor includ: etapa de hidratare a componentei lipidice; ncorporarea substanei active; etapa de uniformizare a dimensiunii lipozomilor; etapa de ndeprtare a substanei active nencapsulate.

1. n etapa de hidratare a filmului lipidic se pot aplica: Metode mecanice agitaremanual sau mecanic (agitatoare tip Vortex) a dispersiei de fosfolipide; microfluidizare; omogenizare prin forfecare nalt.

Metode bazate pe nlocuirea solvenilor organici cu un mediu apos ndeprtarea solvenilor organici nainte de hidratare; evaporarea n faza invers; injecia cu etanol sau eter n faz hidrofil.

Metode bazate pe ndeprtarea agentului tensioactiv gel-cromatografie prin excludere; dializ n timp; diluie rapid.

Metode bazate pe modificarea dimensiunilor lipozomilor obinui anterior i fuziune fuziunea spontan a lipozomilor unilamelari mici n faza de gel; ngheare-dezgheare; liofilizare (criodesicare).

Metode bazate pe ajustarea pH-ului 2. ncrcarea substanei active n lipozomi Lipozomii care conin substane hidrosolubile se prepar direct cu soluia apoas sau soluia tampon apoas a acesteia.

30

Substanele lipofile se pot ncorpora fie adugndu-se n solventul organic n care se dizolv compusul lipofil, fie prin complexare cu compusul lipidic din structura bistratului lipozomal. Asocierea proteinelor n lipozomi are loc prin ncapsularea n faz hidrofil (de exemplu interferon) sau prin legare la suprafaa lipozomului (de exemplu insulina) prin legturi hidrofobe sau de natur electrostatic.

Figura 11. Modalitatea de ncorporare a substanelor active n lipozomi 3. Etapa de uniformizare a dimensiunii lipozomilor n aceasta faza se aplic: extruderea la presiune ridicat sau sczut; ultrasonicarea.

4. Etapa de ndeprtare a materialului nencapsulat n aceast etap se apeleaz la: dializ; ultracentrifugare; cromatografie de penetrare n gel; rini schimbtoare de ioni.

n metoda de hidratare a filmului lipidic descris de Bangham, lipidele se dizolv n solveni organici (cloroform sau amestecuri cu metanol) i solventul este apoi ndeprtat ntr-un rotaevaporator la vid, formnd un film subire pe pereii balonului cu fund rotund. Peste acesta se adaug faza apoas necesar pentru rehidratatrea filmului, prenclzit la o temperatur superioar tranziiei de faz a lipidelor folosite la preparare. Filmul subire se detaeaz de pe perei prin agitare, obinndu-se vezicule multilamelare, diferite ca mrime. 31

Simultan, poate fi ncorporat i substana activ dependent de proprietile fizico-chimice, fie prin introducerea n film mpreun cu lipidele, fie n soluia apoas de rehidratare a filmului lipidic, dac compusul este hidrofil. Pentru omogenizarea dispersiei, respectiv pentru reducerea dimensiunii la scar nanometric a lipozomilor multilamelari rezultai, dispersia se supune ultrasonicrii obinndu-se vezicule unilamelare mici.

Figura 12. Fazele preparrii lipozomilor prin metoda hidratrii filmului lipidic 32

Alegerea metodei de preparare este important, deoarece de aceasta depind: tipul de lipozomi formai; mrimea acestora i distribuia mrimii lor; randamentul ncrcrii cu substan activ.

8. Caracterele i controlul calitii lipozomilor Controlul calitii lipozomilor presupune determinarea unor parametri caracteristici fizicochimici, microbiologici i biologici. Posibilitatea caracterizrii lipozomilor i a formulrilor cu lipozomi a devenit mai evident o dat cu dezvoltarea unor metode analitice i echipamente de control performante. n tabelul urmtor sunt redate sintetic metodele folosite pentru controlul calitii formulrilor lipozomale. Tabel 9. Controlul calitii lipozomilor(caracteristici i metode) Parametri de control Caracterizarea fizico-chimic aspect pH osmolaritatea indice de refracie concentraia n fosfolipide compoziia n fosfolipide concentraia n colesterol concentraia ncorporrii) Stabilitatea chimic pH hidroliza fosfolipidelor autooxidarea colesterolului degradarea antioxidantului Stabilitatea fizic mrimea i distribuia mrimii lamelaritatea difracia dinamic a luminii miroscopie electronic 33 potentiometrie HPLC, CSS HPLC, CSS HPLC, CSS n sm poteniometrie osmometru refractometru coninut n fosfor lipidic/HPLC CSS i HPLC determinarea colesterol- oxidazei i HPLC (randamentul metoda adecvat Procedeu analitic

potenialul electric zeta Caracterizarea biologic sterilitatea pirogenitatea toxicitatea animal Evaluarea eficienei terapeutice

zeta-sizer

culturi aerobe sau anaerobe testul pe iepure ori testul LAL(Limulus) monitorizarea letalitii, histologiei i patologiei teste in vitro utiliznd membrane artificiale teste in vivo

Pentru lipozomii cu aplicaie cutanat se efectueaz teste suplimentare cum ar fi: determinarea capacitii de umectare a pielii, determinarea efectului emolient 9. Dificulti privind dezvoltarea lipozomilor Realizarea lipozomilor ntmpin o serie de dificulti generate de calitatea materiilor prime, caracteristicile lipozomilor, tehnologiile de fabricaie, metodele de control, stabilitate etc. Calitatea materiilor prime Compoziia variabila a fosfolipidelor provenind din surse naturale diverse poate afecta reproductibilitatea, de la o serie la alta, a calitii lor i implicit a lipozomilor. Utilizarea produselor de sintez minimizeaz acest neajuns. Proprietile fizico-chimice ale lipozomilor Eficacitatea in vivo a lipozomilor este n mare msur dependent de proprietile structurale i de suprafa. La dezvoltarea unei formulri lipozomale este necesar s se ia n consideraie unele caracteristici importante ale lipozomilor (mrimea i distribuia dup mrime, potenialul zeta i randamentul de ncrcare a substanei medicamentoase) care determina comportamentul lipozomilor in vitro i in vivo. Se impune deci o caracterizare complet fizico-chimic a lipozomilor farmaceutici n stadiile preliminare ale dezvoltrii farmaceutice, fapt ce reclam utilizarea unor metode analitice complicate.

34

Randamentul ncrcrii cu substan medicamentoas n mod obinuit, n lipozomi nu se nglobeaz toat cantitatea de substan medicamentoas introdusa n formulare. Uzual, procentele incluse sunt mai reduse, iar cantitatea rmas nencrcat trebuie s fie ndeprtat (dac este mai mare de 10%), aciune laborioas i cronofag. Dezvoltarea unor strategii de ncrcare activ sau de la distan crete eficacitatea ncapsulrii. Perioada de valabilitate Dup cum s-a descris anterior, valabilitatea lipozomilor poate fi limitat de fenomenele de instabilitate fizic i chimic. Ambele tipuri de instabiliti modific disponibilitatea in vivo, iar procesul degradrii chimice poate influena i sigurana lipozomilor. Transpunerea preparrii la scar industrial a lipozomilor Prepararea lipozomilor necesit existena unui echipament de fabricaie adecvat. n plus, preparatele lipozomale parenterale reclama aplicarea unor tehnici de fabricatie capabile s asigure sterilitatea i apirogenitatea preparatelor parenterale sau oftalmice. 10. Alte tipuri de sisteme veziculare Pentru a evita unele limite ale lipozomilor (instabilitate chimic, costul i puritatea fosfolipidelor, degradarea oxidativ a fosfolipidelor) s-au dezvoltat i alte tipuri de sisteme veziculare, care s constituie alternative la sistemele lipozomale. Denumirile acestor vezicule fac referire la natura componentelor ce formeaz nveliul vesicular i sunt limitate doar de imaginaia productorilor. Niozomii sunt vezicule obinute cu surfactani (ageni tensioactivi) bicatenari de sintez neionogeni. Sfingozomii sunt lipozomi care conin sfingolipide (sfingomielina, gangliozide) sau lipide a cror compoziie este asemntoare pielii (ceramide, colesterol, acizi grai, sulfat de clesterol). Imunozomii sunt sisteme veziculare la care sunt ataai anticorpi specifici sau fragmente de anticorpi. Hemozomii sunt vezicule asemntoare lipozomilor care conin hemoglobine. Catezomii sunt lipozomi cationici care conin sruri ale acizilor grai cu amine cuaternare. 35

Virozomii conin vaccinuri. Imunoenzimozomii sunt vezicule coloidale ce conin enzime (utili n maladii autoimune). Ufazomii sunt sisteme veziculare ce conin acizi grai nesaturai cu caten lung. Etozomii sunt vezicule lipidice cu un coninut ridicat (pn la 45%) de etanol. Etanolul fluidizeaz att lipidele etozomale, ct i din straturile lipidice ale celulelor stratului cornos. Aciunea de dezorganizare a stratului lipidic cornos permite penetraia veziculelor n piele. Sunt capabili s ncapsuleze i s elibereze n piele molecule lipofile, precum testosteron, minoxidil, ca i substane medicamentoase cationice, precum propranololul sau chiar plasmide i insulin. Rovizomii sunt transportori veziculari multifuncionali care au un coninut mare de acizi grai eseniali (de exemplu, acid linoleic) utilizai pentru transferul a numeroase ingrediente active cosmetice. Dragozomii sunt sisteme veziculare obinute din lecitin hidrogenat i colesterol, cu aplicaii n cosmetologie. Transferozomii sunt un tip special de lipozomi n care sunt ncorporai aa numii activatori marginali (molecule, precum colat de sodiu). Sunt vezicule ultradeformabile cu o capacitate de deformare mai mare de pn la 105 n comparaie cu lipozomii. Datorit elasticitii i capacitii de deformare, ei se pot strecura prin porii stratului cornos (care sunt cu 1/10 mai mici dect diametrul lor). Astfel, ei pot penetra prin pielea intact acionnd pe baza existenei gradientului de hidratare cutanat (diferenei de hidratare din stratul cornos i esuturile viabile ale epidermului mai hidratate n comparaie cu stratul cornos deshidratat). 11. Mecanisme de aciune in vitro a lipozomilor Natura fosfolipidic a lipozomilor le confer o mare asemnare cu membranele biologice, n care cele mai importante componente sunt fosfolipidele (considerate elemente ale vieii). n principal, pe aceast similitudine se bazeaz mecanismul de aciune a lipozomilor, respectiv interaciile dintre acetia i celulele vii. n absena oricarei specificiti, interaciile dintre lipozomi i celulele vii, investigate in vitro, pot fi descrise de urmtoarele procese:

36

Adsorbia la suprafaa celulelor - facilitat de ncrctura electric a veziculelor lipozomale. Adsorbia se poate produce prin fore hidrofobe nespecifice sau electrostatice sau prin interaciuni specifice cu componentele suprafeei celulare. Transferul lipidic- mediat de proteinele de suprafa (exist o analogie ntre lipide, lipozomi i membrane lipidice). Colesterolul trece foarte uor ntre membranele lipozomal i celular, fr distrugerea lipozomului Transferul lipidic poate determina modificarea permeabilitii lipozomilor nsoit de eliberarea unei pri din faza apoas a veziculelor. n anumite condiii, substanele active ncapsulate traverseaz apoi membrana celular. Endocitoza, un fenomen influenat de sarcina electric a particulelor, permite digestia lipozomilor de lizozomi n interiorul celulei i facilitarea cedrii ingredientului active. Endocitoza reprezint mecanismul predominant de ptrundere a lipozomilor n celule; n acest caz exist riscul degradrii principiului activ n lizozomii intracelulari. Fuziunea cu plasma membranei celulare este un proces care rezult prin inserarea constituenilor membranei lipozomale n membrana celular, nsoit de eliberarea simultan a coninutului lipozomal n citoplasma celular.

Figura 13. Reprezentarea schematic a interaciilor lipozomilor cu celulele 37

Adesea este greu de stabilit mecanismul de interaciune dintre lipozomi i celule, existnd posibilitatea ca simultan s intervin mai multe mecanisme. Afinitatea lipozomilor pentru diverse esuturi poate fi modificat prin utilizare n formulare a diferite fosfolipide, cu configuraii diverse ale lanului de acid gras. De asemenea, modificarea sarcinii (ncrcturii) veziculelor lipozomale poate influena n mare msur distribuia lor n organism. Veziculele ncrcate negativ, de exemplu, intr n celule prin fuziune, n timp ce veziculele neutre sunt ncorporate prin endocitoz, substana medicamentoas fiind expus sistemul hidrolitic liozomal al celulelor. Veziculele pozitive sau neutre sunt ndeprtate mai lent dect acelea ncrcate negativ. 12. Ci de administrare a lipozomilor In vivo, obstacolele ntmpinate la transportul i eliberarea la int a substanelor medicamentoase ncorporate n lipozomi sunt substaniale i dificil de depit. n acest sens, se pot cita ca fiind bariere de depit: - clearance-ul nespecific i rapid al lipozomilor prin intermediul celulelor SRE; - dificultatea traversrii endoteliului capilar i a membranei bazale; - capacitatea endocitar foarte mic a numeroase tipuri de celule, inclusiv a celulelor tumorale. Aceste bariere limiteaz n mare msur aplicarea cu succes a lipozomilor. Efectul lipozomilor ca sisteme farmaceutice de eliberare a agenilor terapeutici este intrinsec legat de capacitatea de a controla cu exactitate concentraia de substan activ eliberat care atinge locul de aciune ntr-o perioad de timp dat. Atingerea locului int din organism presupune ca lipozomii s rmn intaci ca transportori ai substanei active (s-i menin integritatea structural) i s conin cantitatea iniial de substan activ ncorporat ce urmeaz a fi eliberat la inta vizat. Succesul unui tratament cu lipozomi nu depinde doar de caracteristicile de formulare, ci i de calea de administrare. Iniial, lipozomii au fost dezvoltai pentru administrare pe cale parenteral, ca vectori medicamentoi n terapia cancerului. Ulterior, s-a studiat i posibilitatea administrrii lor i pe alte ci (oral, transmucozal sau cutanat). Mediile biologice variate ntlnite dup administrare (snge, fluide digestive, lichidele: interstiial, peritoneal, sinovial) influeneaz evoluia in vivo a acestora. 38

Calea intravenoas Lipozomii convenionali administrai intravenos sunt pui n faa unor bariere precum endoteliul vascular i bariera hemato-encefalic. Ca atare, aa cum s-a mai subliniat, extravazarea lipozomilor, ndeosebi a celor multilamelari i a celor unilamelari mari, apare doar n organe, precum ficat, splin i mduva spinrii (datorit fenestrelor i jonciunilor lejere dintre celule endoteliale), i n anumite stri patologice (prezena tumorilor, inflamaie, infecie). Lipozomii unilamleari mici pot avea o distribuie mai mare n esuturi, dar i ei pot fi sechestrai de ficat i splin. n afar de asta, lipozomii prencrcai cu sarcin electric superficial i cu dimensiuni mai mici de 100 nm prezint un clearance sangvin lent n comparaie cu ali lipozomi cu dimensiune mai mare i/sau transportori ncrcai pozitv sau negativ. Schimbul lipidic dintre transportorii lipozomali i lipoproteinele plasmatice contribuie la ruperea membranei i ulterior la pierderea substanei active. De aceea, lipozomii convenionali se folosesc n principal n tratarea SRE sau pentru a masca efectele adverse ale substanelor medicamentoase antitumorale. n cazul lipozomilor de lung-circulaie, profilul biodistribuiei se schimb semnificativ deoarece suprafaa veziculelor este acoperit cu polimeri, uzual cu PEG-uri. Studii experimentale au evideniat o circulaie sangvin mai lung, o preluare mai mic de ficat i o acumulare mai mare n tumori. Acoperirea cu PEG a lipozomilor i face potrivii pentru administrarea intravenoas. Moleculele de PEG furnizeaz o repulsie electrostatic i steric ntre lipozomii i neutralizeaz sarcina electric, previnind opsonizarea lor. De asemenea, opsonizarea lipozomului este redus din cauza inabilitii opsoninelor de a se lega de suprafee hidrofile. Mai mult, grosimea stratului de PEG, care depinde de masa molecular a PEG i de procentul ncorporat n compoziia lipozomilor, influeneaz interacia lipozomilor cu macrofage. De altfel, acest tip de lipozomi au fost concepui pentru a fi administrai pe cale parenteral i de a mri timpul de remanen i circulaia sistemic. n design-ul unor lipozomi eficieni pe cale parenteral trebuie luate n consideraie parametrii importani, precum mrimea, compoziia, sarcina electric a lipozomilor, densitatea substanei

39

active n membrana lipozomal i metoda de preparare, parametrii care influeneaz soarta i biodistribuia lor dup administrare. Calea intramuscular n acest caz, transferul de molecule are loc de la locul de administrare n snge prin difuzie pasiv, injecia respectiv realiznd un depozit local de substan activ i implicit o eliberare prelungit a sa. Calea subcutanat Lipozomii administrai subcutanat au scopul de a inti sistemul limfatic n scop imagistic, precum i n distribuirea unor ageni terapeutici sau n vaccinare. Lipozomii injectai subcutanat care nu intr n fluxul sangvin, fie intr n capilarele limfatice, fie staioneaz la locul de injectare. Veziculele neutre mai mici de 100 nm traverseaz prin interstiiu i apoi spre limfatice cu mult mai uor dect veziculele mari. Transportorii medicamentoi rmai la locul de injectare vor ceda moleculele active ncorporate. Calea intraperitoneal Administrarea intraperitoneal are avantajul de a asigura o expunere direct a tumorii, infeciei sau inflamaiei la agentul terapeutic inclus n lipozomi. Aceast metod de eliberare a substanei medicamentoase crete efectul dozei n cavitatea peritoneal. Pentru substanele antitumorale, acest mod de administrare este preferat celui intravenos datorit acumulrii mai mari a substanei medicamentoase i a minimizrii toxicitii. Calea oral Prin administrarea pe cale oral a lipozomilor se urmrete evitarea degradrii substanei active i facilitarea absorbiei substanelor active coninute. Eficacitatea lipozomilor administrai oral impune meninerea integritii structurale n cursul trecerii prin tractul gastrointestinal i necesitatea absorbiei intestinale cu un randament suficient.

40

Pentru meninerea structurii, lipozomii trebuie s reziste la valorile de pH variate din tractul digestiv i la aciunea srurilor biliare i a lipazei pancreatice (aciune fosfolipazic). Administrarea oral a lipozomilor ce conin fosfolipide saturate are efecte benefice asupra mucoasei gastrice, inhibnd aciditatea sau aciunea duntoare a unor substane asupra mucoasei gastrice. Calea dermic (cutanat) Administrarea dermic a veziculelor bazate pe fosfolipide apare pentru prima dat n literatur la nceputul anilor 80. Dup aplicarea pe piele, lipozomii joac un dublu rol i anume acela de a reine/proteja compusul activ de-a lungul stratului cornos i de a aciona ca un promotor pentru penetraie. Viteza de transport a substanei medicamentoase coninute n formulrile lipozomale prin piele poate fi influenat de compoziia, mrimea i sarcina de suprafa a lipozomilor. n cazul lipozomilor destinai aplicrii cutanate este necesar un design atent pentru a defini compoziia optim, dependent de obiectivul specific, respectiv: eliberarea dermic, cnd se dorete retenia crescut a substanei medicamentoase n piele sau eliberarea transdermic, cnd se impune penetrarea mai profund a transportorului lipozomal n piele. Lipozomii cu sarcin pozitiv pot interaciona cu pielea ncrcat negativ. Deoarece mrimea porilor cutanai este de aproximativ 0,3 nm, mrimea lipozomilor pentru eliberare transdermic este un parametru crucial pentru performana global a formulrii. n general, se consider c principalele ci de penetraie transdermic a compuilor activi sunt cile intercelular sau pe la nivelul anexelor cutanate (calea transfolicular). Tratamentul local al bolilor de piele prin intermediul lipozomilor vizeaz tratamentul acneii, a arsurilor solare i a plgilor sau pentru combaterea mbtrnirii. Lipozomii pentru uz dermatologic sunt potrivii pentru ncrcarea cu antiinflamatoare, antimicotice, antibiotice, retinoide. Recent, pentru eliberarea transdermic a substanelor medicamentoase, atenia a fost centrat pe dezvoltarea unor vezicule transformabile sau elastice, precum transferozomii i etozomii, menionai anterior.

41

n pofida unor rezultate promitoare raportate n unele cercetri, mecanismul eliberrii transdermice rmne nc un subiect controversat, n special n legtur cu profunzimea penetraiei n piele a lipozomilor intaci. Calea ocular (oftalmic) Corneea reprezint o barier eficace fa de absorbia substanelor medicamentoase hidro/lipofile la nivelul segmentului posterior al ochiului. Lipozomii au caracteristici promitoare pentru eliberarea ocular a substanelor medicamentoase deoarece pot fi administrai sub form de picturi sau geluri oftalmice, care vor localiza i menine activitatea farmacologic a acestora la locul de aciune. Niozomii prezint o biodisponibilitate ocular crescut pentru substane medicamentoase hidrofile, deoarece agenii tensioactivi din formulare acioneaz ca promotori de absorbie i ndeprtreaz stratul mucos de pe suprafaa ocular. O versiune modificat a niozomilor, denumii discozomi, variaz n mrime i form. Dimensiunea mai mare a acestora (12-60 m) previne drenajul n sistemul de drenaj nasolacrimal. Mai mult, forma lor asemntoare unor discuri furnizeaz o fixare mai bun la nivel ocular. Studii pe niozomi i discozomi cu timolol maleat au demonstrat o biodisponibilitate mai mare a timololului. Calea vaginal Administrai vaginal, lipozomii au avantajul c pot controla i susine eliberarea substanei medicamentoase la locul de aciune. Substanele investigate sunt contraceptive, antimicrobiene, antibiotice, antifungice, antivirale. Au fost dezvoltate formulri lipozomale n geluri de carbopol care s mreasc timpul de retenie n vagin. Alte ci investigate pentru administrarea lipozomilor sunt calea nazal (pentru eliberarea vaccinurilor) i cea pulmonar (pentru eliberarea peptidelor i proteinelor). 13. Produse farmaceutice lipozomale Fa de numrul mare de cercetri raportate de literatura de specialitate, se constat c numrul produselor lipozomale care au obinut autorizaia de punere pe pia este restrns, fapt explicabil avnd n vedere consideraiile de mai sus.

42

Totui, agenii terapeutici investigai sunt mult mai numeroi, ca i numrul produselor aflate n diverse stadii ale studiilor clinice. Cteva exemple dintre cele mai folosite preparate medicamentoase care conin lipozomi sunt redate n continuare. Tabel 10. Preparate parenterale Produs Substan medicamentoas Amfotericina B Tipul particulelor Lipozomi AmBisome circulaie ndelungat) Complex lipidic Abelcet Amphocil Amfotericina B Complex lipidic Amfotericina B Llipozomi Doxil Doxorubicina circulaie (PEGY-lai) Lipozomi DaunoXome Daunorubicina circulaie lung(PEGY-lai) de Sarcom Kaposi de lung Sarcom Kaposi (de Indicaii Infecii grave Infecii grave Infecii grave Productor fungice NeXstar Pharmaceuticals fungice The fungice Sequus Pharmaceuticals Sequus Pharmaceuticals NeXstar Pharmaceuticals Liposome

Company

Tabel 11. Preparate cutanate Produs Pevaryl Lipogel Substan medicamentoas Econazol baz Tipul particulelor Lipozomi (gel) Lipozomi (gel) Lipozomi (gel) Emulgel 43 Indicaii Eczeme/micoze cutanate Anticoagulant Anticoagulant Anticoagulant Productor Cilag Corp. Ratiopharm Corp. Ratiopharm Corp. Ratiopharm Corp.Corp.

Heparin Pur Heparin Heparin Pur Forte

Heparin Heparin

HepaPlus 30 Emgel

Alte preparate lipozomale aflate n uz clinic conin: Amfotericin B, vaccinuri pentru hepatita A, hepatita B, difterie, tetanos vaccin oral E. coli sau Shigella flexneri, amikacin vincristin nistatin, kanamicin i tretionin.

14. Lipozomii - vectori cosmetici Cercetrile privind utilizarea lipozomilor n domeniul cosmetic sunt mai recente dect cele iniiate pentru aplicaiile farmaceutice. Primul produs lipozomal cosmetic, Capture, a fost obinut de DIOR n 1987. Totui, n prezent pe piaa produselor cosmetice lipozomii sunt larg comercializai, nregistrnd adevrate succese comerciale, spre deosebire de lipozomii medicamentoi care au o aplicare clinic mult mai restrns. Se pot desprinde dou motive eseniale care justific puterea de atracie a acestor preparate n cosmetologie: - pielea ndeplinete funcii fiziologice foarte importante pentru organism i, depunnd de-a lungul timpului o munc extraordinar, merit o atenie special, mai ales atunci cnd vreuna dintre aceste funcii este perturbat; - similaritatea unor componente ale epidermului cu cele ale lipozomilor, fac din acetia principalii transportori (vectori) ai compuilor dermatologici, respectiv ai ingredientelor cosmetice. Preparatele lipozomale au deschis calea unor noi formulri i chiar a unor categorii de produse care ofer consumatorului ansa unei ngrijiri eficace i intense. Lipozomii utilizai n cosmetic prezint o serie de avantaje: au o bun compatibilitate cu lipidele cutanate; formeaz o barier natural la suprafaa pielii, favoriznd hidratarea acesteia; asigur o eliberare prelungit a ingredientului activ; 44

prezint afinitate pentru cheratin, favoriznd fixarea ingredientului cosmetic n stratul cornos i o absorbie prelungit;

Multe din produsele comerciale reprezint variante ale lipozomilor, niozomi, rovizomi, dragozomi etc., a cror denumire au legtur cu compoziia lor sau sunt rodul imaginaiei productorilor. Produsele cosmetice coninnd lipozomi sunt formulate: pentru aplicare n timpul zilei, cu aciune protectoare; pentru aplicare n timpul nopii, cu aciune de regenerare; pentru pielea uscat i sensibil; ca produse anti-age, antirid, ecrane solare, bronzare, autobronzare etc.

n tabelul urmtor sunt prezentate unele ingredientele active cosmetice ncorporate n lipozomi, aciunile i formele de prezentare a produselor lipozomale cosmetice. Tabel 12 Ingredient cosmetic Vitamine (A, B3, C, E, F) Ulei de Avocado Ulei de Jojoba Aloe alfa hidroxi -acizi Pirolidon-carboxilat de sodiu NMF (Factor natural de umectare) Hialuronat de sodiu Filtre UV Ginkgo Biloba Factor uman de cretere Hidrolizat de colagen Elastin Precursori de glicozaminoglicani Ceramide Cofein Stimularea lipolizei i microcirculaiei 45 Refacerea dermice Sprayuri Produse pentru baie ampoane arhitecturii Baze de machiaj Protecie solar Antioxidant Antiaging Contur de ochi Loiuni Hidratant Geluri Aciune Revitalizant Emolient, nutritiv Forme cosmetice Creme - protectoare - restructurante - antirid - antiage

De asemenea, exist lipozomi n care sunt ncorporate i alte ingrediente: depigmentani; compui nutritivi; alte substane pro-barier (acizi grai linoleic i gamalinoleic); extracte vegetale; cheratin; peptide capilare; triclosan (antiacneic); salicilat de sodiu (antiacneic); aminoacizi; coenzima Q (regenerarea i netezirea pielii); lactat de sodiu (hidratant); dihidroxiaceton (autobronzant) etc.

Bibliografie 1. Baillie A.J., Florence A.T., Muirhead L.H., J. Pharm. Pharmacol., 37, 863, (1985). 2. Bangham A.D., Standish M.M., Watkins J.C./1965, Diffusion of univalent ions across the lamellae of swallen phospholipids, J.Mol.Biol., 13, 238-252. 3. Betageri Guru V., Shirish B. Kulkarni, Preparation of Liposomes in Preparation & Chemical Applications, vol. I, ed. Reza Arshady, Citus Books, 489-521, (1999). 4. Billah M.M., Finean J.B., Coleman R., Biochim. Biophys. Acta, 433, 54, (1976); 5. Boddy A., Aarons L., Adv. Drug Deliv. Rev., 3, 155, (1989). 6. Burkhanov S.A. et al., Int. J. Pharm., 46, 31, (1988). 7. Cafiso D.P., Petty F.R., Biochim. Biophys. Acta, 649, 129-132, (1981). 8. Caque J.P. and Bernoud T., Les cristaux liquides dans les cosmetiques, Parf. Cosmet. Aromes, (1990). 9. Cerezo Galan, Liposomas, in Tratado de Farmacia Galenica, ed. Faulii Trillo, Luzan 5, S. A. De Ediciones, Madrid, 173-186, (1993). 10. Chakravarty P.K. & colab., J. Med. Chem., 26, 638, (1983). 11. Chew C.H. and Gan L.M., Monohexylether of ethylene glycol and diethylene glycol as microemulsions cosurfactants, J. Dispersion Sci. Tchnol., 1990.

46

12. Cioca G. and Calvo L., Liquid crystals and cosmetics applications, Cosmet. Toiletries (1990). 13. Davis S.S., J. Pharm. Pharmacool., 44 (suppl. 1), 186, (1992). 14. Deamer D., Bangham A.D., Biochim. Biophys. Acta, 443, 629-634, (1976). 15. Dlattre J., Couvreur P., Puisieux F. et al., Les liposomes: Aspects technologiques, biologiques et pharmacotechniques, Lavoisier Tec et Doc, Paris 1993. 16. Dressman J.B., Bas P., Ritschel W.A., J. Pharm. Sci., 82, 857, (1983). 17. DSilva J.B., Notary R.E., J. Pharm. Sci., 71, 1394-1398, (1982). 18. De Luca M., Grossiord J.L., Medard J.M., A stable W/O/W multiple emulsion, Cosmet. Toiletries, 1990. 19. Ghiescu L., Fixman A., Simionescu M., Simionescu N., J. Cell. Biol., 102, 1304, (1986). 20. Gonzales-Rothi, R.J. SchreiperH, Pulmonary delivery of liposomes, J. Controlled Release, 1993,5, 149-161. 21. Grossiord J.L., Seiller M. and Puisieux F., Apport des analyses rheologiques dans letude des emulsions multiples H/L/H, Rheologica Acta, 1993. 22. Gruner S.M., Novel Multilayered Lipid Vesicles, Biochem., 24, 2833-2842, (1985). 23. Haran G., Cohen R., Bar L., Barenholz Y., Transmembrane ammonium sulphate gradients in liposomes produce efficient and stable entrapment of amphipathis weak bases, Biochim. Biophys. Acta, 1993, 1151, 201-215. 24. Hellstrom K.E. & colab., Antibodies for Drug Delivery, in Controlled Drug Delivery: Fundamental and Applications, ed. J. R. Robinson and V. H. Lee, Marcel Dekker, N. Y., 623, (1987). 25. Harrington K.J., Syrigos K.N., Vile R.G., Liposomally targeted cytotoxic drugs for the treatment of cancer, J. Pharm. Pharmacol., 2002, 54, 1573-1600. 26. Hrju V., Lupuliasa D., Dumitrescu A.M., Dermocosmetologie, ed. Polirom, 30-35, (1998). 27. Hrju Victoria, Lupuliasa D., Hrju M., Sisteme cu eliberare la int a substanelor medicamentoase n Tehnologie Farmaceutic, (Iuliana Popovici, D. Lupuliasa), Editura Polirom, vol. 3, 2009, 682-686. 28. Hofland H.E., Bouwstra J.A., Spies F., Interactions between nonioniques surfactant vesicles and human stratum corneum in vitro, J. Liposome, 1995. 29. Hope M.J., Bally M.B., Biochim. Biophys. Acta, 816, 294, (1985). 47

30. Hopkins C.R., Site-specific Drug Delivery Cell Biology Medical and Pharmaceutical Aspects, ed. Tomlinson E. i Davis S.S., John Wiley & Sons, Chichester, 27, (1986). 31. Hsu M.J., Juliano R.L., Biochim Biophys. Acta, 720, 411, (1982). 32. Hussain A., Truelove J.E., J. Pharm. Sci., 65, 1510, (1976). 33. Illum L., Farraj F., Davis S.S., Int. J. Pharm., 46, 261 (1988). 34. Ishida O., Maruyama K., Sasaki K., Iwatsuru M., Size-dependent extravasation and interstitial localization of polyethylenglycolliposomes in solid tumor bearing mice, Int. J. Pharm., 1999, 190, 49-56. 35. Johnson M.M., Biochim. Biophys. Acta, 307, 27-41, (1973). 36. Kenneth A. Walters, Drug Delivery: Topical and Transdermal Routes, Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, Informa Healthcare USA, 2007, 1318-1319. 37. Kirby C., Clarke J. and Gregoriadis G. (1980), Cholesterol content of small unilamellar liposomes controls phospholipid loss to high density lipoproteins in the presence of serum, FEBS, Lett, 111, 324-328. 38. Kim C.K., Lee M.K., Int. J. Pharm., 108, 21, (1994). 39. Kulkarni S.B., Betageri G.V., Singh M., J. Microencap., 12, 229-246, (1995). 40. Kumar V., Banker G.S., Target - Oriented Drug Delivery Systems, in Modern Pharmaceutics, third ed., ed. Banker S. G. i Rhodes T. C., Marcel Dekker Inc., 611679, (oct. 1995). 41. Lasic D.D., Liposomes: From Physics to Applications, Elsevier, Amsterdam, 63-107, (1993). 42. Lassic D.D., The Mechanism of Vesicle Formation, Biochem. J., 29, 335-348, (1988). 43. Leucua S., Medicamente vectorizate, Ed. Medical, 163-165, (1993). 44. Machida K.J., Hu R., Int. J. Pharm., 61, 109, (1990). 45. Magenheim B. and Benita S., Nanoparticles characterisation. A Comprehensive physicochemical approach, STP Pharma., (1991). 46. Martn F.J., Morano J.K., Liposome Extrusion Method, U.S. Patents, 4737 323, 1988. 47. Marsh D., Handbook of Lipid Bilayers, CRC Press, Boca Raton, FL, 1990. 48. Mayer L.D., Hope M., Cullis P.R., Biochem. Biophys. Acta, 817, 193-196, (1985). 49. Meric E., Tehnologia produselor cosmetice, ed. Corson Iai, 274-278, (2000). 50. Mezei M., Nugent F.J., Method of Encapsulating Biologically Active Materials in Multilamellar Lipid Vesicles, U. S. Patent, 4 485 054, CA 101, 12 227 w., 1984.

48

51. Muller R.H., Hildebrand G.E., Pharmazeutiche Technologie: Moderne Arzneiformen, Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbH Stuttgart (1998). 52. Muranishi S.S. et al., Delivery Systems for Peptide Drugs, ed. S. S. Davis, L. Illum, E. Tomlinson, Plenum Press, N. Y., 177, (1986). 53. New R.R.C., Liposomes, A Practical Approach, IRL press, Oxford and New York, 33103, (1989). 54. Notari R.E., Optimization of Drug Delivery, ed. H. Bundgaard, A. B. Hansen, H. Koford, Munksgaarg Copenhagan, 117, (1982). 55. Oku N., MacDonald R.C., Biochem, 22, 855-863, (1983). 56. Oussoren C., Storm G., Liposomes to target the lymphates by subcutaneous administratio, Adv. Drug Delivery rev. 2001, 50, 143-156. 57. Popovici Adriana, Antofie I., Lipozomii ca vectori medicamentoi, Cluj-Napoca 2004, 123-128. 58. Popovici Iuliana, D. Lupuliasa, Tehnologia farmaceutic, volumul 2, ed. Polirom, 2008, 311-386. 59. Prybilski C., de Luca M., Grossiord J.L., et al., W/O/W multiple emulsions manufacturing and formulation considerations, Cosmet. Toiletries, 1990. 60. Seiller M., Orecchioni A.M., and Vautions C., Vesicular Systems in cosmetologye, in Cosmetic Dermatologye (R. Baran and H. I. Maibach), London, Martin Dunitz, 1994. 61. Seymour L. W., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst., 19, 135 (1992). 62. Sone S., Matsura S., J. Immunol., 132, 2105, (1984). 63. Sophia G. Antimisiaris, Paraskevi Kallinteri, Dimitrios G. Fatouros, Liposomes and Drug Delivery, in Pharmaceutical Manufacturing Handbook: Production and Processes, edited by Shayne Cox Cad, John Willey&Sons, Inc., 2008, 443-506 64. Stella V. I. & colab., J. Med. Chem., 23, 1275, (1980). 65. Storm G., Crommelia D.J.A: Liposomes: Quo vadis?, Pharma Science & Tehnology Today, 1998,vol.1,nr.1, 19-31. 66. Suzuki T., Nakamura M., Sumida H. and Shigeta I., Liquid crystal make-up remover:condition of formation and its cleansing mechanisms, J. Soc. Cosmet. Chem. 1992. 67. Talsma H., Crommelin D.J., Liposomes As Drug Delivery Systems, Pharmaceutical Technology International, 24-36, (Nov. 1992).

49

68. Talsma H., Crommelin D.J., Liposomes As Drug Delivery Systems, Pharmaceutical Technology International, 34-38, (Dec. 1992). 69. Talsma H., Crommelin D.J., Liposomes As Drug Delivery Systems, Pharmaceutical Technology International, 48-59, (Jan. 1993). 70. Taylor K.M., Taylor G., Stevens J., Int. J. Pharm., 58, 57-61, (1998). 71. Tomlinson E., Int. J. Pharm. Technol., 4, 49, (1983). 72. Vasant V. Ranade, Manfred A. Hollinger, Site-specific Drug delivery using Liposomes as carriers, Drug delivery Systems, CRC Press, Boca Roton, Florida 1995, 3-25. 73. Vauthier C., Holzcherer, S. Benabbou, G. Spenlehauer, et al., Methodology for the preparation of ultradispersed polyner systems, STP Pharma Sci., 1991. 74. Wu P.C., Liao Y.H. C.C., Chang J.S., Hiang, Y.B., The characterization and biodistribution of cefocitin-loaded liposomes, Int. J. Pharm., 2004, 271, 31-39.

50