Universidad Nacional Autnoma de Mxico Facultad de Estudios Superiores Cuautitln Campo 1 Virologa Mdica PCR

Antecedentes histricos
En los 70s, la tecnologa del ADN recombinante era la nica forma posible de estudiar la estructura y funcin de los genes eucariticos.


En 1971, un artculo publicado por Kleppe et al. en Journal of Molecular Biology describi por primera vez un mtodo que usaba enzimas para replicar una secuencia pequea de ADN con oligonucleotidos (primers) in vitro. Este temprano ejemplo del principio bsico de la PCR no recibi mucha atencin hasta finales de los 80s.

En 1983, Kary Mullis, investigador de la Cetus Corporation, desarrollo un mtodo simple para la obtencin un nmero ilimitado de copias de una secuencia especfica de ADN en un tubo de ensayo.

Mediante la utilizacin de dos cebadores, Mullis consigui que se generara una reaccin de replicacin en cadena que amplific el segmento genmico de su inters.

Consiste en una serie de 20 a 35 cambios repetidos de temperatura llamados ciclos; cada uno suele consistir en 2-3 cambios de T. Los ciclos a menudo estn precedidos por un choque trmico (hold) a alta temperatura (> 90C), y seguido por otro hold al final del proceso para la extensin de producto final o el breve almacenaje.

Fundamento
La tcnica in vitro se basa en la replicacin del ADN por medio de la DNA polimerasa, estas enzimas realizan la sntesis de una cadena complementaria de DNA en el sentido 5-> 3 usando un molde de cadena sencilla, para lo cual se emplean variaciones de temperaturas.

Reactivos
DNA molde: contiene la regin de ADN que se va a amplificar, 50-2000 nucleotidos de longitud.
Buffer: Mantiene el pH adecuado para el

funcionamiento de la ADN polimerasa.

Sales: Como el KCl que ayuda en la

desnaturalizacin del DNA

Dinucletidos

trifosfatados (DNTPS): Son cuatro: dATP, dGTP, dCTP y dTTP., son el sustrato para polimerizar nuevo ADN.

Oligonucleotidos (primers): Son secuencias cortas de nucletidos, normalmente de 18 a 22nt. Que son reconocidos por la polimerasa permitiendo iniciar la reaccin. Delimitan la zona de ADN a amplificar. DNA Polimerasa: llevan a cabo la replicacin del DNA y se puede clasificar en: Termolbiles: T ptima de 37-42C. Se desnaturalizan con el calor (DNA polimerasa I (E. coli) Fragmento Klenow de DNA polimerasa I (E. coli)). Termoestables: T ptima de 74 C. Resiste durante 40-50 a 96C. Taq polimerasa, enzima aislada de Termus aquaticus (Taq), bacteria que soporta altas T.

Desnaturalizacin
Etapa critica consiste en separar la doble hebra de DNA y convertirla en hebra sencilla , T:94-97C, durante 15-40 seg el tiempo depende del tamao del genoma, rompe puentes de hidrogeno .

Apareamiento (hibridacin)
Los cebadores reaccionas con DNA y se pegan. La T depender de 3 factores:  La composicin de bases  El tamao  La concentracin. Esta oscila 45 - 65C, durante un tiempo 30seg - 1min. Un aumento de T o del tiempo favorece la especificidad ya que disminuye las uniones incorrectas de los iniciadores con la hebra molde.

Extensin (elongacin)
Una polimerasa de DNA extiende los primers en el espacio comprendido entre ambos y coloca dNTPs. La temperatura puede variar entre 70-72C T en que se activa la Taq polimerasa. El tiempo de extensin depende del tamao de la amplificacin. Se puede estimar un tiempo de 1 minuto para elongar 1 kb.

Extensin final
Etapa nica que se lleva a cabo a una temperatura de 70-74C durante 5-15 minutos tras el ltimo ciclo de PCR. Con ella se asegura que cualquier ADN de cadena simple restante sea totalmente ampliado.

PCR anidada
Tcnica

muy especfica en la que el producto de una amplificacin es utilizado como molde para realizar una segunda amplificacin con cebadores que se sitan dentro de la primera secuencia amplificada. Se utiliza sobre todo cuando se tienen pequeas cantidades del ADN de inters o cuando se quieren evitar las amplificaciones inespecficas

PCR en tiempo real PCR-RT

Tcnica que permite cuantificar, la cantidad de ADN o ARN amplificado en cada momento.
Es una tcnica donde el molde inicial es ARN y se requiere de una transcriptasa inversa para realizar la conversin del ARN a ADN complementario.

 La tecnologa PCR en tiempo real se basa en la utilizacin conjunta de termocicladores con un fluorimetro incorporado y fluoroforos.

PCR in situ
Tcnica donde los productos generados pueden visualizarse en el sitio de amplificacin. Son preparaciones fijas sobre un portaobjetos. En la tcnica de in PCR-in situ se realiza primero amplificacin de ADN blanco y luego deteccin mediante hibridacin in situ convencional con sondas ADN/ARN. De esta manera pueden detectarse cantidades pequesimas de genoma viral.

PCR multiplex
Variante de la tcnica de PCR donde se emplean dos o mas pares de primers en nico tubo con el fin de amplificar simultneamente mltiples segmentos de ADN. -Varias secuencias target en forma simultnea. - La eficiencia de amplificacin necesariamente la misma: de ambos targets no es

Secuencia de DNA de los diferentes targets (%GC) Temperatura de hibridacin de los diferentes primers Tamao de las diferentes secuencias target Artefactos / dmeros entre diferentes primers

Varias secuencias target en forma simultnea. La eficiencia de amplificacin de ambos targets no es necesariamente la misma: Secuencia (%GC) de DNA de de los diferentes de los targets

Temperatura primers

hibridacin

diferentes

Tamao de las diferentes secuencias target Artefactos / dmeros entre diferentes primers

Bibliografa
http://colombiamedica.univalle.edu.co/Vol40No3/html/v40n3a12.html http://www.quimica.es/enciclopedia/es/Reaccin_en_cadena_de_la_polimerasa/#_note-4 www.iib.uam.es/servicios/seq/otros/SecuenciaADN/SecuencaciaADN.html