ESCUELA PROFESIONAL DE BIOLOGÍA

Bioinsecticidas: Bacillus sp. como

larvicida de Anopheles sp.
ASIGNATURA :

Microbiología Industrial

DOCENTE :

MSc. Carmen Carreño Farfán

ALUMNO :

Rómulo Aycachi Inga

CICLO :

2007 - I

Lambayeque, setiembre de 2007.

INDICE

2
 Bioinsecticidas: Bacillus sp. como
larvicida de Anopheles sp.

I. Introducción:

En culturas antiguas se conocían enfermedades que afectaban a los

insectos de interés económico, como el gusano de seda (Bómbix mori L.), a la
abeja (Apis mellifera L.). Con el descubrimiento del microscopio se detectaron
algunas de las bacterias responsables.
La sintomatología en los insectos enfermos indujo a pensar que los
agentes etiológicos eran bacterias. Pasteur en 1870 describió una de esas
bacterias llamada Vibrion anoyac, luego reclasificada como Bacillus bombycus.
En 1902 Ishiwata aisló de larvas enfermas del mismo gusano una bacteria que
denomino Bacillus soto. Berliner en 1915 en Turingen, Alemania, aisló de
larvas enfermas de la palomilla del Mediterráneo Anagosta kuehniella L), hoy
conocido como Bacillus thuringiensis o Bt, que produce cristales con actividad
insecticida, desde 1954 se estableció la relación entre la ingestión de los
cristales de la bacteria y la parálisis intestinal del insecto, porque éstos no
tienen toxicidad por otra vía en humanos y/o animales. Un análisis de 161
aislados de Bt propusieron una clasificación con base a sus antígenos
flagelares H, a pruebas bioquímicas para establecer 24 serotipos H y 33
variedades de la bacteria.
En 1977 en la región de Neveg en Israel, se asiló la variedad de Bt con
rápida actividad larvicida sobre mosquitos de los géneros Anopheles,
Uranotaenia, Culex y Aedes, los aislados de Bti tienen actividad toxica contra
larvas de mosquitos, en función del medio de cultivo, la condición de
crecimiento, sin asociación entre la cantidad de espora y la toxicidad de los
cristales, en la actualidad se busca mejorar la producción y toxicidad de los
cristales de Bt.
Estos y otros descubrimientos llevaron al desarrollo y aplicación de
diversos “bioinsecticidas” a base de estos tipos de microorganismos, para el
control de mosquitos vectores transmisores de enfermedades en el hombre. El
orden Diptera corresponde a los mosquitos de importancia médica, porque
algunas de sus géneros y especies son vectores de enfermedades como:
paludismo, fiebre amarilla y dengue, además son responsables del elevado
costo económico de las campañas para su erradicación, en zonas endémicas
del mundo (sobre todo en Sudamérica), así como por el valor económico a
largo plazo del tratamiento médico de los enfermos.
Desde 1950 se realizan campañas de control vectorial de estos insectos
en países como México, ya que con la aspersión de pesticidas: DDT,
metoxicloro, y organofosforados como: el abate, el malatión, el paratión,el
feniton etc., estos fueron al principio efectivos, pero su uso indiscriminado
provoca deterioro ambiental e inducen resistencia en insectos-plaga.
En la actualidad 500 especies de estos son resistentes a uno o más
pesticidas, el número se duplica en un periodo de 6 años, son imprescindibles,

3
aunque existe la tendencia a minimizarlos.
Una alternativa para el control de dípteros es el biológico como: los peces
larvívoros del género Gambusia affinis; los nemátodos del tipo Rabdítidos y
Mermítodos, así como los protozoarios parásitos de los géneros: Epystilis,
Vorticella y Terahymena; hongos entomapatógenos: Beauverya, Entomophora,
Metarrhizium y Coelelomyces spp; de los, virus parásitos de insectos como: la
poliedrosis nuclear, iridiscentes, etc. Entre las bacterias se reportó: Bacillus
popilliae B. sphaericus y B. thuringiensis (Bt), cada una controla plagas con
oportunidades de explotación y uso depende de sus propiedades específicas,
por ejemplo B. popilliae requiere insectos vivos para su reproducción. En
contraste Bacillus thuringiensis var israliensis (Bti) es específico para dípteros
una alternativa en el control biológico.

II. Generalidades sobre la producción de bioinsecticidas.

a. El problema: Enfermedades transmitidas por mosquitos al hombre.

- Paludismo: Enfermedad llamada también Malaria es una de las más

antiguas de la humanidad, citada en documentos chinos y papiro
egipcios desde el siglo I A.C. Los romanos Marco Terencio Varrón y
Columela asociaron su propagación con la existencia de mosquitos. En
1631 Juan de Vega usó la infusión de la corteza de la quina para su
curación. En 1880 Lavoran descubrió que Plasmodium vivax como el
agente etiológico. En 1897 Ross identificó su vector, el díptero del
género Anopheles. Esta enfermedad fue introducida en México en 1519
por los conquistadores españoles, en la época precolombina existían
anofelinos sin paludismo, no obstante P. vivax se adaptó a estos y les
usa hoy como vectores para iniciar epidemias con elevada mortalidad en
los pobladores de este país. En la actualidad el paludismo es un
problema grave de salud pública; en los últimos 10 años ha sido una de
las principales causa de mortalidad a nivel nacional. En los 50 fue la
enfermedad más extendida en el mundo, afectó millones de personas, y
provoco la muerte de otros millones. El trasmisor del paludismo es la
hembra de mosquito del género Anopheles, con sus especies más
comunes: A. quadramaculatus, A. pseudopunctipennnis y A. alimanus.
Para el control y erradicación de los vectores de la enfermedad se
aplican: DDT (Diclaro-difenil-tricoloro etano), hexacloro-benceno,
clordano, dadas las consecuencias negativas al ambiente se propone
nuevas alternativas de control, como Bti para eliminar las larvas de estos
insectos vectores.
- Dengue: Es una virosis humana causada por uno de los cuatro
serotipos de flavovirus, es endémico en áreas tropicales y subtropicales
del mundo, su existencia esta condiciona a la del mosquito Aedes
aegypti, por lo cual la población humana potencialmente afectada es de
1,500 millones en 61 países sin incluir las áreas donde se registra
dengue hemorrágico, con 350 millones. A. aegypti es un eficaz vector,
ya que con un solo mosquito entre 100 es suficiente para iniciar una
epidemia, este insecto es antropófilo estricto y su poca capacidad de
vuelo horizontal como vertical, favorece su adaptación en zonas
urbanas, lo que explica el aumento del dengue en América en los últimos

4
 25 años, es el resultado del incremento de sus dispersión. La reciente
introducción de Aedes albopictus en América agrava esa situación, pues
es un vector accesorio del dengue Asia, además se le identifica en Brasil
y Estados Unidos. El dengue hemorrágico ó serotipo es la forma más
patógena, alcanza un 40% de mortalidad infantil, en México y el Caribe
en donde existen las condiciones ambientales para que aparezca en el
futuro. El control más que la erradicación de dengue se intenta con
campañas contra el vector o con nuevas vacunas, los intentos por
controlar a A. aegypti han tenido poco éxito ya que lo que favorece su
propagación es el desecho de cantidades ilimitadas de recipientes en la
formación de incubadores para sus larvas, el alto costo de aspersión
de insecticidas, al igual que el impacto negativo en los ecosistemas. Lo
anterior apoya la nuevas alternativas de control, como el biológico
como B. sphaericus y Bti para la solución de este problema.
- Fiebre amarilla: Esta enfermedad es causada por un serotipo de
flavivirus. La fiebre amarilla (FA) es una forma selvática que existe entre
los primates de África, Centro y Sudamérica, se trasmitió por mosquitos
de bosques o matorrales a la forma urbana. El vector es A. aegypti. Este
insecto trasmite el virus hasta 168 días después de ingerido de sangre
de un enfermo con FA, se reporta un período de incubación de 3 a 6
días con un inicio rápido de la enfermedad, los síntomas ligeros de una
semana, se manifiestan por fiebre, cefalea, dolor muscular, vómito y
fiebre alta con síntomas hemorrágicos; la FA se distribuye en los trópicos
húmedos de África, Centro y Sudamérica.

b. Las posibles soluciones

i. El control químico.

Antes de la Segunda Guerra Mundial, los insecticidas disponibles

eran compuestos inorgánicos: arsenato de plomo, derivados del
petróleo e insecticidas naturales como los piretroides; durante los años
30, se diseñaron los orgánicos sintéticos, con la guerra al disminuir el
suministro de derris y el pelitre de los trópicos. La empresa suiza
Geigy descubrió las propiedades del DDT en Alemania se descubrieron
los órgano-fosforados e hidrocarburos clorados, una fuente efectiva de
insecticidas, en los primeros años de su empleo fueron ideales en el
control de plagas agrícolas y de salud pública como el paludismo en el
mundo. Desde la década de los 50 y 60 surgieron problemas de tipo:
resistencia artrópodos en promedio de 200 especies lo hacen a uno o
más, brotes secundarios de plagas distintas a las originales de
aquellas contra las que se dirigió el control inicial, el rápido
resurgimiento de las plagas tratadas en los 80 y finales de los 90, que
requieren mayor número de aplicaciones, con alta residualidad tóxica a
humanos, ganado y la vida silvestre, que causan la contaminación del
agua, suelo, aire, riesgo en la manipulación de insecticidas, y el costo
creciente en su producción y aplicación.
La Organización Mundial de la Salud (OMS) inició en 1951 en México
un programa de erradicación de paludismo, con el DDT como el
principal agente de control en las campañas antiaedes y antipalúdicas,

5
 en los sitios inaccesibles se aplicó Dieldrin una vez al año, desde
1959, se detectó resistencia de Anopheles albimanus y A.
pseudopunctipennis al Dieldrin, en 1963 la tolerancia de los anofelinos
al DDT, pero se declaró erradicado A. aegypti de México, regreso en la
década de los 70 por el sureste, con resistencia a organoclorados y
organofosforados. En la actualidad hay resistencia a por lo menos un
insecticida en 20 especies de Aedes, 15 de Culex y 5 de Culiseta. El
comité de expertos en resistencia de especies de anofelinos de la
OMS reconoce más de 51 especies.
Por lo anterior se infiere que el control de insectos no debe basarse
solo en el uso de insecticidas químicos, además en 1991 se publicó la
prohibición y restricción de 40 plaguicidas tipos distintos de
plaguicidas, la Asamblea Mundial de Salud, recomendó un nuevo
método de lucha antivectorial y el interés por el control biológico, las
investigaciones sobre enemigos naturales de los vectores, los
candidatos se clasificaron en 5 grupos, en función de las
investigaciones de bajo, mediano, o alto potencial; con prioridad 1 y
posibilidad de aplicación: el pez y larvívoro Gambusia affinis y Bti.

ii. Control biológico.

El uso de bioplaguicidas (bioinsecticidas) resultó como una

alternativa a las cada vez mas notorias desventajas del control químico
empezado por varios países alrededor de la década del 50’. Los
descubrimientos realizados de bacterias tanto productoras de toxinas
como bacterias parásitas con elevado potencial para uso como
controladores biológicos de insectos plaga a abierto una gran
expectativa tanto en el campo científico como industrial.
Las bacterias utilizadas como controladores biológicos se dividen en
cuatro grupos con base en su efecto sobre el insecto-plaga:

Patógenos obligados: Bacillus popillae y B. larvae, este grupo es

específico para un hospedero y no crecen en medio de cultivo artificial.
Bacillus formadores de esporas y cristales: como B. sphaericus y
B. thuringuiensis var. israelensis. Su principal característica es la
síntesis de toxinas de naturaleza proteica con acción tóxica intestinal
contra larvas de dípteros (mosquitos).
Patógenos facultativos: Pseudomonas aeruginosa, Achromobacter
spp y Serratina mercences. Tienen uno o varios hospederos de la
misma especie de insecto al que infectan. Su capacidad potencial
como patógeno en humanos los excluye como una alternativa segura.

La OMS desde 1984 seleccionó B. sphaericus y B. thuringuiensis

var. israelensis (Bti H-14), por su eficacia en la eliminación de larvas de
mosquitos, Bti es diferente a otros agentes de control por su alto
grado de especificidad, seguridad ambiental y compatibilidad con otras
formas químicas o biológicas de control, propiedad del mejor
bioinsecticida, su manejo exige un cuidado especial pues es un
producto biológico, es necesario conocer la biología de las especies de
insectos que se combaten al igual que reducen su eficacia;

6
 actualmente existen productos en el mercado mundial elaborados con
base a otros microorganismos, aunque ninguna de las formulaciones
es efectiva en baja concentración; se recomienda antes de usar
pruebas de susceptibilidad que determinen el grado de respuesta, se
sugieren análisis locales, regionales e incluso nacionales, para el
seguimiento de estos productos.

III. Bacilos productores de bioinsecticidas: Bacillus thuringiensis var

israelensis

a. Generalidades.

Según su ubicación taxonómica (de acuerdo al manual de

Bacteriología Sistemática de Bergy), B. thuringuiensis se clasifica en:

Reino : Procariote
División II : Firmicutes
Clase I : Firmibacteria
Orden : Eubacterias
Familia : Bacillaceae
Género : Bacillus
Bacillus thuringiensis var.
Especie :
israelensis

B. thuringiensis es una bacteria Gram positiva, aeróbica,

esporógena, heterótrofa y con la propiedad distintiva de sintetizar uno o
más cristales con actividad insecticida, su ciclo de vida tiene dos fases:
la vegetativa y la de resistencia (generan esporas). La primera es la
bacteria, tiene una forma bacilar con un tamaño promedio de 2-5 micras
de largo por 1 micra de ancho, la división celular es por fisión binaria. La
fase de resistencia (esporulación) se induce por condiciones adversas
del medio de cultivo como: baja concentración de nutrientes, pH ácido,
disminución de la humedad, reducción del nivel de O2; la composición
química de la cubierta de la espora le confiere termorresistencia, le
protege contra la desecación. En un ambiente adecuado la espora
germina y da lugar a la fase vegetativa. Simultáneamente a la formación
de esporas, se producen cristales proteicos, que varían en su
composición, según la variedad (población de organismos de una misma
especie, que se pueden diferenciar por su comportamiento, pruebas
bioquímicas, etc.) y pueden alcanzar hasta el 30% del peso seco de la
célula vegetativa. Los cristales ó delta-endotoxina, tienen propiedades
insecticidas para larvas de lepidópteros, coleópteros y dípteros. Los
genes responsables de la formación de los cristales se encuentran
codificados en plásmidos. Los antígenos flagelares de Bti denominados
H y algunas pruebas bioquímicas como: hidrólisis de caseína,
producción de la catalasa, reducción de nitratos, se emplean para su
determinación taxómica y clasificación.

7
 En la actualidad se consideran 24 serotipos caracterización
bacteriana con base en la respuesta antígeno-anticuerpo y 33
variedades.

b. Ecología de B. thuringiensis

La bacteria es parte de diversos ecosistemas como: bosques,

selvas y sabanas y desiertos. La espora de B. thuringiensis supervive
por varios años, germina se multiplica como células vegetativas en
ambientes naturales, su existencia está relacionada con lugares de
elevadas densidades de insectos, el número de esporas de la bacteria
en graneros es alta en relación a otros hábitat de acuerdo con ciertas
condiciones ambientales: como la temperatura y la humedad constante,
mientras que la ausencia de radiación solar permite que permanezcan
viables. En relación a los hábitats naturales y los artificiales como los
graneros, existe controversia en su distribución, investigación en el
agrosistema del Bajío Guanajuatense (Guanajuato, México para
determinar la existencia y supervivencia de esporas de Bt en algunas
malezas, en hojas de cultivos agrícolas como el fríjol y maís, en insectos
saprobios y en el suelo, revelaron la existencia de esporas en el
filoplano de esas malezas y en el suelo cultivado con maíz, pero no en
las hojas de las plantas cultivadas, ni en los insectos y/anélidos del suelo
con los que se asocian, las esporas viables de Bti, se detectaron hasta 4
días después de su aplicación (34 ), lo que explica porque solo en los
graneros se reportan epizootias con miles de insectos muertos por los
cristales de Bti.

c. Toxinas y mecanismos de acción de B. thuringiensis

La investigación sobre la bioquímica de B. thuringiensis reporta que

el cristal no es tóxico en su totalidad; está dividido en regiones o
subunidades de proteína, las cuales tienen actividad enzimática
proteolítica similar a la tripsina del insecto. La ingestión de cristales y
esporas por el insecto revela una interacción entre el cristal y el intestino
del hospedero. Cuando un insecto susceptible los ingiere sus enzimas
digestivas los hidrolizan en el ambiente alcalino de su intestino, lo que
se causa daño en las células epiteliales de la pared intestinal. Las
células expuestas no responden uniformemente, las de tipo cuboide o
columnas se deterioran en estructura en las microvellosidades y en la
membrana celular, dilatación de la cisterna del retículo endoplásmico
rugoso y dispersión de los ribosomas, los núcleos no se afectan, sin
embargo las mitocondrias se hinchan, los cambios fisiológicos son
insuficientes para el transporte de iones y permeabilidad, se agota el
ATP disponible, con cambios patológicos como: vacuolización celular,
hinchamiento y lisis, así el insecto muere en menos de una hora o en
varios días, depende de la dosis ingerida. Cuando una larva consume
cristales sin espora ocurre una secuencia idéntica de estos eventos, en
consecuencia la parálisis y muerte del insecto, en donde las esporas son
pasivas hasta que el pH disminuye a 7, lo que estimula su germinación,
ya que las esporas superviven en casos específico, como en graneros

8
 lo cual provoca epizootia por la invasión masiva de Bt en el insecto.
IV. Aplicaciones y producción industrial de B. thuringiensis

a. B. thuringiensis como bioinsecticida

Hasta 1978 no se había producido ningún insecticida microbiano

para combatir plagas de insectos de valor médico y veterinario, pero a
partir del descubrimiento de B. thuringiensis, se empezaron a elaborar
a escala industrial. La preparación del bioinsecticida es una mezcla
de esporas y de cristales, que causan la muerte en poco tiempo de
que larvas de culícidos y simúlidos que se intoxican y no por
septicemia. El modo de acción del complejo espora-cristal de B.
thuringiensis tiene semejanza con insecticidas convencionales, con la
diferencia de que en los químicos se especifica el control de calidad
del ingrediente activo y sus propiedades físicas y químicas, mientras
que un insecticida de B. thuringiensis H-14 no específica con precisión
la concentración de ingredientes activos, en general se realiza un
bioensayo para comparar la toxicidad de una preparación conocida de
B. thuringiensis var kurstaki, contra la formulación de B. thuringiensis
H-14 de potencial conocido, la bacteria se maneja para evitar que
pierda toxicidad en el almacenamiento, de acuerdo con sus
propiedades se vende para suspensión acuosa, emulsión en polvo
humectable y gránulos, ya que los ingredientes espora/cristal son
insolubles, pero los cristales si, se aprovecha que las larvas de
mosquitos vectores de enfermedades infecciosas son insectos
filtradores cuando ingieren alimento en ambientes naturales.
El uso de un microorganismo o sus metabolitos en cantidades
industriales para eliminar un insecto blanco no debe tener riesgo para
el ambiente y/o humanos.
La OMS diseñó un esquema de 5 fases que evalúa la efectividad y la
seguridad de productos biológicos aplicados en el control de plagas
agrícolas, forestales, urbanas, etc., el esquema considera lo siguiente:

1) No causar infección al hombre, mamíferos y otros animales

2) No ser tóxico
3) No provocar alergias
4) Ningún tipo de caracinogénesis
5) Ningún tipo de infecciones orales, respiratorias, parentales

Además, B. thuringiensis H-14 no es tóxico para mamíferos u otros

animales no blancos excepto el mosquito.
Entre las ventajas y desventajas del uso B. thuringiensis como
agente de control biológico tenemos:

Ventajas.
- Alta especificidad para controlar larvas de las familias: Culicidae,
Simulade y Psichodidae.
- Seguridad ambiental, no daña mamíferos u otros organismos no
blanco, a excepción del culícido Toxorhynchites spp depredador de
larvas de mosquitos.

9
 - Alta virulencia solo para el insecto vectores, tiene un efecto tóxico
relativamente rápido contra mosquitos.
- B. thuringiensis es compatible con otras formas de control físico,
químico y biológico de mosquitos, sin evidencia de que induzca
inmunidad humoral o celular, tampoco heredabilidad en el insecto-
plaga.

Desventajas
- No tiene efecto residual, pero si alta especificidad por ello pocas
compañías se interesan en su manufactura, lo que limita su
espectro de control de insectos-plagas, exclusivamente a
mosquitos.
- Elevado costo producción con lo que un mínimo de gobiernos se
interesan en su producción masiva y la necesidad de investigación
para reducir los costos de producción.
- Formulaciones de eficacia variable contra mosquitos en ambientes
naturales, por que se trata de un ser vivo sujeto a las condiciones
en los que se cultiva.

b. B. thuringiensis como gen transgénico en plantas.

La ingeniería genética se ha utilizado para la introducción de genes

de B. thuringiensis en cultivos afín de conferir resistencia a insectos-
plaga. La primera planta-Bt se desarrolló hacia 1987 con tabaco
(Nicotiana tabacum) para controlar larvas de primer instar de Manduca
sexta. Perlack en 1990 produjo algodón resistente a plagas de insectos
donde la secuencia codificante para las proteínas Cry1Ab y Cry1Ac fue
modificada para aumentar los niveles de expresión hasta alcanzar
porcentajes entre 0.05 a 0.1% del total de proteína soluble. Fujimoto
en 1993 transformaron arroz con el gen cry1Ab. Desde allí las δ-
endotoxinas han sido transferidas y expresadas en por lo menos 26
diferentes especies de plantas.
Estos cultivos presentaron una disminución importante en uso de
plaguicidas químicos dejando ganancias promedio de 60 millones de
dólares para algodón, entre 19 y 190 millones para maíz. Todas las
plantas transgénicas a base de Bt son comercializadas por el sector
privado. De las patentes con relación a Bt, más de la mitad son de
Norte América, 30% de organizaciones europeas y rusas y el 18%
principalmente de compañías japonesas. El 57% de las patentes en
plantas transgénicas con Bt han sido registradas e implementadas por
unas pocas compañías siendo algunas de ellas Monsanto, Micogen,
Novartis, AgrEvo, Pioneer, Hi-Bred Internacional, DeKalb Genetics
Corporation. Los productos más avanzados incluyen algodón, maíz,
maíz dulce, papa, tomate, aceite de semilla de canola (Cerón, 2004).

c. Producción Industrial de B. thuringiensis var. israelensis para la

producción de bioinsecticidas.

La selección de un aislado silvestre de B. thuringiensis var.

israelensis (Bti) y su capacidad efectiva para producir cristales tóxicos

10
y posible manipulación genética para mejorarla, al igual que sus
requerimientos nutricionales, son aspectos fundamentales en la
producción del bioinsecticida a base de esta bacteria una etapa clave
en el proceso de escalonamiento masivo para la producción de la
delta-endotoxina, y su posterior formulación y aplicación a nivel de
campo. Es necesario el diseño de un medio de cultivo (o de
fermentación) adecuado, apto para el crecimiento, esporulación y
formación de los cristales de Bti, pues de ello depende la calidad tóxica
del cristal; en ese sentido el medio de fermentación debe contener una
fuente de carbono, de nitrógeno orgánico y sales minerales que en
balance estimulen el crecimiento, la esporulación y la producción de
cristales altamente tóxicos. En términos del tipo de constituyentes, las
fuentes de carbono más empleadas son: la glucosa, el almidón y
sacarosa, reconocidas como esenciales para la síntesis de cristales,
aunque se pueden utilizar como fuente de carbono materias primas
baratas, como productos de maíz hidrolizado (almidón y dextrinas), al
igual que jugo de agave y melaza de caña (fructosa), con excelentes
resultados sobre la esporulación y calidad tóxica del cristal. Cabe
mencionar que la melaza de caña se considera una materia prima
adecuada como fuente de carbono, de bajo costo con efectos positivos
sobre la toxicidad de la delta-endotoxina. Es claro que la ausencia de
una fuente adecuada de C para Bti, causa una disminución en la
producción de esporas y en la formación y calidad de la
deltaendotoxina.
En el caso de fuentes de Nitrógeno se ha reportado que Bti
requiere de aminoácidos esenciales y otras formas orgánicas de
nitrógeno durante su fase de crecimiento y durante la esporulación. En
general en los medios de cultivo comerciales se han empleado
proteínas de semilla y/o agua de cocimiento de maíz, otras alternativas
más baratas han sido obtenidas de fuentes naturales como la harina
de pescado, de la semilla de algodón, o de leguminosas como la soya,
el garbanzo, la haba, el cacahuate y las lentejas, o bien de líquido de
remojo de maíz; de residuos de levadura, de sangre de res, del suero
de queso y productos secundarios de la industria láctea, esta clase de
materia prima estimula la biosíntesis de la delta-endotoxina con alta
actividad insecticida. Para los minerales se ha señalado al Mn+2, K+1,
Ca+2 y Zn+2 como elementos componentes necesarios en el medio de
fermentación para la producción de la delta-endotoxina. También se
reportó el aislamiento de un Bti en un medio que contenía dextrosa,
extracto de levadura K2HPO4 y KH2PO4 y presentó los mejores niveles
en la producción de la delta-endotoxina y se recomendó el uso de
substratos baratos como harina de semilla de algodón y harina de
soya. Se describió un medio de fermentación con glucosa, peptona de
soya, extracto de levadura y líquido de remojo de maíz y sales
minerales del tipo: KCl, (NH4)2SO4, HPO4 , MgSO4 , CuCl2 , FeSO4,
ZnSO4 y MnSO4 , con el que se logró un alto rendimiento en la
esporulación y cristales tóxicos de excelente calidad. Por lo tanto, los
medios de cultivo para Bti deben contener sales minerales para la
síntesis de energía, estimular el crecimiento y la esporulación, y
factores de crecimiento como: extracto de levadura (como una fuente

11
de vitaminas del complejo B), pues su omisión retarda la esporulación
y reduce la formación de cristales y en consecuencia la toxicidad del
complejo espora/cristal. Para Bti, la combinación de factores
nutricionales orgánicos e inorgánicos es esencial en la síntesis de la
delta-endotoxina de alta toxicidad, así que el uso de materiales de bajo
costo como componentes del medio de cultivo, es básico en la
optimización del proceso de producción bioinsecticidas a base de Bti.
En consecuencia para el diseño de medios de cultivo o fermentación
sugiere:

1) Que sus componentes sean fácil de manejar o que no requieran

pretratamiento
2) Que permitan optimizar el crecimiento de la bacteria sin afectar
negativamente la calidad de la delta-endotoxina
3) Que sean baratos y abundantes
4) Que sean de fácil adquisición en la localidad.

Es importante señalar que una formula basada en la combinación

de nutrientes para una variedad de Bti, no necesariamente es
adecuada para otra variedad, por lo que la calidad de la delta-
endotoxina depende tanto del medio de cultivo como del aislado de Bti
utilizado. Aunque obviamente, el diseño del medio y la bacteria no son
los únicos aspectos involucrados en la producción del bioinsecticida,
existen otras variables que deben considerarse en el proceso de la
fermentación como: la temperatura óptima de crecimiento de Bti oscila
entre los 28 y 32ºC; la cantidad de oxigeno suministrado a la bacteria,
la velocidad de agitación para asegurar un suministro de oxigeno
adecuado en el medio de cultivo y evitar la acumulación del calor y
evitar la inhibición o reducción de la calidad tóxica de los cristales; así
como el pH inicial óptimo de entre 6.8-7.2, ya que al oxidar los
carbohidratos produce ácidos orgánicos, lo que se soluciona con
neutralización con álcali.
Para la producción del bioinsecticida a escala industrial es
necesario un proceso de escalonamiento. El escalonamiento se define
como el conjunto de técnicas y métodos empleados para transferir a
una escala mayor (escalamiento ascendente) o menor (escalamiento
descendente) un microorganismo o un producto biológico como la
deltaendotoxina y, determinar su factibilidad económica en un proceso
industrial. En el escalamiento se requiere el uso combinado e
integrado de métodos y principios de ingeniería química, bioquímica,
microbiología y genética. Los estudios de laboratorio y de planta piloto
son útiles para definir las operaciones unitarias de mayor importancia
en el proceso de escalamiento, como en el caso del bioinsecticida a
base de Bti, en donde el diseño del medio de cultivo es esencial en la
optimización de la producción del complejo espora-cristal, también es
necesario un diseño experimental a nivel de fermentador, el cual en
función de su capacidad, el equipo instalado y los recursos
disponibles, hará posibles la obtención de altamente cristales tóxicos
de Bti.

12
V. Desarrollo de la parte práctica:

a. Objetivos:

- Aislar Bacillus sp.

- Seleccionar Bacillus sp. en base a su potencial biocida a larvas
de Anopheles sp.
- Identificar la especie de Bacillus.
- Conservar la cepa de Bacillus sp. controladoras de Anopheles
sp.

b. Procedimiento:

Muestra 10-1 10-2 10-3

Sembrar
Shock térmico
80 °C/ enfriar

Agar Nutritivo
28°C/48h

Tinción Gram Repicar

(Bacillus esporulados)

13
 Suspensión
N° 06 Nefel.

Cepa Bacillus

10 ml

Control Químico Cepa Bacillus Control Absoluto

c. Resultados:

Tabla 01: Número de larvas muertas y vivas de Anopheles sp. frente a aislamiento de
Control Cepa Control
HORAS absoluto Bacillus químico
Muertos Muertos Muertos
0h 0 0 0
24 h 0 1 2
48 h 1 2 3
72 h 1 2 1
TOTAL 2 5 6
Bacillus sp., y control químico (insecticida químico)

14
 Control Cepa Control
HORAS absoluto Bacillus químico
% Muertos % Muertos % Muertos
0h 0 0 0
24 h 0 20 33
48 h 50 40 50
72 h 50 40 17 Tabla 02:
TOTAL 100 100 100
Porcentaje de mortalidad de larvas de Anopheles sp. a las 24, 48 y 72 horas,
luego de aplicados los tratamientos.

Porcentaje de mortalidad corregida para cepa de Bacillus sp.

71 - 29 10
% Corregido = x
100 - 29 0

% Corregido = 59.15 %

Porcentaje de mortalidad corregida para control químico

86 - 29 10
% Corregido = x
100 - 29 0
Fig. 01: Número de larvas muertas de
%Anopheles
Corregido = sp. 80.28
por % día

3.5
3
2.5
Nº de
2 Control absoluto
larvas Cepa Bacillus

muertas 1.5 Control químico

1
0.5
0
0h 24 h 48 h 72 h 15
Tiempo de evaluación (h)
 d. jsjaksja

Fig. 02: Comparación del porcentaje de

mortalidad corregida entre control químico y
Bacillus sp.

100 80.28
80 59.15
60
Porcentaje
40
20
0
% Mortalidad control % Mortalidad cepa
químico Bacillus sp

d. Conclusiones:

- A partir de la suelo se obtuvo dos aislamientos de Bacillus sp.

- De los dos aislamientos de Bacillus sp. evaluados, se mostró un efecto
biocida de 59.15% sobre las larvas de Anopheles sp. hasta las 72 horas
de iniciado el bioensayo.
- La mortalidad corregida a las 72 horas del control químico fue de
80.28%.
- La cepa aislada de Bacillus sp. mostró una efectividad biocida
moderada, muy parecida a la del control químico.

16
17
VI. Referencias:

- E. LEUCONA, Roberto (2002) Situación actual y perspectivas de uso

de bioplaguicidas en Latinoamérica. Conferencia “Producción y uso
de agentes microbianos para el control de plagas”. Buenos Aires.
- SOBERON, M. y A., BRAVO (2003) Bacillus thuringiensis y sus
toxinas. Deparatamento de Microbiología Molecular. Universidad
Autónoma de México. Mexico D.F.
- FERNANDEZ, C. y R. JUNCOSA (2002) Biopesticidas: ¿la
agricultura del futuro? FuturEco SL. Barcelona.
- E. FLORES, A. y colbs. (2001). Resistencia a insecticidas en insectos
vectores de enfermedades con énfasis en mosquitos. Laboratorio de
Entomología Médica. Universidad Autónoma de Nuevo León.
España.
- SANCHEZ YAÑEZ, Juan M. (2001). Producción de bioinsecticida a
base de Bacillus thuringiensis: Minirevisión. Instituto de
Investigaciones Químico-Biológicas. Universidad Michoacana de San
Nicolás de Hidalgo. México.

18
VII. Anexos:

19
Lista de serotipos de Bacillus thuringiensis usados en el control biológico de
plagas agrícolas urbanas y forestales.

No. Serotipo Variedad

1 H1 thuringiensis
2 H2 finitimus
3 H 3ª alesti
4 H 3a, 3b kurstaki
5 H 4a, 4b sotto
6 H 4a, 4b dendrolimus
7 H 4a, 4c kenyae
8 H 5a, 5b galleriae
9 H 5a, 5c canadensis
10 H6 subtoxicus
11 H6 entomocidus
12 H7 aizawai
13 H 8a, 8b morrizoni
14 H 8a, 8c ostrinidae
15 H 8b,8d nigeriensis
16 H9 tolworthi
17 H 10 darmstadiensis
18 H 11a, 11b toumanoffi
19 H 11a, 11c kyussshuensis
20 H 12 thompsoni
21 H 13 pakistani
22 H 14 israelensis
23 H 15 dakota
24 H 16 indiara
25 H 17 tohokuensis
26 H 18 kumanotoensis
27 H 19 tochigiensis
28 H 20a, 20b yunnanensis
29 H 20a, 20C pondicheriensis
30 H 21 colmeri
31 H 22 shandongiensis
32 H 23 leonensis
33 H 24 japonensis

20
Insecticidas microbianos y virales para el control de mosquitos vectores de
enfermedades humanas, disponibles en el mercado.

Grupo Organismo Producto País

Elcar E.U
Virus de la Gypchek E.U
Poliedrosis Nuclear
Virus Manestrin
Monisarmio-virua
Bulgaria
Finlandia
TM-Buocontrol E.U
Virox Inglaterra
Menestrin* Francia
Spodeterin* Francia
VPN 80 Guatemala
VPN 82 Guatemala
Virus de la Hifantrin Bulgaria
Poliedrosis
VPC Japón
Citoplasmática
Bacillus popillae Doon E.U
Japademic E.U
Milky Spore E.U
Bacterias Bacillus spahericus
ABG-6185
2362*
E.U
Bélgica
Dipel E.U
Javelin E.U
Thuricide E.U
Bactospeine Bélgica
Bathurin Checoslovaquia
Bacillan Polonia
Bacillus thuringiensis
Thuridán Polonia
Thurindhgin Rumania
Kturintoks Rumania
Biotrol E.U
Backtutal Bosinia
M-1 E.U
Foil E.U
Larvo-Bt. E.U
Biobit Dinamarca
Bactimos E.U
Teknar E.U
Vectobac E.U
Republica
Moskitur Checa

21