UNIVERSIDAD AUTONOMA DE MADRID ASIGNATURA: ANLISIS QUMICO

TCNICAS PTICAS DE ANLISIS

SONIA ALONSO ROMN. JAVIER CALVO GARRIDO. ANA RIZO MART.

TCNICAS PTICAS DE ANLISIS

PRINCIPIOS BASICOS DE LA RADIACION ELECTROMAGNETICA Y CONCEPTOS FUNDAMENTALES..PAG3 CLASIFICACION DE LOS MTODOS OPTICOS.PAG6 INSTRUMENTACION Y COMPONENTES BASICOS DE LOS INSTRUMENTOS DE MEDIDA....PAG7 TCNICAS BASADAS EN LA ABSORCIN DE RADIACIN...PAG9 ABSORCIN DE RADIACIN Y CONCENTRACIN. LEY DE BEER.PAG9 ESPECTROFOTOMETRA DE UV-VIS..........PAG10 ABSORCIN ATMICA..PAG13 TECNICAS BASADAS EN LA EMISION DE RADIACIN.PAG15 FOTOLUMINISCENCIA MOLECULARPAG15 ESPECTROSCOPIA DE EMISIN ATMICA..PAG18 TECNICAS BASADAS EN LA DISPERSION DE RADIACIN..PAG21 TURBIDIMETRIA Y NEFELOMETRIA.PAG21 APLICACIONES AL ANLISIS DE ALIMENTOS DE LOS MTODOS PTICOS DE ANLISISPAG23 BIBLIOGRAFA...PAG24

TECNICAS PTICAS DE ANLISIS:

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Todas aquellas que implican la medida de la radiacin electromagntica emitida por la materia o que interacciona con ella. Los mtodos pticos de anlisis cubren un amplio campo de aplicaciones debido a su rapidez, a la gran gama de instrumentacin disponible y sus grandes posibilidades de automatizacin. PRINCIPIOS BSICOS DE LA RADIACIN ELECTROMAGNTICA Y CONCEPTOS FUNDAMENTALES: La radiacin electromagntica est constituida por ondas que se propagan en el espacio, y que estn constituidas por componentes elctricos y magnticos perpendiculares entre s.

Radiacin electromagntica polarizada en un plano A diferencia de otros fenmenos ondulatorios, como el sonido, la radiacin electromagntica no necesita un medio de apoyo para transmitirse y, por tanto, se propaga fcilmente a travs del vaco. En cualquier medio material, la propagacin de la radiacin disminuye a causa de la interaccin entre el campo electromagntico de la radiacin y los electrones enlazantes de la materia (la longitud de onda disminuye cuando la radiacin pasa del vaco a algn otro medio). Sin embargo, para describir cuantitativamente determinadas interacciones con la materia (asociadas a la absorcin o emisin de energa radiante), se hace necesario considerarla como un flujo de partculas o corpsculos, llamados fotones (dualidad ondacorpsculo). La energa del fotn es proporcional a la frecuencia de la radiacin (relacin de Einstein-Planck), de modo que un haz de radiacin puede ser ms o menos intenso en funcin de la cantidad de fotones por unidad de rea, pero la energa del fotn es siempre la misma para una determinada frecuencia. El espectro electromagntico: El espectro electromagntico abarca un intervalo enorme de longitudes de onda y de frecuencias (y as como de energas). De hecho, el intervalo es tan grande que se necesita una escala logartmica. Las zonas de separacin entre regiones no estn establecidas de modo rgido.

Regiones del espectro electromagntico Tambin se denominan mtodos pticos a los mtodos espectroqumicos que utilizan no slo la radiacin visible, sino tambin las radiaciones ultravioleta e infrarroja, a pesar de que el ojo humano no es sensible a ellos, debido a las similitudes que se observan en las interacciones de estos tres tipos de radiacin con la materia. a pesar de que el ojo humano no es sensible a ellos. Superposicin de ondas: cuando dos o ms ondas atraviesan la misma regin del espacio, se produce un desplazamiento igual a la suma de los desplazamientos causados por las ondas individuales. Por tanto, una onda compleja puede descomponerse en componentes simples por medio de una operacin matemtica.

Difraccin de la radiacin: proceso por el que un haz paralelo de radiacin se curva cuando pasa por un obstculo puntiagudo o a travs de una abertura estrecha.

Transmisin de la radiacin: La velocidad a la que se propaga la radiacin a travs de una sustancia es menor que su velocidad en el vaco y depende de los tipos y concentraciones de tomos, iones o molculas del medio. Sin embargo, dado que no se observa ningn cambio en la frecuencia, la interaccin no puede implicar una transferencia permanente de energa, sino que dicha energa provoca la polarizacin de las especies atmicas y moleculares que constituyen el medio (deformacin transitoria de las nubes de electrones) slo momentneamente, emitindose de nuevo sin alteracin cuando la sustancia vuelve a su estado original. Es por eso que la frecuencia de la radiacin emitida no vara, pero la velocidad de su propagacin disminuye a causa del tiempo necesario para que se produzca la retencin y la emisin. Refraccin de la radiacin: se trata de un cambio brusco de direccin de la radiacin cuando incide con un ngulo en la interfase entre dos medios que tienen densidades diferentes.

Reflexin de la radiacin: cuando la radiacin atraviesa una interfase entre medios con diferente ndice de refraccin, se produce siempre una reflexin. La fraccin de radiacin reflejada es tanto mayor cuanto mayor sea la diferencia entre los ndices de refraccin.

Dispersin de la radiacin: Fraccin de la radiacin momentneamente retenida por tomos, iones o molculas que es reemitida en todas las direcciones cuando las partculas vuelven a su estado inicial. La intensidad de esta radiacin dispersada aumenta con el tamao de partcula.

Dispersin de luz por un prisma

Polarizacin de la radiacin: La radiacin ordinaria consiste en un haz de ondas electromagnticas en el que las vibraciones se distribuyen por igual entre una seria infinita de planos centrados a lo largo de la trayectoria del haz. Un vector de cualquier plano puede descomponerse en dos componentes perpendiculares entre s. La eliminacin de uno de estos dos planos de vibracin, origina un haz que est polarizado en un plano. El vector elctrico resultante de un haz polarizado en un plano ocupa, por tanto, un solo plano del espacio. La polarizacin se produce por el paso de radiacin a travs de medios que absorben, reflejan o refractan de forma selectiva la radiacin que vibra en un solo plano.

Seccin transversal de un haz de radiacin

Descomposicin en dos componentes perpendiculares de un vector en el plano xy

Interaccin materia-radiacin electromagntica: Cuando incide radiacin electromagntica sobre una muestra material puede ser absorbida por ella (generalmente de forma parcial), transformndose, en muchas ocasiones, en energa trmica. Sin embargo, otras veces, parte de la radiacin puede ser dispersada o re-emitida, con o sin cambio en la longitud de onda. Incluso es posible que, como consecuencia de la interaccin, se origine simplemente un cambio en las propiedades de la radiacin, sin necesidad de producirse absorcin y emisin. Por otra parte, la muestra puede emitir radiacin electromagntica si se la excita bajo determinadas situaciones. Cuando la materia interacciona con energa trmica o electromagntica, los tomos y molculas pueden pasar a un estado activado en el que permanecen durante un periodo de tiempo muy corto, regresando su estado fundamental. En este proceso, ceden la energa previamente absorbida a su entorno en forma de calor, o en forma de fotones, de la misma longitud de onda o menor. CLASIFICACIN DE LOS MTODOS PTICOS: -MTODOS ESPECTROSCPICOS: aquellos en los que existe intercambio de energa entre la radiacin electromagntica y la materia. En estos mtodos se miden espectros, siendo stos debidos a transiciones entre distintos niveles energticos. Tcnicas basadas en la absorcin de radiacin: -niveles moleculares: UV-visible, microondas -niveles atmicos: absorcin atmica, rayos x Tcnicas basadas en la emisin de radiacin: -niveles moleculares: luminiscencia (fluorescencia, fosforescencia) -niveles atmicos: espectrometra de emisin, fotometra de llama, fluorescencia de rayos x, fluorescencia atmica

-MTODOS NO ESPECTROSCPICOS: aquellos en los que no hay intercambio de energa, sino cambios en la direccin o en las propiedades fsicas de la radiacin electromagntica. Tcnicas basadas en la dispersin de radiacin: turbidimetra, nefelometra Tcnicas basadas en la refraccin de radiacin: refractometra, interferometra Tcnicas basadas en la difraccin de radiacin: rayos x, electrones Tcnicas basadas en la rotacin ptica: polarimetra, dicrosmo circular INSTRUMENTACIN: -Fotmetro: mide la intensidad de radiacin -Espectrofotmetro: mide la transmitancia o la absorbancia de una muestra en funcin de la longitud de onda -Colormetro: compara, usando el ojo humano como detector, el color de la sustancia problema con el de una disolucin patrn -Espectroscopio: detecta lneas espectrales a simple vista (lneas de color q emite un tomo) -Espectrgrafo: instrumento que registra lneas espectrales sobre una placa fotogrfica -Espectrmetro: instrumentos que poseen sistemas de deteccin elctricos

COMPONENTES BSICOS DE LOS INSTRUMENTOS DE MEDIDA: Los mtodos espectroscpicos pticos se fundamentan en seis fenmenos: 1.- Absorcin 2.- Fluorescencia 3.- Fosforescencia 4.- Dispersin 5.- Emisin 6.- Quimioluminiscencia Para medir cada fenmeno la mayora de los componentes bsicos de los instrumentos son muy parecidos, aunque difieren algo en su configuracin. Adems, las propiedades necesarias de estos componentes son las mismas independientemente de si se aplican a la regin ultravioleta, visible o infrarroja del espectro. Los instrumentos espectroscpicos caractersticos incluyen cinco componentes: 1.- Una fuente estable de energa radiante 2.- Un recipiente transparente para contener la muestra 3.- Un dispositivo que asle una regin restringida del espectro para la medida (seleccin de la longitud de onda) 4.- Un detector de radiacin, que convierta la energa radiante en una seal utilizable (en general elctrica)

5.- Un sistema de procesamiento y lectura de la seal, que visualice la seal detectada en una escala de medida, en una pantalla de osciloscopio, en un medidor digital o en un registrador. Instrumento para espectroscopia ptica de absorcin:

Instrumento para espectroscopia ptica de emisin:

La espectroscopia de emisin no requiere una fuente de radiacin externa, pues la propia muestra es el emisor. El receptculo de la muestra es un arco, una chispa o una llama, que a la vez contiene a la muestra y le hace emitir una radiacin caracterstica. Instrumento para espectroscopia ptica de dispersin:

TCNICAS BASADAS EN LA ABSORCIN DE RADIACIN Vamos a abordar en este apartado dos tcnicas como la espectrofotometra de UV-vis y la espectrofotometra de absorcin atmica, las dos basadas para su funcionamiento en fenmenos de absorcin de radiacin electromagntica. La medida de la cantidad de radiacin absorbida con la ayuda de estos mtodos nos servir en algunos casos aplicando la ley de Lambert-Beer para establecer una relacin lineal entre la radiacin absorbida y la concentracin de la sustancia en el medio. ABSORCIN DE RADIACIN Y CONCENTRACIN. LEY DE BEER INTRODUCCIN La ley de Lambert-Beer nos permite establecer una conexin entre la absorcin de radiacin y la concentracin de la sustancia que absorbe en un medio conocido, fue descubierta independientemente (y de distintas maneras) Pierre Bougler en 1729 en 1760 por Johann Heinrich Lambert y August Beer en 1852. La absorcin de radiacin provoca una alteracin en la posicin de ciertos electrones de las molculas absorbentes llevndolos a niveles de energa superior, aunque posteriormente lo veremos con ms exactitud. Las diferentes molculas y de un modo ms exacto y preciso los electrones que forman parte de stas pueden absorber radiacin electromagntica a diferentes y nosotros podemos llegar a medir sta y de ese modo conociendo ciertas caractersticas de la propia sustancia expresar su concentracin. La relacin de la ley entre concentracin y absorcin de luz est basada en el uso de espectroscopa para identificar sustancias, eso lo veremos ms adelante. La ley de Lambert-Beer se basa en la siguiente frmula: A=cl A representa la absorbancia. representa el coeficiente de absorcin de la sustancia analizada(l/mol cm). Su valor vara dependiendo de los materiales absorbentes y la aplicada en cada caso y se determina experimentalmente. C representa la concentracin de la muestra(mol/l). L representa el espesor de la cubeta(cm). El modo de trabajo es muy sencillo, irradiando la muestra con luz monocromtica, que situamos dentro de la cubeta, obtendremos valores de su absorbancia a diferentes tiempo o diferentes condiciones, aplicando la frmula anteriormente expuesta podemos conocer que concentracin existente.

Existen otra serie de parmetros asociados a la absorbancia, son los siguientes: Al incidir sobre la muestra utilizamos una radiacin que denominamos Io, la radiacin que recibimos en el detector del espectrofotmetro de UV-vis por ejemplo que luego veremos es I. A = log (Io/I) T = (I/Io) 100 Conocida la T(transmitancia) podemos conocer la A(absorbancia).

APLICACIONES

La ley tiende a no ser vlida para concentraciones muy elevadas, especialmente si el material dispersa mucho la luz. La ley de Beer se cumple para una radiacin monocromtica que atraviesa una disolucin diluida, cuando la especie absorbente no participa en un equilibrio que depende de su concentracin, podemos pensar en cualquier cido dbil cuya forma variar desde HA hasta su forma disociada dependiendo de una situacin concentrada a una diluida con lo cual no cumplir la ley de Beer. Existen muchos campos en los que es una herramienta muy usada. En el campo de la bioqumica nos permite conocer concentracin de sustancias, actividades enzimticas, al igual que en el de la qumica analtica con el estudio de otros analitos, etc y tambin en la tecnologa de los alimentos como luego veremos. Esta ley tambin se aplica para describir la atenuacin de la radiacin solar al pasar a travs de la atmsfera. En este caso hay dispersin de la radiacin adems de absorcin.

ESPECTROFOTOMETRA UV-VISIBLE INTRODUCCIN La espectrofotometra UV-Visible es una tcnica de medicin basada en la absorcin de radiacin UV o visible por parte de las molculas muy usada en campos como la qumica analtica, bioqumica o biologa molecular. Los electrones en una molcula se establecen formando orbitales atmicos y a su vez estos forman orbitales moleculares. La absorcin de esta radiacin por parte de las molculas provoca un fenmeno denominado transicin electrnica en la cual el electrn se mueve desde un orbital de menor nivel energtico a uno de mayor La absorcin por parte de la molcula estudiada de un tipo u otra de radiacin UV o visible(la variacin en la es causa a su vez de una variacin en la energa de la onda) provoca una transicin electrnica diferente entre estos orbitales(fig.1). 10

Transicin * * * *

(nm) <200 200500 160260 250600 -

(L mol4cm-1) 104 102 103 10 103

Ejemplo Hidrocarburos saturados Alquenos, alquinos aromticos H2O, CH3OH, CH3CL Carbonilos, nitro, nitrato, carbonilo

Fig.1 Tipos de transiciones electrnicas dependiendo de la incidente con correspondientes ejemplos de cada una.

Aquellas molculas con enlaces sencillos son excitadas por de menores y por lo tanto de mayor energa. Estas se conocen con el nombre de UV de vaco. Es necesario el trabajo en vaco ya que el O2 absorbe en estos niveles lo cual invalidara el experimento. Las mayores solamente son absorbidas por unas estructuras o grupos funcionales denominadas cromforos los cuales presentan electrones de absorcin energtica baja. Hay tambin otro grupo denominado auxocromos que refuerzan a los cromforos. El estado de excitacin de la molcula es de alrededor de 10-9, emitiendo entonces esta energa recibida en forma de calor o de otro tipo de radiacin como puede ser la fosforescencia o fluorescencia de las que posteriormente hablaremos; esto nos lleva a pensar que podemos conocer ms acerca de una molcula, de sus grupos funcionales, de su estructura conociendo su espectro de absorcin o de emisin dependiendo de la tcnica que utilicemos. De este modo podremos realizar el espectro de emisin y de absorcin de una sustancia, incidiendo sobre ella a diferentes y viendo su emisin y absorcin. APLICACIONES Desde el punto de vista cualitativo podemos llegar a conocer que grupo funcional tenemos ante nosotros, o que tipo de molcula ya que una caracterstica puede ser nica en una molcula y llevarnos a su conocimiento y aplicando la ley de Beer anteriormente expuesta. En estudios bioqumicos podemos conocer la cantidad de bacterias que presenta un medio dada su absorbancia dentro de visibles, tambin ver la actuacin de un enzima sobre un compuesto inicial viendo su transformacin en otro al mismo tiempo que su desaparicin, uso de colorantes como Biuret para determinar la concentracin proteica de una suspensin, etc. Presencia de electrolitos, variacin de pH, disolvente en el que trabajemos son elementos muy importantes a la hora de establecer un mtodo de trabajo correcto, la presencia de un disolvente polar o apolar en la medicin de una concentracin proteica puede provocar un cambio de conformacin tal que aminocidos aromticos que absorben en cercanas a 280nm cambien su posicin desde el exterior al interior molecular haciendo variar nuestros resultados; el color del disolvente es otro punto fundamental. La eleccin del tipo de material de nuestra cubeta tambin es importante, ya que no queremos provocar absorcin por parte de esta o que bloquee el paso de la luz, las 11

mediciones para cuantificar DNA se realizan en cubetas de cuarzo dada la usada 260nm y 280nm. El espectrofotmetro de UV-vis funciona de un modo muy simple(fig.2). Situamos la muestra en una cubeta donde va a ser excitada por un haz de luz monocromtica a una determinada seleccionada previamente, e incidimos sobre sta. El espectrofotmetro permite la medicin tanto de la luz incidente como de la transmitida y de ese modo la absorbida con los siguientes clculos:

Fig. 2. Esquema bsico de incidencia y deteccin de absorbancia

T = I/Io 100 A = log10(Io/I) Conocida la absorbancia y por la ley de Beer anteriormente expuesta conocer la concentracin de una sustancia:

pH 5,5

Ph 8

0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 100 T(SEG) 200 300

0,8 0,7 ABSORBANCIA 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 50 100 150 T(SEG) 200 250 300

Fig.3. Variacin de absorbancia diferencial dependiendo del pH de la disolucin. Izquierda pH5.5. Derecha pH 8.

Podemos encontrarnos una sustancia que comienza a decrecer en su absorbancia, lo cual puede suceder porque la sustancia deja de absorber o porque est desapareciendo del medio. En este caso la accin continuada de un enzima provoca una disminucin en la cantidad de reactivo y en consecuencia de la absorbancia de la muestra. Mediante la aplicacin de la ley de Beer podramos conocer las concentraciones de reactivo que estn siendo eliminadas en el tiempo. Adems vemos como la variacin de la absorbancia es diferente en uno y otro pH(fig.3).

ABSORBANCIA

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ABSORCIN ATOMICA INTRODUCCIN La espectroscopia de absorcin atmica se basa en la absorcin de luz por parte de tomos en forma gaseosa, de ese modo podemos medir su concentracin, lo cual representa una diferencia importante en cuanto a la espectroscopia UV-vis que trabaja en fase lquida o slida. Mediante esta tcnica al igual que antes podemos conocer la concentracin de analito por la ley de Lambert-Beer conociendo la absorbancia de la muestra, pero no permite conocer estructuras ya que las rompe. Sin embargo la preparacin de la muestra o la no-uniformidad de sta pueden darnos valores cambiantes lo cual nos obliga a interpolar nuestro valor de absorbancia en una curva de calibracin. Los instrumentos de medida son mucho ms complejos que en la espectroscopa de UV-vis. Necesitamos una fuente de luz, los lseres poseen la intensidad necesaria para generar la excitacin atmica y en consecuencia el cambio hacia un orbital molecular de mayor energa. En segundo lugar la amplia mayora de las muestras se encuentran en estado lquido o slido y en esta tcnica la muestra debe encontrarse en un estado gaseoso. Para su conversin usamos un atomizador, tenemos dos tipos los cuales explicaremos de un modo sencillo ya que su funcionamiento interno puede resultar complicado. FUNCIONAMIENTO DE LOS ATOMIZADORES: Atomizador de llama: este tipo de atomizador solamente acepta soluciones analticas por ello la muestra debe ser tratada para formar pequeas gotas. El atomizador de llama consta de una serie de componentes, son los siguientes: Fuente de radiacin: este formada por un ctodo hueco fabricado con el mismo metal a analizar junto con un nodo que en este caso es un hilo de wolframio todo sellado en un tubo de vidrio con un gas inerte como el argn. Al aplicar una diferencia de potencial entre el nodo y el ctodo se genera una ionizacin de los tomos del gas inerte, estos chocan con el ctodo provocando el movimiento de diferentes tomos para producir una nube atmica que emiten radiacin. Quemador y un nebulizador(fig.4): el nebulizador transforma la muestra en un aerosol fino para alimentar el quemador. Este puede ser de flujo laminar si tanto muestra como combustible y oxidante se mezclan antes de llegar a la llama o de flujo turbulento donde muestra combustible y oxidante no llegan a la vez a la llama. Monocromador: que selecciona la necesaria para cada muestra. Atomizador de horno de grafito o atomizacin electrotrmica: puede aceptar soluciones lquidas, slidas y una mezcla de ellas, la muestra se aplica directamente siendo calentado el horno elctricamente. Consta de un cilindro de grafito hueco con dos ventanas que permiten el paso de luz. Muy usado para muestras orgnicas ya que se

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requiere menos cantidad de muestra y su sensibilidad es mayor al poder controlar la temperatura y el tiempo de una mejor manera que en el mtodo anterior. Podemos tener problemas en las diferentes mediciones debido a la similitud de absorcin de dos sustancias como pueden ser el V y Al, tambin interferencias qumicas debido al proceso de atomizacin de la muestra, en este caso son de dos tipos: 1. Aniones que provocan compuestos de baja volatilidad con el elemento a analizar disminuyendo la velocidad de atomizacin, el problema puede ser resuelto aumentando la temperatura. 2. Reacciones de asociacin y disociacin el O2.

Fig.4 Esquema bsico de funcionamiento de los espectrofotmetros de absorbancia atmica.

APLICACIONES Destacamos su gran importancia dentro de la industria alimenticia dada la capacidad de esta tcnica para detectar la presencia de elementos qumicos como Pb o Hg entre otros(fig.5).

Fig5. Elementos qumicos en rosa objeto de medicin en esta tcnica.

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TCNICAS BASADAS EN LA EMISIN DE RADIACIN FOTOLUMINISCENCIA MOLECULAR Cuando una especie qumica absorbe radiacin pasa a un estado electrnico excitado. Muchas sustancias disipan el exceso de energa en forma de calor. Sin embargo, un cierto nmero de especies pierde slo una parte de ese exceso de energa en forma de calor, y emite la energa remanente en forma de radiacin electromagntica de distinta frecuencia que la absorbida, a una longitud de onda mayor, y que puede utilizarse con fines analticos. X + Calor X + hv Absorcin (espectrofotometrma) X* X + calor +hv Emisin (fotoluminiscencia) La luminiscencia es el trmino aplicado a la reemisin de radiacin que ha sido previamente absorbida, mientras que la fotoluminiscencia se refiere al caso particular en el que la excitacin tenga lugar por absorcin de fotones. La fotoluminiscencia puede clasificarse en: fluorescencia y fosforescencia. Se diferencian en que las transiciones electrnicas responsables de fluorescencia no conllevan un cambio en el espn del electrn. Por el contrario, las emisiones de fosforescencia van acompaadas por un cambio en el spn del electrn. La medida de la intensidad permite la determinacin cuantitativa de especies inorgnicas y orgnicas importantes a niveles de trazas. Estados excitados de singulete/triplete Un estado molecular en el cual todos los espines de los electrones estn apareados se llama estado singulete. Cuando uno de los electrones de una molcula es excitado a un nivel de energa superior, se forma un estado de triplete. En el estado de singulete excitado, el espn del electrn promocionado contina apareado, con signos opuestos, con el electrn del estado fundamental, hecho que ocurre en los procesos de fluorescencia. En cambio, en el estado de triplete los espines de los dos electrones se han desapareado, y por tanto, estn paralelos; hecho que ocurre en la fosforescencia. El tiempo de vida de un estado de singulete de excitacin es normalmente de 10-9- 10-6 s. Cuando una molcula absorbe radiacin se produce el paso desde el estado electrnico y vibracional fundamental a un estado excitado. Este proceso tiene lugar en unos 10-15 s cuando se trabaja con una disolucin, el exceso de energa vibracional se

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pierde rpidamente, como consecuencia de los choques de las molculas excitadas. Este proceso recibe el nombre de relajacin vibracional. El proceso de fluorescencia ocurre inmediatamente despus de la excitacin, por lo que no es posible percibir visualmente la emisin de fluorescencia una vez eliminada la de excitacin. El proceso de transformacin de un estado singulete a estado triplete se denomina cruzamiento entre sistemas. Una vez adquirido el estado de triplete, la molcula puede llegar al nivel vibracional inferior mediante procesos de relajacin y posteriormente emitir un fotn para retornar al estado fundamental. Esta emisin se denomina fosforescencia. Rendimiento cuntico El rendimiento cuntico o eficacia cuntica, es la relacin entre el nmero de molculas que emiten luminiscencia con respecto al nmero total de molculas excitadas. Factores que afectan a la fluorescencia: - Estructura molecular: es imprescindible que la molcula posea una estructura capaz de absorber radiacin ultravioleta/visible. Los compuestos que contienen dobles enlaces conjugados, especialmente aquellos con un alto grado de resonancia son los que presentan una fluorescencia ms intensa y ms til. Suelen presentar fluorescencia muchos hidrocarburos aromticos con gran rigidez y estructuras multicclicas. - Influencia del disolvente y la temperatura: la eficacia cuntica de la fluorescencia disminuye en la mayora de las molculas al aumentar la temperatura, lo mismo ocurre con una disminucin de la viscosidad del disolvente. La fluorescencia se reduce en presencia de disolventes que contiene tomos pesados. - Influencia de pH: la fluorescencia de un compuesto aromtico con sustituyentes cidos o bsicos en el anillo, depende del pH. Tanto la longitud de onda como la intensidad de emisin son diferentes para las formas ionizadas y no ionizadas del compuesto. - Oxgeno disuelto: la presencia de oxgeno reduce la intensidad de la fluorescencia. - Efecto de la concentracin en la intensidad de fluorescencia: la intensidad, If, es directamente proporcional a la concentracin, C, de la sustancia absorbente, pero slo a concentraciones bajas, lo cual puede demostrarse segn la ley de Beer. Para disoluciones muy diluidas, la intensidad de fluorescencia ser proporcional a la concentracin. INSTRUMENTACIN Nos encontramos con dos diseos: fluormetro y espectrofluormetro. Los distintos componentes de los instrumento son similares a los que se encuentran en espectrofotmetros ultravioleta/visible.

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Componentes de un fluormetro o un espectroflurmetro

Componentes: - Fuentes: se necesitan fuentes ms intensas que las utilizadas en medidas de absorcin, por lo que se utiliza para los fluoromtros, una lmpara de arco de mercurio a baja presin. Y para los espectrofluormetros una lmpara de arco de xenn. Tambin se utilizan lseres. - Filtros y monocromadores. Se utilizan tanto los filtros de interferencia como los de absorcin. - Detectores:los mas utilizados son los tubos multiplicadores. - Cubetas. Aplicaciones en el anlisis de alimentos: Entre los numerosos compuestos que pueden determinarse por fluorescencia se encuentran los aminocidos, las protenas, las coenzimas, las vitaminas, los cidos nucleicos, los alcaloides, las porfirinas, los esteroides, los flavonoides y muchos metabolitos. Indudablemente por su alta sensibilidad y selectividad la espectroscopia de fluorescencia es una herramienta especialmente valiosa en el anlisis de alimentos, productos farmacuticos, muestras de laboratorio clnico y productos naturales. Algunos de los casos concretos de determinaciones en el caso del anlisis de alimentos son: - Generalmente aquellas especies que posean anillos aromticos pueden presentar fluorescencia, mientras que si la especie posee heterociclos aromticos puede presentar fosforescencia. - Determinacin de hidrocarburos policclicos aromticos, son compuestos muy txicos. - Determinacin de vitaminas que son fluorescentes A, C o D.

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ESPECTROSCOPA DE EMISIN MOLECULAR Los mtodos atmicos de emisin se basan en la medida De la radiacin emitida de una muestra, previamente excitados Muestra (X) + Energa X* X + hv La determinacin espectroscpica de especies atmicas slo se puede llevar acabo dentro de un medio gaseoso, en el cual los tomos individuales estn separados unos de otros, por lo que el primer paso en todos los procedimientos espectroscpicos es la atomizacin, un proceso en el cual los tomos de la muestra son excitados a estados electrnicos superiores. En la espectroscopia de emisin atmica una parte de la muestra se vaporiza y se excita trmicamente hasta alcanzar la emisin atmica. La rpida relajacin de las especies excitadas va acompaada de la produccin de espectros de lneas ultravioleta y visibles que son tiles para el anlisis de los elementos. Histricamente, la espectroscopia de emisin atmica requera la atomizacin y excitacin mediante llama, arco elctrico y chispa elctrica. Sin embargo, hoy en da las fuentes de plasma se han convertido en las ms importantes y ms ampliamente utilizadas en estos procesos. Los espectros de emisin obtenidos utilizando fuentes de plasma, arco o chispa son muy complejos, estn constituidos por cientos, e incluso, miles de lneas. Esta cantidad de lneas, es muy ventajosa cuando se busca informacin cualitativa aunque aumenta la probabilidad de interferencias espectrales en el anlisis cuantitativo. La espectroscopia atmica se emplea en la determinacin cualitativa y cuantitativa de muchos elementos. La longitud de onda a la que se efecta la medicin de intensidad, identifica al elemento, mientras que la intensidad de la radiacin emitida cuantifica su concentracin. La anchura de las lneas de emisin atmica aumenta con el incremento de la temperatura; las lneas son mas anchas cuando los tomos estn ms calientes y ms estrechas cuando los tomos estn ms fros. La razn de este aumento es que los tomos se mueven ms rpidamente a temperaturas mayores. Las tcnicas espectroscpicas atmicas se pueden clasificar en funcin de la fuente de atomizacin: - Llama: Espectroscopia de Absorcin atmica. La temperatura de atomizacin alcanza los 1700-3150 C - Plasma de Argn acoplado inductivamente: Espectroscopia de plasma acoplado inductivamente (ICP). La temperatura de atomizacin alcanza los 6000-8000 C.

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- Plasma de Argn de corriente contimua: Espectroscopia de plasma de corriente contimua (CD). La temperatura que se alcanza es de 6000-10000 C. - Arco elctrico: Espectroscopia de emisin de fuente de arco, mide emisin a 40005000 C. -Chispa elctrica: Espectroscopia de emisin de fuente de chispa, mide emisin a 40000 C. INSTRUMENTACIN Los componentes bsicos de un espectrofotmetro son los siguientes: - Fuente de excitacin: proporciona energa a la muestra. La energa suministrada para la excitacin procede de una descarga elctrica entre dos electrodos. Uno de ellos, normalmente contiene la muestra, pulverizada, en forma slida, o el residuo procedente de una disolucin. - Monocromador: selecciona las diferentes radiaciones emitidas. Para ello, se emplean prismas y redes. - Sistema de deteccin: registran la radiacin emitida por la muestra. Espectroscopia de emisin con fuente de arco y chispa Las espectroscopias con fuentes de arco y de chispa fueron los primeros mtodos instrumentales ms utilizados en el anlisis. Estn basados en la obtencin mediante excitacin del espectro de emisin de elementos por medio de arcos elctricos o chispas elctricas. Estos espectros permiten la determinacin cualitativa y cuantitativa de elementos metlicos en varios tipos de muestras, incluyendo metales, aleaciones, suelos, minerales y roca. La excitacin de la muestra se produce en el pequeo espacio existente entre un par de electrodos. El paso de electricidad entre los electrodos a travs de este pequeo espacio proporciona la energa necesaria para atomizar la muestra y producir tomos o iones en estado electrnico excitado. Las fuentes de arco y chispa requieren integrar las seales de emisin durante al menos 20 s, y a menudo, durante un minuto o ms, para obtener datos analticos reproducibles. Actualmente, estos mtodos se aplican principalmente al anlisis de muestras slidas, ya que las muestras lquidas o gaseosas se manipulan mejor usando una fuente de plasma. Fuentes de microsonda lser En esta fuente se utiliza el lser para vaporizar la muestra en el espacio entre dos electrodos de grafito, que se utilizan como fuente de excitacin. Cuando un impulso de lser de elevada potencia se focaliza en una zona de 5 a 50 micrometros sobre la superficie de la muestra, generalmente slida, se vaporiza una pequea cantidad de slido. La nube resultante est compuesta por tomos, iones y molculas. En la microsonda, los componentes de la nube se excitan por medio de una chispa entre un par de pequeos electrodos situados justo por encima de una superficie de la muestra. La radiacin resultante se focaliza entonces sobre un sistema detector adecuado. Con esta tcnica ha sido posible determinar el contenido de elementos traza en clulas sanguneas aisladas y analizar materiales no conductores.

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Fuentes de emisin de llama Actualmente, las llamas no se utilizan para obtener espectros de emisin, ya que la modalidad de absorcin proporciona resultados mejores en cuanto a exactitud, conveniencia y lmites de deteccin para la mayora de determinaciones de un nico elemento. Para el anlisis multielemental, las fuentes de plasma son bastantes superiores. Por ello, la espectroscopia de emisin de llama actualmente tiene poca utilidad, excepto en la determinacin de metales alcalinos, se excitan a temperaturas relativamente bajas para dar espectros que son notablemente sencillos y exentos de interferencias de otras especies. Espectroscopia de emisin con fuente de plasma Un plasma es un gas ionizado, una mezcla gaseosa que contiene una concentracin significativa de cationes y electrones. Normalmente se utiliza argn. Para originar el plasma es preciso un aporte externo de energa que provoque la ionizacin del gas y la mantenga estacionaria. En funcin de cmo se aporte esta energa externa, se han desarrollado tres tipos de fuentes de alimentacin: - Fuente de corriente continua, consistente en dos electrodos sumergidos en la corriente del gas argn. - Campos de microondas - Radiofrecuencia: se utiliza en la espectroscopia de plasma acoplado inductivamente (ICP).

Plasma acoplado inductivamente

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Aplicacin al anlisis de alimentos - Tiene gran importancia para la determinacin de elementos traza en diferentes alimentos, fundamentalmente de minerales traza - Tambin se puede utilizar para la determinacin de contaminantes ambientales en productos vegetales - Determinacin de algunas vitaminas. TCNICAS BASADAS EN LA DISPERSIN DE RADIACIN Existen dos tipos de dispersin: - Dispersin elstica: se genera cuando la radiacin incidente tiene la misma longitud de onda que la dispersada. - Dispersin de partculas pequeas o Rayleigh: se produce cuando el tamao mximo de las partculas que producen la dispersin es menor al 5% de la longitud de onda de la radiacin. La intensidad de la luz dispersada se distribuye de manera simtrica. - Dispersin de grandes partculas: la distribucin de la luz dispersada disminuye en sentido retrgrado, debido a las interferencias constructivas y destructivas. - Dispersin inelstica: se produce cuando el fotn emitido tiene una longitud de onda diferente. TURBIDIMETRA Y NEFELOMETRA Cuando la luz atraviesa un medio transparente en el que existe una suspensin de partculas slidas, se dispersa en todas direcciones y como consecuencia se observa turbia La turbidez es la propiedad ptica de una muestra que hace que la radiacin sea dispersada y absorbida mas que transmitida en lnea recta a travs de la muestra. La turbidez es ocasionada por la presencia de materia suspendida en un lquido. Hay dos mtodos para medir la turbidez de una muestra, la turbidimetra y la nefelometra. Son dos tcnicas complementarias que se utilizan para el anlisis cuantitativo de disoluciones coloidales, emulsiones, humos o nieblas. La dispersin no supone la prdida neta de potencia radiante, solo es afectada la direccin de la propagacin, porque la intensidad de la radiacin es la misma en cualquier ngulo. En la turbidimetra se compara la intensidad del rayo de luz que emerge con la del que llega a la disolucin. En cambio, en la nefelometra la medida de la intensidad de luz se hace con un ngulo de 90 con respecto a la radiacin incidente. El instrumento usado en la nefelometra, el nefelmetro se asemeja al fluormetro. En cambio en turbidimetra se utiliza el turbidemetro que es un fotmetro de filtro.

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Turbidimetra Es un mtodo en el que se mide la disminucin de la potencia de la radiacin transmitida debido a la dispersin. Se mide en un espectofotmetro UV/Vis. Para determinar la concentracin del analito mediante este mtodo aplicamos:

En donde T es la transmitancia medida,It ,es la intensidad de la fuente de radiacin transmitida, Io es la intensidad de la radiacin de la fuente transmitida por un blanco. La relacin entre T y la concentracin de las partculas dispersas es similar a la proporcionada por la ley de Beer: - logT = kbC Siendo C la concentracin de las partculas dispersantes expresada como masa por unidad de volumen; b es la longitud del camino ptico y k es una constante que depende de varios factores: tamao, forma de las partculas dispersantes y la longitud de onda. Nefelometra Es un mtodo para medir la intensidad de una radiacin dispersa en un ngulo de 90 C con respecto a la fuente. Se mide en un espectrofluormetro. Para determinar la concentracin de analito en este mtodo aplicamos: IS = KSIOC Donde KS es una constante emprica del sistema, IO es la intensidad de la fuente de radiacin incidente. El valor de KS depende de una curva de calibracin preparada, usando una serie de patrones de concentracin conocida. La eleccin entre turbidimetra y nefelometra viene dada por dos factores: - Intensidad de la radiacin transmitida o dispersada con la intensidad de la radiacin procedente de la fuente. Cuando la concentracin de partculas dispersantes en la disolucin es pequea, IT ser muy similar a IO. Por lo que la mejor eleccin cuando la muestra contiene pocas partculas dispersantes es la nefelometra. La turbidimetra es una buena tcnica para cuando las muestras contienen grandes concentraciones de partculas dispersantes. - Tamao de las partculas dispersantes. En la nefelometra la intensidad de la radiacin dispersada a 90C es mayor si las partculas son bastante pequeas para que se produzca una dispersin Rayleigh. Si las partculas son mayores la intesidad de la dispersin disminuir a 90C. En turbidimetra la seal consiste en la disminucin relativa de la radiacin transmitida, por lo que el tamao de las partculas dispersantes es menos importante.

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Aplicaciones en alimentos de la turbidimetra y nefelometra Generalmente, nefelometra y tubidimetra se utilizan en el anlisis de la calidad qumica del agua para determinar la claridad y para el control de los procesos de tratamiento. Tambin se utilizan para la determinacin de iones sulfato. APLICACIONES AL ANLISIS DE ALIMENTOS DE LOS MTODOS PTICOS DE ANLISIS: La espectroscopia UV/vis sirve, sobre todo en forma de fotometra, para hacer determinaciones cuantitativas de los componentes de los alimentos y sus aditivos. Es de utilidad para determinar el color extrado de un alimento, para determinar la concentracin de compuestos orgnicos tales como la cafena, la vitamina A, y el cido benzoico, los cuales tienen grupos cromforos que absorben fuertemente la luz UV. Se usa tambin para la determinacin enzimtica de azcares y otros constituyentes de los alimentos. Los mtodos para determinar metales traza que involucran la medicin de complejos coloridos en la regin visible, han sido completamente reemplazados por la espectrofotometra de absorcin atmica, usndose los procedimientos colorimtricos en laboratorios pequeos para algunos aniones y cationes principales solamente. La espectroscopia infrarroja, adems de caracterizar e identificar sustancias desconocidas y analizar mezclas, se utiliza desde controles sencillos de productos y de calidad por comparacin de espectros, hasta otros objetos ms complicados, como la determinacin de simetras moleculares y el clculo de constantes de fuerza y relaciones de enlace. La espectrometra de absorcin atmica resulta adecuada para la determinacin rpida de distintos metales pesados (plomo, mercurio, zinc, cadmio, arsnico...) y de alcalinotrreos (estroncio...) La fotometra de emisin de llama se utiliza principalmente para la determinacin de sodio y potasio. La polarimetra se aplica sobretodo a la determinacin cuantitativa de carbohidratos, como sacarosa, azcar invertido y glucosa o almidn. La refractometra resulta adecuada para identificar y caracterizar grasas y aceites, para comprobar la pureza de distintos alimentos y para la determinacin cuantitativa del contenido en agua de la miel o para determinar el extracto de alimento que est formado principalmente por azcar (sacarosa), como es el caso de confituras, miel, jarabe de almidn, zumos, etc.

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BIBLIOGRAFA: L. Hernndez, C. Gonzlez, Introduccin al Anlisis Instrumental. Editorial: Ariel Ciencia (2002) D.A. Skoog, F.J. Holler, T.A. Nieman, Principios de Anlisis Instrumental 5 edicin. Editorial: Mc Graw Hill (2000) R. Matissek, F.M. Schnepel, G. Steiner, Anlisis de los Alimentos. Editorial Acribia. S.A. R.S. Kirk, R. Sawyer, H.Egan, Composicin y Anlisis de Alimentos de Pearson. Editorial CECSA.

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