DAO DE LA RADIACION UV Y EL SISTEMA DE REPARACION DEL ADN BACTERIAL Jorge Alberto Caro Vargas 133206 Universidad Nacional de Colombia

Departamento de Fsica Termodinmica Modulo Experimental RESUMEN En este experimento podremos ver la influencia de los rayos UV en dos tipos diferentes de bacterias Escherichia coli y Serratia marcescens, donde se prueban a diferentes tiempos expuestas a radiacin. Se vieron las propiedades del ADN de cada una de ellas.

INTRODUCCION Se denomina radiacin ultravioleta o radiacin UV a la radiacin electromagntica cuya longitud de onda est comprendida aproximadamente entre los 400 nm (4x10-7 m) y los 15 nm (1,5x10-8 m). Su nombre proviene que su rango empieza desde longitudes de onda ms cortas de lo que los humanos identificamos como el color violeta. Esta radiacin puede ser producida por los rayos solares y produce varios efectos en la salud. La Escherichia coli (tambin conocida por la abreviacin de su nombre, E. coli) es quizs el organismo procarionte ms estudiado por el ser humano, se trata de una bacteria que se encuentra generalmente en los intestinos animales, y por ende en las aguas negras. Fue descrita por primera vez en 1885 por Theodore von Escherich, bacterilogo alemn, quin la denomin Bacterium coli. Posteriormente la taxonoma le adjudic el nombre de Escherichia coli, en honor a su descubridor. sta y otras bacterias son necesarias para el funcionamiento correcto del proceso digestivo, adems de producir las vitaminas B y K. Es un bacilo que reacciona negativamente a la tincin de Gram (gramnegativo), es anaerbico facultativo, mvil por flagelos peritricos (que rodean su cuerpo), no forma esporas, es capaz de fermentar la glucosa y la lactosa y su prueba de IMVIC es ++--. Ver figura 1

Figura 1. E. Coli

La Serratia marcescens es un bacilo gramnegativo de la familia Enterobacteriaceae. Puede ser peligroso para el hombre, ya que a veces es patgena, como causa de infecciones nosocomiales y urinarias. Es un bacilo motil que puede crecer a una temperatura que oscila entre 5-40 C, en niveles de pH que varan entre 5 y 9. El ambiente en el cual predomina es en condiciones hmedas, por esa razn es posible encontrarla creciendo en los baos y las alcantarillas, aunque puede ser eliminada mediante la aplicacin de leja y otros desinfectantes (sin abusar de la dosis, porque sino la bacteria puede volverse inmune a los efectos de los desinfectantes). En la figura 2 podremos ver una muestra de ella.

Figura 2. Serratia Marcescens Los efectos de los rayos UV en la piel principalmente por el sol han sido estudiados por muchos aos estas investigaciones muestran que los rayos son absorbidos por los nucletidos del ADN, estos pueden causar cncer en la piel como ya es conocido, para esto las clulas han creado un mecanismo para protegerse del efecto perjudicial de los rayos UV, por ejemplo la pigmentacin o melanina. En el estudio de estas dos bacterias veremos la manera de cada una de protegerse de los rayos UV, la S. marcescens produce un pigmento rojo llamado prodigiosina mientras que el E. Colin produce uno blanco. El prodigiosina es parecido a la molcula de la melanina humana. MONTAJE EXPERIMENTAL Un cultivo de cada material es preparado (E.Coli y S. marcescens), es inicialmente y reposicionada aadiendo 100l de una muestra preparada comercialmente en 5ml de un cultivo nutritivo1 en 50ml de tubos de prueba. La dilucin debe realizarse en tubos de ensayo que contengan aire por lo menos nueve veces superior al volumen de lquido, a fin de permitir un suministro suficiente de oxgeno durante el crecimiento de los cultivos bacterianos. Dos cultivos de E. Coli y dos cultivos de S. marcescens deben estar preparados, e incubados
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Peptona 10.0g, cloruro de sodio 5.0g, extrado 5.0g, hervido y destilado hasta un volumen final de 1000ml luego esterilizado en autoclave por 60 minutos

durante la noche en un bao de agua, a dos temperaturas diferentes. El pigmento prodigiosina no se desarrolla en temperaturas superiores a 30 C. El crecimiento de la bacteria Serratia en dos diferentes temperaturas se ha diseado para crear un cultivo de la produccin de este pigmento (25 C), y un cultivo de pigmentos deficientes (37 C). Los cultivos se incubaron 1:10 de la noche a la maana luego se diluyen en serie en caldo nutritivo estril. Esta dilucin se consigue mediante la adicin de 100l del cultivo a 900l de caldo nutritivo. Cada cultivo debe diluirse de esta manera para producir un total de cuatro diluidos de cultivos bacterianos. Los cultivos diluidos se transfieren y se extendieron por separado en nutriente agar2 placas de vidrio reloj. Un esparcidor de cristal que son esterilizados por inmersin en 95% de alcohol etlico que pasa por una llama, se utiliza para difundir 100l muestras del cultivo en la superficie del agar. Por otra parte, las bolas de cristal esterilizados pueden ser utilizados para difundir la muestra en el agar. La radiacin UV se realiza mediante una lmpara UV bactericida (por ejemplo, como la lmpara UV Vilber Lourmat VL-6LC 3) con una longitud de onda de 245nm. Con el fin de esterilizar la zona de radiacin y permitir que la lmpara llegue a un estado estable, le sugerimos que la lmpara funcione por lo menos 30 minutos antes de la irradiacin a los vidrio reloj en el laboratorio. La distancia ptima entre la lmpara UV y el plato es de 25-30cm. La parte inferior de cada uno del vidrio reloj debe ser dividido en seis secciones iguales utilizando un rotulador. Cada una de estas secciones ser irradiada de diferente cantidad de tiempo. El nmero de segundos que se marca en el borde inferior de cada seccin: segundos 0, 3, 10, 30, 60 y 120. Un crculo de cartn, del tamao de la placa de vidrio reloj, menos una seccin el tamao de una sexta parte de la placa, se prepara. El vidrio reloj Luego se coloca en una bandeja de plstico de cartn bajo la lmpara UV, para asegurar que las manos de los estudiantes no estarn expuestas al rea irradiada. El plato debe ser abierto y cubierto con la de cartn para que slo una seccin de la placa se exponga a la radiacin UV, como se muestra en la Figura 3. Tenga cuidado de que el cartn es slo ligeramente ms grande que el vidrio reloj, no para que el cartn est en contacto con la superficie del agar. Recuerde que debe utilizar gafas de proteccin UV, y el objetivo de la UV la lmpara hacia la zona de radiacin slo durante el tiempo asignado. Cada seccin del vidrio reloj deben ser expuestos a los rayos UV los rayos de una cantidad variable de tiempo: 0, 3, 10, 30, 60 y 120 segundo, como se indica en la parte inferior del plato. Mueva el crculo de cartn a otra seccin slo cuando la placa este fuera de la zona irradiada. Asegrese de que la lmpara UV se mantiene durante todo el experimento. Despus de la irradiacin de cada placa, las placas se incuban al revs durante 24 horas a 37 C, o por unos das a temperatura ambiente. Las placas se deben refrigerar hasta el prximo perodo de sesiones de laboratorio.

Antes de la esterilizacin, agregue 15.0-20.0g de agar-agar en el nutriente caldo. Llevar a ebullicin y, a continuacin esterilizar la solucin como se indica. Vierta la solucin de agar esterilizada en los platos en cuanto se enfra a 60 C. un vidrio reloj por lo general requiere de 15 20ml de solucin de agar.

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Figura 3. Montaje Experimental ANALISIS Y RESULTADOS La observar la S. marcescens durante unos minutos vemos la diferencia en, vemos en apariencia que la placa que estuvo a 25C incrementa la produccin de pigmento rojo, mientras que a 37 C muestra un crecimiento de colonias blancas, en ambos casos parecen en las secciones de 0, 3 y 10 segundos respectivamente pero en la seccin de 30 segundos en ambos platos se mostro un crecimiento bacterial significativo, mientras que en las zonas de 60 y 120 segundos, est casi esterilizada no hay crecimiento de colonias.

Figura 4. Crecimiento de la bacteria en diferentes condiciones (4a, 4b S. Marcescens); (4c, 4d E.Coli) 25C y 37C respectivamente Para la E. Coli en la figura 4a y 4 b se ve un crecimiento importante en las dos primeras secciones (0 y 3 segundos respectivamente), la seccin de 10 segundos muestra un crecimiento importante pero las fronteras entre colonias se pueden observar, en 30 segundos se observa un crecimiento a 37 C mientras que en 25C solo 3, el resto estuvieron esterilizadas.

El pigmento rojo producido por la S. Marcescens llamado prodigiosin es el causante de la gran resistencia a la radiacin tal vez esto se debe a su gran parecido con la melanina, que protege a los humanos y animales contra los rayos UV, como se ve en la figura 4a y 4b la S. Marcescens es mas resistente que la E. Coli a la radiacin, ya que esta ultima resisti hasta 3 segundos mientras que el otro hasta 30 segundos e inclusive mostro crecimiento en 60 y 120 segundos, aqu se pudo observar que la resistencia de cada una no depende de la temperatura a la que estn expuestos. Con estos resultados vemos la reparacin del ADN de cada una de las bacterias y su razn de cambio, una a 10 segundos y la otra a 30 segundos. Entre ms sea capaz el sistema de minimizar los daos por radiacin la razn de supervivencia ser ms alta, pero en un punto la radiacin hace que la reparacin del ADN no sea manejable esto afecta el crecimiento del cultivo y genera ms clulas muertas. EXPERIMENTO PROPUESTO Este experimento se puede realizar de diferentes maneras, para poder sacar ms informacin acerca de los componentes de las bacterias y su resistencia a la radiacin. Se analizaran los siguientes aspectos: Se puede analizar la intensidad de la luz y su influencia en las enzimas de las bateras y su rata de cambio en el crecimiento de las mismas. Podemos cambiar la intensidad de la luz, y mirar hasta donde es resistente cada una con una longitud de onda diferente. Examinar los diferentes componentes de los bloqueadores solares y ver cmo responden a este tipo de radiacin controlada, y ver que tan buenos pueden ser.

El montaje seria el mismo, que el de la figura 3 solo cambiando la intensidad de la luz, su distancia, ya vimos que la temperatura no es dependiente en este caso, aumentar las cantidades de la bacteria o del elemento a analizar. CONCLUSIONES Se observo el efecto de los Rayos UV en unas cadenas de bacterias S. Marcescens y E. Coli, viendo que la 1 es ms resistente, a este tipo de radiacin, donde se vio crecimiento del cultivo hasta los 30 segundos, mientras que en la 2 muestra solo alcanzo a los 10 segundos: este ejercicio puede ser pedaggico, pero adems se pueden ver las influencias de los rayos UV en nuestro piel y en otros organismos, se puede analizar dependencia entre la longitud de onda, el tiempo, la temperatura entre otros como objetos de estudio termodinmico. REFERENCIAS Journal of Biological Education - UV radiation damage and bacterial DNA repair systems, Michal Zion, Daniel Guy, Ruth Yarom and Michaela Slesak, Science Teaching Center, School of Education, Bar-Ilan University, Ramat Gan, Israel http://es.wikipedia.org/wiki/Escherichia_coli

http://es.wikipedia.org/wiki/Serratia_marcescens http://es.wikipedia.org/wiki/rayos_ultravioleta