MANEJO DE SEMILLAS RECALCITRANTES

EQUIPO 4:
ARANDA ASCENCIO JESUS ALEJANDRO MARTNEZ ANTONIO GENARO MONCADA RODRGUEZ MARA DEL CARMEN PADILLA CHAVEZ BLANCA IRIS ZARAGOZA PACHECO JOSE ALEJANDRO ZUIGA OCEGUEDA YESICA Introduccin La estrategia a seguir para la conservacin de germoplasma depende de la naturaleza del material vegetal, y est definida por la duracin de su ciclo de vida, el modo de reproduccin y el tamao de sus individuos. De acuerdo con estas caractersticas se han intentado diversas alternativas de conservacin, que van desde el tradicional banco de semillas hasta el mantenimiento de reas de reserva. Sin embargo, en muchos casos el mantenimiento no es posible y en otros resulta sumamente costoso, siendo muy elevados los riesgos de prdidas por manipulacin o desastres naturales. Por ello se ha buscado implantar nuevas estrategias para conservar los recursos genticos en una forma ms eficiente (Scocchi y Rey, 2004). Clasificacin Todas las semillas difieren en su tolerancia a la desecacin que sigue tras su diseminacin. Segn este parmetro, las semillas se pueden clasificar en ortodoxas, recalcitrantes e intermedias. Las semillas ortodoxas toleran una deshidratacin hasta de 5% en el contenido de humedad; por su parte, las semillas que toleran la deshidratacin entre 10% y 12,5% de contenido de humedad se consideran intermedias y las que toleran la deshidratacin entre 15% y 50% de humedad se denominan recalcitrantes (Farrant et al., 1993; Gentil, 2001). Citado por Magnitskiy et al. (2007). La mayora de las especies cultivables y forrajeras, y muchas especies arbreas producen el tipo de semilla ortodoxa. Muchas especies importantes de rboles tropicales y subtropicales producen semillas recalcitrantes que no sobreviven la desecacin ni toleran temperaturas bajas. Kamesuara et al (2007). Caracterizacin de semillas recalcitrantes Las semillas recalcitrantes no se pueden conservar por periodos prolongados debido a sus caractersticas fisiolgicas y bioqumicas, as como la imposibilidad de reducir el contenido de humedad por debajo de cierto lmite (20%) sin causar alteraciones en la estructura subcelular. Por otro lado para su buena conservacin, la temperatura debe ser superior al punto de congelacin para evitar la formacin de cristales de hielo en las clulas: los recipientes para tal almacenamiento deben ser a prueba de humedad, aunque no a prueba de intercambio de aire, pues algunas especies requieren de cierto intercambio de oxgeno para sobrevivir mientras estn en latencia (Bonner 1981) citado por Gmez et al (2006). Las semillas recalcitrantes se caracterizan por su sensibilidad a la deshidratacin y una rpida prdida de viabilidad posterior a la diseminacin, lo que implica limitaciones graves para el almacenamiento de la semilla con fines de propagacin de rboles tropicales. Adems este tipo de semillas no experimentan deshidratacin en la planta madre y, sin detener su desarrollo, pasan directamente a la germinacin (Farrant et al.1993) citado por Magnitskiy et al. (2007).

Protocolo para determinar el comportamiento de las semillas en almacenamiento.

Fuente: Hong y Ellis (1996). Citado por Rao et al (2007) Tabla 1. Viabilidad de algunas especies de rboles tropicales de semillas recalcitrantes
Especie Nuez de Brasil (Bertholletia exelsa Humb. Bonpl) Caoba (Swietenia macrophylla King.) Araucaria (Araucaria angustifolia Bertol) Fruta dorada (Virola surinamensis (Rol) Warb.) Palma (Euterpe espiritosantensis Fernand ) Roble(Quercus rugosa Ne) Maitn (Maytenus boaria Molina) Condiciones (T;HR y otros ) 22-26 0C 3 - 5 0C 12-14%HR contenedores de metal 4 - 6 0C 38-42%HR Empaque de plstico 25 0C Vermiculita humedad 10 0C 20-25 HR Empaque de plstico 5 - 7 0C Agrolita hmeda Empaque de plstico 3 - 5 0C Arena hmeda empaque de plstico Tiempo (meses ) 5.5 7 Viabilidad 54 44 35 31 89

1.5 1

11

34 56

1.5

Conservacin de semillas recalcitrantes. 1. Conservacin ex situ. Las semillas recalcitrantes por su sensibilidad a la desecacin se dificulta su conservacin en cuartos fros. El germoplasma de estas especies puede ser conservado bajo otras estrategias, una de ellas es de forma ex situ pero en condiciones de campo (Molina y Crdova, 2006). Es decir que las especies que producen semillas recalcitrantes son sacadas de sus hbitats naturales y reproducidos fuera de su lugar de origen en donde se le proveen las condiciones adecuadas para la conservacin del material por largo tiempo. 2. Conservacin in situ. La va de conservacin in situ involucra el mantenimiento de los recursos genticos en el centro de origen (sitios donde se dio la especiacin y generalmente se encuentra la mayor diversidad gentica) o cultivo en campos de productores agrcolas en sistemas de agricultura tradicional (Rao 2004) citado por Neiva y Jimnez (2010). Sus requerimientos, en cuanto a espacio y mantenimiento, son similares a los indicados para los bancos de genes en campo. 3. Bancos de germoplasma in vitro Los bancos de germoplasma in vitro son sitios para la conservacin de los recursos genticos en condiciones controladas de laboratorio y que involucran diversas tcnicas de cultivo y almacenamiento in vitro. En los mismos se busca maximizar la diversidad de ejemplares recolectados de poblaciones en campo o en su centro de origen. La unidad de coleccin que se mantiene en condiciones controladas puede ser la semilla botnica o explantes vegetativos, dependiendo principalmente del hbito de crecimiento de la especie (Rao 2004, Wang et al. 2005, Tyagi et al. 2007) citado por Neiva y Jimnez (2010). Tipos de almacenamiento in vitro. El almacenamiento in vitro se puede clasificar, segn su duracin, en: 3.1 .Almacenamiento por corto plazo. En el almacenamiento por corto plazo los explantes (que son tejidos removidos de un organismo y transferido para su crecimiento a un medio artificial de nutrientes) permanecen in vitro hasta por 12 meses, manejando condiciones de cultivo para retrasar el crecimiento y aumentar los intervalos entre subcultivos (Cousins y Adelberg 2008) citado por Neiva y Jimnez (2010). Como parte de las estrategias empleadas para disminuir el crecimiento de los explantes y aumentar los intervalos entre subcultivos, est el reducir la temperatura de los cuartos de crecimiento, modificar los medios de cultivo y otros factores ambientales que se deben tomar en cuenta para optimizar el almacenamiento ( Engelmann 1991) citado por Neiva y Jimnez (2010). Dentro del almacenamiento por corto plazo podemos encontrar la siguiente tcnica: 3.1.1. Encapsulacin. En la tcnica de encapsulacin se recubren embriones somticos, yemas gametofticas (en brifitas) o pices, con una cubierta gelatinosa, como por ejemplo de alginato de calcio, para formar semillas sintticas. La proteccin que provee el encapsulamiento confiere, a la vez, resistencia contra la deshidratacin y las bajas temperaturas durante el almacenamiento por corto plazo (Engelmann 1991, Malln et al. 2007) citado por Neiva y Jimnez (2010).

3.2 Almacenamiento por largo plazo. El almacenamiento por largo plazo es muy seguro por lo que se usa extensivamente en agricultura, horticultura, y forestera para la investigacin y el monitoreo ambiental (Benson et al. 2006). Esta tcnica permite almacenar semillas Dussert et al. 2000), meristemas y pices (Thinh et al. 2000), polen (Towill y Walters 2000), clulas (Rei nhoud et al. 2000), callos y suspensiones celulares (Panis et al. 2000a). Adems, requiere de poco espacio y mantenimiento (Wang et al. 2005) citado por Neiva y Jimnez (2010). Se considera que el almacenamiento por largo plazo es una prctica til para evitar la variacin somaclonal (que es la variacin gentica o epigentica que se genera durante el cultivo in vitro de plantas) que provenga de clulas somticas en plantas con propagacin vegetativa y permite mantener los explantes sin alteracin alguna bajo estas condiciones, prcticamente por tiempo indefinido. Dentro del almacenamiento por largo plazo podemos encontrar las siguientes tcnicas: 3.2.1. Tcnicas de crioconservacin La crioconservacin clsica (es un proceso que consistente en la preparacin, mantenimiento y preservacin a largo plazo de un material vegetal, en unas condiciones de temperatura ultra bajas de 196 C, obtenidas mediante nitrgeno lquido) incluye la deshidratacin inducida en condiciones estriles en una cmara de flujo laminar, el preenfriamiento paulatino de los materiales (se utilizan diferentes gradientes de temperatura, por ejemplo: 10, 8, 4, -20 y -40 C, as como diferentes tiempos de permanencia en esas temperaturas). Sin embargo nuevas tcnicas basadas en la eliminacin parcial de agua en los tejidos y el congelamiento inmediato de los explantes han desplazado parcialmente a la tcnica clsica (Dixit et al. 2004, Wang et al. 2005) citado por Neiva y Jimnez (2010). Estas nuevas tcnicas son: 3.2.2. Vitrificacin La vitrificacin es un proceso que promueve la deshidratacin celular y solidificacin de lquidos en ausencia de cristalizacin (se evita la formacin de cristales de hielo intracelulares que daan los tejidos). Con la solidificacin se induce un estado con una estructura molecular aleatoria pero que posee propiedades fsicas y mecnicas similares a un slido. Esta tcnica se recomienda para rganos complejos, como pices de tallos, tejidos embriognicos y cultivos de clulas. 3.2.3. Encapsulacin deshidratacin La encapsulacin-deshidratacin se ha utilizado con pices de tallo y tejidos embriognicos. Los explantes se precultivan en una solucin con concentracin alta de sacarosa (0,5-0,75 M) y luego son encapsulados en alginato de calcio o en polioxietilen glicol (PEG); despus se les aplica una deshidratacin en la cmara de flujo laminar (cuatro a cinco horas), se congelan con NL y se mantienen a -80 C por el perodo de almacenamiento. El descongelamiento se realiza en bao de Mara a 40 C por uno a dos minutos y se cultivan en medio para la recuperacin del crecimiento y regeneracin. 3.2.4. Encapsulacin vitrificacin. Es similar al anterior en cuanto al uso de alginato de calcio para la encapsulacin. Se diferencia del mismo por no utilizar el precultivo de los explantes en una solucin con alta concentracin de sacarosa, sino ms bien por el uso de una solucin crioprotectante (que es una sustancia que se utiliza para proteger el tejido biolgico de la congelacin) a 0 C por unas horas, en su lugar, y por haber sido usado especficamente para meristemos. Los

meristemos son encapsulados en medios que contienen altas concentraciones de azcares (glicerol 2 M y/o sacarosa 0,4 M). Se congelan inmediatamente con Nitrgeno lquido (NL) y se mantienen a -80 C. 3.2.5. Precrecimiento Se ha utilizado especficamente para embriones cigticos y somticos. La tcnica involucra el cultivo in vitro previo de los embriones en presencia de crioprotectantes por varios das. Posteriormente, los embriones se congelan directamente en NL, para luego almacenarlos a -80 C. El proceso de descongelamiento es similar a la tcnica de encapsulacin deshidratacin. 3.2.6. Precrecimiento deshidratacin Se utilizan segmentos de tallo previamente cultivados en un medio alto en sacarosa. Posteriormente estos se desecan en flujo de aire y se congelan directamente en NL. El proceso de descongelamiento es similar a la tcnica mencionada para la vitrificacin. 3.2.7. Desecacin La desecacin se ha utilizado slo con semillas recalcitrantes y estructuras haploides como polen y vulos. En ella se realiza primero la desecacin de los tejidos o semillas en una cmara de flujo laminar o en un aparato con aire comprimido estril o en slica gel y, luego se congelan las estructuras con NL. 3.2.8. Enfriamiento de gotas. Se ha realizado con pices de tallos, los cuales son pre-tratados con una solucin crioprotectante y luego colocados sobre papel aluminio, de manera que se formen gotas pequeas de crioprotectante con el pice en el centro. Los explantes se congelan directamente con NL. Bibliografa Gmez. T.J, et al. 2006. Deterioro de las semillas de dos procedencias de Swietenia macrophylla King., bajo distintos mtodos de almacenamiento. Universidad Autnoma indgena de Mxico. Mxico. Revista Ra Ximhai. 2(1): pp.223-239. www.ejournal.unam.mx/rxm/vol02-01/RXM002000112.pdf Consultado 01 de Octubre 2011 Kamesuara, R.N, et al. 2007. Bioversity International. Manual para el manejo de semillas en bancos de germoplasma. Roma, Italia. pp. 47. www.bioversityinternational.org/fileadmin/bioversity/.../1261.pdf Consultado 01 de Octubre 2011 Magnitskiy, S.V y Plaza, G.A. 2007. Fisiologa de semillas recalcitrantes de rboles tropicales. Agronoma Colombiana, Universidad Nacional de Colombia Bogot, Colombia. 25 (1), pp. 96-103. www.revistas.unal.edu.co/index.php/agrocol/article/.../15242 Consultado 01 de Octubre 2011 Molina M.J.C y Crdova T.L. 2006. Recursos Fitogenticos de Mxico para la Alimentacin y la Agricultura: Informe Nacional 2006. Secretara de Agricultura, Ganadera, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentacin y Sociedad Mexicana de Fitogentica, A.C. Chapingo, Mxico. p.76.http://www.fao.org/docrep/013/i1500e/Mexico.pdf. Consultado el 01 de octubre 2011.

Neiva S.C y Jimnez V.M. 2010. Tcnicas de conservacin in vitro para el establecimiento de bancos de germoplasma en cultivos tropicales. Agronoma mesoamericana 21(1). pp 193-205 www.mag.go.cr/rev_meso/v21n01_193.pdf consultado el 01 de octubre de 2011 Rao, N.K, et al. 2007. Manual para el manejo de semillas en bancos de germoplasma. Manuales para Bancos de Germoplasma No. 8. Bioversity International, Roma, Italia. pp. 182. www.bioversityinternational.org/fileadmin/bioversity/.../1261.pdfConsultado 01 de Octubre 2011 Scocchi, A. y Hebe R. 2004. Conservacin de germoplasma In vitro. Biotecnologa y mejoramiento vegetal. pp. 179-185.www.inta.gov.ar/ediciones/2004/biotec/parte5_cap3.pdf Consultado 01 de Octubre 2011