MULTIPLICAREA BACTERIILOR

ESTIMAREA CRETERII BACTERIENE

Trebuie definii o serie de parametri care caracterizeaz acest proces i stabilite mai multe formule de exprimare matematic i grafic. Ciclul de cretere

Include perioada de timp de la apariia prin diviziune a unei celule pn la atingerea unei noi faze de diviziune prin cretere i maturitate. n acest interval, celula crete n dimensiuni i atinge masa critic care impune sciziparitatea.

Numrul bacteriilor dintr-o populaie (N)

n

cazul populaiilor cultivate n medii lichide se raporteaz la unitatea de volum de mediu (N/ml). Durata unei generaii (g) sau timpul unei generaii (timpul de dublare)

Reprezint

timpul (exprimat n ore sau minute) necesar pentru ca o celul sau o populaie celular s se dubleze.

Poate fi exprimat prin intervalul de timp dintre dou diviziuni sau prin numrul de generaii/or: g = t/n

t intervalul de timp; n numrul de generaii. Acest timp variaz foarte mult, n funcie de specie. unde:

La majoritatea bacteriilor, durata unei generaii este cuprins ntre 1 3 ore, n timp ce la altele poate varia de la cteva ore la cteva zile.

Numrul de generaii (n)

n timpul fazei de cretere exponenial, numrul celulelor crete astfel: o populaie bacterian, avnd la timpul t0 (n inocul) numrul de celule N0, devine dup o diviziune 2 N0, dup dou diviziuni 22 N0, dup trei diviziuni 23 N0, iar la timpul t, dup n diviziuni (generaii) 2n N0. Prin urmare, numrul de bacterii se dubleaz la fiecare generaie: N0 2 N0 4 N0 8 N0 ....... etc.

 Pentru

calcularea numrului de bacterii dup n generaii se utilizeaz formula:

Nn = 2n N0 n care: Nn = numrul de bacterii nregistrat dup n generaii, la timpul t, N0 = numrul iniial de bacterii, la timpul t0, n = numrul de generaii ntre timpul t0 i t.

numr diviziuni numr celule

Reprezentarea schematic a dublrii numrului de celule la fiecare generaie

Numrul de generaii poate fi reprezentat pe scar aritmetic sau logaritmic

Numrul de Numrul de celule generaii (n) exprimat aritmetic
0 5 (25) 10 (210) 15 (215) 1 32 1024 32768

Log10 din numrul aritmetic de celule

0 1,51 3,01 4,52

16 (216)
17 (217) 18 (218)

65536
131072 262144

4,82
5,12 5,42

19 (219)
20 (220)

524288
1048576

5,72
6,02

Rata de cretere ()

Rata de cretere (caracteristic fazei exponeniale) reprezint numrul de generaii (de dublri sau diviziuni) ntr-o unitate de timp (or) i este dat de formula: = n/t

Aceast formul, care reprezint ecuaia fundamental a creterii bacteriilor sub form exponenial, devine n forma sa logaritmic:

log 2 N n - log 2 N 0 = t

 ntruct

reprezentarea grafic a creterii numerice n valori aritmetice este foarte dificil, se utilizeaz curent exprimarea logaritmic.
poate realiza o reprezentare semilogaritmic a creterii, nregistrnd pe abscis timpul i pe ordonat rezultatele, respectiv numrul celulelor. populaiei, consecutiv diviziunii bacteriilor cu ritm constant (la acelai interval de timp) se exprim printr-o linie dreapt.

Se

Creterea

1000

1000

Curba creterii exponeniale exprimat logaritmic i aritmetic

numr de celule (logaritmic)

10 aritmetic

100

timp (ore)

numr de celule (aritmetic)

log10

100

Randamentul creterii

Creterea total a bacteriilor reprezint diferena dintre numrul celulelor aflate n mediu, cnd populaia intr n faza final de cretere i numrul de celule iniale din inocul. Masa de material celular produs/unitate de mas nutrient consumat este o constant numit randament de cretere.

DINAMICA MULTIPLICRII BACTERIILOR N CULTURI

n general microorganismele sunt cultivate pentru:

1) izolarea i identificarea lor; 2) meninerea n colecii, fr pierderea funciilor importante; 3) studiul structurii i funciei lor; 4) studierea rolului n natur; 5) obinerea de produi rezultai din biomasa celular, biosintez, fermentaii, bioconversii etc.

Se cunosc relativ puine date legate de dinamica multiplicrii populaiilor bacteriene n natur. Multiplicarea n condiii experimentale (de laborator sau industriale) este destul de bine cunoscut. Exist dou tipuri principale de culturi bacteriene: 1. culturile discontinue (n mediu de cultur nerennoit); se pot realiza n dou variante: asincrone i sincrone 2. culturile continue n mediu de cultur rennoit continuu.

CULTURILE DISCONTINUE ASINCRONE

Creterea bacteriilor este limitat la un volum fix de mediu care nu este rennoit. De cele mai multe ori compoziia mediului este modificat de acumularea produilor de metabolism, putnd deveni la un moment dat necorespunztor pentru cretere. Acest gen de cultivare este folosit curent n laborator, avnd ns o serie de dezavantaje.

Curba de cretere (evoluia) unei populaii bacteriene

Pentru a aprecia dinamica multiplicrii bacteriilor n culturi discontinue asincrone se recolteaz eantioane i se determin numrul de bacterii/ml. Cifrele obinute se nscriu ntr-un grafic, avnd pe abscis notat timpul, iar pe ordonat valorile logaritmice ale numrului de celule. Rezult curba de cretere la care se pot distinge patru faze principale, caracterizate de valorile ratei de cretere: faza de lag, faza de cretere exponenial (logaritmic), faza staionar i faza de declin.

faza staionar log. nr celule

faza de declin

faza de log

faza de lag

timp (ore)

Curba de cretere a unei populaii bacteriene

Faza de lag (engl. to lag = a ntrzia)

Numit i faz de laten sau de cretere zero reprezint perioada de timp n care bacteriile introduse ntr-un mediu de cultur se acomodeaz noilor condiii, au o activitate metabolic intens (n special sintez de enzime) i ncep s se multiplice.

n cursul acestei faze, numrul bacteriilor din inocul rmne constant ( = 0), cultura nefiind vizibil macroscopic.
Faza de laten este facultativ, apariia ei depinznd de doi factori principali: vrsta bacteriilor inoculate i adaptarea enzimatic a acestora.

Vrsta bacteriilor inoculate

n

cazul nsmnrii celulelor tinere, de cteva ore, ntr-un mediu nou, faza de lag este extrem de scurt.

cazul culturilor btrne, la care creterea a ncetat de mult, este necesar un timp mai lung pentru ca celulele din inocul s-i refac sistemele enzimatice i metaboliii necesari creterii.

Adaptarea enzimatic a bacteriilor inoculate

n cazul nsmnrii celulelor tinere, aflate n faza de cretere exponenial (logaritmic), ntr-un mediu de cultur nou, cu o compoziie identic cu cel n care au fost cultivate bacteriile din inocul, ele se multiplic spontan, durata fazei de laten fiind foarte scurt. Perioada de lag este prelungit n cazul transferului unor celule cultivate dintr-un mediu bogat ntr-un mediu srac n nutrieni, deoarece celulele trebuie s-i formeze ntregul set de enzime, necesar sintezei tuturor metaboliilor eseniali.

Dac noul mediu de cultur are o compoziie chimic total diferit de cea a mediului din care provin bacteriile nsmnate, faza de lag este foarte lung deoarece majoritatea celulelor nu se pot multiplica pentru c nu gsesc factorii de cretere indispensabili. Perioada de lag este necesar i n cazul celulelor lezate de efectul unor ageni chimici (radiaii, cldura) sau chimici, datorit timpului necesar reparaiei celulare. La sfritul acestei faze, celulele bacteriene cresc foarte mult ca mrime (unele i pot dubla sau tripla dimensiunea) i au un coninut mrit n proteine, ARN i fosfor.

Faza de cretere exponenial (logaritmic) = faz de log

Se caracterizeaz prin multiplicarea continu a bacteriilor. Rata de cretere la nceput se mrete progresiv, devenind maxim i constant ( = max.), iar durata generaiei atinge un minimum constant. Mortalitatea celular este nul, numrul total de celule este egal cu numrul de celule viabile.

n faza de log celulele au cea mai intens activitate metabolic, aceasta reprezentnd perioada de vrf a activitii i eficienei n practica industrial. S-a constatat o sensibilitate mrit a celulelor aflate n faza de cretere exponenial la aciunea agenilor fizici i chimici. De exemplu, radiaiile i numeroase substane antimicrobiene (penicilina) i exercit efectul, interfernd cu una din etapele importante ale procesului de cretere, fiind mai nocive pentru celulele aflate n aceast faz.

 Durata

fazei exponeniale (cteva ore) este limitat, datorit factorilor limitani care apar n mediul de cultur.

culturile discontinue, la care sursa de C, N, energie scade sub nivelul care asigur creterea maxim sau este pe cale de a fi epuizat, se nregistreaz o perioad de ncetinire a ritmului de cretere. n cazul culturilor continue este posibil meninerea unei populaii n faza exponenial de cretere, indefinit.

Faza staionar

Ca urmare a diminurii substanelor nutritive i a acumulrii produilor toxici de metabolism n mediu, rata de cretere a celulelor scade progresiv pn cnd nceteaz complet. Celula intr n faza staionar, n cursul creia numrul celulelor viabile este maxim, rmnnd constant o perioad de timp.

Exist un echilibru ntre numrul celulelor moarte i cel al celulelor rezultate din diviziune.

Multiplicarea bacteriilor n faza staionar nu nceteaz, limitndu-se doar la nlocuirea celulelor moarte, ceea ce nseamn c rata de cretere devine din nou nul ( = 0).
n cursul fazei staionare, celulele bacteriene sunt considerate mature, cu morfologia caracteristic, citoplasma mai puin omogen datorit apariiei de incluziuni i acumulrii de substane de rezerv, afinitate normal pentru colorani, prezena sporilor la speciile sporogene. n final numrul celulelor viabile scade progresiv i ncepe declinul culturii.

Faza de declin

ncheie evoluia unei culturi bacteriene realizat n sistem discontinuu.

Multiplicarea bacteriilor nceteaz ( < 0) iar rata de mortalitate este constant. Sporadic, celulele rmase vii se mai pot multiplica pe baza substanelor nutritive rezultate din autoliz. Celulele n faza de declin au o morfologie alterat, conin cantiti mari de substane de rezerv. Cultura sfrete prin moartea tuturor celulelor i autosterilizarea ei.

CULTURI SINCRONE

Nu toate celulele unei culturi bacteriane se divid n acelai timp (sincron), astfel nct se ajunge la o populaie heterogen, format din indivizi care nu au aceeai vrst.

Pentru o serie de studii morfologice, fiziologice, biochimice i genetice este important s se lucreze pe celule de aceeai vrst, care se divid sincron, s-au realizat culturi speciale, cu cretere i multiplicare sincron a indivizilor populaiei respective.

 Sunt

cunoscute dou categorii de culturi cu cretere sincron: sincrone toate bacteriile se divid n acelai timp, deoarece iniial au fost selecionate celule de vrste i dimensiuni asemntoare. sincronizate celulele au fost aduse n acelai stadiu de diviziune prin diferite tratamente fizice sau chimice.

culturi

culturi

Tehnicile se bazeaz pe modificarea condiiilor de mediu: expunerea la doze subletale de radiaii expunerea alternativ la temperaturi optime sau subletale de cretere lipsa din mediul de cultur a unui factor esenial de cretere expunerea la aciunea unui antibiotic care inhib sinteza proteinelor etc.

Principalul mijloc de obinere a culturilor sincronizate este supunerea populaiilor bacteriene la schimbri ciclice de temperatur.
Dac o populaie de Salmonella typhimurium aflat n multiplicare este supus alternativ la temperatura optim de dezvoltare (370 C) i apoi la o temperatur mai sczut (250 C), ntreaga populaie se va divide sincron n timpul scurtei incubri (8 minute) la 370 C. n timpul incubrii (28 minute) la 250 C populaia rmne constant deoarece multiplicarea nu are loc la aceast temperatur.

numr de celule

Curba creterii sincronizate la Salmonella typhimurium

timp (ore)

CULTURI CONTINUE

Procesele de biosintez, industriale sau de laborator, necesit existena bacteriilor n faza exponenial de cretere. Acest lucru nu poate fi realizat timp ndelungat ntr-un volum fix de mediu nerennoit, n care faza exponenial are un numr limitat de generaii, iar condiiile de mediu (concentraia substanelor nutritive sau a O2) devin limitante.

n aceste condiii, prelungirea fazei exponeniale se poate realiza numai dac mediul de cultur este rennoit continuu, simultan cu eliminarea produilor de metabolism.

 Aparatele

n care se realizeaz astfel de culturi se numesc chemostate = sisteme de cultivare deschise, n flux continuu, n care mediul proaspt este adugat n mod continuu, n timp ce o cantitate egal, reprezentnd surplusul de microorganisme i de mediu, este ndeprtat.

Spre

deosebire de cultura static, n care concentraia substratului scade pe msur ce microorganismele se multiplic, n chemostat adugarea mediului proaspt n mod continuu menine concentraia substratului i rata de cretere.

filtru de aer

robinet evacuare

rezervor de mediu steril

Reprezentarea schematic a unui chemostat

port inoculare

vas de cultur robinet admisie

agitator magnetic vas colector al culturii

Principalul avantaj al culturii continue este posibilitatea de a varia rata de cretere prin modificarea ratei de aprovizionare cu substane nutritive proaspete. n chemostat densitatea populaiei bacteriene i rata de cretere pot fi controlate prin intermediul a doi factori de reglare: rata diluiei i concentraia unui nutrient limitant. Chemostatul asigur n mod continuu o cultur care crete indefinit, cu o vitez constant, n condiii constante, furniznd celule cu proprieti uniforme i activiti fiziologice optime.

n condiii de laborator chemostatul poate fi utilizat pentru scopuri de cercetare: - modele pentru studiul ecosistemelor microbiene naturale; - controlul sintezelor enzimatice; - studiul factorilor care influeneaz creterea i multiplicarea bacteriilor; - studii de fiziologie celular.

Culturile continue se folosesc n practica industrial pentru: - obinerea biomasei microbiene bogate n nutrieni; - extragerea unor principii active de la diferite specii de microorganisme (vitamine, enzime etc.).