REPORTE 5: DIAGNOSTICO DE ENFERMEDADES POR ANALISIS INMUNOLOGICOS PRUEBA DE ANILLO EN LECHE (MRT) Y PRUEBA DE SEROAGLUTINACIN EN PLACA Coila Chacn,

Ftima Dafne Facultad de Ciencias Farmacuticas, Bioqumicas y Biotecnolgicas, Programa Profesional de Ingeniera Biotecnolgica, Campus U.C.S.M. Arequipa, PER. RESUMEN En la presente prctica se reconocieron y compararon la deteccin de anticuerpos y la deteccin de antgenos en leche y sangre de animal, basndose en un solo principio, el de la reaccin antgeno anticuerpo. La prueba de anillo en leche fue diseada por Fleishauer (1937) para evidenciar o detectar anticuerpos IgG e IgM atados a los glbulos de grasa en la leche. En esta prueba se emplea un antgeno preparado a partir de cultivos puros de B. abortus S99 o Sil 19-3 a una concentracin celular del 4%, coloreada con hematoxilina y con un pH de 3.3 - 3.7. El antgeno debe estandarizarse frente al OlESS. Prueba de Aglutinacin en placa, tambin llamada rpida o de Huddleson quien en 1920 prepar un antgeno concentrado para usarlos en pruebas de aglutinacin en placas. La prueba de rosa de bengala es una prueba rpida de aglutinacin en placa, el antgeno es una suspensin de Brucelas, en tampn lactato a pH 3,6 teidas con rosa de bengala.

ABSTRACT The present practice is recognized and compared the antibody and antigen detection in milk and animal blood, based on a single principle, the antigen-antibody reaction. The milk ring test was designed by Fleishauer (1937) for evidence or IgG and IgM antibodies bound to the fat globules in milk. This test uses an antigen prepared from pure cultures of B. 19-3 Sil abortus S99 or a cell concentration of 4%, stained with hematoxylin and with a pH of 3.3 - 3.7. The antigen must be standardized against OlESS.

Agglutination test, also called rapid or Huddleson who antigen for use in agglutination plates.

in 1920 prepared a

concentrated

The Rose Bengal test is a rapid slide agglutination, the antigen is a suspension of Brucella, in lactate buffer pH 3.6, stained with rose bengal.

INTRODUCCION

La Brucelosis en los animales esta descrita y referida como una entidad nosolgjca reproductiva caracterizada por aborto, retensin de placenta y consecuentemente disminucin de la produccin lctea e infertilidad en los machos; en consecuencia la Brucella es uno de los principales patgenos zoonticos a nivel mundial que, por su implicancia en salud humana y los rasgos epidemiolgicos, es de notificacin obligatoria a todos los pases miembros de la Organizacin Mundial de Sanidad Animal (OIE). El propsito de las pruebas existentes en la actualidad para el diagnstico de la infeccin producida por el gnero Brucella en los diferentes especmenes y en donde el hombre es un husped heterlogo accidental guardan una estrecha relacin con la finalidad de servir como elementos de orientacin referencial no slo en la investigacin epidemiolgica de la enfermedad, sino porque lleva consecuentemente a un mejor producto pecuario y por ende un desarrollo socio-econmico ms productivo, incluso permite desarrollar tareas especficas en la toma de decisiones relacionadas con el binomio Ganadera / Medio Ambiente. Actualmente hay un gran nmero de pruebas diagnsticas para evidenciar anticuerpos especficos antibrucelares tanto en suero, plasma sanguneo, leche y en otros fluidos orgnicos como: plasma seminal y mucus vaginal; dichas tcnicas varan en sensibilidad y especificidad, desde luego hay que tener en cuenta el momento de su aplicacin, se sabe que ninguna prueba serolgica aislada es adecuada para todas y cada una de las situaciones epidemiolgicas. Por lo tanto, la reactividad de las muestras que son positivas en pruebas de anlisis deben confirmarse utilizando una estrategia confirmativa establecida. Es de relevante importancia que los programas y/o sistemas de erradicacin estn basados en criterios complementarios de diagnstico de hato o rebano ya que en el diagnstico individual se logran los mejores resultados al aplicarse varios criterios y procedimientos que luego deben ser evaluados en su conjunto. Los objetivos de esta prctica son detectar la presencia de anticuerpos en la leche y comprender los fundamentos bsicos de la prueba de aglutinacin como prueba inmunolgica para el diagnostico e investigacin de agentes de importancia patgena.

FUDAMENTO TEORICO Brucella es el nombre genrico con el que se denomina a un grupo de pequeos cocos y cocobacilos gramnegativos aerbicos, inmviles y de crecimiento lento. Se reconocen tres especies clsicas que producen la brucelosis humana: Brucella mellitensis afecta fundamentalmente a cabras y ovejas, pero puede afectar a bvidos y cerdos 1. Brucella abortus es el microorganismo implicado con mayor frecuencia en la brucelosis bovina y es poco frecuente en nuestro pas. Brucella suis afecta primariamente al ganado porcino y no se ha descrito ningn caso en nuestro pas. Las tres especies menores (B. canis, B. ovis y B. Neotomae) no revisten importancia en patologa humana. La Brucella tiene capacidad de sobrevivir en el interior de las clulas fagocticas. Este hecho determina la clnica caracterstica, el curso ondulante, su tendencia a presentar recadas y su frecuente evolucin a formas crnicas. La brucelosis es una zoonosis que afecta a animales domsticos y produce aborto contagioso en el ganado bovino, ovino y en cerdos y perros. El germen, adems, infecta las glndulas mamarias del animal y se elimina por la leche, especialmente en el ganado bovino y ovino. Se transmite al hombre, a partir del animal infectado, quien constituye el autntico reservorio de la enfermedad.2 La enfermedad tiene una cierta tendencia estacional relacionada con la biologa de los vidos, y se asocia ms frecuentemente al sexo masculino, entre los 31-40 aos. Las vas de transmisin se asocian, en el medio urbano a la ingesta de productos lcteos sin higienizar y, en el medio rural, al contacto con ganado enfermo.3 El hombre puede infectarse por:

Ingestin: leche, queso y derivados lcteos sin pasteurizar. Contacto: con animales infectados o con sus productos, 60%-70% de todos los casos en el medio rural. Inhalacin: trabajadores de la lana y de laboratorio clnico. Inoculacin: veterinarios, matarifes y personal de laboratorio.

Cuando la Brucella penetra en el organismo es fagocitada por los leucocitos polimorfonucleares (PMN) y los macrfagos tisulares, donde puede multiplicarse en su interior, localizndose, finalmente, en los rganos del sistema reticuloendotelial. La produccin de anticuerpos especficos es importante en cuanto a su magnitud y a su utilizacin en el diagnstico serolgico de la enfermedad, pero al ser un germen intracelular tienen una capacidad protectora limitada. La primera inmunoglobulina que se produce es la IgM, sus niveles comienzan a disminuir alrededor de los 3 meses del inicio de la enfermedad. A partir de la segunda semana se elevan la IgG y la IgA que pueden permanecer aumentadas durante un largo perodo de tiempo con independencia de la evolucin clnica de la enfermedad. El mecanismo defensivo fundamental y necesario para la erradicacin del germen depende, fundamentalmente, de la activacin de los linfocitos T CD4 que modulan la respuesta de las

clulas efectoras del sistema inmune, de forma que capacitan a los linfocitos B para la sntesis de Ig especficas, potencian la actividad ltica de los linfocitos T y determinan la consiguiente activacin de los macrfagos y clulas NK, aumentando su capacidad para destruir estos microorganismos. 2 MRT O PRUEBA DE ANILLO EN LECHE La prueba del anillo en leche (PAL) pertenece al grupo de pruebas indirectas empleadas en el Diagnstico Presuntivo de la brucelosis bovina, dado que evidencia o detecta anticuerpos aglutinantes antibrucela frente a la fraccin O de la cadena de lipopolisacridos de la membrana externa del agente etidgico. La prueba del anillo en leche se emplea frecuentemente en reas libres y de control de la enfermedad, ayuda a descubrir establos y/o hatos infectados, incluso es usada ampliamente en Vigilancia Epidemiolgica porque permite controlar peridicamente la brucelosis en los establos, adems contribuye a descubrir si la infeccin se ha reinstalado en el establecimiento lechero. La pruebadel anillo en leche que es til en ganado bovino, resulta ineficaz en los pequeos rumiantes (segn OLE). Principio Los anticuerpos brucelares contenidos en la muestra, reaccionan con el antgeno coloreado de Brucella formando con l un complejo antgeno-anticuerpo que se adhiere a los glbulos de grasa de la leche que, por su menor densidad ascienden a la superficie del tubo formando una capa de crema a manera de un anillo que se colorea de morado (bematoxilina del antgeno) que por su intensidad varan en matices; desde un morado intenso (positivo) a un blanco cremoso (negativo), el cual es indicativo de que la muestra no contiene aglutininas especficas por lo tanto el antgeno no aglutina permaneciendo la columna de leche uniformemente coloreada de lila. Toma de la muestra. Las muestras de leche deben ser homogneas es decir con una buena distribucin de la crema (grasa) la agitacin no debe ser vigorosa, luego mantearla en reposo y en refrigeracin. SEROLOGIA EN PLACA: PRUEBA DE AGLUTINACIN La prueba de Rosa Bengala o prueba del antgeno tamponado de Brucela, es una tcnica rpida de aglutinacin en porta para la deteccin de anticuerpos anti-Brucela en sueros animales y humanos . La suspensin bacteriana es reactiva tanto con anticuerpos IgG como IgM, siendo los primeros detectados ms precozmente (infecciones sub-clnicas) y por un perodo ms largo de tiempo (fase crnica) que con el procedimiento convencional de tubo. La determinacin se efecta ensayando la suspensin tamponada (pH 3,6) de Brucella coloreada con Rosa Bengala frente a los sueros problema. La presencia o ausencia de aglutinacin visible es indicativa de la presencia o ausencia de anticuerpos en las muestras ensayadas.
1-3

MATERIALES Y METODOS MRT O PRUEBA DE ANILLO EN LECHE Incubadora 37C Frscos de 50 ml para la recoleccin de la muestra Tubos de ensayo de vidrio de 1 ml Gradilla pequea para sujetar los tubos de ensayo Pipetas: para la toam de muestra de 1 ml o de 1000 ul o Para el reactivo de 30 ul

Tips para micropipetas Reactivo o el antgeno

METODO Las muestras de leche deben tenerse frescas; se Llevan a temperatura ambiente incluyendo el antgeno, una hora antes de la realizacin de la prueba. Mezclar bien cada frasco que contiene la muestra; para lo cual se invierte varias veces, no violentamente, para resuspender la grasa (crema). En una gradilla con tubos debidamente rotulados y considerando los controles respectivos, colocar 1 ml de muestra en cada tubo (de dimetro suficiente que permita la formacin de una columna de 25 mm) Aadir 30 uL de antgeno para la prueba del anillo en leche a cada tubo y mezclar invirtiendo suavemente el tubo varias veces logrando una distribucin uniforme antgeno- leche. Luego colocar la gradilla en la incubadora a 37C por una hora y realizar la primera lectura a los 30 minutos y la lectura final a los 60 minutos, sin embargo, la refrigeracin durante toda la noche a 4C aumenta la sensibilidad de la prueba y permite una interpretacin ms fcil. Es conveniente indicar que el vnculo antgeno-leche es muy importante ya que al aumentar la cantidad de leche en la prueba aumenta la sensibilidad del antgeno y viceversa, de manera que ste principio ha permitido modificar la prueba usndola en muestras de tanques en establos lecheros y camiones cisternas.

Figura 1. Imagen donde se observa la gradilla con tubos de ensayo con diferentes tipos de muestra de leche, mezclados con el reactivo mostrando un color morado azul

SEROAGLUTINACION EN PLACA Muestra de suero sanguneo Reactivo de Rosa de Bengala Placa de vidrio rayada en cuadriculas Piperas automaticas graduables 30ul Tips 100 ul

METODO 1. Llevar a temperatura ambiente el reactivo, controles y muestras de suero. 2. Utilizando la pipeta automtica adicione 30 L de la muestra del paciente en un crculo de la placa. 3. Mezcle suavemente el Antgeno Rosa de Bengala hasta que se encuentre totalmente homogneo, despus coloque 30 L en la placa de prueba, en el mismo circulo donde se coloco la muestra del paciente, mezcle ambas con un aplicador. (usar un aplicador diferente para cada muestra). Repita este paso para cada muestra de paciente y controles. 4. Agitar la placa con movimientos rotatorios por 4 minutos.

5. Con la ayuda de una fuente de luz directa lea el resultado. Importante: Despus de este tiempo la lectura ya no es vlida.

Figura 2. Placa Petri con dos muestras de sangre diferente, a su lado el reactivo rosa de bengala que sern echados a cada gota para ver la reaccin antgeno-anticuerpo

RESULTADOS Y DISCUSION La brucelosis es una enfermedad profesional a la que estn especialmente expuestas las personas que deben relacionarse con el ganado como pastores, veterinarios, matarifes, agricultores, etc. En los animales la infeccin puede causar de forma asintomtica o manifestar una sintomatologa que en general es expresin de una orquepididimitis en los machos y mamitis y aborto epizotico en las hembras. La excrecin de brucelas en la leche, la prolongada eliminacin por las secreciones genitales y la infecciosidad de los productos del aborto, explican la transmisibilidad al hombre. En la prueba de anillo en leche, el resultado despus de la incubacin en la mayora de muestras dio como resultado negativo porque presenta un anillo de crema color blanco la columna de leche de color lila y/o azulada.
La Prueba de anillo en leche (PAL), tiene una sensibilidad del 99% y una especificidad del 56%(3).

Aunque en la Quinta Edicin del Manual de Pruebas de Diagnostico y de Vacunas para Animales Terrestres (Mamferos, Aves y Abejas) de la OIE referido en el captulo de Brucelosis Caprina y Ovina (no por Brucella mis) indica que la prueba del Anillo en leche es muy til en ganado bovino, es considerada inefectiva en pequeos rumiantes.

Figura 3. Muestra negativa en la prueba de anillo en leche

En la prueba de seroaglutinacion de suero sanguneo, se agreg la rosa de bengala que contiene los anticuerpos, esperando los 4 minutos que se pide en las especificaciones del reactivo y obtenindose como resultado positivo.

Figura 4. Reaccin positiva de aglutinacin en placa, quiere decir que hay presencia de Brucela en la sangre del animal

La respuesta serolgica es similar sea cual sea la especie de brucela causal, es decir que las pruebas serolgicas no pueden discriminar la especie responsable del proceso. Por otra parte, los antgenos a utilizar en las pruebas pueden obtenerse indistintamente de cualquiera de las especies mayores (cepas lisas). En el momento actual, el diagnostico serolgico de la brucelosis reposa en las pruebas de seroaglutinacin, Coombs anti-Brucella y rosa de Bengala. A ellas debe aadirse la reaccin de EIA frente a LPS.

La reaccin de seroaglutinacin es la prueba ms ampliamente utilizada. Tiene un gran valor y es de sencilla realizacin. Es muy especfica por lo que los ttulos positivos indican contacto previo con brucelas. Un titulo 1/80 en medio urbano o zonas no endmicas, y en ausencia de historia previa, es altamente indicativo de enfermedad actual. En el diagnstico clnico, los resultados de la determinacin de los anticuerpos anti-Brucela deben ser considerados siempre en relacin a los hallazgos clnicos y otras pruebas de laboratorio. CONCLUSIONES

La brucelosis es una infeccin originada por una bacteria denominada Brucella. En el mundo el gnero ms frecuente que afecta al ser humano es la Brucella melitensis, transmitida por animales, sobre todo ovejas y cabras, por medio de la leche que es consumida sin higienizar. La clnica es muy variada, siendo la presentacin ms frecuente la forma de enfermedad aguda, parecida a un cuadro gripal, que en algunas ocasiones se puede localizar en algunos rganos. En estos casos lo habitual es la aparicin de una sacroiletis. Solo un 5% de los casos recae, y en menor porcentaje se cronifican. El diagnstico definitivo es su aislamiento en hemocultivos, pero si se sospecha la existencia de la infeccin, se deben solicitar pruebas serolgicas como Coombs, Rosa de Bengala y ELISA.

BIBLIOGRAFIA
1. 2. Young E. An overview of human brucellosis. Clin Infect Dis 1995;21:283-9 [PubMed] Rodrguez Zapata M, J. Solera Santos, L. Snchez Martnez, J. Sols Garca del Pozo y M. lvarezMon Soto. Brucelosis. Medicine 2002;8(65):3455-3463 Bercovich, 1998: Bercovich Z Maintenance of Brucella abortus free herds: A review with emphasis on epidemiology and the problems of diagnosing brucellosis in areas of low prevalence. Veterinary Quarterly. 1998: 20(3): 81- 88. [PubMed: %84294].

3.