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CINTICA ENZIMTICA ..................................................................................................... 4 FACTORES QUE AFECTAN LA VELOCIDAD DE LAS REACCIONES CATALIZADAS POR LAS ENZIMAS .................................................................................................................. 5-8 LA CONCENTRACIN DE SUSTRATO AFECTA LA VELOCIDAD DE LAS REACCIONES CATALIZADAS POR LAS ENZIMAS...................................................................................... 9 CARACTERSTICAS PARA MEDIR LA VELOCIDAD DE REACCIN FUNCIN DE SUSTRATO ........................................................................................................................ 10 PARMETROS CINTICOS ............................................................................................. 11-15 REACCIONES CATALIZADAS POR LAS TRASAMINASAS ............................................... 16-17 TRANSAMINASAS DE INTERS CLNICO ....................................................................... 17-18 NOMENCLATURA Y NMERO DE CDIGO ...................................................................... 18 COFACTORES REQUERIDOS POR LAS TRASAMINASAS .....................................................19 FUNDAMENTOS ...............................................................................................................20 OBJETIVOS .......................................................................................................................20 PROCEDIMIENTO ........................................................................................................21-22 RESULTADOS ................................................................................................................... 23 CONCLUSIONES .......................................................................................................... 24-25 BIBLIOGRAFA ................................................................................................................ 26

CINTICA ENZIMTICA

Estudia la velocidad de reaccin, los mecanismos y factores que los modifican. Estos estudios proporcionan informacin directa acerca del mecanismo de la reaccin cataltica y de la especificad de la enzima. La velocidad de una reaccin catalizada por un enzima puede medirse con relativa facilidad, ya que en muchos casos no es necesario purificar o aislar el enzima. La medida se realiza siempre en las condiciones ptimas de pH, temperatura, presencia de cofactores, etc., y se utilizan concentraciones saturantes de sustrato. En estas condiciones, la velocidad de reaccin observada es la velocidad mxima (Vmax). La velocidad puede determinarse bien midiendo la aparicin de los productos o la desaparicin de los reactivos. Las dos propiedades cinticas ms importantes de una enzima son: el tiempo que tarda en saturarse con un sustrato en particular y la mxima velocidad de reaccin que pueda alcanzar. El conocimiento de estas propiedades hace posible hipotetizar acerca del comportamiento de una enzima en el ambiente celular y predecir cmo responder frente a un cambio de esas condiciones.

FACTORES QUE AFECTAN LA VELOCIDAD DE LAS REACCIONES CATALIZADAS POR LAS ENZIMAS

Concentracin de la enzima Concentracin del sustrato Activadores e inhibidores Fuerza inica del medio pH del sistema de reaccin

CONCENTRACIN DE SUSTRATO
Mantiene constante: la concentracin de enzima, pH y temperatura ptima de la enzima, en ausencia de inhibidores enzimticos es posible medir la velocidad de reaccin en funcin de concentraciones variables de sustrato. El efecto de saturacin de la E por el S ha permitido la determinacin de los parmetros cinticos: Km y Vmax

CONCENTRACIN DE LA ENZIMA
Si se aaden cantidades crecientes de enzima a un sistema de reaccin en el que se han establecido las condiciones ptimas de pH y To y en el que hay cantidades suficientes de sustrato y cosustrato, se observa que la velocidad de la reaccin es directamente proporcional a la cantidad de enzima utilizada (relacin lineal entre ambos parmetros)

La reaccin general se puede representar as:

E+S K1 ES K3 E+P

K2

K4

Sin embargo podemos representar la reaccin globalmente:

E+S

K1 K2

E+P

El complejo ES normalmente es muy pequeo y los valores K2 y K3 son prcticamente iguales, pero de signos opuestos resulta: V1 = K1 E S y V2 = K4 E P EFECTO DE LA TEMPERATURA
En determinado margen la velocidad de las reacciones aumentan cuando se aumenta la temperatura. Grficamente el aumento de temperatura versus velocidad de reaccin = respuesta llega a lmite por encima de la cual disminuye.

La temperatura a la que se alcanza Valor mximo = temperatura ptima (Valor superior o similar al interior de clula). La temperatura ptima de enzima en animales son por debajo de 40oC, las de origen vegetal est por encima de los 40oC. Enzimas de ciertos microorganismos poseen temperatura ptima con valores cercanos a 100oC. La temperatura ptima depende del tiempo de exposicin de la enzima a dicha temperatura. Cuanto ms corto sea el tiempo de exposicin ms alta ser la temperatura ptima alcanzada. La aceleracin de la reaccin producida por el aumento de temperatura que no superen a la ptima resulta del aumento de la energa cintica de las molculas reaccionantes. A temperaturas ms altas la enzima cintica aumenta tanto que excede barrera energtica que mantiene la estructura cataltica activa, perdiendo la enzima la estructura (desnaturalizacin) y su actividad cataltica desaparece irreversiblemente. In vivo las enzimas son estables moderadamente a temperaturas habituales de los organismos. El proceso de extraccin de la enzimas de su ambiente in vivo, sin embargo puede aumentar su susceptibilidad a la desnaturalizacin por efecto de la temperatura. La mayor cantidad de enzimas se desnaturalizan a 100oC, pierden a 60oC actividad. Peor enzimas como ribonucleasas y Adenilato quinasa pueden resistir temperaturas de ebullicin = facilita purificacin. Las enzimas de microorganismos que viven en aguas termales (60-80oC) presentan una resistencia excepcional al calor. Valor de Q10 para reacciones catalizadas por encima est entre 1.5 y 2.5. En general, los aumentos de temperatura aceleran las reacciones qumicas: por cada 10C de incremento, la velocidad de reaccin se duplica. Las reacciones catalizadas por enzimas siguen esta ley general. Sin embargo, al ser protenas, a partir de cierta temperatura, se empiezan a desnaturalizar por el calor. La temperatura a la cual la actividad cataltica es mxima se llama temperatura ptima. Por encima de esta temperatura, el aumento de velocidad de la reaccin debido a la temperatura es contrarrestado por la prdida de actividad cataltica debida a la desnaturalizacin trmica, y la actividad enzimtica decrece rpidamente hasta anularse. En el efecto de la temperatura hay dos componentes:

1. Aceleracin de la reaccin segn la ecuacin de Arrhenius k = A exp (-Ea/RT) 2. Desnaturalizacin trmica de la protena EFECTO DEL pH
Los enzimas poseen grupos qumicos ionizables (carboxilos -COOH; amino -NH2; tiol -SH; imidazol, etc.) en las cadenas laterales de sus aminocidos. Segn el pH del medio, estos grupos pueden tener carga elctrica positiva, negativa o neutra.
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Como la conformacin de las protenas depende, en parte, de sus cargas elctricas, habr un pH en el cual la conformacin ser la ms adecuada para la actividad cataltica. Este es el llamado pH ptimo. La mayora de los enzimas son muy sensibles a los cambios de pH. Sus pH ptimos son entre 4-8, el pH ptimo refleja el pH del entorno en el que ejercen su actividad cataltica. Desviaciones de pocas dcimas por encima o por debajo del pH ptimo pueden afectar drsticamente su actividad. Ejemplo: la pepsina gstrica tiene un pH ptimo de 2, la ureasa lo tiene a pH 7 y la arginasa lo tiene a pH 10. Como ligeros cambios del pH pueden provocar la desnaturalizacin de la protena, los seres vivos han desarrollado sistemas ms o menos complejos para mantener estable el pH intracelular: Los amortiguadores fisiolgicos. La actividad enzimtica debe medirse a pH ptimo por 2 razones: 1. Porque la sensibilidad de la reaccin es mxima a ese valor de pH 2. Porque la curva de efectividad Vs pH tiene de ordinario mnima pendiente cerca de ese pH, por lo que una variacin de pH causar un cambio mnimo en la actividad enzimtica

En el efecto del pH hay tres componentes: a) Sobre la fijacin del substrato al centro activo: o Grupos disociables de la enzima o Grupos disociables del substrato b) Sobre la transformacin cataltica del substrato c) Sobre la estructura de la protena enzimtica

EFECTO DE LA FUERZA INICA

A veces, un enzima requiere para su funcin la presencia de sustancias no proteicas que colaboran en la catlisis: los cofactores.

Los cofactores pueden ser iones inorgnicos como el Fe++, Mg++, Mn++, Zn++ etc. Casi un tercio de los enzimas conocidos requieren cofactores. Cuando el cofactor es una molcula orgnica se llama coenzima. Cuando los cofactores y las coenzimas se encuentran unidos covalentemente al enzima se llaman grupos prostticos. La forma catalticamente activa del enzima, es decir, la enzima unida a su grupo prosttico, se llama holoenzima. La parte proteica de un holoenzima (inactiva) se llama apoenzima.

EFECTO DE LOS ACTIVADORES E INHIBIDORES

Los inhibidores enzimticos son molculas que reducen o anulan la actividad enzimtica. Estos inhibidores pueden unirse a las enzimas de forma reversible (la desaparicin del inhibidor restaura la actividad enzimtica) o irreversible (el inhibidor inactiva permanentemente a la enzima).

Los activadores se unen al centro regulador, cambian la configuracin del centro activo, que hasta ese momento estaba inactivo y desencadenan la catlisis enzimtica.

EFECTO DE LA CONCENTRACIN DE SUSTRATO

Mantiene constante: concentracin de enzima, pH y temperatura ptima de la E, en ausencia de inhibidores enzimticos es posible medir la velocidad de reaccin en funcin de concentraciones variables de sustrato. La disminucin de concentracin de sustrato ->Velocidad de reaccin es directamente proporcional a la concentracin de sustrato= es decir que la cintica de reaccin es de primer orden con respecto al sustrato. Al aumentar la concentracin de sustrato y alcanzar concentraciones intermedias de sustratos -> Velocidad de reaccin se va tornando independiente de la [S] y la cintica de la reaccin es de orden mixto o pseudoprimer orden. El aumento de la concentracin de sustrato > la enzima est saturada por sustrato-> Velocidad de reaccin se hace completamente independiente de la concentracin de sustrato y la cintica es de orden 0. La concentracin de sustratos saturantes -> Factor limitante de la reaccin de concentracin de enzima. Todas las enzimas muestran este efecto de saturacin, peor varan ampliamente con respecto a la concentracin de sustrato para alcanzar dicha saturacin.

CONDICIONES DE ENSAYO PARA LA MEDICIN DE LA VELOCIDAD DE REACCIN EN FUNCIN DE SUSTRATO

La velocidad de una reaccin enzimtica depende de la concentracin de sustrato. La Figura 1 muestra la velocidad de una reaccin enzimtica a 6 concentraciones distintas de sustrato. Adems, la presencia de los productos finales puede hacer que la reaccin sea ms lenta, o incluso invertir su sentido (Figura 2).

Un ensayo enzimtico es un procedimiento, llevado a cabo en un laboratorio, mediante el cual se puede medir la velocidad de una reaccin enzimtica. Como las enzimas no se consumen en la reaccin que catalizan, los ensayos enzimticos suelen medir los cambios experimentados bien en la concentracin de sustrato (que va decreciendo), bien en la concentracin de producto (que va aumentando). Existen diversos mtodos para realizar estas medidas. La espectrofotometra permite detectar cambios en la absorbancia de luz por parte del sustrato o del producto (segn la concentracin de estos) y la radiometra implica incorporacin o liberacin de radiactividad para medir la cantidad de producto obtenido por tiempo. Los ensayos espectrofotomtricos son los ms utilizados, ya que permiten medir la velocidad de la reaccin de forma continua. Por el contrario, los ensayos radiomtricos requieren retirar las muestras para medirlas, por lo que son ensayos discontinuos. Sin embargo, estos ensayos son extremadamente sensibles y permiten detectar niveles muy bajos de actividad enzimtica. Tambin se puede utilizar la espectrometra de masas para detectar la incorporacin o liberacin de istopos estables cuando el sustrato es convertido en producto. Los ensayos enzimticos ms sensibles utilizan lseres dirigidos a travs de un microscopio para observar los cambios producidos en enzimas individuales cuando catalizan una reaccin. Estas medidas pueden utilizar cambios producidos en la fluorescencia de cofactores que intervienen en el mecanismo de catlisis o bien unir molculas fluorescentes en lugares especficos de la enzima, que permitan detectar movimientos ocurridos durante la catlisis. Estos estudios estn dando una nueva visin de la cintica y la dinmica de las molculas individuales, en oposicin a los estudios de cintica enzimtica tradicionales, en los que se observa y se mide el comportamiento de una poblacin de millones de molculas de enzima.

PARMETROS CINTICOS

Km

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Km-> ndice muy aproximado de la afinidad de la Enzima por el Sustrato. Definicin: concentracin de sustrato necesario para alcanzar la mitad de la velocidad mxima (Vmax) La KM es inversamente proporcional con la actividad de la enzima (inversamente proporcional la afinidad de la Enzima por el Sustrato). Valor de KM grande, baja actividad-> menor afinidad y viceversa. Valor de KM pequeo, alta actividad-> [S] se alcanzar Vmax. Valor de km se expresa en moles/l de solucin. Es constante en cada enzima y depende del sustrato en particular y condiciones del ensayo. El conocimiento del valor de Km de una enzima puede ser de considerable valor en investigaciones de control metablico. Las alteraciones en la concentracin celular de un sustrato o un cofactor no influyen forzosamente en la velocidad de una reaccin enzimtica. Influirn solo si las concentraciones son menores o sobrepasan en mucho el valor del Km del cofactor o del sustrato de la E. Ejemplo : [glucosa en sangre en 5mM] 2 enzimas hepticas que fosforolizan la glucosa: Hexoquinasa Km 0.01M para la glucosa Glucosquinasa Km 20 mM para la glucosa

Kcat (constante para cada enzima)

Nmero de recambio = Nmero de molculas de sustrato convertidas en producto por molcula de enzima y unidad de tiempo, en condiciones de saturacin de sustrato. Su inversa define el tiempo requerido por el enzima para transformar una sustrato molcula de

Unidad de enzima
Cantidad de enzima que transforma 1mol de sustrato por miunto= una forma comn de expresar la velocidad.

Constante especfica
Sirve para comparar la eficiencia de una enzima dada para distintos sustratos Kcat/Km

Actividad especfica
Unidades por mg de protena total de la preparacin enzimtica. En el caso de enzimas en suero: unidades/L (U/L), unidad ms moderna kat= nmero de moles de producto/segundo.

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Vmax (Velocidad mxima terica)

La velocidad cuando todos los centros activos estn ocupados con sustrato (nunca alcanzada en la realidad). Llamada tambin EFICACIA CATALITICA Mxima velocidad a la cual la enzima es capaz de transformar el sustrato en producto Revela el nmero de recambio de la enzima. La Vmax se alcanza siempre que se trabaja a concentraciones saturantes de sustrato El valor de Vmax depende de la concentracin de enzima. Al duplicarse la concentracin de enzima se duplica el valor de Vmax, pero no vara el Km. Vmax es una expresin de EFICENCIA DE OPERACIN, en el lmite superior de cierta enzima. Para comparar Enzimas diferentes es necesario expresar la Vmax en trminos de la mxima cantidad molar de cada enzima. Cuando se trata de E purificadas los valores de Vmax se suelen referir los miligramos de protena. Experimentalmente se puede determinar el valor de la velocidad mxima de una reaccin enzimtica Vmax = K3 [Et]

Constante de Michaelis - Menten

La constante de Michaelis Km se define como la concentracin a la que la velocidad de la reaccin enzimtica es la mitad de la Vmax. Esto puede verificarse sustituyendo la concentracin de sustrato por dicha constante ([S] = Km). Si la etapa limitante de la velocidad de la reaccin es lenta comparada con la disociacin de sustrato (k2 <<< k1), la constante de Michaelis Km ser aproximadamente la constante de disociacin del complejo ES, aunque sea una situacin relativamente rara. La ecuacin de Michaelis-Menten y su derivacin se basa en 3 supuestos: 1. Complejo E-S se encuentra en estado estacionario. [E-S] permanece constante.

2. Bajo condiciones de saturacin, toda la E interviene en la formacin del complejo E-S. 3. Cuando toda la E se encuentra en forma de complejo ES; la velocidad de la reaccin es la mxima posible.

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EXPRESIN MATEMTICA DE LA ECUACIN DE MICHAELIS-MENTEN: Enzimas con saturacin por sustrato

MODELO DE MICHAELIS - MENTEN Curva hiperblica y= a x/b + x Variables Y y X son V y S Las constantes a y b son Vmax y Km respectivamente

De acuerdo con la ecuacin de Michaelis-Menten tendremos que: V: velocidad inicial a concentraciones bajas de sustrato S: concentracin de sustrato Vmax: velocidad mxima, a concentraciones saturantes de sustrato Vmax= k3/ES max Vmax= k3/Et Km = constante de afinidad de la enzima por el sustrato. En trminos de las constantes de velocidad se expresa: k 2 k3 km Adems de ajustarse a la representacin grfica de la Velocidad y Vs S de la ecuacin de k1 Michaellis-Menten se derivan datos importantes, bajo los siguientes supuestos: 1. Si consideramos que la concentracin de sustrato es igual al valor de km es decir Km= S dicha ecuacin se convertir en:

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[ ] [ ]

[ ]

[ ]

Esta expresin nos define el valor numrico de km, que es igual al Sustrato, cuando la Vinicial de la reaccin es la mitad de Vmax.

En consecuencia es posible determinar experimentalmente el valor de km, si se conoce la Vmax (mediante la representacin grfica de la cintica enzimtica).

2. Si consideramos que la concentracin de sustrato es muy inferior al valor de km, entonces puede despreciarse el valor de S en denominador, de la ecuacin de Michaelis-Menten [ ] [ ] [ ] [ ]

Puesto que Vmax y Km son 2 constantes, dicha ecuacin indica que bajo estas condiciones, la velocidad inicial de la reaccin es directamente proporcional a la concentracin de sustrato 3. Por lo contrario, cuando la concentracin de sustrato es mucho ms alta que el valor de Km, puede considerarse estaigual a cero en el denominador de la ecuacin de Michaelis-Menten por tanto tendremos que: [ ] [ ] [ ]

Cuando la [S] es muy alta, la velocidad inicial de reaccin es igual a la Vmax La ecuacin de Michaelis-Menten, debe ser coherente con la observacin de que la V guarda una relacin lineal con la cantidad de E presente. Esta concordancia puede verse al sustituir el valor de Vmax en la ecuacin de velocidad. [ ] [ ] [ ][ ][ ] [ ]

Km, k3 y s son constantes se tiene que: V: K3Et, de donde se deduce que la velocidad tiende al infinito a medida que se incrementa la concentracin de enzima

Representacin de la ecuacin de Michaelis-Menten

DIAGRAMA DE LINEWEAVER-BURKE

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La grfica de Lineweaver-Burke o del doble recproco muestra el significado de los puntos de corte entre la recta y los ejes de coordenadas, y el gradiente de la velocidad. La grfica de velocidad frente a [S] mostrada anteriormente no es lineal. Aunque a bajas concentraciones de sustrato se mantenga lineal, se va curvando a medida que aumenta la concentracin de sustrato. Antes de la llegada de los ordenadores, que permiten ajustar regresiones no lineales de forma sencilla, poda llegar a ser realmente difcil estimar los valores de la Km y la Vmax en las grficas no lineales. Esto dio lugar a que varios investigadores concentraran sus esfuerzos en desarrollar linearizaciones de la ecuacin de Michaelis-Menten, dando como resultado la grfica de Lineweaver-Burke y el diagrama de Eadie-Hofstee. Con el siguiente tutorial de la cintica de Michaelis-Menten realizado en la Universidad de Virginia , se puede simular el comportamiento de una enzima variando las constantes cinticas. La grfica de Lineweaver-Burk o representacin de doble recproco es la forma ms comn de mostrar los datos cinticos. Para ello, se toman los valores inversos a ambos lados de la ecuacin de Michaelis-Menten. Como se puede apreciar en la figura de la derecha, el resultado de este tipo de representacin es una lnea recta cuya ecuacin es y = mx + c, siendo el punto de corte entre la recta y el eje de ordenadas equivalente a 1/Vmax, y el punto de corte entre la recta y el eje de abscisas equivalente a -1/Km.

Obviamente, no se pueden tomar valores negativos para 1/[S]; el mnimo valor posible es 1/[S] = 0, que correspondera a una concentracin infinita de sustrato, donde 1/v = 1/Vmax. El valor del punto de corte entre la recta y el eje x es una extrapolacin de datos experimentales obtenidos en laboratorio. Generalmente, las grficas de Lineweaver-Burke distorsionan las medidas realizadas a bajas concentraciones de sustrato y esto puede dar lugar a estimaciones no muy exactas de la Vmax y del Km. Un modelo lineal mucho ms exacto es el diagrama de Eadie-Hofstee, pero en las investigaciones cientficas actuales, todo este tipo de linearizaciones han quedado obsoletos y han sido sustituidos por mtodos ms fiables basados en anlisis de regresin no lineal. Para analizar los datos es conveniente la normalizacin de los mismos, ya que esto puede ayudar disminuyendo la cantidad de trabajo experimental a realizar e incrementando la fiabilidad del anlisis.

REACCIONES QUE CATALIZAN LAS TRANSAMINASAS

Las aminotransferasas (o transaminasas) son un conjunto de enzimas del grupo de las transferasas, pues transfieren grupos amino desde un metabolito a otro, generalmente
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aminocidos. Estas enzimas son inducibles, porque su actividad puede aumentarse por la accin de diversas hormonas como la tiroxina o los glucocorticoides, su reaccin es libremente reversible y su constante de equilibrio est cerca a la unidad. Su nomenclatura se establece a partir del aminocido des del cual transfieren el grupo amino. Los nmeros EC 2.6 representan a las enzimas transferasas que transfieren grupos que contienen nitrgeno. Las transaminasas catalizan las reacciones de transaminacin, importante sobre todo para la sntesis de aminocidos no esenciales y la degradacin de la mayora de aminocidos, que pierden su grupo amino por transaminacin, excepto los aminocidos lisina y treonina, donde esta reaccin no es posible. Hay una aminotransferasa para cada aminocido excepto para estos dos aminocidos. Las principales aminotransferasas son las hepticas como:

La alanina aminotransferasa (ALT) o Glutamato-piruvato transaminasa (GPT), se localiza fundamentalmente a nivel citoslico en el hepatocito, por la que se la denomina unilocular. La aspartato aminotransferasa (AST) o Glutamato-oxalacetato transaminasa (GOT), localizada sobretodo en la mitocondria y a nivel citoplasmtico, por lo que se le llama enzima bilocular. sta est presente, adems del hgado, en otros rganos, como son, en orden de abundancia: el miocardio, el msculo esqueltico, los riones, el cerebro, el pncreas, el pulmn, los leucocitos y los eritrocitos.

Estas aumentan en asociacin a diversas enfermedades. En ocasiones, el tipo especfico de aminotransferasa elevada sugiere el rgano afectado por su relativa abundancia en l. En la transaminacin participan normalmente, como donante y receptor, el glutamato y el -cetoglutarato (-KG), que participan en las diferentes reacciones catalizadas por las diferentes aminotransferasas. La transaminacin consiste en transportar un grupo -amino desde un -aminocido donador, al carbono ceto de un -cetocido receptor. Este proceso ocurre en dos etapas y es catalizado por las distintas aminotransferasas especficas de cada sustrato. La reaccin de transaminacin tiene lugar en el citosol y las mitocondrias. Las reacciones de transaminacin son reversibles, as se podrn utilizar los -cetocidos para la sntesis de aminocidos. Incluso si los -cetocidos que corresponden a los esqueletos de carbono de los aminocidos esenciales son administrados por la dieta, podrn sintetizarse estos aminocidos con una simple transaminacin, catalizada por la aminotransferasa correspondiente. El sentido de la reaccin viene determinado por la concentraciones de productos y reactivos en el hgado porque, en ste, los metablitos estn prximos al equilibrio. La GOT cataliza la reaccin hacia la formacin de oxaloacetato.

Aspartato + -Cetoglutarato Oxalacetato + Glutamato

La GTP cataliza otra reaccin, hacia la formacin de piruvato.

Alanina + -Cetoglutarato Piruvato + Glutamato

La GTP tiene una gran importancia en la catalizacin de reacciones que transfieren carbono y nitrgeno del msculo esqueltico al hgado en forma de alanina. Primero, en el msculo esqueltico, el piruvato acta como receptor de un grupo amino y se transforma en alanina, esta ser transportada a travs del corriente sanguneo hasta el hgado donde la alanina transferasa (ALT) transfiere el grupo amino al -KG, regenerando as el piruvato que puede

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incorporarse en la gluconeognesis como fuente de carbonos y la glucosa resultante podr pasar de nuevo al msculo. Este proceso se conoce como el ciclo de la glucosa-alanina y permite la eliminacin del nitrgeno del msculo esqueltico en forma de urea, transformacin que se dar gracias al Ciclo de la urea.

TRANSAMINAS DE INTERS CLNICO

Los niveles de Transaminasas en sangre se utilizan como indicador para detectar posibles patologas en las funciones del hgado. Tanto la AST y ALT estn presentes en el suero en concentraciones inferiores a 30-40 Ul/l, pero si el hgado est daado, la permeabilidad de la membrana celular aumenta y estas enzimas son liberadas a la sangre en grandes cantidades, hecho que no siempre requiere la necrosis de los hepatocitos. De hecho, hay escasa correlacin entre el dao celular heptico y el grado de elevacin de las transaminasas. Prcticamente cualquier enfermedad heptica que comporte un dao necroinflamatorio puede ser la causa. Las enfermedades hepticas: hepatitis viral, cirrosis, el hgado graso, el consumo excesivo de alcohol, quistes o tumores en el hgado u obstruccin graves de la va biliar pueden provocar un aumento notable de la transaminasa en sangre. La elevacin de transaminasas es un proceso muy inespecfico que puede ocurrir en casi todas las enfermedades hepticas y en numerosas extrahepticas. Alanina aminotransferasa (ALT) o Transaminasa glutmico pirvica (GPT) La ALT cuya vida media es de 48 horas es ms especfica de dao heptico que la AST. Se localiza casi exclusivamente en el citosol del hepatocito. Las enfermedades hepticas (hepatitis viral, cirrosis) provocan un aumento notable de la transaminasa glutmico-pirvico (ALT) en el plasma sanguneo, debido a su nica localizacin en el hgado. Aspartato aminotransferasa (AST) o Transaminasa glutmico-oxalactica (GOT) La AST con una vida media de 18 horas. Adems del citosol y mitocondria, se encuentra en el corazn, msculo esqueltico, riones, cerebro, pncreas, pulmn, eritrocitos y leucocitos.

Otras enfermedades no hepticas, como pueden ser aquellas relacionadas con procesos musculares (distrofias, polimiositis o traumatismos e un infarto agudo de miocardio) pueden ser la causa de un incremento ms marcado de la transaminasa glutmico-oxalactico (AST), debido a su presencia, adems del hgado, en otros rganos.

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As pues, en la mayora de tipos de enfermedad heptica, la actividad de la ALT es mayor que la de la AST. La hepatitis alcohlica es una excepcin a esta regla ya que el alcohol incrementa la actividad de la AST en el plasma, al contrario que otras formas de hepatitis; la mayora de formas de dao heptico hacen disminuir la actividad hepatocitaria de ambas formas de la AST mientras que el alcohol slo reduce la actividad citoslica. En los alcohlicos es comn la deficiencia en piridoxina, que reduce la actividad de la AST y, finalmente, el alcohol induce la liberacin de la AST mitocondrial a partir de clulas sin dao celular visible.

VALORES NORMALES DE LABORATORIO Los valores de referencia para la GOT (o AST) y la GPT (o ALT) son:

* GOT o AST: 10-45 unidades internacionales por litro en el hombre y 5-31 en la mujer; * GPT o ALT 10-43 unidades internacionales por litro en el hombre y 5-36 en la mujer. Tales valores pueden ser, en todo caso, diferentes segn los laboratorios y las metodologas utilizadas en el anlisis.

NOMENCLATURA Y NMERO DE CDIGO DE LAS 2 ENZIMAS

2.6.1.1 aspartato transaminasa; transaminasa glutmico oxalactico; transaminasa glutmico asprtico; transaminasa A. AST; aminotransferasa glutamato oxalacetato; transaminasa glutamato-oxalato; aminotransferasa glutamico-aspartico; transaminasa glutamico-oxalacetico; transaminasa glutamico oxlico GOT (enzima); L-aspartata transaminasa; L-aspartate-alfa-ketoglutarato transaminasa; Laspartato-2-ketoglutarato aminotransferasa; L-aspartato-2-oxoglutarata aminotransferasa; L-aspartato-2-oxoglutarato-transaminasa; L-aspartico aminotransferasa; oxaloacetatoaspartato aminotransferasa; oxaloacetato transferasa; aspartato: 2-oxoglutarato aminotransferasa; glutamato oxaloacetato transaminasa 2.6.1.2 alanina transaminasa; transaminasa glutamico-piruvico; glutamico-alanina transaminasa GPT; beta-alanina aminotransferasa; alanina aminotransferasa; alanina-alfa-ketoglutarato aminotransferasa; alanina-piruvato aminotransferasa ALT; glutamico acido-piruvico acido transaminasa; glutamico-piruvico aminotransferasa; Lalanina aminotransferasa; L-alanina transaminasa; L-alanina-alfa-ketoglutarato aminotransferasa; piruvato transaminasa; piruvato-alanina aminotransferasa; piruvataglutamato transaminasa

COFACTORES REQUERIDOS POR LAS TRANSAMINASAS

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Las aminotransferasas (o transaminasas) son un conjunto de enzimas del grupo de las transferasas, que transfieren grupos amino desde un metabolito a otro, generalmente aminocidos. Estas enzimas son inducibles, porque su actividad puede aumentarse por la accin de diversas hormonas como la tiroxina o los glucocorticoides, su reaccin es libremente reversible y su constante de equilibrio est cercana a la unidad.

Las transaminasas necesitan de una coenzima llamada piridoxal fosfato (derivado de la piridoxina o vitamina B6) para ejercer su funcin. Esta coenzima acta como transportador del grupo amino entre los sustratos, alternando su estructura entre la forma aldehdica (piridoxal) y la forma aminada (piridoxamina).

Piridoxal-5'-fosfato (PLP)
Para transportar el grupo amino, las transaminasas requieren la participacin del piridoxal5'-fosfato (PLP), un derivado de la piridoxina (vitamina B6). El PLP se une covalentemente a la enzima mediante una unin por base de Schiff (imina) formada por la condensacin de su grupo aldehdo con el grupo -amino de un resto de lisina de la enzima. Esta base de Schiff, que est conjugada al anillo piridnico de la coenzima, es el foco de la actividad de la coenzima. El grupo amino del aminocido se acomoda por conversin de esta coenzima a piridoxamina-5'-fosfato (PMP). Esmond Snell, Alexander Braunstein y David Metzler demostraron que la reaccin ocurre mediante un mecanismo de bi bi ping pong

FUNDAMENTOS

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Los estudios de la cintica enzimtica es determinar el mecanismo qumico que subyace en la reaccin enzimtica, por ejemplo, determinar la secuencia ordenada de sucesos que transcurren en la transformacin de sustrato en producto.

OBJETIVOS
1. Determinar cul es el efecto de la concentracin de sustrato sobre la velocidad de la reaccin catalizada por la enzima Aspartato aminotransferasa. 2. Demostrar si la reaccin catalizada por la enzima Aspartato aminotransferasa sigue la cintica de Michaelis Menten. 3. Linealizar la curva de Michaelis Menten bajo el grfico de Lineweaver Burker. 4. Calcular los parmetros cinticos de Km y Vmax de la enzima estudiada.

MATERIALES Pipetas Tubos de ensayo Bao de vapor Auxiliar de pipeta Pipeta automtica Gradilla Pipeta de 5ml Espectrofotmetro

REACTIVOS Sustrato 1 Sustrato 2 Enzima (GOT) 2,4 D.F.H Tricloro Actico NaOH Agua destilada

PROCEDIMIENTO

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PREPARACIN DE LA MUESTRA
Tubos Sustrato 1 Sustrato 2 1 1000 2 950 50 3 900 100 4 850 150 5 800 200 6 700 300 7 600 400 8 500 l 500 l

Mezclar Bao 370C por 3 minutos.

Tubos Enzima (GOT)

1 200

2 200

3 200

4 200

5 200

6 200

7 200

8 200 l

Controlar el tiempo que se demora al aadir la enzima, y as poder estandarizar el tiempo para cada tubo. Una vez dentro del bao los tubos no se los retiran; dentro del mismo se aade la enzima. Mezclar Bao 370C por 5 minutos.

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Tubos 2,4 D.F.H

1 500

2 500

3 500

4 500

5 500

6 500

7 500

8 500 l

Mezclar Bao 370C por 5 minutos.

Tubos NaOH

1 5

2 5

3 5

4 5

5 5

6 5

7 5

8 5 ml

Retirar los tubos del bao. Mezclar Reposo 5 minutos, leer. A 505 nm, las absorbancias. Hacer el cero con agua destilada.

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RESULTADOS

Tubos 1 2 3 4 5 6 7 8

Absorbancia 0.370 0.649 0.847 1.028 1.038 1.074 1.125 1.122

Absorbancia (corregida= V actividad) 0.279 0.477 0.658 0.668 0.704 0.755 0.752

Concentracin de Sustrato [S] 18 25 37 46 56 79 113

Absorbancia corregida= Abs (2-9) Abs1 Ejemplo: 0.649 0.370 = 0.279 [ ] [ ] Consideramos como Vmax=0.755 por ser la mayor absorbancia corregida. Partiendo de la Vmax el valor de V= 0.477 al comparar el resultado obtenido siendo el ms cercano el valor antes mencionado.

Y de esta manera, con dicha V, se pudo obtener el valor de la [S]= 25. La Km ser: [ ] [ ]

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CONCLUSIONES

Los valores obtenidos son: V Vmax [S] Km 0.477 0.755 25 14.57

Constante de Michaelis - Menten

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Grfica de Lineweaver - Burke

25

BIBLIOGRAFA

https://www.itescam.edu.mx/principal/sylabus/fpdb/recursos/r55275.PDF www.upch.edu.pe/.../Enzimas%20%20y%20cinetica%20enzimatica.pdf ufq.unq.edu.ar/Docencia-Virtual/.../T8-Cinetica-enzimatica.pdf www.bcelular.fmed.edu.uy/Material/enzimas.pdf docencia.udea.edu.co/bacteriologia/.../microbiologia_3.pdf whqlibdoc.who.int/publications/2005/9243546503_spa.pdf

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