1

UNIVERSITATEA BABE-BOLYAI CLUJ- NAPOCA

FACULTATEA DE FIZIC










STUDII PRIN METODE ATOMICE I MOLECULARE A
UNOR PROBE BIOLOGICE




Rezumatul tezei de doctorat




















Coordonator tiinific
Prof.univ.dr. Constantin Cosma
Doctorand
Mesaro Cornelia






Cluj-Napoca
2010


2
Cuprins


Introducere .....1

Capitolul I. Metode spectroscopice de analiz

1.1. Generaliti .......3
1.2. Spectroscopia n vizibil i UV......5
1.3. Spectroscopia IR ......8
1.3.1. Rotaii moleculare .....8
1.3.2. Vibraii moleculare ......13
1.3.3. Aplicaii ale spectroscopiei IR .16
1.4. Spectroscopia RES .....16
1.4.1. Spectrul RES .......19
1.4.2. Aplicaiile spectroscopiei RES ....20
1.5. Spectroscopia de RMN ...21
1.5.1. Bazele RMN ....21
1.5.2. Spectrul RMN ......24
1.5.3. Aplicaiile RMN ......25

Capitolul II. Spectrometria de mas

2.1. Sisteme de introducere ...27
2.2. Surse de ioni .......29
2.2.1. Surse de ioni cu ionizare n faz gazoas ....29
2.2.2. Surse de ioni cu plasm ...30
2.2.3. Surse de ionizare la presiune atmosferic ....32
2.3. Analizoare de mas .........33
2.4. Detectori de ioni .....36
2.5. nregistrarea i achiziia datelor MS ...37
2.6. Prelucrarea datelor MS ...39
2.7. Analiza cantitativ n MS ...40

3
Capitolul III. Cromatografia de gaze i aplicaii

3.1. Generaliti .....41
3.2. Factorul de retenie. Parametrii de retenie ....43
3.3. Profilul de concentraie al picului cromatografic ...43
3.4. Numrul de talere i nlimea talerului .44
3.5. Cromatografia gazoas ...45
3.6. Analiza calitativ a compuilor organici prin GC...51
3.7. Analiza cantitativ a compuilor organici prin GC ........52

Capitolul IV. Aplicaii ale GC-MS n studii de biologie i medicale

4.1. Analiza cantitativ de compui bioactivi utiliznd metoda ID-MS ....56
4.1.1. Analiza cantitativ prin ID. Curba de calibrare ...59
4.1.2. Analiza teofilinei n fluide biologice prin ID-MS ...62
4.2. Diagnosticarea bolilor de disfuncie hepatic prin GC-MS ....70
4.2.1. Cuplajul GC-MS ..70
4.2.2. Testul cafeinei metod de diagnosticare pentru disfuncia hepatic ....71
4.3. Diagnosticarea de boli metabolice nnscute prin GC-MS ....80
4.3.1 Aplicaiile GC-MS n metabolomic ...80
4.3.2. Aminoacizii i importana lor n organism ......83
4.3.3. Monitorizarea profilelor aminoacizilor pentru diagnosticarea PKU i
MSUD.....88

Capitolul V. Concluzii .......105

Bibliografie ....108



Cuvinte cheie: metode spectroscopice, diluie izotopic, GC-MS, SIM, validare, diagnosticare,
fluide biologice, boli metabolice, teofilina, aminoacizi, cafeina.
4
INTRODUCERE


Spectroscopia studiaz interaciunea dintre radiaiile electromagnetice cu materia. n acelai
timp, spectroscopia este o denumire generic dat unei clase de procedee i tehnici experimentale
de analiz calitativ i cantitativ a unor probe solide, lichide sau gazoase. n urma interferenelor
energetice ntre radiaia electromagnetic i materie, rezult spectrul substanei de analizat care
ofer informaii precise despre compoziia calitativ i cantitativ a materiei.
nceputurile spectroscopiei se refereau numai la analiza spectrului luminii vizibile. La ora
actual, spectroscopia, acoper pe lng domeniul spectral al luminii vizibile i restul spectrului
radiaiei electromagnetice, pornind de la domeniul radiaiei gamma pn n domeniul undelor radio.
Dintre toate tehnicile spectroscopice, spectrometria de mas este poate cea care ofer cele
mai multe posibiliti aplicative, datorit varietii de genuri de spectre pe care le poate da. La
nceputul secolului XX, spectrometria de mas s-a dezvoltat ca o tehnic folosit n principal de
fizicieni, pentru a determina structura atomului. La sfritul anilor `30 i nceputul anilor `40,
spectrometria de mas a jucat un rol important n dezvoltarea energiei atomice. n anii `40, cnd
spectrometria de mas a fost folosit pentru identificarea i cuantificarea substanelor organice, au
nceput s apar instrumentele comerciale ceea ce a condus la utilizarea n multe domenii diferite
ca: fizica nuclear, biologie, medicin, geologie, studiul mediului.
Spectrometria de mas este un instrument puternic pentru studiul tuturor substanelor,
deoarece dintr-o cantitate infim furnizeaz mai multe informaii despre structura i compoziia unei
substante, dect orice alt tehnic analitic. n acelai timp este i un puternic instrument de
cuantificare. Pot fi identificate i cuantificate dintr-un fruct ptat urme (10
-15
g) de pesticide; sunt
necesare doar cantiti de zeptomoli (10
-21
mol) de proteine pentru caracterizarea unor anomalii
genetice, sau pot fi detectate picograme (10
-12
g) de fier n cristalul de siliciu, nainte de folosirea lui
ca materie prim n costisitorul proces de fabricaie al semiconductorilor.
La rndul su, cromatografia, are un puternic impact n domeniul analizei calitative i
cantitative. Este metoda prin care se pot analiza amestecuri de compui de ordinul sutelor n decurs
de cteva minute.
Prin cuplajul ntre cromatografia de gaze i spectrometria de mas pot fi detectai i
identificai compui dintr-un amestec necunoscut. Cantitatea de prob necesar analizei poate fi
extrem de mic, datorit detectorilor cu performane ridicate. Computerizarea a permis o important
diminuare a costurilor analizelor i a poziionat tehnica GC-MS printre tehnicile de vrf cu aplicaii
n foarte multe domenii cum ar fi: petrochimia, industria chimic i farmaceutic, n domeniul
analizei poluanilor din aer, ap, sol, alimente, analiza aromelor i a uleiurilor volatile, studii clinice,
criminalistic, etc.
5

n lucrarea de fa s-a urmrit analiza unor probe biologice utiliznd diferite metode
spectroscopice, (n special spectrometria de mas i gaz cromatografia) n scopul unor determinri
specifice n domenii medicale i farmacologice.
Primul capitol cuprinde pe scurt, cteva aspecte teoretice legate de principalele metode
spectroscopice i aplicaiile lor n studii de biologie.
n capitolele II i III sunt descrise mai detaliat spectrometria de mas i gaz cromatografia,
acestea fiind cele mai utilizate tehnici n analizele efectuate n partea experimental.
Capitolul IV cuprinde rezultatele experimentale referitoare la analizele cantitative i
calitative ale probelor biologice din domeniile amintite mai sus.
Ultimul capitol sintetizeaz concluziile desprinse n urma rezultatelor obinute.



1. METODE SPECTROSCOPICE DE ANALIZ

1.1 Generaliti

Spectroscopia este o denumire dat unei clase de procedee i tehnici experimentale prin
care se urmrete i se cuantific efectul absorbiei sau emisiei de energie de ctre o prob supus
analizei chimice calitative i / sau cantitative.
Scopul spectroscopiei este acela ca dintr-un spectru s se obin informaii despre proba
analizat precum: structura intern, compoziie, dinamic. Spectroscopia analitic permite
recunoaterea naturii atomilor i moleculelor dup forma caracteristic a spectrelor lor.
Spectroscopia de mare precizie are ca scop determinarea unor constante fizice sau testarea de
ipoteze referitoare la legi ale naturii.
Analizele spectroscopice se bazeaz pe interaciunea undelor electromagnetice cu materia.
Originea liniilor spectrale din spectroscopia atomica este dat de variaia energiei unui atom
ca urmare a tranziiilor electronice cnd se emite sau absoarbe un foton. Spectrele atomice sunt
spectre de linii.
Originea liniilor spectrale din spectroscopia molecular este dat de emisia sau absorbia
unui foton cnd variaz energia unei molecule. Energia unei molecule poate varia nu numai ca
urmare a tranziiilor electronice ci i pentru c molecula sufer schimbri n starea de rotaie i
vibraie. Rezult c spectrele moleculare sunt mai complexe dect cele atomice, sunt spectre de
band.
6
Spectrele moleculare conin informaii pentru determinarea unei serii de proprieti moleculare:
dimensiune i forma molecular, valori ale momentelor de dipol, valori ale triei i lungimii
moleculelor i a unghiului dintre legturi

1.2. Spectroscopia n vizibil si UV

Spectroscopia n vizibil si UV se bazeaz pe interaciunea undelor electromagnetice din
domeniul vizibil si UV cu substana si folosete legea Lambert-Beer aplicat undelor din acest
domeniu. Aceast lege arat efectul global de absorbie la trecerea radiaiei electromagnetice printr-
un strat de substan de grosime x.
x
e I I

=
0
(1)
unde:
0
I este intensitatea radiaiei care cade pe prob,
I este intensitatea radiatiei care prsete proba,
x este grosimea stratului de prob,
este coeficientul de atenuare (de absorbie).
Spectrul este de fapt o reprezentare grafic a absorbanei n funcie de numrul de und
~

( / 1
~
= ). Absorbana este definit prin relaia:
I
I
A
0
lg = (2)

1.3 Spectroscopia IR

Spectroscopia IR se bazeaz pe interaciunea radiaiei electromagnetice din domeniul IR cu
moleculele ce alctuiesc o substan. Ea const n msurarea lungimii de und i a intensitii
absorbiei luminii n infrarou de ctre o prob.

n cazul n care radiaia electromagnetic interacineaz cu moleculele, pe lng excitarea
electronilor, molecula poate prelua i energie sub form de energie de rotaie i energie de vibraie a
moleculei. Energia moleculelor se compune din:
E=E
tr
+E
r
+E
v
+E
e

unde: E
tr
energia de translaie
E
r
energia de rotaie
E
v
energia de vibraie
E
e
energia electronic
E
tr
<E
r
<E
v
<E
e

7
n spectroscopie este important de a gsi expresiile pentru nivelele de energie ale
moleculelor pentru ca apoi s se poat calcula frecvenele tranziiilor prin aplicarea regulilor de
selecie. Forma spectrului se face innd seama de populaiile strilor.

1.4 Spectroscopia de rezonan electronic de spin (RES)

Orice particul ncrcat cu sarcin electric i care se deplaseaz pe o traietorie nchis este
echivalent cu un curent inelar i genereaz un dipol magnetic.
Momentul magnetic al unui electron cu sarcina electric (e) ce se deplaseaz pe o traiectorie
circular de raz (r) i cu perioada de rotaie (T) este:
c
r e
r
c
e
c
r e
r
Tc
e
2 2
2
2
2
2

= = = = (3)
unde: - viteza unghiular a electronului, - frecvena electronului.
Rezonana electronic de spin (RES) este o metod fizic de analiz ce se bazeaz pe
absorbia de energie din domeniul microundelor de ctre un sistem de ioni paramagnetici plasai
ntr-un cmp magnetic static. Ionii paramagnetici prezint straturi electronice incomplete, cu
electroni nemperecheai care au spinul 2 / 1 = s i un moment magnetic dipolar de forma:
s
mc
e
2
= (4)
Energia de interaciune dintre ionii paramagnetici (dipoli magnetici) i un cmp magnetic
staionar ( H

) este exprimat de relaia:

H sg E
B
= (5)
unde g - este factorul Land (sau factorul de despicare spectroscopic).
Dac perpendicular pe direcia cmpului magnetic static H

se aplic un cmp magnetic alternativ

Z
H de nalt frecven ( ) ce satisface condiia de rezonan:

g
h
H H g h E
rezonanta
= = = A (6)
dipolul magnetic va absorbi energia cmpului H
z
i i va modifica orientarea fa de cmpul H

din
paralel n antiparalel, adic va trece din starea de energie inferioar n cea superioar. Aceasta
constituie esena rezonanei electronice de spin.
Rezonana electronic de spin se aplic moleculelor ce conin electroni impari. Se
folosete o radiaie electromagnetic de frecven fix ( ) (monocromatic) i se variaz
intensitatea cmpului magnetic H.

8
1.5 Spectroscopia de RMN

Studiul spectrelor atomice a evideniat pe lng structura fin i o structur hiperfin a
liniilor spectrale ce a putut fi explicat pe baza micrii de spin a nucleului ce conduce la apariia
momentului magnetic nuclear. Spinul nuclear se cupleaz cu spinul electronilor i duce la scindarea
suplimentar a nivelelor energetice explicnd apariia structurii hiperfine a liniilor spectrale.
Fenomenul de rezonan magnetic nuclear se bazeaz pe proprietatea unor nuclee de a
prezenta moment magnetic.
Semnalul RMN furnizeaz informaii:
- despre numrul de nuclee,
- despre numrul de nuclee vecine cu care este cuplat un anumit nucleu,
- despre vecintatea chimic a nucleului studiat care determin deplasarea chimic.

2. SPECTROMETRIA DE MAS

n general, un spectrometru de mas se compune din urmtoarele elementele:
- sistemul de introducere al probei, unde proba este introdus n forma i cantitatea potrivit.
- sursa de ioni, unde se produce un fascicul de ioni din substana de analizat sub form de vapori.
- analizor, care separ ionii n funcie de raportul (m/z)
- detector, care nregistreaz abundena relativ sau intensitatea funciei de mas.
n funcie de scopul propus, aceste elemente pot varia constructiv i funcional n limite
foarte largi. Sursele de ioni se adapteaz la probe solide, vapori sau gaze iar analizorul poate fi cu
cmpuri constante sau variabile n timp.
De asemeni, trebuie remarcat faptul c att n sistemul de introducere, ct i n sursa de ioni
i n analizor, trebuie creat vid pentru ca procesul de analiz al probei s nu fie influenat de
prezena moleculelor de aer, n situaia n care unii din compuii analizai se afl n concentraii
extrem de mici (10
-9
g).
Puterea de separare a unui spectrometru de mas se numete rezoluie, i se definete prin
raportul:
m
m
R
A
= (7)
unde: m-masa ionului, m-diferena de mas dintre dou picuri consecutive dinstincte din spectrul
de mas.

9
Spectrul de mas reprezint nregistrarea abundenei ionilor unui compus n funcie de mas
(raportul m/e) i este specific substanei, caracteriznd-o. Spectrul de mas reprezint amprenta
unei substane, de aceea spectrometrul de mas reprezint un detector ideal pentru compuii separai
prin cromatografie de gaze. Cuplajul GC/MS are un numr foarte mare de aplicaii n numeroase
domenii ale tiinei i medicinei.
Spectrele EI conin alturi de ionul molecular [M]
+
(exist i cazuri cnd acesta lipsete) ioni
fragment, care pot fi explicai logic prin pierderi de grupri funcionale din ionul molecular.
Spectrul de mas se poate utiliza pentru indentificarea unui compus necunoscut. n acest caz, de
obicei, spectrul de mas necunoscut se compar cu cel al unor compui cunoscui. Picurile
spectrului de mas al compusului necunoscut se pot utiliza pentru determinarea structural a
acestuia. Studiul cilor de fragmentare ale compusului utiliznd tehnicile de msur a maselor
exacte n nalta rezoluie i msurarea ionilor metastabili dau informaii i mai precise asupra
structurii i triei legturilor compusului de analizat.
Baleiajul masei. Spectrul de mas se obine baleind cmpul magnetic. Computerul
controleaz baleiajul i optimizeaz condiiile n sursa de ioni. Semnalele de la SEM sunt trecute
prin filtrul analog nainte de a trece la convertorul analog digital (ADC). Viteza de digitalizare este
selectat pentru a obine un numr suficient de date punctiforme de-a lungul fiecrui ion semnal
pentru definirea picului i determinarea cu acuratee a poziiei i intensitii lui. Viteza de baleiaj i
rezoluia dicteaz viteza de digitalizare necesar i pentru instrumente cu baleiaj rapid (0,1 secunde
pe decad) este necesar o vitez de conversie de pn la 250 kHz. Interfaa dintre MS i computer
gzduiete ADC i alte dispozitive de operare.
Modul de lucru cu ioni selectai (SIM). n modul de lucru SIM masele individuale ale ionilor
sunt selectate continuu sau cnd se dorete msurarea mai multor ioni, fiecare este detectat n
secven pentru o perioad de timp. n acest mod de lucru sensibilitatea este mult mrit fa de un
baleiaj n care fiecare ion este nregistrat un timp scurt (0,05-1 ms).

Prima etap n prelucrarea datelor de achiziie este identificarea masei de calibrare.
Computerul prelucreaz o list de mase de referin, baleind un compus de calibrare utilizat pentru
stabilirea valorilor maselor ionilor probei. Se utilizeaz, de obicei, o scar de timp. Pentru
instrumentele cuadrupolare masele de referin sunt legate de o scar de tensiune derivat de la
tensiunea barelor cuadrupolului. Similar, o sond Hall plasat n cmpul magnetic poate da o
tensiune pentru colerarea cu picurile de referin. Se utilizeaz ca standarde de referin pentru
calibrare perflorokerosen sau perflortributilamina. Ajustrile spectrometrului de mas privind
focalizarea fasciculului de ioni se fac pentru obinerea unui pic simetric i reproductibil n
intensitate de la un baleiaj la altul. La spectrometrele de mas cuadrupolare, computerul are sarcina
10
de focalizare de rutin a instrumentului utiliznd substana de referin pn cnd intensitile
ionilor selectai sunt n anumite limite. Compuii de referin trebuie s dea ioni care s nu interfere
cu ionii probei . Compuii perflorinai de referin, datorit defectului de mas al florului
(M=18,9984) i deficicienei de mas rezultate pentru ionii ce conin flor, ndeplinesc aceast
condiie.
Prezentarea grafic a spectrului de mas este reprezentarea pe abscis a raportului m/z i pe
ordonat a abundenei relative a ionilor fa de cel mai intens ion al spectrului care se ia 100%.
Aceast procedur se numete normarea spectrului. Exist programe care reprezint spectrul de
mas i marcheaz automat ionii cei mai inteni.
Scderea spectrului. Prezena spectrului de mas al fondului sau al unui alt component
nedorit, se poate ndeprta prin scderea ionilor de interferen din spectrul compus. Acest program
se intrebuineaz pentru curirea spectrului n cazul unor componeni parial rezolvai.
Date de aezare pe ioni selectai. Datele SIM, achiziionate pentru detecie cantitativ
sensibil la componeni specifici, sunt reprezentate grafic sub forma unei cromatograme coninnd
trasarea fiecrui ion n funcie de timp. n modul de lucru SIM sensibilitatea este de aproximativ 10
3

ori.
Biblioteca de spectre este utilizat pentru identificarea componenilor prin comparaie cu
spectre de mas a unor componeni cuoscui. Identificarea unui component necunoscut poate fi
asistat de msurtori de mas exact, msurtori metastabile, utilizarea unor derivatizri,
incorporare de izotopi stabili, metode de ionizare alternative, MS/MS, etc.
Orice analiz cantitativ trebuie s fie specific, precis i sensibil. n vederea realizrii unei
astfel de analize trebuie s inem cont de mai multe aspecte: modul de operare a spectrometrului i
folosirea standardelor de referin interne i externe, nregistrarea datelor cu spectrometrul de mas
se poate obine n mai multe moduri de operare. Spectrometrul de mas n mod obinuit este reglat
pentru a parcurge un anumit domeniu de mas. Acest domeniu poate fi foarte larg, nct s cuprind
ntreg domeniul de mas al aparatului, dar poate fi foarte ngust, ca n cazul monitorizrii unui ion
specific. Monitorizarea unui ion specific se poate face oriunde n domeniul de mas. Cele mai
uzuale moduri de operare ale unui spectrometru de mas sunt: nregistrarea spectrului de mas pe
ntreg domeniul disponibil i monitorizarea unui ion specific
n primul caz se obine reprezentarea curentului total de ion n funcie de timp. Identificarea
unui component pe baza acestuia este dificil, deoarece pot exista mai muli ioni cu aceeai mas.
Masa molar nu este un identificator unic n cazul compuilor organici.
n cazul monitorizrii unui ion specific, spectrometrul este reglat s parcurg un domeniu de
mas ct mai ngust. Cu ct acest domeniu este mai ngust cu att monitorizarea este mai specific.
Graficul curentului ionic rezult din contribuia maselor din acest domeniu ngust. Acest grafic de
11
asemenea poate prezenta mai multe picuri. Graficul obinut prin monitorizarea unui anumit ion este
mai specific dect graficul obinut prin parcurgerea ntregului spectru (graficul curentului total de
ioni). n consecin pentru analize cantitative spectrometrul se opereaz n modul SIM.
Pentru analize trebuie s construim curba de calibrare cu ajutorul unei substane certificate
folosit ca standard de referin.

3. CROMATOGRAFIA DE GAZE I APLICAII

Datorit relativei simpliti, sensibilitii mrite i eficacitii n separarea componenilor
unui amestec, gaz cromatografia a devenit n ultimul timp o unealt foarte important de analiz,
att n analiza cantitativ ct i calitativ a amestecurilor; poate fi de asemenea utilizat pentru
purificarea compuilor, determinarea constantelor termochimice la inclzire i la vaporizare a unor
soluii, determinarea presiunii de vapori i a coeficienilor de activitate sau n monitorizarea
automat a unor procese industriale.
Pe de alt parte utiliznd gaz-cromatografia, o mulime de analize de rutin din mediu i alte
domenii pot fi efectuate rapid. Ca urmare a acestui fapt, multe ri au fixat puncte de monitorizare
pentru msurarea continu (prin metoda gaz-cromatografic) a nivelului de emisii cum ar fi oxizii
de azot, bioxidul i monoxidul de carbon. Gaz-cromatografia este totodat de ajutor i n analiza
produselor farmaceutice, alcoolului din snge, uleiurilor esentiale, produselor alimentare, etc.

Principiul cromatografiei
n principiu, un cromatograf se compune dintr-o coloan i un detector la care se adaug
urmtoarele anexe: o butelie cu gaz purttor (eluent) sau un generator de gaze, dispozitiv de reglare
a presiunii, dispozitiv de introducere a probei, nregistrator i sistemul computerizat de prelucrare a
datelor, programarea temperaturii i a debitelor de gaze.
Principiul de funcionare al cromatografului const n trecerea eluentului prin dispozitivul de
introducere a probei de unde preia proba de analizat i o introduce n coloana cromatografic care
este sediul procesului de separare. Datorit interaciunilor dintre moleculele probei cu faza
staionar, compuii din amestecul de analizat rmn n urma eluentului, migrnd prin coloan cu
viteze diferite. Astfel, la ieirea din coloan componenii vor fi separai i purtai de eluent la
detector.
Detectorul transform o proprietate fizico-chimic a unui component din eluent de obicei
ntr-un semnal electric, proporional cu concentraia componentului. nregistrarea grafic a
semnalului dat de detector n funcie de timp pentru toi componenii din prob se numete
12
cromatogram, iar n cazul unui component se numete pic. Suprafaa picului poate fi integrat cu
ajutorul unui computer.

Factorul de retenie (R) este raportul dintre viteza de migrare (u
z
) a unui component i
viteza de deplasare (u) prin coloan a eluentului:
u
u
R
z
= (8)
Pe de alt parte, valoarea lui R este o proprietate de echilibru i depinde de coeficientul de
repartiie al componentului respectiv, deoarece retenia zonelor, mrime ce fixeaz poziia lor n
timp i spaiu este determinat de distribuia componentului in zon, ntre cele dou faze: mobil i
staionar.
Volumul de retenie (V
R
) este volumul necesar de eluent pentru a elua un component din
momentul injectrii pn la apariia concentraiei maxime. n cromatografia de gaze volumul
eluentului este specificat la presiunea de ieire i temperatura coloanei.
Volumul total sau volumul reinut (V
M
), este volumul necesar pentru a elua un component
a crei concentraie n faza staionar este neglijabil n raport cu concentraia din faza mobil pn
la apariia concentraieie maxime. Acest volum este inclus n volumul de retenie (V
R
), care se mai
numete i volumul de retenie total. Volumul de retenie este o caracteristic calitativ pentru
componenetul respectiv.
n general, n cromatografia de gaze se opereaz cu mrimile de retenie exprimate n uniti
de timp:
t
R
=V
R
/F
C
t
M
=V
M
/F
C
(9)
n care F
C
este debitul volumetric msurat la ieirea din coloan i la temperatura coloanei.

Cromatografia n faza gazoas este o tehnic de separare i identificare a substanelor
chimice prin care amestecul de separat ce este introdus ntr-o faz stationar este supus unui numr
mare de sorbii, desorbii si resorbii n faza stationar, n timp ce este transportat prin sistem de
faza mobil. Vitezele de migrare ale componenilor amestecului depind de coeficienii de distribuie
ai acestora ntre cele dou faze si sunt determinate de proprietile lor fizice si chimice.
Prile componente ale unui cromatograf sunt:
- faza mobil i controlul fluxului de gaz,
- sistemul de introducere a probei injectoare (clasice, cu splitare, split-splitless, on column,
PTV, alte tipuri),
- faza stationar depus n coloanele cromatografice,
- detectorul cromatografic,
13
- sistemul de transmitere a semnalului

Analiza calitativ i cantitativ prin cromatografia n faza gazoas
Analiza calitativ asigur identificarea unor compui organici necunoscui dintr-o prob
supus analizei. Identificarea calitativ se poate realiza n dou moduri:
- prin compararea timpului de retenie (timpul cuprins ntre momentul injectrii probei i cel al
maximului de eluie) sau volumului de retenie al compusului necunoscut, cu cel al unei
substane standard cunoscute sau al unui amestec sintetic de compui;
- prin analizarea componenilor separai cromatografic cu ajutorul unui spectrometru de mas sau
al unui spectrometru IR.
Pentru realizarea unei analize cantitative este necesar s se parcurg urmtoarele etape de lucru:
- prelucrarea preliminar a probelor;
- stabilirea parametrilor de operare;
- calibrarea aparatului;
- calculul rezultatelor;
- aplicarea msurilor de asigurare a calitii.
Cele mai utilizate metode de calibrare i de determinare a concentraiei compuilor sunt :
- metoda curbei de etalonare (normarea de arie). Concentraia componentului necunoscut (X) se
calculeaz folosind aria picurilor, dup formula:
100 %
|
|
|
.
|

\
|
=

i
i
x
A
A
X (10)
- normarea de arie cu factori de rspuns. Calculul concentraiei componenilor se face cu factori
de rspuns (f
i
) determinai experimental cu etaloane sau calculai teoretic sau preluai din
literatura de specialitate, dup formula:
( )
( )
100 %
(
(
(

i
i i
x x
f A
f A
X (11)
- metoda standardului intern
- metoda adiiilor standard
- metoda standardului extern.
Metoda curbei de calibrare. Aceast metod const n realizarea n prealabil a unei curbe de
calibrare, A = f (C
i
), dup care se determin ecuaia dreptei celei mai probabile. Cu ajutorul acestei
ecuaii, dup determinarea ariei picului se calculeaz concentraia acestuia. Prin aceast tehnic se
poate obine o precizie de 0,5%.
14
Metoda standardului intern. Aceast metod const n adugarea la amestecul de analizat a
unei substane de referin (denumit standard) de concentratie cunoscuta C
S
(% greutate). n acest
caz concentraia componentului I se calculeaz cu relaia:
( ) % 100 / =
S S S i i i
C f A f A C (12)
Substana considerat standard trebuie s indeplineasc urmatoarele condiii: s nu fie coninut n
amestecul de analiz, s fie complet separat de restul componenilor de determinat i s nu difere
prea mult ca i concentraie fa de componentul de determinat.
Cu aceast metod se poate obine o precizie de 0.1%
Metoda adiiilor standard. n aceast metod, pentru determinarea concentratiei C
i
a
componentului I, se va determina aria acestuia, A
i
. Se adaug apoi o cantitate cunoscut din acest
component, de concentraie standard C
S
la prob i se determin aria A

i
(compus din A
i
+A
S
) de pe
noua cromatogram. Concentraia C
i
se determin din relaia:
C
i
/(C
i
+C
S
) = A
i
/A

I
de unde rezult C
i
=C
S
A
i
/(A

i
-A
i
) (13)
Metoda standardului extern. La concentratia C
i
necunoscut a unui component I, din
amestecul analizat i corespunde aria picului A
i
. Apoi se introduce n cromatograf o prob din
acelai component dar de concentraie cunoscut C
S
. Se impune urmtoarea observaie: concentraia
standardului extern nu trebuie s fie prea mult diferit de concentraia componentului de determinat.
Se constat uor c aceast metod nu difer n principiu de metoda de calibrare, cu singura
precizare c n acest caz, pentru componentul de concentraie cunoscut se face o singur
determinare. Concentraia componentului necunoscut se calculeaz cu relatia:
C
i
=A
i
C
S
/A
S
(14)


4. APLICAII ALE GC-MS N STUDII DE BIOLOGIE I MEDICALE

4.1. Analiza cantitativ de compui bioactivi utiliznd metoda ID-MS

Indiferent de metoda de analiz cantitativ adoptat, ea trebuie validat privind urmtorii
parametri de validare:
- Liniaritatea capabilitatea unei metode analitice de-a permite, ntr-un domeniu prestabilit
obinerea de rezultate de testare variabile, direct proporionale cu concentraia analitului n
prob. Liniaritatea este demonstrat prin ridicarea curbelor de calibrare pentru analiii
considerai i calculul coeficientului de corelaie aferent. Se recomand ca valoare de referin
0,997 pentru coeficientul de corelaie, dar se admit i valori mai mici, n situaia n care abaterea
15
valorii calculate fa de valoarea de referin, pentru toate punctele de calibrare, nu depete
5% din valoarea efectiv a analitului.
- Limita de detecie (LOD), limita de determinare cantitativ(LOQ) Limita de detecie este
reprezentat de cantitatea cea mai mic de analit care se poate detecta prin metoda considerat.
Cantitatea de analit la limita de detecie trebuie s fie mai mare dect eroarea asociat
msurtorii (raportul semnal/zgomot= 2 sau 3). Limita de cantitate este reprezentat de
cantitatea cea mai mic de analit care d msurtori precise, cu un raportul semnal /zgomot =10.
- Acurateea (exactitatea) - reprezint gradul de apropiere ntre rezultatele obinute prin metoda
analitic i valori accceptate ca valori de referin sau convenional adevrate. Se determin prin
analiza unui material de referin certificat sau prin analiza unei probe generat la nivelul
laboratorului, cu materiale de referin. Exactitatea estimeaz erorile sistematice Se pot
compara rezultatele metodei cu o metod de referin sau se utilizeaz o prob cu concentraie
cunoscut (MRC=material de referin certificat). Se utilizeaz matrici cu cantitate cunoscut de
analit, etaloane sau standarde, n care ncrederea este deplin. Eroarea este diferena dintre
valoarea adevrat i cea msurat.
Pentru a exprima eroarea se calculeaz deviaia standard relativ, RSD, cu relaia:
100
var .
var . .
(%) . .

=
ata ade valoarea
ata ade valoarea masurata valoarea
D S R (15)
unde valoarea msurat n cazul a n msurtori reprezint x :
n
x
x
n
i
i
=
=
1
(16)
- Precizia reprezint gradul de apropiere ntre rezultatele obinute prin msurarea unei serii de
probe realizate din aceeai prob omogen, n condiiile inpuse de metod. Precizia este
investigat la trei nivele:
- repetabilitatea (precizia pe termen scurt) se determin prin citirea repetat, pe termen
scurt, a probei n aceleai condiii de operare,
- precizia intermediar (precizia n cadrul laboratorului) se determin variabilitatea
rezultatelor pe termen mai lung, uzual n zile diferite.
- reproductibilitatea (precizia interlaboratoare) presupune analiza interlaboratoare a
aceleiai probe omogene, prin aceeai metod (transfer direct de metod).
Precizia i reproductibilitatea caracterizeaz concordana dintre rezultatele msurtorilor
individuale sau a seriilor multiple de msurtori. Cu alte cuvinte, precizia este eroarea
statistic.
16
Precizia se exprim cu ajutorul deviaiei standard relative sau a coeficientului de variaie (C.V.)
exprimat n procente:
M D S D S R V C / 100 . .(%) . . .% . = = (17)
unde S.D. este deviaia standard pentru n msurtori i este dat de relaia:
( )
) 1 (
. .
2
+

=

n n
x x
D S
i
(18)
unde x este media msurtorilor individuale i i este dat de relaia (16).
- Robusteea stabilitatea metodei, ca rezultate analitice, la variaii ale parametrilor operaionali.
Se verific prin inducerea controlat a unor abateri de la parametrii operaionali (ntr-un
domeniu realist ales) i verificarea efectului asupra rezultatelor.
- Selectivitatea capacitatea unei metode analitice de a msura cu acuratee un analit n prezena
altor analii i a unor posibili interfereni. Pentru procesele cromatografice este asigurat prin
stabilirea corect a parametrilor separrii cromatografice iar pentru ICP prin alegerea corect a
liniilor spectrale, libere de interferne n domeniul de concentraii ales, comparativ cu alte linii
spectrale. n multe publicaii de specialitate, selectivitatea i specificitatea sunt utilizate ca
sinonime.

4.1.1. Analiza cantitativ prin diluie izotopic. Curba de calibrare.

Analiza prin diluie izotopic (ID) este o metod de analiz cantitativ n care se adaug o
cantitate cunoscut de trasor la o cantitate necunosct de trasat. Dup atingerea echilibrului izotopic
(n care abundena izotopic relativ este aceeai peste tot n sistem iar abundena izotopic iniial
a trasorului adugat este diluat), rezultatul abundenei izotopice de msurat este o msur a
cantitii necunscute de trasat.
Compusul nemarcat conine o cantitate de compus stabil i marcarea nseamn doar excesul
peste aceast cantitate natural. Pentru a calcula cantitatea necunoscut de trasat se utilizeaz
urmtoarea ecuaie de echilibru izotopic:
a n n a n a n
x x
) (
1 1 1 0
+ = + (19)
unde: n
x
cantitatea de trasat (necunoscut), n moli,
a
0
abundena trasatului (natural), n procente,
n
1
- cantitatea de trasor, n moli,
a abundena relativ medie a amestecului ) (
1
n n
x
+ .

17
0
1 1
) (
a a
a a n
n
x

= (20)
Metoda diluiei izotopice este util pentru a calcula cantitatea unui compus dat in vitro. n cinetica
trasorului in vivo acest principiu este suprapus cu reacii cu viteze de reacii chimice, fluxuri de
substrat, formri de rezervor, etc
Curba de calibrare
n orice tehnic analitic se msoar valoarea unei cantiti y pentru valorile date ale unei
cantitti x. n domeniul spectrometriei de mas, x poate fi concentraia unei soluii care a fost
extras ca prob de determinat, iar y poate fi rspunsul la o valoare m/z particular. O reprezentare a
lui y n functie de x va arta o distribuie, obinndu-se o curb sau o dreapt. Dac relaia este
liniar, dreapta se poate construi prin metoda celor mai mici ptrate. Rezultatul, numit regresie
liniara y/x, este linia dreapt care minimizeaz suma ptratelor deviaiilor verticale fa de aceast
linie dreapt.
Ecuaia pentru regresie liniar este:
) ( x x b y y = (21)
unde b este panta sau coeficientulde regresie.
Trebuie s se stabileasc dac exist o legatur semnificativ ntre cele dou seturi de
rezultate. Aceasta se poate face prin calculul coeficientului de corelatie r, dat de:
}{ } {




=
2 2
2 2
/ ) ( ) ( / ) ( ) (
/ ) ( ) ( ) (
n y y n x x
n y x xy
r (22)
Corelaie perfect nseamn 1 = r . Dac 0 = r , nseamn c x i y sunt complet
independente.

4.1.2 Analiza teofilinei n fluide biologice prin ID-MS

Teofilina este un medicament de importan major pentru tratarea astmului i a apneei
premature la copii. Att doza zilnic ct i doza frecvent trebuie individualizat mai ales la copiii
precolari la care au fost raportate fluctuaii excesive a concentraiei teofilinei n ser. Nivelul
terapeutic al teofilinei n plasm este ntre 5-15 g/ml. Dozele care depesc acest interval produc
efecte toxice iar cele mai sczute sunt ineficiente.
n acest studiu au fost comparate dou metode de calcul (matricial i cu ajutorul dreptei de
regresie) pentru determinarea teofilinei din fluide biologice. Dac este urmat o tehnic strict,
concentraia teofilinei n saliva stimulat nu este cu nimic mai puin relevant dect msurtorile din
plasm. Metoda este neinvaziv i a fost aplicat pentru optimizarea tratamentului n clinic.
Material i metod
18
A fost utilizat un spectrometru de mas Hewlett Packard 5989B cuplat cu un gaz-
cromatograf HP-5890 n condiiile: energia electronilor 70 eV, emisia electronic 300 A i
temperatura sursei de ioni 200
o
C, modul de lucru monitorizare de ion selectat (SIM). Gaz-
cromatograful a utilizat o coloan capilar HP-5MS, 30m x 0,25mm, 0,25m grosimea
filamentului, programat de la 200
o
C la 270
o
C cu 10
o
C/min, debitul 1 ml/min, cu heliu ca gaz
purttor.
Ca standard intern s-a folosit teofilina marcat cu
15
N (74,2 atom% teofilin-
15
N)
sintetizat la INCDTIM Cluj-Napoca. Puritatea standardului intern s-a verificat prin spectroscopie
IR, spectrometrie de mas i punct de topire. Cloroformul i izopropanolul folosite la extracie s-
au purificat prin distilare.
Analiza s-a fcut pe ionii moleculari m/z 180 i m/z 181, ai analitului i standardului intern,
utiliznd pentru analiza cantitativ modul de lucru SIM.
Procedura de extracie
O cantitate de 0,5 ml plasm coninnd teofilin a fost introdus ntr-o filol cu capac cu
filet de 5 ml i s-au adugat 5 l standard intern
15
N-teofilin, 1 ml solvent pentru extracie
cloroform:izopropanol 20:1 v/v cu adaos de 0,2 g NaCl. Dup 1 min de amestecare mecanic, proba
a fost centrifugat 3 min i apoi stratul inferior (organic) a fost injectat n GC.
Grupe de studiu:
Au fost alese dou grupe diferite de studiu: grupa A format din 27 de copii cu astm avnd
vrsta cuprins ntre 2-16 ani i grupa B, format din 13 nou-nscui cu apnee prematur, cu vrsta
ntre 2-10 sptmni. A fost msurat concentraia teofilinei pentru cei 40 de copii spitalizai i
tratai cu teofilin. Pentru grupul A, a fost utilizat o doz de 15 mgkg
-1
24h
-1
. Pentru grupul B,
doza administrat de aminofilin IV a fost de 5 mg/kg i doza de ntreinere de 3 mg/kg la fiecare 8
ore.
Rezultate:.
Metoda a fost validat n domeniul 0-40 g/ml. S-au analizat probe etalon, cte dou
extracii din fiecare prob, coninnd 5, 10, 20, 30, 40 g/ml teofilin i 10 g/ml standard intern.
Curba de regresie obinut a fost: y = 0,103x - 0,336 cu un coeficient de regresie de 0,998.
Matricea design a fost construit n primul rnd din fraciile molare ale spectrului de mas al
teofilinei naturale, al trasorului i al standardului intern iar cnd a fost nevoie prin construirea
sintetic prin computerizare a spectrului de mas. A fost necesar rezolvarea unui set de ecuaii
liniare simultane fiecare descriind contribuiile izotopice de forma:

=
=
j i x
j i x
X A I
,
(23)
19
unde I
x
reprezint abundena relativ a ionului x iar X
j
este abundena fracional necunoscut.
Abundena relativ a ionilor contributori (A
i
) s-a calculat pentru doi din cei mai inteni ioni,
formnd ecuaiile simultane n notaie matricial:
AX I = (24)
Soluia celor mai mici ptrate a lui X poate fi obinut utiliznd matricea pseudoinversat:
I A A A X
T T 1
) (

= (25)
unde A
T
este matricea transpus i X este estimat prin minimizarea sumei ptratelor.
Matricea abundenei izotopice este preferabil s se determine din spectre de mas msurate
experimental pentru probe de compui puri i standarde interne.

n tabelul 1. se d un exemplu de matrice construit n acest studiu metabolic experimental.
Calculul s-a fcut n programul Excel.

Tabel.1 Matricea construit (stnga) i matricea pseudoinversat (dreapta) folosite pentru
calcularea teofilinei
__________________________________ _________________________________________
teofilin [M] [M+1] teofilin [M] [M+1]
n.a. 0.95 0.05 n.a. 1.07 -0.07
15
N 0.27 0.73
15
N -0.40 1.40
____________________________ __________________________________


y = 1.1368x - 1.0426
R
2
= 0.997
0.00
5.00
10.00
15.00
20.00
25.00
30.00
35.00
0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00
Matrix calculation(g/ ml)


Fig. 1. Compararea celor dou metode (curba de regresie i matrice)

20
Rezultatele obinute pentru probele de saliv i plasm au dat o bun corelaie folosind cele
dou metode de calcul. Figura 1 reprezint comparaia celor dou metode de calcul. Coeficientul de
corelaie calculat a fost 0,9985.
Figura 2 prezint corelaia foarte bun ntre valorile de medicament obinute din plasm i
saliv pentru cele dou grupe de pacieni. Nivelele de medicament din plasm i saliv sunt
prezentate n tabelul 2.

Tabel 2. Valorile comparative ale nivelelor de medicament n plasm i saliv pentru cele dou
grupe de pacieni

Populaia domeniu, g/ ml media SD, g/ml
Nivele plasma
Grupa A
Grupa B

1.98 21.96
1.62 27.90

7.98 5.25
7.76 5.85
Nivele saliva
Grupa A
Grupa B

1.41 15.06
1.02 18.23

5.12 3.45
5.51 4.61
Raportul saliva/ plasma
Grupa A
Grupa B

0.47 0.71
0.43 0.88

0.60 0.09
0.69 0.13


Fig. 2 Corelaia ntre concentraia teofilinei n plasm i saliv n cele dou grupe: a) grupa A, b)
grupa B.



Concluzii
Metoda diluiei izotopice prin spectrometrie de mas (ID-MS) este simpl, precis i rapid.
Calcularea prin metoda curbei de regresie a dat rezultate similare cu metoda de calcul matricial. S-
a obinut o bun corelare ntre nivelele de medicament msurate n plasm i saliv.

y=0.68x+0.07; r=0.972
0
5
10
15
20
25
0 5 10 15 20 25 30
Plasma concentration , g mL
-1
b)
S
a
l
i
v
a

c
o
n
c
e
n
t
r
a
t
i
o
n
,

g

m
L
-
1
y=0.62x+0.12; r=0.955
0
5
10
15
20
0 5 10 15 20 25
Plasma concentration, g mL
-1
a)
S
a
l
i
v
a

c
o
n
c
e
n
t
r
a
t
i
o
n
,

g

m
L
-
1
21

4.2.2 Testul cafeinei metod de diagnosticare a disfuncie hepatice

Cafeina poate fi utilizat pentru msurarea capacitii metabolice a ficatului. S-a observat c
metabolismul cafeinei este sczut la pacienii cu diferite forme de boal de ficat n funcie de starea
bolii. Cafeina are avantajul de a fi bine tolerat cnd se administreaz oral, nivelele n saliv fiind n
concordan cu concentraiile serice, fcnd posibile teste neinvazive.
Reactivi: Ca standard intern s-a utilizat
15
N-teofilina, 74.2 atom %
15
N, sintetizat la
INCDTIM Cluj-Napoca. Puritatea standardului intern a fost verificat prin msurtori IR,
spectrometrie de mas i punct de topire. Cafeina s-a administrat oral la copiii cu diferite disfuncii
hepatice. S-a utilizat pentru injectare o soluie steril de cafein - benzoat de sodiu n ap coninnd
125 mg cafein i 125 mg benzoat de sodiu per fiol de 1 ml din farmacie. Toi ceilali reactivi au
fost de la Merck (Germania).
Aparatura: S-a utilizat un spectrometru de mas Hewlett Packard (Palo Alto, CA, USA) HP
5989B cuplat cu un cromatograf de gaze HP 5890 n condiiile:EI (impact electronic), energia
electronilor 70 eV, emisia electronilor 300A i temperatura sursei de ioni 200
o
C, modul de lucru
monitorizare de ion selectat (SIM). Msurarea prin GC-MS a utilizat o coloan capilar HP-5MS,
30m x 0.25 mm , 0.25m grosimea filmului, programat de la 200
o
C la 250
o
C cu o vitez de 10
o
C/min, debitul de 1ml/min, cu heliu 5.5 ca gaz purttor. Temperatura injectorului a fost de 200
o
C.
Timpul de reinere al cafeinei i al standardul intern-
15
N-teofilinei a fost 3.5 min, respectiv 2.8 min.
S-au injectat 3 l prob. Pentru analiza cantitativ n modul de lucru SIM, au fost msurai ionul
molecular al cafeinei m/z 194 i ionul molecular m/z 181 pentru standardul intern.
Procedura de extracie: S-a utilizat o procedur de extracie foarte simpl. 1 ml plasm
coninnd cafein s-a plasat ntr-o fiol cu capac cu filet de 5 ml i s-au adugat 10l standard
intern
15
N-teofilin, 2 ml solvent pentru extracie, cloroform: izopropanol 20:1 v/v i 0.5 g NaCl.
Dup amestecare mecanic timp de 1 min, proba s-a centrifugat 3 minute. Stratul organic (stratul
inferior) s-a transferat n alt fiol i s-a evaporat n flux de argon. Reziduul s-a dizolvat n 100 l
solvent i 3 l s-au injectat n GC. Sensibilitatea metodei fiind foarte bun, s-a putut lucra fr
concentrarea extractului.
Validarea metodei: Metoda a fost validat n domeniul 0-20g/ml cafein. Probe etalon
(aliquots) de ap distilat coninnd cantiti cunoscute de cafein 3, 5, 10, 15, 20 g/ml

i 10 g
15
N-teofilin s-au prelucrat dup procedura de mai sus. Fiecare prob s-a preparat n duplicat i s-a
msurat de dou ori. Dreapta de regresie, reprezentat ca raportul ariei picului . m/z 194 per m/z181
n funcie de concentraia cafeinei, a dat urmtorii parametri de liniaritate: panta 0,1208, ordonata la
origine 0.0926, i coeficientul de corelaie r = 0.98.
22

Tabel. 3. Precizia i acurateea metodei
Concentraia
adugat
(g ml
-1
)


n
Concentraia
msurat
(g ml
-1
))
DSR
(%)
Acurateea
(%)
3 5 3.1 2.96 3.36
5 7 5.5 5.06 10

Grupe de studiu: S-au studiat trei grupe diferite: grupa A, format din 19 copii cu hepatit
cu vrste cuprinse ntre 3-19 ani, grupa B, constnd din 5 copii cu ciroz, cu vrste ntre 5-12 ani, i
grupa C, 10 copii martori cu vrste ntre 5-15 ani. Doza medie a fost de 4 mg/kg, p.o., pentru toate
grupele. S-au recoltat probe de snge la 0, 30 min, 1, 3, 6, 9 i 12 h. Probele de snge au fost puse n
tuburi de plastic cu heparin i centrifugate imediat. Plasma s-a pstrat la -20
o
C. S-a obinut
acordul n scris de la prinii fiecrui subiect nainte de nceperea acestei cercetri.
Mod de calcul: Dreptele de regresie obinute prin metoda GC/MS n modul SIM au fost
utilizate pentru studiul parametrilor farmacocinetici studiai. Constanta de eliminare a cafeinei s-a
calculat dup cum urmeaz:
t C C k
el
A = / ) ln (ln
2 1
(26)
unde: C
1
- concentraia mare de cafein n snge,
C
2
- concentraia mic de cafein n snge
t - timpul dintre dou colectri de probe de snge.
Clearance-ul n dou puncte s-a calculat utiliznd o constant de volum de distribuie (V
d
)
de 0.6 litri per kg corp:
d el
V k Cl = (27)
i timpul de njumtire
el
k t / 2 ln
2 / 1
= (28)
Valorile calculate pentru clearance ca raport doz/arie de sub curb au fost comparabile cu cele n
dou puncte.
Rezultate:
Clearance-ul cafeinei, msurat la pacienii cu ciroz i hepatit cronic a fost redus iar
timpul de njumtire a fost mrit la copiii bolnavi fa de cei sntoi. Descreterea
metabolismului observat la pacienii cu diferite forme de boal hepatic s-a corelat cu starea bolii.
Valorile medii ale celor doi parametri farmacocinetici studiai, Cl i t
1/2
, pentru pacienii cu
boli hepatice i martori, arat diferene mari n special ntre martori i cazurile cu ciroz. Valorile
23
timpilor de via medie au sczut iar valorile clearence-lui (vitezei de eliminare) au crescut pentru
pacienii cu disfuncii hepatice comparativ cu martorii. Fig.3. prezint valorile mari ale
concentraiilor de cafein ale pacienilor comparativ cu valoarea medie a concentraiei cafeinei
pentru martori (n=10).
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Martor Ciroza Hepatita
cronica
c
a
f
e
i
n
a

(

g
/
m
l
)



C1(1h)
C2(9h)

Fig.3. Nivelul cafeinei dup o or i 9 ore de la administrare, comparativ cu proba martor

Control
0
2
4
6
8
10
0 2 4 6 8 10 12 14
Time after administration (h)
P
l
a
s
m
a

c
a
f
f
e
i
n
e

(

m
o
l
/
m
l
)

Fig. 4. Curba de eliminare a cafeinei la subiecii din grupul de control

Metoda prezentat este simpl, precis i rapid, util pentru analiza xantinelor. Utilizarea
standardului intern marcat izotopic evit suprapunerea cu diferii contaminani. Pentru acest
medicament, n domeniul de interes 0-20g ml
-1
, s-au obinut liniaritate, precizie, acuratee i limit
de detecie bune.
S-au observat schimbri semnificative (test T-Student, p<0.01) n metabolismul cafeinei la
copiii cu ciroz decompensat. Valorile pentru clearance 0.740.49 ml min
-1
kg
-1
i timp de
njumtire 14.7312.36 h sunt diferite fa de martor datorit reducerii masei de hepatocite
funcionale.
24
Pacienii cu boli hepatice necirotice (hepatite) au valori intermediare (Cl = 1.23 0.45 ml
min
-1
kg
-1
i t
1/2
= 6.32 2.17 h) dar valori mai mari ale concentraiilor cafeinei mai ales n primele
ore dup doz.
n literatura de specialitate, nivelele pentru martori ale clearance-lui i timpului de
njumtire au fost 1.30.4 ml min
-1
kg
-1
i t
1/2
=4.41.9 h iar datele noastre au dat 1.280.31 ml
min
-1
kg
-1
i t
1/2
=5.731.58 h (n=10).
Concentraiile plasmatice ale cafeinei s-au msurat la 18 pacieni cu hepatit cronic, la
cinci cu ciroz i la zece subieci sntoi dup administrarea cafeinei (4 mg/kg p. o.). Valorile
obinute penru clearance-ul cafeinei (viteza de eliminare din corp) msurat prin metoda n dou
puncte (timpi de prelevare 1h i 9 h) sau apte-puncte (timpi de prelevare 0, 0.5, 1, 3, 6, 9, 12 h) s-
au corelat foarte bine (r = 0.94, p<0.001), astfel c nu este nevoie s se preleveze snge dect la 1
or i la 9 ore dup administrarea dozei de cafein pentru testul cafeinei de diagnosticare a
disfunciei hepatice. Timpul de njumtire (t
1/2
) al cafeinei a fost semnificativ mai mare pentru
pacienii cu ciroz fa de celelalte grupuri de studiu iar clearance-ul a fost substanial redus la
aceti pacieni.
Concluzii:
Metoda elaborat este simpl, precis i rapid, util pentru analiza xantinelor. Utilizarea
standardului intern marcat izotopic evit suprapuneri cu contaminani. S-au obinut parametri de
validare buni n domeniul de interes.
S-au observat schimbri semnificative ale metabolismului cafeinei la copiii cu ciroz
decompensat (p<0.01). Valorile pentru clearance i timpi de njumtire sunt schimbate din cauza
masei de hepatocite funcionale. Pacienii cu boli hepatice necirotice au prezentat valori
intermediare, dar valori mai mari ale concentraiei cafeinei plasmatice.
Aceste rezultate sugereaz c parametrii farmacocinetici ai cafeinei pot fi determinai
utiliznd procedura de prelevare de probe n dou-puncte i determinarea GC-MS, dup o singur
doz. Testul clearance-lui cafeinei nu a putut distinge diferena ntre funcionarea ficatului la
subiecii martor i cei cu hepatit (p>0.05). Concentraia mare de cafein observat la prima or
dup doz la cazurile cu hepatit fa de martor poate fi utilizat ca un test rapid pentru hepatit
cnd utilizm metode foarte precise i exacte de analiz.

4.3. Diagnosticarea de boli metabolice nnscute prin GC-MS

4.3.3. Monitorizarea profilelor aminoacizilor pentru diagnosticarea fenilcetonuriei i a
bolii urinei cu miros de arar

25
Fenilcetonuria (PKU) este o boal ereditar cauzat de deficiena fenilalanin-hidroxilazei.
Catabolismul normal al fenilalaninei (Phe) la mamifere cere conversia ei iniial n tirosin (Tyr) n
ficat. Deficiena enzimei conduce la nivele specifice ale aminoacizilor din plasm cu creterea
anormal a Phe sau descreterea Tyr. Boala se manifest din primele sptmni de via. Deficitul
mintal devine evident dup patru ase luni. Testul cel mai vechi este reacia urinei cu perclorur de
fier, care d o culoare caracteristic de verde nchis. Ca tratament se recomand un regim srac n
fenilalanin. Fenilalanina plasmatic trebuie meninut sub 2 mg% .

Boala urinei cu miros de arar (Maple syrup urine disease - MSUD), apare prin reducerea
activitii alfa-cetoacid-decarboxilazei (se refer la izoleucin, leucin, valin). Este o boal de
metabolism cauzat de un defect de gen, n care corpul nu poate rupe anumii aminoacizi
ramificai. Boala conduce la formarea unor proteine n snge i se caracterizeaz prin simtome
cerebrale i eliminare de urin cu miros asemntor siropului de arar. Dac nu se pune
diagnosticul, copilul moare n cteva luni. Tratamentul const n administrarea unor regimuri care
s evite cei trei aminoacizi.
Scopul acestui studiu a fost dezvoltarea unei metode precise i rapide de analiz cantitativ
i screening prin SIM-GC/MS pentru diagnosticul de certitudine a fenilcetonuriei (PKU) i a
MSUD.

Parte experimental
Reactivi i probe
Au fost comparate dou metode diferite de extracie i derivatizare.
Subiecii de la care s-a facut recoltarea au avut vrsta cuprinsa ntre 3 i 10 ani. Recoltarea
sngelui s-a facut prin 2 metode. Prima a fost puncia venoas iar ce-a de-a doua, care a avut mai
mare pondere, a fost recoltarea de snge capilar, cu aplicarea picturii de snge rezultate pe hrtie
de filtru cu spoturi delimitate la 8 mm diametru, respectiv la o cantitate de 20 l de snge. Extacia
din spoturile de snge s-a fcut, dup decuparea acestora, n sticlue cu capac, iniial 1 or la 4
o
C,
apoi 1 min ntr-o baie cu microunde, cu metanol 0.1% HCl, rezultatele fiind identice. S-a adugat
standard intern
15
N-Ile (25g/ml sau 0.5g/spot de snge) pentru metoda diluiei izotopice.
Metoda 1. Aminoacizii s-au purificat pe o rain schimbatoare de ioni Dowex 50W-X8, pe o
coloan de 2x40mm i au fost eluai cu 4M NH
4
OH. S-a aplicat o procedur de derivatizare n dou
etape: esterificare cu butanol- clorura de acetil (4:1 v/v) timp de 1 h la 110
o
C pentru esterificarea
grupri carboxil, i trifloracetilare cu 200 l anhidrid trifloracetic la 60
o
C pentru 30 min, pentru
acetilarea gruprii amino.
26
Metoda 2. Sngele a fost plasat ntr-un flacon cu capac cu filet cu 200 l metanol/HCl 0.1%
i extractia a fost obtinut fie la 1h la 4
o
C sau prin sonicare 1 min. 100 l de extract au fost plasai
n alt flacon i derivatizai dup adugarea standardului intern. Aminoacizii din probele de snge
sau din probele etaloane au fost derivatizate ca esteri butil trifloracetici. Derivatizarea a fost fcut
n dou etape, n flacoane cu capac cu filet. Probele uscate au fost esterificate cu 100l ml butanol:
clorur de acetil, 4:1, (v/v) pentru 30 min la 100 C. Excesul de reactiv a fost ndeprtat n flux de
azot. Gruparea amino a aminoacizilor a fost trifloracetilat cu 100 l anhidrid trifloracetic
(TFAA) la 60 C timp de 30 min. Dup rcire, excesul de reactiv a fost ndepartat cu azot la
temperatura gheii i s-a adugat acetat de etil.
Ca biomarkeri s-au folosit aminoacizii din tabelul urmtor:

Tabel.4. Aminoacizii utilizai ca biomarkeri
Aminoacid Simbol Ioni (SIM)
Valina Val m/z 168
Leucina Leu m/z 182
15
N-Glicina
15
N-Gly

m/z 155
15
N-Isoleucina
15
N-Ile m/z 183
Prolina Pro m/z 166
Phenilalanina Phe m/z 91,148
Tirozina Tyr
m/z 203, 260,316,
m/z 107,164,220





27
RT: 0.00 - 14.03
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Time (min)
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
R
e
l
a
t
i
v
e

A
b
u
n
d
a
n
c
e
Chloroacetyl-Tyr
Tyr
Phe
Pro
Leu
Val
Gly-15N
8.41
9.72
11.28
7.03
10.20
7.51
10.78
6.43
4.92
3.06 3.84 13.65 11.45 13.42 9.49 8.25 4.97
NL:
2.46E7
TIC F: MS
10aa1

Fig.5. Cromatograma separrii prin SIM-GC-MS a aminoacizilor de interes pentru diagnosticarea
PKU i MSUD

n modul de lucru SIM au fost utilizai ionii cei mai importani din spectrele de mas ale
aminoacizilor derivatizati ca trifloracetil butil esteri: m/z 168 pentru Val, m/z 182 pentru Leu, m/z
166 pentru Pro, m/z 91, 148 pentru Phe, m/z 203,260,316 pentru Tyr complet derivatizat (Tyr-
ditrifroacetl butil ester) i m/z 107, 164, 220 pentru Tyr-monotrifroacetl butil ester.
Rezultate:
Analiza cantitativ a celor cinci aminoacizi (valina, leucina, prolina, fenilalanina, tirosina) n
probe de snge prin dou metode diferite de extracie, derivatizare i analiz, au dat rezultate
asemntoare. Coeficientul de regresie pentru compararea valorilor aminoacizilor prin cele dou
metode de extracie a dat r = 0.91 (n = 4).
Metodele au fost validate utiliznd 15 aminoacizi etalon, respectiv 5 aminoacizi. Etaloanele
au urmat aceeai procedur de extracie, derivatizare i analiz (n = 3) ca i probele. Precizia a dat
valoare mai mic dect 19.81% pentru deviaia standard relativ (R.S.D.), cu excepia aminoacizilor
Arg, Cys i Met i valoarea sensibilitii sub 10 ng pentru aminoacid injectat. Dreptele de regresie s-
au obinut injectnd soluii etalon coninnd aminoacizi n concentraii de 5, 10, 15, 20 i 40 g/ml
cu 20 g/ml
15
N-Gly adugat la fiecare soluie etalon (metoda 1).
Prin a doua metod, liniaritatea s-a calculat reprezentnd raportul ariei picului selectat
pentru aminoacid per standard intern n funcie de concentraia aminoacidului etalon (n g/ml).
Dreptele de regresie s-au obinut injectnd soluii etalon coninnd aminoacizi cu concentraiile 1, 5,
28
10, 20, 30 i 40 g/ml cu 25 g/ml
15
N-Ile adugat la fiecare soluie etalon, respectiv, per ml prob
de snge.

Tabel.5. Valorile RSD (%) pentru precizie i acuratee (metoda 2)
Amino acid
(n=4)
Precizie
RSD(%)
30 g/ml
Precizie
RSD(%)
40 g/ml
Acc. RSD(%)
30 g/ml
Acc. RSD(%)
40 g/ml
Val 9.02 12.82 3.75 0.65
Leu 12.90 6.73 0.15 1.66
Pro 11.73 8.68 13.33 2.11
Phe 9.70 18.60 24.67 1.76
Tyr 7.92 8.22 30.44 5.54

S-a obinut o bun precizie pentru acelai copil (R.S.D. mai mic dect 10.4 %). Rezultatele
obinute din numai 20 l spot de snge au artat c diagnosticarea PKU ar putea fi testat calculnd
raportul Phe/Tyr. Diagnosticarea bolii MSUD se va obine calculnd raportul dintre aminoacizii
alifatici i aromatici n probe de snge. Rezultatele unor pacieni PKU prin metoda 2, sunt
prezentate n Tabelul 4.13.
Valorile raportului Phe/Tyr obinute pentru martori i pacieni ciagnosticai cu PKU n unele
din cazurile studiate sunt prezentate n Fig.6.

0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
0 10 20 30 40
samples
P
h
e
/
T
y
r


Fig.6. Valorile raportului Phe/Tyr pentru spoturi de snge pentru PKU (o) i
martori () prin SIM/GC/MS.

Concluzii:
GC/MS este o metod sensibil si rapid pentru determinarea cantitativ a aminoacizilor din
probe de plasm sanguin.
29
Metoda folosit este util pentru diagnosticarea bolilor de eroare de metabolism prin
determinarea cantitativ a unor aminoacizi.
Se impune monitorizarea tuturor nou-nscuilor prin aceast metod.
Diagnosticarea i tratarea bolii urinei cu miros de arar i a fenilcetonuriei n primele 3
luni de via este vital.
Msurtorile efectuate pe aminoacizi din plasm au artat c GC-MS este o metod potrivit
pentru diagnosticarea PKU n probe de snge la nou nscui, fie prin screening fie prin analiza
cantitativ a unor aminoacizi (din raportul Phe/Tyr).
Metoda este o metod minim invaziv prin utilizare de cantiti foarte mici de snge.
Raportul dintre concentraiile aminoacizilor alifatici i cei aromatici poate indica alte
dezordini ale metabolismului cum ar fi MSUD.


5. CONCLUZII

Concluziile cele mai importante care reies din rezultatele experimentale obinute sunt enumerate
dup cum urmeaz:

1. Cuplajul GC-MS ntrunete calitile deosebite ale celor dou aparate, separare ideal prin gaz-
cromatograf i identificare ideal prin spectrometru de mas.

2. Selectivitatea i specificitatea foarte bun a spectrometrului de mas dau precizie i siguran
foarte ridicat analizelor. Prin identificarea de mare precizie a componenilor la timpul de eluie
cromatografic al analitului (analiilor), prin testarea permanent n timpul analizei a identitii
componenilor, metoda spectrometriei de mas este unic, extrem de preioas i de nenlocuit.

3. Este necesar controlul continuu i obiectiv al rezultatelor analitice prin validarea metodelor de
analiz cantitativ att pentru a demonstra c metoda este corect i corespunde scopului propus
ct i pentru a verifica dac analistul a lucrat corect.

4. S-a stabilit o metod de analiz cantitativ utiliznd diluia izotopic-spectrometria de mas
pentru analiza teofilinei. Pentru a corela nivelele de medicament n plasm i saliv au fost
comparate dou metode de calcul: matricial i cu ajutorul dreptei de regresie. Ca standard intern
a fost utilizat teofilina marcat cu
15
N, sintetizat la INCDTIM Cluj-Napoca. Metoda a fost
30
validat n domeniul 0-40 g/ml. S-a obinut o liniaritate bun, r=0,99, precizia, acurateea i
reproductibilitatea au dat coeficieni de variaie foarte buni.
-Rezultatele pentru probele de saliv i plasm au dat o bun corelaie ntre cele dou metode de
calcul, r=0,997. S-a obinut o bun corelare i ntre nivele de medicament msurate n plasm i
saliv cu r=0,955 respectiv r=0,972 pentru cele dou grupe de studiu alese.
-Metoda este util i n cazul unor testri de medicamente noi cu coninut de teofilin cu aciune
retardat, mult studiate pe plan mondial, avnd efecte benefice n caz de criz.
-De asemenea, metoda este util n studii farmacocinetice i poate fi utilizat ca metod de
control a unor metode de rutin, fiind o metod de precizie foarte ridicat.

5. S-a stabilit o metod rapid i precis prin CG-MS pentru stabilirea nivelului i a parametrilor
farmacocinetici ai cafeinei n snge la copiii suferinzi de boli hepatice. Metoda a fost testat pe
un spectrometru de mas Hewlett Packard HP 5989B cuplat cu un cromatograf de gaze HP
5890. S-a utilizat o coloan capilar HP-5MS, 30m x 0,25 mm, 0,25 m grosimea filmului,
programat de la 200 C la 250 C cu o vitez de 10 C/min, cu heliu 5,5 ca gaz purttor avnd
debitulde 1ml/min.
-Ca standard intern s-a folosit
15
N teofilin sintetizat la INCTIM Cluj-Napoca.
Metoda a fost validat n domeniul 0-20 g/ml cafein. S-au preparat probe etalon de ap
distilat coninnd cantiti cunoscute de cafein 3, 5, 10, 15, 20 g/ml i 10 g
15
N-teofilin.
Dreapta de regresie obinut a dat coeficientul de corelaie r=0,98.
-Acurateea a prezentat valori de deviaie standard relative mai mici de 10%. Limita de detecie
a fost de 0,1 g/ml cafein n probele de snge, la un raport semnal/zgomot de 4:1.
-Concentraiile plasmatice ale cafeinei s-au msurat la 19 pacieni cu hepatit cronic, la 5 cu
ciroz i la 10 subieci sntoi dup administrarea cafeinei (4 mg/kg p. o.). Valorile obinute
pentru clearance-ul cafeinei msurat prin metoda n dou puncte ( 1h i 9 h) sau apte-puncte (
0, 1/2, 1, 3, 6, 9, 12 h) s-au corelat foarte bine (r = 0.94, p<0.001), fapt de demonstreaz c
pentru simplificarea metodei este suficient prelevarea n dou puncte pentru testul cafeinei de
diagnosticare a disfunciei hepatice. Timpul de njumtire (t
1/2
) al cafeinei a fost semnificativ
mai mare, iar clearance-ul a fost substanial redus pentru pacienii cu ciroz fa de celelalte
grupuri de studiu. Testul cafeinei nu a putut distinge diferene ntre funcionarea ficatului la
subiecii martor i cei cu hepatit (p>0,05). S-au observat schimbri semnificative ale
metabolismului cafeinei la copiii cu ciroz decompensat (p<0.01). Valorile pentru clearence i
timpi de njumtire sunt schimbate din cauza masei de hepatocite funcionale.

31
6. S-a elaborat metoda de analiz a aminoacizilor minim invaziv din cantitate minim de snge
(20 l), monitorizarea de copii martori i pacieni diagnosticai cu fenilcetonurie, teste prin
metode spectroscopice comparative pentru diagnosticare. S-au colectat spoturi (n=6) de snge a
20 l de la un numr de 63 copii, 53 probe martor i 10 probe de la pacieni suspeci de
fenilcetonurie (PKU). S-a elaborat metoda de analiz minim invaziv, utiliznd spoturi de snge
din deget, pe hrtie special. S-a utilizat ca standard intern pentru diluia izotopic glicina
marcat cu
15
N i izoleucina marcat cu
15
N. Metoda de analiz minim invaziv s-a aplicat la un
numr mare de cazuri (n=53) obinndu-se raport pentru fenilalanin fa de tirosin de 0,70
(n=53) fa de media valorilor pentru bolnavi PKU de 12,26 (n=10). Rezultatele obinute prin
SIM GC/MS pentru probele pacienilor bolnavi au dat valori pozitive i prin metoda clasic
(BIA). Comparaia amprental a evideniat valori crescute ale fenilalaninei n cazurile
pacienilor PKU prin RMN. Metoda poate fi utilizat pentru monitorizarea nou nscuilor n
scopul diagnosticrii a dou boli de eroare de metabolism, fenilcetonuria (PKU) i boala urinei
cu miros de arar (MSUD).
-n etapa a doua a studiului s-a urmrit compararea metodei minim invazive (spoturi de snge de
20 l) cu metoda GC-MS prin diluie izotopic utiliznd cantiti mai mari de snge (1 ml) n
urma efecturii recoltrii prin venepuncie la martorii cu vrsta cuprins ntre 3 i 10 ani.
Compararea valorilor aminoacizilor determinai prin cele dou metode de analiz au dat valori
apropiate, obinndu-se un coeficient de regresie de r=0,91.
-Liniaritatea s-a calculat prin reprezentarea raportului concentraiei fiecrui aminoacid fa de
standardul intern. S-au obinut coeficieni de regesie buni pentru cei doi aminoacizi marcai
(
15
N-Gly i
15
N-Ile ) folosii ca standard intern.

7. Tehnicile ID-MS i ID-GC/MS, utiliznd compui marcai cu izotopi stabili, sunt tehnici fizice
performante de analiz cantitativ la nivel de urme de mare precizie, cu numeroase posibiliti
aplicative interdisciplinare. Folosirea compuilor marcai cu izotopi stabili face posibil evitarea
contaminanilor prezeni n probe.

Bibliografie:

1. Monica Culea, Cornelia Mesaro, Andreea Iordache, DIAGNOSIS OF CIRRHOSIS BY
GC/MS, "Chemick listy" Journal, 2008,102, s961-962
2. Monica Culea, Andreea Iordache, Cornelia Mesaro, AMINOACID PROFILES
MONITORING FOR DIAGNOSIS, "Chemick listy" Journal, 2008, 102, s936-938.
32
3. Cornelia Mesaro, Monica Culea, Andreea Iordache

, I. Visovan, Onuc Cozar, Constantin
Cosma, A new caffeine test for diagnosis of cirrhosis by Gas Chromatography coupled to Mass
Spectrometry, Asian J Chem, vol. 22, issue 5, art.no.40, p. 3608-3614, 2010
4. Andreea Iordache, Elena Horj, A.R. Toma, Cornelia Mesaro, Simona Morar, O. Cozar,
Monica Culea: Amino Acids Profiles in Biological Media, AIP Conference Proceedings,
vol.1262, 192-197, 2010
5. Cornelia Mesaro, Andreea Iordache, O. Cozar, C. Cosma, Monica Culea, Diagnosis by mass
spectrometry, Rom. J. Biophys. 2010 20(1): 71-82
6. Andreea Iordache, Elena Horj, A.R. Toma, Cornelia Mesaro, S. Morar, Monica Culea: Fatty
acids profile in fich plasma, Analele Universitii de Vest Timioara, Seria Fizica, 2010,
(Accepted)
7. Cornelia Mesaro, Andreea Iordache, Monica Culea, Cora Crciun, Onuc Cozar, Radu
Fechete, Eugen Culea, Sea Bucktorn Oil Study by GC/MS and IR, Studia Univ. Babes- Bolyai,
Fizica, vol.1, 2009, pg. 26-32
8. Andrea Iordache, Cornelia Mesaros, Onuc Cozar, Monica Culea: Determination of
Theophylline in Biological Fluids by Isotopic Dilution Mass Spectrometry, Studia Univ. Babes-
Bolyai, Fizica, nr. 2, 2009, pg. 101-108
9. Cornelia Mesaro, Monica Culea, Andreea Iordache, O. Cozar, C. Cosma, GC-MS analysis of
flavonoids in Orthosiphon stamineus Benth, Bulletin USAVM, nr. 66, (1), 2009, 547-548,
Agriculture, Print ISSN 1843-5246; Electronic ISSN 1843-5386).
10. Cornelia Mesaro, Monica Culea, Andreea Iordache, Onuc Cozar,

GC-MS characterization of
the compounds in some essential oils, Bulletin USAVM, nr. 66 (1),2009, 111-117, Agriculture,
Print ISSN 1843-5246; Electronic ISSN 1843-5386)
11. Andrea Iordache, Cornelia Mesaro, Monica Culea, O. Cozar, Statistics for cirrhosis diagnosis
by GC/MS, Studia Univ. Babes-Bolyai, Fizica, vol.2, 2008, p.58-65
12.
Monica Culea, E. Culea, Cornelia Mesaro, Biomarkers; a valuable tool in diagnosis,
Rev.
Medico-Chirurgicala a societatii de medici si naturalisti din Iasi, vol III, 2, p.71-74, 2007
13. Monica Culea, Cornelia Mesaro, Use of biomarkers in diagnosis by isotopic dilution GC/MS
and gaschromathography-mass spectrometry, Analele Universitatii de Vest din Timisoara, seria
Fizica, 2006, vol.48, p.135-141
14. Anca Sin, A. Habor, M. Tilinca, S. Bancu, Bernadete Kantelip, Cornelia Mesaro, Evaluarea
Cantitativ prin Microscopie Electronic i Morfometrie a Fibrozei Perisinusoidale, Revista
Romn de Hepatologie, Vol. 2, nr.1, 2002, p.25-28.