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La raction antigne - anticorps et ses applications

1. Gnralits
1.1. Les antignes - antigne = toute substance capable de se lier spcifiquement un anticorps ou TCR. - immunogne = substance qui provoque une rponse immunitaire spcifique quand elle est introduite dans un organisme - tous les immunognes sont des antignes mais pas l'inverse (ex : haptnes) - pour rendre un haptne immunogne, il faut le fixer sur une protine porteuse. - pitope = structure reconnue, qui se lie au paratope de l'anticorps. Une protine peut contenir plusieurs dizaines d'pitopes identiques, ou le plus souvent diffrents. Les pitopes peuvent tre squentiels (ils possdent des AA qui se suivent la structure primaire), ou conformationnel (les AA ne se suivent pas dans la structure primaire mais sont proches dans l'espace). 1.2. Les anticorps isotypes = dfinissent les classes et sous classes : - IgG (1, II, III, IV) - Ig A (I, II) - Ig M, Ig D, Ig E - Ig kappa, Ig lamda structure : diffrents domaines d'environ 110 AA. Les 2 chanes L et H sont identiques 2 2. domaines constants : proprits effectrices de l'anticorps : - fixation du complment (IgG et Ig M) - cytophilie : un rcepteur pour le fragment perc les IgG sur les cellules - passage transplacentaire (IgG : immunisation passive du nouveau-n) paratope = structure qui se lie l'pitope de l'antigne srum polyclonal (= srum et humain =immum serum = anticorps polyclonal) : - c'est un srum qui contient un mlange d'anticorps provenant de LB diffrents. - obtention : en injecte un antigne avec 3 pitopes un lapin ; il produit 3 LB diffrents reconnaissant les 3 pitopes ; diffrenciation en 3 plasmocytes diffrents et donc scrtion de 3 anticorps. Ces anticorps reconnaissent le mme antigne mais avec des spcificits, des affinits diffrentes selon les pitopes ; ils peuvent aussi avoir des isotypes diffrents. anticorps monoclonal : c'est un anticorps provenant d'un seule clone de LB stimul - obtention : technique in-vitro d'hybridation lymphocytaire : immunisation d'une souris avec un antigne donc production de LB qui se diffrencient en plasmocytes. On rcupre la rate de cette souris. On immortalise les cellules par fusion avec des cellules mylomateuses (cellule tumorale provenant de la moelle osseuse) = hybridomes. On spare ces cellules. L'anticorps monoclonal produit est homogne : il est de mme isotype, mme allotype, mme idiotype (spcificit).

2. aspect thorique de la raction antigne - anticorps


2.1. Caractristiques de la liaison antigne - anticorps - association de 2 molcules entre le paratope et l'pitope. Cette association ncessite une bonne complmentarit strique entre les 2 sites ractifs. - c'est une raction exothermique, spcifique et rversible. - la loi d'action de masse dtermine la constance d'quilibre K = affinit intrinsque. 2.2. Nature des liaisons

faible nergie dpendent de la complmentarit entre le paratope et l'pitope non covalentes

forces de van der Walls : - les plus faibles - dues au mouvement des lectron dans la molcule : formation de diples SS forces lectrostatiques = liaisons ioniques : - entre 2 groupements ioniques - 2 5 kcal/mol liaison hydrogne : - entre atomes lectropositifs et lectrongatifs - faibles liaisons hydrophobes : - entre groupements polaires ou hydrophobes - faibles il y a donc des forces d'attraction et de rpulsion entre le paratope et l'pitope. L'nergie de liaison est leve entre le paratope et l'pitope car toutes ces liaisons sont de faible nergie mais sont trs nombreuses. l'nergie dpend de la complmentarit entre les 2 sites. quand on mesure l'affinit d'un anticorps pour son antigne, on mesure la somme des forces attractives et rpulsives.

2.3. Mesure de l'affinit intrinsque d'un anticorps technique de dialyse l'quilibre : - la diffrence de niveau l'quilibre correspond la quantit d'haptne lie l'anticorps partir des donnes exprimentales on fait la reprsentation de Scatchard qui donne l'affinit de l'anticorps ainsi que sa valence (nombre de paratopes par molcule) - lorsque la moiti des sites d'anticorps sont lis l'haptne : K = affinit = 1/[Ag]. - + la valeur de K est grande, plus l'anticorps est afin et plus il dtecte de faibles concentrations d'haptne. 2.4. Avidit K = mesure thorique de l'affinit intrinsque d'un paratope pour l'pitope. dans la ralit l'anticorps est au moins bivalent et les antignes sont multivalents l'interaction de l'anticorps avec l'antigne au niveau d'un seul site augmente la probabilit de rencontre au niveau du 2me site l'intensit des interactions = avidit = affinit fonctionnelle. la somme thorique entre les affinits intrinsques de chaque site est trs infrieure l'affinit relle. la multivalence augmente d'un facteur 10 puissance 3 pour 1 IgG et de 10 puissance 7 pour Ig M l'nergie de liaison pour un mme pitope. Pour une affinit intrinsque gale( 10 puissance 4) l'Ig M est + avide que l'IgG. l'avidit conditionne la rapidit de formation d'un complexe antigne - anticorps. Elle dpend de l'affinit intrinsque, de la valence de l'anticorps et de l'antigne, de conditions physicochimiques : temprature, pH, force ionique. au cours d'immunisations rptes, l'affinit et l'avidit des anticorps augmentecar il y a une slection des anticorps ayant des paratopes de plus en plus complmentaires des pitopes.

2.5. Spcificit et ractions croises Cf. poly - les ractions croises s'observent si 2 antignes diffrents ont des pitopes communs, ou si l'un des anticorps du srum immun se lie un pitope ayant une structure chimique proche de l'pitope original 2.6. Applications des ractions antigne - anticorps 2.6.1. Diagnostic des maladies infectieuses (bactries, virus, parasites, champignons) - diagnostic indirect = recherche d'anticorps spcifiques dans un srum - diagnostic direct = recherche de l'agent infectieux dans diffrents liquides biologiques ou sur des biopsies. 2.6.2. Diagnostic de pathologies affectant le systme immunitaire = dficit immunitaire, maladie auto-immunes (ex : polyarthrite rhumatode), hypersensibilit (= allergie), syndromes prolifratifs (ex : lymphomes) 2.6.3. Dosage quantitatif de molcules Hormones, vitamines, protines inflammatoires, mdicaments etc. que

3. Les ractions de prcipitation


3.1. Gnralits - c'est une raction qui apparat dans un milieu liquide ou glifi entre un antigne soluble et 1 anticorps prcipitant (Ig M, IgG). - le prcipit est d la formation d'un rseau macromolculaire tridimensionnel - l'anticorps doit tre au moins bivalent (2 paratopes) : Fab ne donne pas de prcipit ; seuls les srums polyclonaux donnent des ractions de prcipitation. - l'antigne doit tre au moins bivalent (2 pitopes) : un haptne ne donne pas de ractions (un seul pitope) ; mais si l'haptne est coupl une protine porteuse, a marche. 3.2. Prcipitation en milieu liquide : mthode de Heidelberger et Kendall (1929) Cf. poly - C'est la premire technique ayant permis de quantifier une rponse en anticorps - partir de ces donnes exprimentales, on a dtermin une courbe de prcipitation. Il en existe 2 types : courbe de type lapin : 3 zones : zone 1 : excs d'anticorps. Les complexes immuns sont de petite taille. Il existe des anticorps libre dans le surnageant. zone 2 : zone d'quivalence. Tous les anticorps spcifiques sont complexs l'antigne. Il n'existe pas d'anticorps libres ou d'antignes libres dans le surnageant. Zone 3 : zone d'excs d'antigne. La taille des complexes immuns diminue et le prcipit se redissout. Il existe des antignes libres dans le surnageant. courbe de type cheval : 3 zones + une przone = prozone. La prozone : dans les premiers tubes pas de prcipit, car les anticorps ne sont pas prcipitants. Cette prozone st due des anticorps trs affins qui ne prcipitent pas. Il se forme des complexes immuns solubles. NB : la prozone est observable pour toutes les ractions antigne-anticorps. Il faut donc faire attention pour viter les faux ngatifs.

3.3. -

immunonphlmtrie et immunoturbidimtrie c'est une technique quantitative de dosage d'un Ag ou d'un Ac un des ractifs est concentration constante : antigne constant pour un dosage d'anticorps et inversement. on obtient la concentration de la molcule doser partir d'une gamme d'talonnage technique utilisable pour des molcules des concentrations du mg/l.

Si la concentration d'anticorps correspond celle d'antigne : apparition d'un trouble : - turbidimtrie : mesure du rayonnement absorb - nphlmtrie : mesure du rayonnement diffus (plus sensible). 3.4. Immuno-lectrophorse. - technique qualitative en 2 temps. - exemple : immuno-lectrophorse de protines sriques 1er temps : sparation des protines sous l'action du champ lectrique. Les protines sont spares selon leur charge et et leur PM 2me temps : rvlation des protines spares par immuno-diffusion avec un srum animal immunis polyspcifique ou monospcifique. Cf. schma poly. NB : application pour la recherche d'un dficit en anticorps.

4. Les ractions d'agglutination


Aspects thoriques interaction entre un anticorps agglutinant spcifique (IgM, IgG) et un antigne particulaire. on obtient des agglutinats visibles l'oeil nu. ex : hmaties en milieu isotonique et neutre. La particule = globule rouge , charg moins. Le potentiel zta = la diffrence de potentiel entre la particule et le milieu. Ce potentiel = - 16 mV. Il permet aux hmaties de rester en suspension. S'il est modifi (< 7 mV) les hmaties s'agglutinent. Les anticorps spcifiques de l'antigne particulaire modifient l'tat lectrique de cette particule, le potentiel zta augmente : agglutination. l'antigne et particulaire et multivalence l'anticorps est au moins bivalent (les IgM sont plus agglutinant que les IgG) agglutination active : l'antigne pour lequel on recherche les anticorps est dj particulaire agglutination passive : l'antigne est solubles. on le fixe artificiellement sur une particule. agglutination directe si l'anticorps est directement agglutinant (IgM ) agglutination indirecte si l'anticorps n'est pas agglutinant (certaines IgG ) . On utilise alors un 2me ractif = anticorps anti globulines qui provoque l'agglutination. 4.1. -

4.2. Exemple d'une agglutination directe et active : les groupes sanguins Cf. poly preuve de Beth-Vincent Recherche des Ag ports par les hmaties. 4.3. Exemple d'une agglutination indirecte Recherche d'Ac non agglutinants (Ac anti Rh) = test de Coombs indirect. Cf. poly Raction en 2 temps : - Ractif = GR Rh+, en prsence de srum (si Ac anti Rh : fixation) - ajout d'une antiglobuline (anti IgG humaine) : si srum + : agglutination.

4.4. Exemple d'une agglutination passive Recherche d'Ac agglutinants anti-toxoplasme dans un srum de malade 2 temps : - Ag soluble (toxoplasme) : fixation sur billes de latex ( = "sensibilisation des billes de latex") - Ag particulaire + srum anti Toxoplasme : agglutinantion NB : les ractions d'agglutination sont plus sensibles que les ractions de prcipitation.

5. Ractions utilisant des ractifs radiomarqus


cela permet d'augmenter la sensibilit du dosage (ng/l) les molcules sont marques par le tritium ou par 125I

5.1. Dosage de radio immunologique en phase solide = en phase htrogne. - dosage d'un antigne soluble par une technique de comptition - la ractions antigne-anticorps tant rversible, un antigne marqu combin son anticorps spcifique peut tre dplac de l'anticorps par un excs d'antigne libre non marqu. Cf. poly 5.2. Cf. poly Dosage radioimmunomtrique l'antigne soluble doit possder 2 pitopes suffisamment loigns sur la molcule ex : dosage de l'hormone de croissance dans srum plusieurs temps

6. Ractions utilisant des ractifs marques par une enzyme


ELISA EIA - on fixe sur l'anticorps 1 enzyme = anticorps marqu ou conjugu (l'enzyme est fixe au niveau du Fc) : proxydase, phosphatase alcaline. - l'anticorps marqu est dtect par addition du substrat de l'enzyme. On obtient un produit color et on mesure la coloration. - applications trs nombreuses : dosage qualitatif ou quantitatif d'un antigne ou d'un anticorps spcifique en solution.

6.1. ELISA indirect Recherche ou dosage d'un anticorps spcifique Cf. poly + TP 6.2. ELISA sandwich Recherche ou dosage de l'antigne en solution Cf. poly Ex : dosage de l'EPO

6.3. Cf. poly -

Technique immunohistochimique ou immunocytochimique recherche d'un particulaire coupes de tissus ou de cellules fixes sur une lame ex : mise en vidence d'antignes viraux au niveau de coupes tissulaires

6.4. Le systme de biotine - avidine - systme qui permet d'amplifier le signal enzymatique : augmentation du seuil de dtection d'un antigne ou d'un anticorps - biotine : vitamine H = petite molcule - avidine : glycoprotine extraite du blanc d'oeuf - la biotine a une affinit leve pour l'avidine. - -. l'avidine possde 4 sites de fixation pour la biotine (interaction non covalente) - on utilise des anticorps spcifiques marqus la biotine (Ac biotinyls). Les anticorps sont des Ac anti isotypes - on fixe sur l'avidine plusieurs enzymes ou plusieurs fluorochromes. 6.5. Technique d'immunotransfert = immunoempreinte. = Western Blot - cet veil unique permettait la mise en vidence dans un srum, de plusieurs anticorps spcifiques et diffrents vhicules vis--vis des diffrentes protines d'un mme antigne. - technique qualitative - plusieurs tapes : Cf. poly Ex : recherche d'Ac anti VIH dans un srum. Test de confirmation d'une infection au VIH.

7. Ractions utilisant des ractifs marqus par des fluorochromes


7.1. Les fluorochromes. - molcules qui absorbent de l'nergie une longueur d'onde lamda 1 et qui la rmettent lamda 2 > lamda 1. - exemples : isothiocyanate de fluorescine (FITC) : fluo verte rhodamine : fluo orange phycorythrine (PE) : fluo rouge - les molcules utilises pour marquer des anticorps sont fixes par des liaisons covalentes 7.2. Immunofluorescence directe mise en vidence d'un antigne port par une particule coupe de tissu, frottis ou cellules en suspension on utilise un Ac spcifique fluorescent Cf. schma poly

7.3. Immunofluorescence indirecte - mise en vidence soit d'un antigne port par une particule, soit d'un anticorps spcifique dans un srum - dans cette technique le premier Ac spcifique de l'Ag n'est pas fluorescent. On utilise un 2me Ac antiisotype marqu par le fluorochrome. - Cf. schma poly

7.4. 7.5. -

Double immunofluorescence mise en vidence de 2 Ag diffrents ports par une mme cellule ou de cellules diffrentes utilisation de 2 Ac spcifiques de chaque Ag et marqus par des fluorochromes diffrents ex : dnombrement des LT de LB au niveau du sang priphrique Cf. poly. Analyse de la fluorescence utilise un microscope optique quip d'un systme UV cytomtre de flux FACS = Fluorescence Activated Cell Sorter (pour trier des cellules et les sparer)

8. Ractions utilisant le complment (C ')


C ' = 30 40 protines sriques activation du C ' par 2 voies principales : voie classique : spcifique. Ncessite la formation d'un complexe immun antigne-anticorps. voit alterne : non spcifique. Active par la paroi des micro-organismes. protines du C ' thermolabiles : inactives par chauffage 56 pendant 30 minutes C ' non spcifique d'espce dans les ractions antigne-anticorps utilisant le complment, en utilise la voie classique d'activation. Ac utiliss fixent le complment = IgM et IgG. dans ces ractions, le complment est utilis comme ractif que.

8.1. Raction de cytolyse mdie par le complment Ex : typage HLA (molcules de classe I ou II) Cf. poly 8.2. Rdaction de fixation du C ' Ex : recherche d'anticorps antigrippaux (IgM, IgG) Cf. poly.