L. P.2 Reacii de precipitare. Clasificare. Reacii de precipitare n mediu lichid. Reacii de precipitare n mediu solid. Difuzia simpla Mancini.

Difuzia dubla Ouchterlony. Difuzia dubl Elek. Reacii de precipitare combinate cu migrarea n cmp electric: Imunoelectroforeza. Contraimunelectroforeza Reactia Ag-Ac de precipitare consta in unirea Ag solubile cu Ac specifici, rezultind complexe Ag-Ac, care nu devin insolubile si stabile decit in cazul formarii unei retele tridimensionale, conform teoriei retelei care presupune: un Ag cel putin trivalent pentru amplasarea Ac, un Ac bivalent si conditii fizice favorabile precipitarii. Reactia de precipitare este sensibila si specifica in evidentierea prezentei Ag (pentru realizarea retelei Ag-Ac este necesar ca in reactie sa intre o anumita cantitate de Ag si Ac, care sa se gaseasca intr-un anumit raport/proportie, iar Ag care participa la formarea agregatelor sunt intr-o cantitate proportional mai mica, in raport cu Ac). Clasificarea reaciilor de precipitare Reactia Ag-Ac de precipitare poate avea loc in mediu lichid sau solid. Reactii de precipitare in mediu lichid: reactii de precipitare in amestec, reactii de floculare: - titrarea toxinei difterice (metoda Ramon), determinarea titrului Ac antitoxici (metoda Dean si Web) - VDRL (Veneral Disease Research Laboratory), RPR (Rapid Plasma Reagin), utilizate in diagnosticul serologic al sifilisului reactii de precipitare in inel - reactia Ascoli, determinarea grupului streptococic reactii de precipitare in tub capilar - determinarea prezentei proteinei C reactive - determinarea prezentei tipului M streptococic (streptococi de grup A) dozajul nefelometric Reactii de precipitare in mediu gelifiat: imunodifuzia radiala simpla (metoda Mancini) difuzia dubla: - metoda Elek - difuzia dubla radiala (Ouchterlony) Reactii de precipitare in care difuzia in gel este combinata cu migrarea in cimp electric: Imunoelectroforeza Contraimunoelectroforeza Electroforeza urmata de imunofixare Electroimunodifuzia REACII DE PRECIPITARE N MEDIU LICHID Au la baza unirea Ag cu Ac in mediul lichid, formindu-se complexe Ag-Ac, care vor precipita atunci cind Ag si Ac se gasesc in anumite proportii. Reacii de precipitare n amestec Se demonstreaza prezenta sau absenta precipitatului in functie de concentratiile relative de Ag si Ac. Titrarea toxinei difterice ( metoda Ramon) Se pun in contact, in amestec in tuburi, cantitati egale din componenta care trebuie titrata (toxina difterica, Ag) cu cantitati variabile de Ac la care titrul este cunoscut. Cantitatea maxima de precipitat se gaseste in tubul unde exista raportul de echivalenta. Pentru sistemul toxina difterica-Ac anti-toxina

difterica (ca si in cazul sistemului toxina tetanica-Ac anti-toxina tetanica), raportul de echivalenta se suprapune peste proportia optima, astfel incit se poate observa relativ usor tubul in care apare cantitatea cea mai importanta de precipitat. Cunoscind titrul Ac, se afla imediat titrul toxinei (1 Lf = 1 limes floculans = cantitatea de toxina care se combina cu o unitate de antitoxina = 1UA = 1 unitate antitoxica). Daca de exemplu, precipitarea maxima apare in tubul in care titrul Ac este de 10 UA, titrul toxinei este de 10 Lf. Asemanator, prin metoda Dean si Web se poate determina titrul Ac anti-toxici, cunoscind titrul toxinei. VDRL (Veneral Disease Research Laboratory) este un test de floculare, netreponemic (nespecific) utilizat pentru diagnosticul serologic al sifilisului. Testele de floculare se bazeaza pe faptul ca particulele antigenice ramin dispersate in serul normal, dar formeaza grunji vizibili atunci cind se combina cu reaginele. Tehnica: Serul de cercetat se inactiveaza 30 minute la 56C. Se amesteca intr-o placa cu godeuri o cantitate de 0,05 ml ser cu suspensie antigenica preparata in prealabil. Se folosesc martori (seruri cu reactivitate cunoscuta, martor pentru Ag) pentru fiecare test. Se aseaza placa pe un agitator la 180 turatii/minut 4 minute. Rezultatul se citeste prin transluminare pe fond negru, cu ajutorul unei lupe. Rezultatul este negativ daca lichidul nu prezinta flocoane si este asemanator martorului negativ si martorului Ag. Rezultatul este pozitiv cind se vad flocoane, in lichid clar. Rezultatul negativ nu elimina diagnosticul de sifilis; pacientul se poate afla in perioada de incubatie sau in faza de sifilis latent (evidentiabil prin TPHA). RPR (Rapid Plasma Reagin) este un alt test de floculare, netreponemic (nespecific) utilizat pentru diagnosticul serologic al sifilisului. Tehnica: Se executa pe carduri de material plastic pe care apar mai multe cercuri de 18 mm. Ag este preparat dintr-o suspensie antigenica tip VDRL modificata (pentru a elimina etapa de inactivare prin caldura). Reactivul contine si particule de carbune. Ag RPR este amestecat cu serul de cercetat in cercul de pe card. Daca Ac anti-T. palidum sunt prezenti, se combina cu particulele lipidice din Ag si produc aglutinarea lor. Particulele de carbune coaglutineaza cu Ac si duc la aparitia unor granule negre pe fondul alb al cardului. In absenta Ac rezulta un aspect gri uniform. Testul se poate realiza calitativ si cantitativ (dilutii de ser). Reacii de precipitare n inel Reacia de precipitare n inel, consta in punerea in contact a Ag si Ac astfel incit sa nu se amestece; reactia care apare la interfata dintre Ag si Ac se concretizeaza printr-un inel de precipitare albicios. Aplicatii: - in medicina legala reactia Uhlenhut pentru identificarea originii petelor de singe - in industria alimentara pentru identificarea provenientei unor preparate pe baza de carne - identificarea prezentei Ag carbunos (Ag obtinut de la Bacillus anthracis) reactia Ascoli Reactia Ascoli: Se utilizeaza 3 tuburi, 1 pentru reactie si 2 tuburi martor. In primul tub martor se pipeteaza 0,5 ml ser anticarbunos si 0,5 ml solutie salina fiziologica, iar in al doilea tub martor vom pipeta 0,5 ml ser normal de cal si 0,5 ml solutie de antigen. In tubul de reactie se pipeteaza intii 0,5 ml din serul anticarbunos, urmind ca solutia de Ag, 0,5 ml, sa fie pipetata foarte lent, eventual prin scurgere picatura cu picatura, pe peretele interior al tubului, astfel incit cele doua solutii sa nu se amestece. In cazul reactiei pozitive (prezenta Ag carbunos in solutia antigenica), dupa circa 5 minute, la interfata dintre cei doi reactivi apare un inel de precipitare. REACII DE PRECIPITARE N MEDIU SOLID (IN GEL) Reactia Ag-Ac se vizualizeaza utilizindu-se geloza in care pot sa migreze cei doi reactivi, obtinindu-se un arc/ linie de precipitare. 2

Imunodifuzia radiala simpla (IDRS Mancini) Imunodifuzia radiala simpla (IDRS Mancini) se bazeaza pe difuzia spontana si radiala a Ag din proba de cercetat, intr-un gel care contine o cantitate constanta de Ac, determinind aparitia unui cerc de precipitare al carui diametru este direct proportional cu concentratia de Ag din proba. Pentru a obtine un cerc de precipitare de marime convenabila, concentratia Ac inglobati in gel trebuie sa fie aleasa in functie de titrul acestora si de concentratia Ag care urmeaza a fi testat. Aplicatii: - determinarea cantitativa a Ig (IgG, IgM, IgA), fractiunii C3 a complementului, 1- antitripsinei, siderofilinei etc. Tehnica: Sunt necesare placute in care se toarna un gel care include Ac fata de structura a carei concentratie dorim sa o determinam. In gel sunt perforate mici godeuri (3 mm). Sunt necesare seruri de cercetat si un ser de referinta in care se cunoaste concentratia diferitelor componente. Serurile se dilueaza in functie de proteina care urmeaza a fi determinata si apoi se pipeteaza in godeuri. Dupa 10 minute de mentinere a placutei pe masa de lucru, aceasta se incubeaza la 37C, cu stratul de gel pozitionat in sus, timp de 24-48 ore. Citirea se face cu ajutorul unei rigle gradate din plastic, speciala pentru aceasta analiza. Se va masura initial diametrul cercului de precipitare din jurul godeului in care se afla serul de referinta, iar in functie de acesta se vor masura si cele ale serurilor test. Concentratiile se obtin dupa inmultirea cu dilutia probei, conform unor tabele. Imunodifuzia radiala dubla (Ouchterlony) Imunodifuzia dubla se bazeaza pe difuzia Ag si Ac (unul spre celalalt) intr-un gel. Deoarece marimea moleculelor de Ag si Ac este mai mica decit diametrul porilor gelului, iar distanta parcursa de reactant intr-un anumit timp este direct proportionala cu gradientul concentratiei sale si invers proportionala cu greutatea sa moleculara, migrarea reactantilor unul spre celalalt determina formarea unor linii de precipitare la locul de intilnire Ag-Ac. In gelul transparent vor aparea linii opace, numarul lor corespunzind numarului sistemelor Ag-Ac studiate. Metoda certifica prezenta sau absenta proteinei cercetate. Aplicatii: - determinarea -fetoproteinei, proteina C reactiva, -2 microglobulina, proteine Bence-Jones tip kappa si lambda, produsi de degradare ai fibrinogenului - in micologie, pentru determinarea exoantigenelor fungice (Histoplasma capsulatum, Blastomyces dermatidis, Coccidioides immitis etc) sau prezenta Ac fata de Ag fungice, in diagnosticul serologic al aspergilozelor invazive - determinarea specificitatii Ac antinucleari sau a altor Ac Tehnica: Sunt necesare lame de microscop pe care se toarna un gel de agar 1%, lama putind fi folosita pe parcursul unei zile. In gelul de pe lama se perforeaza 3 grupe de godeuri, cite 7 godeuri in fiecare grup (1 godeu central si 6 godeuri periferice, fiecare cu diametrul de 3 mm). De exemplu, daca se determina prezenta proteinei C reactiva (CRP) in seruri de cercetat, e nevoie de un ser cu Ac anti-CRP, seruri de cercetat si un ser de referinta care contine CRP. Se numeroteaza godeurile periferice, se pipeteaza Ac anti-CRP in godeul central si un ser de referinta cu CRP in godeurile 1 si 4. In celelalte godeuri se pipeteaza serurile de cercetat. Se incubeaza la 37C, timp de 24 ore, in camera umeda. Liniile de precipitare pot deveni vizibile dupa 2-4 ore dar sunt mult mai clare dupa 24 ore. Pentru citire poate fi necesara o lupa si o sursa de lumina. Intre godeul central si godeurile 1 si 4 (martori pozitivi) vor aparea linii (arcuri) de precipitare. In cazul in care de ex., in godeul 2 exista CRP, va aparea un arc de precipitare si intre godeul central si godeul nr.2. Este certificata prezenta CRP in cazul in care cele 2 linii de precipitare (dintre godeul central si godeurile 1 si 2) sunt una in continuarea celeilalte (imagine de genunchi indoit). Difuzia dubl Elek Aplicatii: 3

depistarea capacitatii toxigene a unei tulpini de Corynebacterium diphteriae daca tulpina este toxigena, toxina va difuza in mediu, iar dupa unirea cu Ac anti-toxina, complexele Ag-Ac vor da nastere unor linii de precipitare Tehnica: Intr-o cutie Petri se toarna mediul Elek si dupa ce mediul s-a intarit, se decupeaza un sant pe unul din diametre. In santul respectiv se pipeteaza 0,5 ml ser antidifteric, ser care contine Ac anti-toxina difterica in concentratie de 1000 UI/ ml. Ac anti-toxina difterica vor difuza in mediu. Dupa circa 2 ore se insaminteaza pe santul cu Ac anti-toxina, de fiecare parte a santului, o tulpina de Corynebacterium diphteriae toxigena (martor pozitiv), o tulpina de Corynebacterium diphteriae ne-toxigena (martor negativ) si tulpini de cercetat, cite un striu (de fiecare parte a santului) pentru fiecare tulpina. Se incubeaza la 37C pentru 48 ore, dar se urmareste zilnic aparitia culturii si precipitatului (liniilor de precipitare). De-a lungul liniilor de insamintare apare cultura bacteriana. Din cultura de Corynebacterium diphteriae toxigen, toxina (Ag) difuzeaza in mediu. Unirea dintre Ag si Ac duce la formarea unor complexe Ag-Ac care precipita, iar in mediu vor aparea linii de precipitare in unghiurile dintre cultura si santul cu Ac anti-toxina. In cazul in care apar linii de precipitare in unghiul dintre una dintre tulpinile de cercetat si santul cu Ac anti-toxina, respectiva tulpina este toxigena. Reactia va fi negativa pentru martorul negativ si pentru tulpinile de cercetat ne-toxigene.

REACII DE PRECIPITARE COMBINATE CU MIGRAREA N CMP ELECTRIC Electroforeza proteica in gel Electroforeza proteica in gel este folosita pentru decelarea unor proteine patologice. Deplasarea proteinelor intr-un strat de gel supus actiunii unui cimp electric se va realiza diferentiat, pentru fiecare structura proteica in parte, in functie de greutatea moleculara si incarcatura electrica a proteinelor. Pentru vizualizare este necesara fixarea, uscarea si colorarea liniilor de precipitare care corespund fractiunilor proteice din serul normal sau a unor eventuale proteine patologice. Proteinele serice ndeplinesc funcii variate n organism: - surs de nutriie; - componente ale sistemelor tampon; - ageni imunologici (imunoglobulinele); - rol de carrier, asigurnd transportul anumitor ioni i molecule (haptoglobina, prealbumina, transferina); - rol de reglare a activitii diverselor enzime proteolitice (antiproteaze: alfa1-antitripsina, alfa2macroglobulina); - rol n reglarea presiunii oncotice. Proteinele apar sub form de benzi crora li se msoar densitatea optic, fiecare band avnd un maxim de absorbie. Prin electroforez, n condiiile amintite mai sus, se obin cinci fraciuni: albumina seric, alfa1, alfa2, beta, gamma - globuline. Albumina, a1 i b apar sub forma unor benzi omogene, bine definite. a2, i g apar ca benzi difuze, iar fraciunea g prezint n partea sa central o zona mai intens colorat. Indicatii: - detectarea gamapatiilor monoclonale; - evaluarea proteinelor serice i a statusului nutriional. Valori de referin - sunt dependente de vrst2 Vrst < 1 an 1 16 ani > 16 ani Albumina (%) 40-65 50-65 52 68 a1(%) 2-5 2-5 2-5 a2(%) 6.6-13.5 6-15 6,6-13,5 b(%) 8.5-14 8.5-15 8,5 -14 g(%) 10-21 10-22 11 21 A/G 1.16-2.23 1.06-2.48 1.39-2.23

Interpretarea rezultatelor3 4

Pentru a facilita interpretarea rezultatelor va fi descris fiecare din cele 5 fraciuni cu proteinele componente:

Albumina - (hipoalbuminemie) - malnutriie, malabsorbie, sindrom nefrotic, neoplazii - - deshidratare. n cazuri speciale, n zona de migrare a albuminei se constat o band suplimentar, datorat unor variaii genetice fr relevan clinic (aloalbuminemie i bisalbuminemie). Zona alfa1 reflect n special concentraia seric de alfa1-antitripsin - - in deficitul de alfa1-antitripsin asociat cu anumite boli pulmonare (emfizem cu debut precoce) i hepatice (hepatit neonatal). - - in reaciile inflamatorii (reactant de faz acut). n cazuri rare, obinerea unei benzi suplimentare largi n aceast zon poate sugera prezena alfafetoproteinei. Zona alfa2 este constituit din 2 componente proteice: alfa2 macroglobulina i haptoglobina. - - n infecii acute, reumatism articular acut, arterit, sindrom nefrotic, diabet zaharat, neoplazii - - n pancreatite acute severe, leziuni hepatocelulare, sindroame de coagulare intravascular diseminat, anemii hemolitice, anemii megaloblastice. Zona beta este alctuit din 2 benzi distincte: b1 corespunztoare transferinei i b2 care include fraciunile complementului C3 i C4. Al treilea component al acestei zone este beta-lipoproteina, a crei band se poate suprapune pe cea a transferinei sau C3 sau poate fi situat n zona beta-gamma. - - in anemia feripriv i ciroza biliar - - n boli autoimune aflate n puseu activ (LES), nefroz, afeciuni hepatice, neoplazii, infecii acute i cronice. n unele cazuri de mielom multiplu de tip IgA se poate constata prezena unui component monoclonal n aceasta zon. Zona gamma include imunoglobulinele (IgG, IgA, IgM, IgD i IgE). Anomaliile suferite de acestea se traduc fie prin diverse deficite, fie prin hipergamaglobulinemii policlonale sau monoclonale. - n agamaglobulinemie, hipogamaglobulinemii i sindroame nefrotice. Hipogamaglobulinemia poate fi congenital sau dobndit i poate fi uor detectat la electroforeza proteinelor serice atunci cnd concentraiile principalelor 3 clase de imunoglobuline sunt sczute (IgG, IgA i IgM). Prezena hipogamaglobulinemiei la adult impune continuarea investigaiilor n vederea depistrii unei posibile boli limfoproliferative (mielom cu lanuri uoare, leucemie limfatic cronic, limfoame). - creterile policlonale de gamaglobuline indic un proces imunologic cronic asociat cu afeciuni hepatice (hepatit cronic activ, ciroz), boli de colagen (LES, poliartrit reumatoid), 5

neoplazii (ex. boal Hodgkin), leucemie mielo-monocitar cronic. n aceste cazuri, hipergamaglobulinemia se datoreaz activrii unui numr mare de clone plasmocitare care elibereaz imunoglobuline. Trebuie menionat aspectul caracteristic cirozei alcoolice de punte beta-gama, vizualizat pe gel ca o zon intens colorat ntre zonele beta i gamma. Uneori, n zona gamma se pot observa cteva benzi mici, nguste, denumite oligoclonale, ntlnite la pacieni cu hepatit, boli ale complexelor imune, sindromul imunodeficienei dobndite, limfomul angioimunoblastic. Gamapatiile monoclonale includ un numr mare de condiii clinice i biologice asociate de obicei cu afeciuni maligne (mielom multiplu, boal Waldenstrm, amiloidoz, limfoame) dar i cu unele afeciuni benigne sau chiar cu absena unei modificari patologice (gamapatii monoclonale cu semnificaie nedeterminat). n aceste cazuri, se depisteaz la electroforeza proteinelor un component monoclonal (band M), rezultat ca urmare a proliferarrii unei singure clone plasmocitare. Pe gel, componentele monoclonale apar sub forma unor benzi inguste, net definite, iar dup scanarea densitometric, se obin vrfuri (peak-uri) caracteristice, ce pot fi ntlnite oriunde ntre zonele alfa i gamma, datorit mobilitii electroforetice variabile, cel mai frecvent ins n zona gamma. Imunoglobulinele monoclonale sunt omogene din punct de vedere structural i biochimic, fiind alctuite dintr-un singur tip de lan uor (kappa sau lambda). n circulaie pot fi eliberate imunoglobuline complete sau numai subuniti ale acestora (ex. lanuri uoare monoclonale, denumite proteine Bence-Jones). Prezena componentului monoclonal va fi precizat pe buletinul final de analize al pacientului, cu recomandarea de a se efectua electroforeza proteinelor serice cu imunofixare1-3. n tabelul de mai jos sunt sintetizate informaiile prezentate: Zone electroforetice Descriere aspect

Albumina Alfa 1 Alfa Beta Gamma % % 2 % % % Normal N N N N N Enteropatie cu pierdere de N+ N+ N-N+ proteine Sindrom nefrotic N +++ N NHipogamaglobulinemie NN N N Agamaglobulinemie NN N N Absent Gamopatie policlonal NN N N + Rspuns inflamator cronic NN+ + N + Rspuns inflamator acut N+ + N NRspuns inflamator subacut NN + N N Ciroz hepatic N NPunte beta-gamma Hipoalfa-1 globulinemie N N N N Gamopatie monoclonal (tip ) NN N N Band M Gamopatie monoclonal (tip ) NN N Banda NM Gamopatie biclonal NN N Banda Band M M Benzi oliglonale NN+ N+ N Benzi oligl. Bisalbuminemie Vrf dublu Hipoalbuminemie N N N N

Legend N = nivel normal + =nivel crescut N+ =nivel Nnormal/crescut normal/sczut - =nivel sczut =nivel -N+ sczut/normal/crescut

=nivel

Limite i interferene Variaii fiziologice: n sarcin scade albumina i cresc alfa2, beta- i gamaglobulinele (IgG); valori mai sczute ale gamaglobulinelor pot fi ntlnite la vrstnici. Medicamente Albumin (scderi): acid valproic, allopurinol, asparaginaz, azatioprin, clorpropamid, cisplatin, contraceptive orale, dapson, dextran, estrogeni, fenitoin, ibuprofen, izoniazid, nitrofurantoin, prednison (doze mari), sargramostim. Alfa1-globuline (creteri): testosteron. Alfa2-globuline: estrogeni, contraceptive orale, fenitoin (creteri), asparaginaz (scderi). Beta-globuline: estrogeni, contraceptive orale (creteri); asparaginaz (scderi). Gamma-globuline: tratament citostatic sau imunosupresor (scderi). Interferente analitice: - o cretere uoar a lrgimii benzii de albumin poate fi datorat legrii unor medicamente (penicilin) sau a bilirubinei (pacieni cu icter); - bisalbuminemia tranzitorie (non-ereditar) poate fi ntlnit ca rezultat al unui tratament medicamentos sau unei perturbri metabolice severe (ex. pancreatit) - benzi monoclonale false pot fi date de: hemoglobina liber, n cazul unui ser hemolizat sau a unei hemolize intravasculare (band n zona alfa2 - beta); proteina C reactiv n cantitate mare; lizozim crescut, fibrinogen (la pacienii tratai cu anticoagulante; n coagulopatii, daca sngele a fost centrifugat nainte de a coagula complet); alfa-fetoproteina n concentraii mari, seruri vechi. - vizualizarea este dificil n cazul n care banda monoclonal se suprapune peste o band normal (ex. banda monoclonal n zona beta1 va migra n aceeai poziie ca i transferina).

Imunoelectroforeza Se asociaza electroforeza in gel cu imunodifuzia dubla (realizindu-se separarea prin electroforeza a proteinelor in mediu gelozat, urmata de o imunodifuzie dubla utilizind un antiser corespunzator). Reactia Ag-Ac se va vizualiza prin aparitia unor arcuri de precipitare. Este o metoda foarte utila in studierea puritatii unui Ag (sau Ac). Aplicatii: - evidentierea prezentei Ag K eliminat in urina in boala pneumococica Contraimunoelectroforeza Contraimunoelectroforeza este o dubla difuzie in care deplasarea unul fata de celalalt a Ag si Ac este accelerata de un cimp electric. Tehnica: Pe o lama de microscop se toarna un gel de agar 1% si se perforeaza 3 grupe de perechi de godeuri, fata in fata. Metoda poate fi folosita pentru acele structuri antigenicecare in cimp electric migreaza catre anod. In godeurile care vor fi pozitionate spre catod (polul negativ) se pipeteaza Ag, iar in godeurile care vor fi pozitionate spre anod (polul pozitiv) se pipeteaza Ac cunoscuti, specifici Ag de identificat. Reactia este mai rapida si mai sensibila decit dubla difuzie deoarece migrarea celor doi reactanti unul catre celalalt este amplificata de cimpul electric. Reactia (aparitia unei linii de precipitare intre godeuri, in cazul in care in godeul catodic se gaseste Ag presupus) poate fi citita dupa numai 30-90 minute in loc de 24 ore asa cum se intimpla in dubla difuzie Ouchterlony. 7

Aplicatii: - identificarea prezentei AgHBs importanta istorica - identificarea Ag capsulare in LCR la pacientii cu meningita acuta (Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae). Electroimunodifuzia Electroimunodifuzia are la baza electroforeza probelor care contin proteina-Ag, intr-un strat de gel, care contine o cantitate constanta de Ac monospecifici (anti proteina-Ag), rezultind zone de precipitare in forma de racheta sau conuri, a caror arie este direct proportionala cu concentratia Ag. Metoda are o sensibilitate mai mare decit imunodifuzia radiala simpla.