1 : On dtermine les temps de rtention (tr) au cours d'une chromatographie sur Sephadex, des protines suivantes dont on connat

la masse molculaire (MM) (Le dbit de la colonne est de 5 ml / min) :

MM Aldolase Lactate dshydrognase Phosphatase alcaline Ovalbumine Lactoglobuline 145000 135000 80000 45000 37100 tr (min) 10,4 11,4 18,4 26,2 28,6

1 - Calculer les volumes d'lution (Ve) correspondants. Porter le log de MM en fonction de Ve - Que remarquez-vous ? 2 - Pour la glucokinase, tr = 21 min. Dterminer sa masse molculaire l'aide du graphique prcdent. Existe t'il une autre mthode pour dterminer la MM ?

Correction
Correction exercice 1 :

1 - Cet exercice met en jeu une chromatographie d'exclusion (encore appele : tamisage molculaire, gel filtration, permation de gel). La connaissance du dbit de la colonne (5 ml / min) et des diffrents temps de rtention nous permet de calculer le volume d'lution pour chaque compos (voir tableau), selon la relation : Ve (volume d'lution) = d (dbit) x tr (temps de rtention) La reprsentation graphique du log de la masse molculaire (log MM) qu'il faut calculer pralablement (voir tableau) en fonction du volume d'lution (Ve) nous donne une droite :
MM Aldolase Lactate dshydrognase Phosphatase alcaline Ovalbumine Lactoglobuline 145000 135000 80000 45000 37100 Log MM 5,16 5,13 4,9 4,65 4,57 tr (min) 10,4 11,4 18,4 26,2 28,6 Ve (ml) 52 57 92 131 143

Le

fait

de

visualiser

une

droite

signifie

qu'aucune

protine

n'est

exclue

du

gel.

2 - La glucokinase, avec un temps de rtention de 21 min, est lue un volume d'lution de 5 x 21 = 105 ml. Il suffit de se reporter au graphe pour dterminer un log de MM = 4,82 environ, soit une masse molculaire de 66070 Da (ou 66070 g/mol ou 66,07 kDa), environ. Ici, on a trac le logarithme de la masse molculaire en fonction du volume d'lution : log MM = f (V e). L'autre reprsentation serait de porter le logarithme de la masse molculaire en fonction du KAV, le coefficient de partage entre la phase liquide et la phase gel : log MM = f (KAV). KAV = (Ve - Vm) / (Vt - Vm) Mais pour cela, il faudrait connatre le volume mort (Vm) et le volume total de la colonne (Vt).

Exercice 2
Exercice 2 : On veut sparer 3 acides-amins : l'acide L-glutamique, la L-leucine et la L-lysine par chromatographie sur une rsine polystyrnique substitue par des groupements sulfonate (-SO3 ). Les pH isolectriques de l'acide L-glutamique, de la L-leucine et de la L-lysine sont respectivement : 3,22 ; 5,98 ; 9,74, 25 C. On dpose ces 3 acides amins sur la colonne, pH 2, puis on lue en amenant progressivement le pH 7. Question :

1 - Quels acides amins sont lus et dans quel ordre ? (On considrera que les interactions acide aminrsine sont uniquement d'ordre lectrostatiques).

Correction 2

Correction

exercice

1 - Cet exercice met en jeu une chromatographie changeuse d'ions. Une rsine polystyrnique substitue par des groupements sulfonate (-SO3 ) est charge ngativement et est donc une rsine changeuse de cations. Lorsque le pH est suprieur au pHi (pH > pHi), l'acide amin est charg ngativement (forme anionique). Lorsque le pH est infrieur au pHi (pH < pHi), l'acide amin est charg positivement (forme cationique). Le tableau ci-dessous donne les charges des 3 acids amins, pH = 2 et pH = 7.
acide amin : Acide L-Glutamique (Glu) L-Leucine (Leu) L-Lysine (Lys) pHi : 3,22 5,98 9,74 charge pH = 2 : + + + charge pH = 7 : +

Ainsi, pH = 2, les trois acides amins sont chargs positivement, et seront retenus lors du passage sur la colonne. A pH = 7, seuls Glu et Leu, chargs ngativement, seront lus. Lys reste fix la colonne. Glu est lu en premier (pHi = 3,22) puis Leu l'est ensuite (pHi = 5,98).

Exercice 3
Exercice 3 : La carboxymthylcellulose (CM-cellulose) est un support changeur de cations. Elle est obtenue en substituant la cellulose par des groupements carboxymthyls (-CH2-COOH). Questions :

1 - Quelle est la proportion des groupements carboxymthyls chargs ngativement aux pH suivants : 1 ; 4,76 ; 7 et 9 (on considrera que le pKa du groupement carboxyl des radicaux carboxymthyls est 4,76). 2 - Parmi les protines suivantes : Ovalbumine (pHi = 4,6), Cytochrome c (pHi = 10,65) et Lysozyme (pHi = 11), quelles sont celles qui sont retenues par la CM-cellulose pH 7 ? (On considrera que les interactions protine-CM-cellulose sont uniquement d'ordre lectrostatiques).

CORRECTION 3
Correction exercice 3 :

1 - Proportion des groupements carboxymthyls (pKa = 4,76) chargs ngativement aux pH : 1, 4,76, 7 et 9. Le pH est donn par la relation suivante :

 pH = 1 :

= pH - pKa = 1 - 4,76 = -3,76

donc :
-4

= 1,74 10

-4

Sachant que (A) + (B) = 100 % et que (B) = 1,74 10 .(A), (A) est mis en facteur : (A) =

on en dduit que (A) + 1,74 10 .(A) = 100 100 /(1 + 1,74 10 )

-4

-4

On peut ainsi calculer le pourcentage des formes (A) et (B) : (A) = 99,98 % et (B) = 0,02 %

pH = 4,76 :

= pH - pKa = 4,76 - 4,76 = 0

donc :

=1

Sachant que (A) + (B) = 100 % et que (B) = (A), (A) est mis en facteur :

on en dduit que (A) + (A) = 100 (A) = 100 /(2)

On peut ainsi calculer le pourcentage des formes (A) et (B) : (A) = 50 % et (B) = 50 %

pH = 7 :

= pH - pKa = 7 - 4,76 = 2,24

donc :

= 173,78

Sachant que (A) + (B) = 100 % et que (B) = 173,78(A), (A) est mis en facteur :

on en dduit que (A) + 173,78(A) = 100 (A) = 100 /(174,78)

On peut ainsi calculer le pourcentage des formes (A) et (B) : (A) = 0,575 % et (B) = 99,425 %

pH = 9 :

= pH - pKa = 9 - 4,76 = 4,24

donc :

= 13378

Sachant que (A) + (B) = 100 % et que (B) = 173,78(A), (A) est mis en facteur :

on en dduit que (A) + 13378(A) = 100 (A) =

-3

100

/(13379)

On peut ainsi calculer le pourcentage des formes (A) et (B) : (A) = 5,73 10 % et (B) = 99,994 %

Globalement, on peut donc constater qu' un pH infrieur au pKa (pH acide), les groupements carboxymthyls se prsenteront majoritairement sous forme acide (-CH2-COOH). l'inverse, un pH suprieur au pKa (pH basique), les groupements carboxymthyls se prsenteront

majoritairement

sous

forme

basique

(-CH2-COO )

2 - pH = 7, on a pu calculer que la rsine tait 99,425 % sous forme basique, charge ngativement (-CH2COO ). Protine : Ovalbumine Cytochrome c Lysozyme pHi : 4,6 10,65 11 Charge ph = 7 : ngative positive positive

Ainsi, seule l'ovalbumine, qui pH = 7 est charge ngativement, ne sera pas retenue sur la colone. Le cytochrome c et le lysosyme seront retenus.

Exercice 4
Exercice 4 : La dithylaminothylcellulose (DEAE-cellulose) est un support changeur d'anions, obtenu en substituant la cellulose par des groupements dithylaminothyls :
CH2-CH3 / -CH2-CH2- NH+ \ CH2-CH3

Questions

1 - Quelle est la proportion de radicaux-DEAE chargs positivement aux pH suivants : 2 ; 7 ; 9,4 ; 12 ? (On considrera que le pK de l'amine tertiaire du groupement DEAE est 9,4). 2 - Parmi les protines suivantes : Srumalbumine (pHi = 4,9), Urase (pHi = 5), Chymotrypsinogne (pHi = 9,5), quelles sont celles qui, pH 7, sont retenues par la DEAE-cellulose ? (On considrera que les interactions protine-DEAE-cellulose sont uniquement de type lectrostatiques).

Correction 4
Correction exercice 4 :

1 - Proportion des groupements dithylaminothyls (DEAE : pKa = 9,4) chargs ngativement aux pH : 2, 7, 9,4 et 12. Le pH est donn par la relation suivante :

 pH = 2 :

= pH - pKa = 2 - 9,4 = -7,4

donc :
-6

= 3,98 10

-6

Sachant que (A) + (B) = 100 % et que (B) = 3,98 10 .(A), (A) est mis en facteur : (A) =

on en dduit que (A) + 3,98 10 .(A) = 100 100 /(1 + 3,98 10 )

-6

-6

On peut ainsi calculer le pourcentage des formes (A) et (B) : (A) = environ 100 % et (B) = 0 %

pH = 7 :

= pH - pKa = 7 - 9,4 = -2,4

donc :
-3

= 3,98 10

-3

Sachant que (A) + (B) = 100 % et que (B) = 3,98 10 .(A), (A) est mis en facteur : (A) =

on en dduit que (A) + 3,98 10 .(A) = 100 100 /(1 + 3,98 10 )

-3

-3

On peut ainsi calculer le pourcentage des formes (A) et (B) : (A) = 99,996 % et (B) = 0,004 %

pH = 9,4 :

= pH - pKa = 9,4 - 9,4 = 0

donc :

=1

Sachant que (A) + (B) = 100 % et que (B) = (A), (A) est mis en facteur :

on en dduit que (A) + (A) = 100 (A) = 100 /(2)

On peut ainsi calculer le pourcentage des formes (A) et (B) : (A) = 50 % et (B) = 50 %

pH = 12 :

= pH - pKa = 12 - 9,4 = 2,6

donc :

= 398,1

Sachant que (A) + (B) = 100 % et que (B) = 398,1(A), (A) est mis en facteur : (A)

on en dduit que (A) + 398,1(A) = 100 = 100 /(1 + 398,1)

On peut ainsi calculer le pourcentage des formes (A) et (B) : (A) = 0,25 % et (B) = 99,75 %

Globalement, on peut donc constater qu' un pH infrieur au pKa (pH acide), les groupements + dithylaminothyls se prsenteront majoritairement sous forme acide (-NH ). l'inverse, un pH suprieur au pKa (pH basique), les groupements dithylaminothyls se prsenteront

majoritairement

sous

forme

basique

(-N)

2 - pH = 7, on a pu calculer que la rsine tait 99,996 % sous forme acide, charge positivement. Protine : Srumalbumine Urase Chymotrypsinogne pHi : 4,9 5 9,5 Charge ph = 7 : ngative ngative positive

Ainsi, pH = 7 la srumalbumine et l'urase sont charges ngativement, et seront donc retenues sur la colone. Le chymotrypsinogne ne sera pas retenus.

Exercice 5
Exercice 5 : Le coefficient de partage de l'iode (I2) entre les deux solvants non-miscibles : ttrachloromthane et eau, est gal 100 25 C. 10 ml de solution aqueuse d'iode 10 g/l, on ajoute 10 ml de ttrachloromthane (CCl4). Donne : I2 est plus soluble dans le ttrachloromthane que dans l'eau.

Question : Dterminer la concentration en iode dans le ttrachloromthane et dans l'eau, aprs agitation et dcantation.

Correction 5
Correction Coefficient de partage de exercice l'iode dans le 5 ttrachloromthane et : l'eau.

D'aprs les donnes de l'exercice, on peut crire les deux galits suivantes :

On peut en dduire que :

Concentration

dans

le

ttrachloromthane

(solvant

organique)

9,9

g/l

Concentration dans l'eau (solvant aqueux) = 0,099 g/l

Exercice 6
Exercice 6 : On veut dterminer la masse molculaire (MM) d'une protine p par chromatographie d'exclusion. La limite d'exclusion du gel se situe entre 40000 et 400000 de MM. L'talonnage du gel se fait par diverses substances, dont les MM (exprimes en Daltons) et les volumes d'lution (Ve, exprim en ml) sont indiqus dans le tableau suivant :
MM (Da) Dextran Fibrinogne Catalase Lactoglobuline 2000000 340000 230000 19000 Ve (ml) 45 60 75 132

Questions 1 - Rappeler quoi correspond le

: Dalton.

2 - La protine p montre, quant elle, un volume d'lution Ve = 113 ml. Dterminer sa MM.

Correction 6
Correction exercice
-27

1 - Le Dalton est une unit de masse atomique et correspond 1,66 . 10 kg. La masse molculaire d'un compos s'exprimera soit en dalton (Da), soit en grammes par mole (g/mol). Noter que l'abrviation de dalton s'crit avec un Dmajuscule : Da et que le kilodalton s'crit kDa. 2 - Afin de dterminer la masse molculaire (MM) de la protine p (Ve = 113 ml), il faut au pralable tracer la reprsentation du log (masse molculaire) = f(Ve). Le schma ci-dessous reprsente le trac de log (MM) = f(Ve) pour les composs suivants : Dextran, Fibrinogne, Catalase et Lactoglobuline.

Une colonne a t rajoute dans le tableau pour le calcul du log de la masse molculaire :

MM (Da) Dextran Fibrinogne Catalase Lactoglobuline 2000000 340000 230000 19000

Ve (ml) 45 60 75 132

log MM 6,3 5,53 5,36 4,28

Il suffit de reporter sur le trac : log (MM) = f(Ve), le volume de 113 ml pour en dduire un log MM = 4,93, soit une masse molculaire de 85114 Da ou 85114 g/mol pour la protine p.

Il

est

trs

important

de

noter

que

- 45 ml reprsente le volume mort de la colonne, c'est dire le volume d'lution des substances exclues (ici, le dextran). 132 ml reprsente le volume d'exclusion des protines totalement incluses.

- la droite a t trae en ne tenant compte que des points correspondants au fibrinogne et la catalase, car le dextran est un compos totalement exclu, alors que la lactoglobuline est une protine totalement incluse dans le gel. Ainsi, il aurait t totalement faux de tracer une droite partir des points correspondant la catalase et la lactoglobuline (qui sont les protines dont les volumes d'lution encadrent celui de la protine p).

Exercice 7

Exercice 7 : Une enzyme a t purifie en trois tapes, en partant de 1000 g d'un extrait brut contenant au total 20000 units de cette enzyme. Questions 1 - Complter le tableau ci-dessous :
protine (g) : Extrait brut Chromato. d'exclusion Chromato. d'change d'ions Chromato. d'affinit 1000 200 15 0,5 activit (UE) : 20000 14000 4500 3500 taux de purification : rendement :

2 - Quelles conclusions peut on tirer de cette tude ?

Correction7
Correction Afin de remplir le exercice tableau, il faut connatre 7 quelques dfinitions : :

- L'activit spcifique (AS) reprsente un nombre d'units enzymatiques (UE) par gramme de protines (g) : AS = (UE / g)

- Le taux de purification d'une enzyme est le rapport de l'AS mesure aprs une tape de purification, sur l'AS mesure l'tape prcdente : Taux de purification = AS aprs une tape / AS avant cette mme tape

- Le rendement correspond un nombre d'UE mesur aprs une tape de purification, sur un nombre d'UE mesur l'tape prcdente : Rendement = UE aprs une tape / UE avant cette mme tape

Connaissant ces dfinitions, on peut remplir le tableau. Il faudra rajouter une colonne supplmentaire "AS" qui nous permettra de calculer le taux de purification :

protine (g) : Extrait brut Chromato. d'exclusion Chromato. d'change d'ions Chromato. d'affinit 1000 200 15 0,5

activit (UE) : 20000 14000 4500 3500

AS : 20 70 300 7000

taux de purification : 3,5 fois 4,28 fois 23,3 fois

rendement : 70 % 32 % 77,7 %

On

pourra

utilement

calculer

- Le taux global de purification, qui est gal l'AS mesure la fin de toutes les tapes, divise par celle de dpart. Ici, le taux global de purification est gal 7000 / 20 = 350. - Le rendement global qui est gal 3500 / 20000 = 17,5 %,

Conclusion : Suite aux diffrentes tapes de purification, on a pu rcuprer 3500 units, sur les 20000 que l'on avait au dpart, soit 17,5 %. L'enzyme a t purifie 350 fois.

Exercice 8
Exercice 8 : Un mlange de trois acides amins : Asp (pHi = 2,87), Arg (pHi = 10,76) et Leu (pHi = 6), est soumis une chromatographie sur colonne changeuse de cations. L'lution est effectue l'aide d'un tampon pH = 6. Question 1 - Dans quel ordre peut-on prvoir la sortie de ces acides amins ? :

Correction 8
Correction exercice 8 :

Un mlange de trois acides amins : Asp (pHi = 2,87), Arg (pHi = 10,76) et Leu (pHi = 6), est soumis une chromatographie sur colonne changeuse de cations. L'lution est effectue l'aide d'un tampon pH = 6.

Question

dans

quel

ordre

peut-on

prvoir

la

sortie

de

ces

acides

amins

Si les trois acides amins ont t retenus sur la colonne, c'est que la charge de la colonne a t ralise un pH infrieur au plus petit des pHi, soit un pH infrieur 2,87, afin que les acides amins se prsentent sous une forme charge positivement et qu'ils puissent tre retenus sar la rsine changeuse de cations, charge ngativement.

Acide amin : Asp Leu Arg

pHi 2,87 6 10,76

Charge pH < 2,87 + + +

Charge pH 6 neutre (50%/50%) +

un pH de 6, Asp est charg ngativement; il est donc lu de la colonne. La leucine est ensuite lue. L'Arginine, toujours charge positivement pH = 6 reste sur la colonne et n'est donc pas lue.

Exercice 9
Exercice 9 : Un mlange d'immunoglobulines G (MM = 160000 Da) et d'albumine srique bovine (MM = 67000 Da) est dpos sur colonne de sphadex G-100 (limite d'exclusion = 100000 Da). Rappel Question 1 - Tracer un diagramme d'lution vraisemblable (DO en fonction de Ve) en indiquant le volume mort. : MM = masse molculaire. :

CORRECTION 9

Correction

exercice

Voici un diagramme d'lution vraisemblable pour une chromatographie d'exclusion sphadex G-100 (limite d'exclusion = 100000 Da), sur laquelle on aurait dpos un un mlange d'immunoglobulines G (MM = 160000 Da) et d'albumine srique bovine (MM = 67000 Da). Ici on a reprsent la mesure de la densit optique (DO) de l'luat en fonction du volume d'lution (Ve).:

Les IgG prsentent une masse molculaire suprieure la valeur de la limite d'exclusion de la colonne (100000 Da). Elles seront donc lues en premier, et donneront la valeur du volume mort de la colonne (V m = Ve IgG) L'albumine de masse molculaire 67000 g/mol, sera incluse dans le gel et lue plus tard, avec un Ve albumine qui est gal Vm + Ve' albumine.

EXERCICE 10
Exercice 10 : On veut raliser la sparation de 5 acides amins (Glu, Met, Tyr, Lys, Ser). On utilise pour cela 5 g de rsine sche de polystyrne sulfon que l'on dispose dans une colonne ouverte. La rsine est lave par une solution d'HCl (1 M) en excs. Aprs ce traitement, la rsine est lave l'eau distille. On fait alors passer une solution de NaCl (2 M) en excs. Le filtrat correspondant est recueillit dans sa totalit et est dos par 11,5 ml de NaOH (1 M).

Questions

1 - Commenter les oprations effectues (crire sommairement les quations mises en jeu) et en dduire la capacit de rtention de la rsine. 2 - Les 5 acides amins sparer sont solubiliss dans un tampon pH = 3,8. A ce pH, quels sont les composs qui seront retenus sur la rsine ? 3 - Aprs avoir charg la colonne par les 5 acides amins pralablement solubiliss dans le tampon pH 3,8, l'lution est ralise en gradient de pH, en augmentant le pH. Dans quel ordre les acides amins vont-ils tre lus ? On se servira des donnes ci-aprs :
acide amin : Glu Met Tyr Lys Ser pK - COOH 2,19 2,28 2,20 2,18 2,21 pK - NH2 9,67 9,21 9,11 8,95 9,15 pK -R 4,25 10,07 10,53 -

Correction 10