Curs 4 PURIFICAREA ENZIMELOR Comportamentul ideal al unei enzime are loc in conditiile sale naturale de existenta, deci in celula,

tesut, mediu de cultura etc. Totusi dupa alegerea unui surse optime si separarea proteinei de interes intr-un Extract Proteic Total (EPT) de cele mai multe ori enzima este mai mult sau mai putin purificata in functie de scopul sau scopurile pentru care a fost izolata. Astfel enzimele se purifica pentru numeroase motive cum sunt de exemplu:

Intelegerea proceselor care au loc in celula sau intre celule rolul enzimelor in
diverse procese metabolice, cinetica lor, studiul reactiilor etc;

Intelegerea deviatiilor care au loc in metabolism in procese anormale, boli,

efecte degenerative etc.

Realizarea unor medicamente, aditivi, cat mai aproape de substantele existente

deja in natura (ex. Indulcitori, insulina), biocatalizatori terapeutici etc. Nu exist un procedeu standard cu etape specifice care ar putea fi utilizat pentru purificarea tuturor enzimelor. Diferite tehnici de separare/purificare pot fi realizate practic ntr-un numr infinit de combinaii variabile pentru parametrii de separare (pH, temperatur, trie ionic etc.). Practic fiecare tehnic de separare, purificare, trebuie optimizat pentru fiecare produs n parte. Adeseori procesele de prelucrare, ale mediului de cultur sau a unei alte surse pentru o enzima, sunt prin dificultatea sau preul lor mare, factori limitativi pentru dezvoltarea unui proces biotehnologic de obinere a unei enzime. De asemenea trebuie sa stim ca termenule de puritate pentru enzime este un termen relativ deoarece practic nu s-a obtinut o enzima 100% pura. Procedeul ales pentru purificarea unei enzime depinde de proprietatile acesteia si de gradul de purificare dorit. In orice procedeu de purificare trebuie insa sa se pastreze structura si activitatea enzimei in cea mai mare masura posibila intacte. Obiectivele ce trebuie urmarite intr-un proces de purificare cand se doreste obtinerea unei enzime pure sunt deci: obtinerea unui preparat enzimatic de puritate maxima si cu activitate maxima posibila. Principalele metode de purificare ale enzimelor se bazeaza pe proprietatile acestora si anume:
1.Solubilitate:

modificarea

pH-ului,

modificarea

tariei

ionice, modificarea constantei dielectrice;

2.Dimensiunea sau masa moleculara: centrifugarea, separarea prin membrane (dializa,

ultrafiltrarea, osmoza inversa), gel-filtrarea;

3.Polaritatea: sarcina electrica:

cromatografia isoelectrica;

de

schimb

ionic, focusarea

cromatofocusarea, electroforeza, caracterul hidrofobic: structurale: cromatografia hidrofoba

4.Interactia specifica cu alte biomolecule prin situsuri specifice de legare sau trasaturi

cromatografia de afinitate, elutia de afinitate, cromatografia cu liganzi colorati, cromatografia covalenta, imunoadsorbtia,

Alegerea metodelor de separare este de asemenea dependenta si de cantitatea de preparat care se prelucreaza. In general se considera termenul de scara mare cand se lucreaza cu o enzima de interes aflata in cantitati mai mari de 100 mg. Astfel in functie de scara metodele ce se pot utiliza in general sunt: Scara mare centrifugarea cromatografia de schimb ionic Scara mica centrifugarea Dializa, ultrafiltrarea, osmoza inversa gel-filtrarea cromatografia de schimb ionic cromatofocusarea electroforeza focusarea isoelectrica cromatografia hidrofoba modificarea tariei ionice cromatografia de afinitate elutia de afinitate cromatografia cu liganzi colorati cromatografia covalenta imunnoadsorbtia

modificarea pH-ului modificarea tariei ionice modificarea constantei dielectrice elutia de afinitate cromatografia cu liganzi colorati

1. Dimensiunea sau Masa Moleculara

Dimensiunea si/sau masa moleculara ofera posibilitatea de separare a macromoleculelor prin metode relativ simple si acesibile cum sunt: centrifugarea, dializa, ultrafiltrarea si gel-filtrarea. Centrifugarea este una dintre cele mai importante tehnici de separare. Separarea este determinata in aceasta metoda de masa moleculara a macromoleculelor de interes. Totusi separarea unei enzime de alta nu este foarte eficienta tocmai din cauza proprietatilor acestora. De aceea in
2

majoritatea cazurilor, cetrifugarea este folosita pentru indepartarea impuritatilor cu mase moleculare mari si separarea enzimelor se realizeaza mai ales prin ultracentrifugare. Dializa si ultrafiltrarea sunt procese asemanatoare si se utilizeaza mai ales pentru enzime cu masa moleculara de zeci de mii. In mod obisnuit prin aceste metode se indeparteaza moleculele mici saruri, molecule mici, solventi organici etc. si se realizeaza concentrarea proteinelor. Gel-filtrarea se utilizeaza in principal pentru enzime cu masa moleculara de sute de mii. Se utilizeaza in general pentru purificari la scara mica in ultimele stadii de purificare deoarece foloseste materiale scumpe - Sephadex, Bio-Gel P, Sephacryl si Sepharose si este consumatoare de timp. Centrifugarea Separrile centrifugale se bazeaz pe diferenele de dimensiune, forma i densitate ale particulelor, vascozitatea mediului si viteza de rotatie a rotorului unei centrifugi. Diferenta de densitate a particulelor in solutie face posibila separarea lor ca urmare a unei miscarii circulare a eprubetei cu amestec in care acestea sunt dispersate. Eficiena depunerii particulelor solide depinde pentru fiecare tip de amestec de campul centrifugal aplicat. Forta centrifugala la care este supusa particula este data de relatia: Fc = mp 2r (1) unde mp este masa particulei, este viteza angular msurat n rads-1, iar r raza de rotaie (cm) (distanta particulei fata de axa de rotatie), Media vitezei angulare este data de relatia: =
2 rev . min 1 60

unde rev este from Lebowitz al.,Protein Science, 1 et

rotatie/revoloutie per minut (r.p.m) si 1 rev=2 radiani = 360. Campul centrifugal este dat de relatia: 2r si se poate calcula folosind relatia: G = 2r =
4 2 ( rev min 1 ) 2 r 3600

(2)

Deoarece diferitele centrifugi au rotoare diferite in functie de producator pentru reprezentzrea fortei centrifuge a aparatului se utilizeaza asa numita Forta de Centrifugare Relativa (RCF) care reprezinta un multiplu al fortei gravitationale si este data de raportul dintre greutatea unei particule in camp centrifugal si greutatea aceleiasi particule numai in camp gravitational: RCF =
m p 2 r mpg

= 2rg-1

(3)

In procesul de centrifugare asupra unei particule actioneaza trei forte: forta centrifugala descrisa mai sus, forta de frecare a solutiei asupra particulei in miscare si forta de plutire sau de rezistenta a
3

particulei.
Forta de frecare Forta centrifuga

Forta de flotatie

Forta de de flotatie a particulei este data de relatia: Ff = ms 2r (4) In care ms este masa volumului de solutie egal cu volumul particulei. Forta de frecare sau de miscare a particulei este: F= fv, unde f este coeficientul de frecare al particulei in solutie si v viteza sa de miscare Suma acestor forte reprezinta forta neta careia ii este supusa particula, adica: forta neta asupra particulei = mp 2r - ms 2r - fv= (mp - ms) 2r fv (5). Cand forta de miscare a particulei in campul centrifugal este echilibrata de fortele de frecare si de miscare, adica miscarea particulei devine egala cu zero (dv/dt=0) si (mp - ms) 2r - fv = 0 (6) atunci are loc sedimentarea unei particulei viteza de sedimentare se poate calcula prin asa numitul coeficient de sedimentare s, specific pentru fiecare enzima, proteina, particula, si care este descris de bine cunscuta ecuatie a lui Svedberg derivata din relatiile de mai sus: s=
v
M (1 V ) D M (1 V ) = N f RT

r
2

(7)

unde : - v este viteza de sedimentare a particulei, este viteza angular msurat n rads-1, r raza de rotaie (cm) (distanta particulei fata de axa de rotatie), 2r este campul centrifugal, M masa moleculara a particulei, N numarul lui Avogadro (6,023x1023), V volumul specific partial al particulei (adica modificarea de volum care se produce atunci cand un gram de particule se dizolva intr-un volum infinit de solvent), f este coeficientul de frecare a particulei si poate fi calculat din masuratori ale vitezei de difuzie a particulei, este densitatea solutiei, D este coeficientul de difuzie, R este constanta gazelor, iar T este temperatura. Valorile s se masoara in unitati Svedberg. O unitate Svedberg este egala cu 10-13sec. Utilizand aceste relatii se ajunge la viteza de sedimentare a unei particule care se poate astfel calcula cu ajutorul relatiei: v=
d 2 ( p s ) 2 r Fs 18

(8)
s

unde: d diametrul particulelor, p este densitatea particulelor,

densitatea soluiei, Fs un factor de

corecie determinat de interacia particulelor n timpul depunerii, este vscozitatea cinetic i este un factor determinat de forma particulelor ( = 1 pentru particule sferice). Fs depinde de volumul de
4

fracii solide prezente n amestec. Pentru concentraii procentuale de particule solide de 1%, 3%, 12% i 20% acest factor este aproximativ egal cu 1; 0,5; 0,1 i respectiv 0,05. Eficiena depunerii particulelor solide depinde pentru fiecare tip de amestec de durata centrifugrii i distana necesar a fi parcurs pentru sedimentare (L). Timpul necesar de centrifugare este dat de raportul dintre volumul depus () i volumul centrifugii (V). Pentru evaluarea utilizrii eficiente a unei centrifugi se determin capacitatea de depunere maxim folosindu-se relaia: =
d 2 ( p s ) 2 r VF s 18 L

(9)

Dup cum se vede din relaie eficiena procesului este dependent de fracia de solide din amestec, de suprafaa efectiv de clarificare (V/L) i de factorul de accelerare (2r/g n care g este constanta gravitaional egal cu 981 cms-2; astfel un rotor cu o raz de 25 cm i care se rotete cu 1 revoluie per secund are un factor de accelerare egal aproximativ cu 1 G). Factori de accelerare mici cu valori de circa 1500 g se pot utiliza pentru sedimentarea de celule n timp ce pentru depunerea eficient a enzimelor sunt necesari factori de accelerare mult mai mari. Acest fapt determina necesitatea utilizarii de ultracentrifugi care pot genera viteze de centrifugare de pana la 65.000 rpm pentru ca proteinele sa se poata sedimenta. In aceste cazuri sedimentarea unei enzime se monitorizeaza in general prin metode optice cum sunt modificarea indicelui de refractie sau absorbtia la 280 nm. Relatia (7) poate fi utilizata pentru determinarea maselor moleculare a enzimelor, proteinelor daca se cunoaste valoarea lui f. Pentru determinarea masei moleculare se mai utilizeaza si relatia: M=
Rs T D (1 V )

(10)

unde : R este constanta gazelor, T este temperatura, s coeficientul de sedimentare, V volumul specific partial al particulei, este densitatea solutiei si D este coeficientul de difuzie. Valoarea V poate fi determinata din masuratori foarte exacte ale densitatii solutiilor sau calculata din compozitia in aminoacizi a enzimei de interes. Coeficientul de difuzie, D, poate fi masurat in experimente separate de ultracentrifugare la viteze scazute incat sa nu aibe loc nici o sedimentare detectabila. In cazul in care nu se poate atinge o viteza suficient de mare pentru a se realiza sedimentarea completa a enzimelor, intre regiunea concentrate in enzime din partea inferioara a tubului de centrifugare si concentratia scazuta de la suprafata sedimentului. Din masuratori ale distributiei concentratiei macromoleculelor, c, masa moleculara poate fi calculata folosind relatia:

M=

d ln c 2 RT 2 (1 V ) dr 2

(11)

valoarea d ln c / dr 2 se obtine din panta graficului obtinut reprezentand ln c fata de dr2. Avantajul utilizarii acestei solutii este ca sistemul se studiaza la echilibru si nu este dependent de forma solutului si de vascozitatea solutiei. Produsul 2rV/gD, este numit factor sigma ( ) i este utilizat pentru compararea aparatelor de centrifug i ridicarea unui proces la scar. Centrifugele de laborator nu pot fi utilizate pe scar mare deoarece crete stresul mecanic la captul tuburilor de centrifug care crete proporional cu raza tubului la ptrat, care crete cu mrirea capacitii acestora. Pentru nivel industrial se utilizeaz variate modele de centrifugi, majoritatea fiind cu alimentare continu, ndeprtarea continu a supernatantului i ndeprtarea semicontinu sau continu a depunerii solide. n cazul n care precipitatul este ndeprtat discontinuu sau semicontinuu, acest proces decurge prin splarea automat, cu ap sau soluie specific, a depunerii solide fapt ce poate crea probleme dac precipitatul este apoi utilizat n tratamente suplimentare. Centrifugarea reprezint un proces preferat n biotehnologii, mai ales n producia de preparate enzimatice deoarece posibilitatea de afectare a activitii enzimatice este minim. n fig. sunt prezentate principiile constructive i funcionale a unor dintre cele mai utilizate tipuri de centrifug la nivel industrial. Eficiena proceselor de centrifugare poate fi crescut prin creterea diametrului particulelor. Acest lucru se realizeaz prin coagularea sau flocularea particulelor.

Fig. Principiul de baz al funcionrii unor centrifugi industriale.

a) centrifug tubular a crui rotor tubular permite parcurgerea unui drum lung, care ofer

posibilitatea unei clarificri complete. Sedimentul se depune n partea de jos a sistemului i poate fi ndeprtat continuu. b) Centrifug cu spiral continuu. Particulele solide se depun sub aciunea forei centrifuge pe tamburul sub form de urub elicoidal care mpinge sedimentul n fa i lichidul napoi. Prin acest sistem sedimentul este practic uscat la ieirea din centrifug. c) Centrifug continu cu talere dispuse piramidal. Tancul de centrifug conine un numr de talere paralele i uor nclinate care furnizeaz o larg suprafa de limpezire i permite evacuarea sedimentului prin valve laterale i a lichidului printr-un tu la nivel superior. Separarea prin membrane Procesele de filtrare prin membrane au la baz fenomene de difuziune. Astfel sub influena unui gradient de concentraie moleculele unei substane dintr-o soluie trec n soluia mai diluat datorit micrilor de agitaie molecular formnd un flux de difuziune (Fig. a). Fenomenul de difuziune al unui solvent ntr-o soluie, de care este separat printr-o membran semipermeabil, genereaz o presiune osmotic, definit ca presiunea de exces care trebuie aplicat soluiei, pentru a preveni trecerea solventului n soluia mai concentrat (Fig. c). Deci osmoza este o micare net a solventului (apa) prin membrana selectiv datorit diferenelor de concentraie a solutului de cele dou pri ale membranei, adica trecerea apei din partea mai diluata spre cea mai concentrata pana cand presiunea din
7

ambele parti este echilibrata. n procesul de ultrafiltrare sub aciunea presiunii prin membran trec att molecule de solvent ct i molecule de mici dimensiuni (Fig. b).

a .

Fig. Difuzia solventului i/sau solutului n diferite condiii prin membran Aceste fenomene au condus n ultimul timp la dezvoltarea unor proceduri de izolare i purificare nu numai ieftine ci i superioare calitativ. Enzimele au doua caracteristici care sunt importante pentru aceste separari: sunt proteine deci macromolecule si au srcina electric care se schimba cu variatia de pH. Dializa Procesul de dializ se utilizeaz n biotehnologii n special pentru procese de desalinizare. Moleculele de solut destul de mici pentru a trece prin porii membranei vor difuza din partea cu concentraie ridicat n cea cu concetraia sczut. Trstura principal a procesului de dializ este diferenta de concentraie a solutului care va determina micarea acestuia spre egalizarea concentraiei, nefiind necesare pompe sau vid pentru a determina aceast migrare. Acest procedeu este larg folosit mai ales n laborator deoarece dei nu este scump necesit un timp de lucru destul de mare. De exemplu n procesele de purificare a proteinelor adeseori se utilizeaz precipitarea cu sruri neutre. Pentru ndeprtarea srurilor proteinele precipitate sunt introduse n saci de dializ, formai din membrane specifice, acetia sunt nchii etan i apoi scufundai n volume mari de ap distilat sau soluii tampon adecvate. Moleculele mari de proteine nu trec prin porii membranei, rmn n interiorul sacului, n timp ce moleculele mici de sare difuzeaz n ap sau tampon pn la atingerea unui echilibru. Se observ c srurile nu au fost eliminate complet din sacul de dializ dar concentraia lor a sczut foarte mult. Pentru eliminarea practic total a srurilor sacul de dializ se pune n soluii proaspete de tampon sau ap pn se ajunge la purificarea dorit (fig.).
8

Fig. Proces de dializ. n prezent exist i sisteme, comerciale, care conin o membran ntre dou spaii, un spaiu pentru proba ce se va dializa i un spaiu pentru tamponul fa de care se face dializa i care este mai mare deoarece tamponul (apa) fa de care se dializeaz se afl ntr-un volum de 200-300 ori mai mare (fig.). Pe lng desalifiere, este necesar ca n procesele de purificare s fie ndeprtate i alte molecule. De exemplu n lucrul cu proteine i acizi nucleici este adeseori necesar s fie ndeprtai agenii reductori (ditiotreitol, 2-mercaptoetanol), liganzi care nu au reacionat, reactivi de marcare sau conservani.

Fig. Celul pentru dializ n sistem batch. De asemenea acest procedeu se folosete i atunci cnd este necesar s se schimbe tamponul n care se afl proba.