IZOLAREA BACTERIILOR IN VIVO Izolarea bacteriilor in vivo se realizeaza prininocularea la animale sensibile a produselor patologice (exemple: pneumococul sau

Klebsiella pe soarece, bacilul tuberculozei pe cobai, etc.). Produsul patologic se inoculeaza ca atare sau suspensionat in solutie clorurosodica izotona, utilizand seringi si ace sterile. Calea de inoculare este diferita in functie de afinitatile pentru tesut ale germenului: calea subcutanata pentru produsele cu flora de asociatie care ramane cantonata la poarta de intrare; calea intraperitoneala utilizata pentru produsele patologice monomicrobiene; calea intravenoasa; instilare pe mucoasa nazala, calea conjunctivala, per os, intramuscular, intracerebral etc. Daca operatiunea de inoculare a animalului nu este urmata de leziuni, animalul ramanand sanatos, se pot efectua o suita de pasaje oarbe pe animale in scopul exacerbarii virulentei germenului.

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR IN INFECTIILE CU STAFILOCOC Stafilococii sunt germeni ubicvitari, raspanditi in natura (in apa, aer, sol),prezenti pe pielea si mucoasele organismului uman. Stafilococii, in special S. aureus siS. epidermidis, fac parte din flora normala a unor indivizi (purtatori asimptomatici), ca germeni saprofiti, localizarea predilecta fiind fosele nazale. Ei se pot afla la originea unor procese infectioase, fie prin auto-infectie, fie prin transmitere la alti indivizi. Aproximativ 20-75% dintre indivizi sunt purtatori de S. aureus, fapt deosebit de important in urmarirea si aparitia infectiilor nosocomiale. Se apreciaza ca peste 80% din personalul medico-sanitar este purtator de S. aureus. Transmiterea este in special interumana directa (contact direct, maini murdare) sau indirecta, prin alimente sau din mediul exterior. Infectiile umane stafilococice sunt foarte variate. La nivelul pielii si mucoaselorpot genera impetigo, furuncule, foliculite, sindromul pielii oparite sau boala Ritter von Rittershain prin secretie de exfoliatine; la nivel visceral pot fi implicati in producerea deosteomielite, endocardite, septicemii, infectii urinare, toxiinfectii alimentare, enterocolite acute si temutul sindrom al socului toxic TSST-l (Toxic Shock Syndrome Toxin 1), consecinta unei vaginite cu S. aureus secretor de exotoxina 1 la femeile folosind tampoane intravaginale.

Diagnosticul de laborator in infectiile stafilococice este bacteriologic: se urmareste insamantarea si identificarea germenilor, precum si testarea sensibilitatii la antibiotice in vederea instituirii unei conduite terapeutice adecvate.

1. RECOLTAREA PRODUSELOR PATOLOGICE Recoltarea trebuie facuta inaintea administrarii de antibiotice si curespectarea riguroasa a regulilor de antisepsie, atat in ceea ce priveste hemocultura, LCR, lichidul articular, urina, dar si in cazul secretiilor purulente, aspiratul bronsic, exudatele faringiene si nazale. Cel mai mare risc este reprezentat de contaminarea accidentala a prelevatelor cu tulpini de S. aureus si S. epidermidis prezenti la nivelul pielii. In cazul toxiinfectiilor alimentare se vor recolta materii fecale, lichid de varsatura, resturi din alimentul ingerat. In situatiile cand sunt incriminate epidemiile hidrice se recolteaza probe de apa din retaua de aductiune sau din piscine. In mediul spitalicesc se recolteaza probe de pe suprafete si din aer conform normelor antiepidemice in vigoare si in colaborare cu medicul epidemiolog. Pentru depistarea purtatorilor nazofaringieni de stafilococ patogen se recolteaza exudatul faringian si nazal. Transportul probelor recoltate se face cat mai repede la laborator folosind mediile de transport gelozate sau recipiente sterile corespunzatoare (urocultoare, coprocultoare, tampoane pentru exudat faringian sau nazal etc.).

2. DIAGNOSTICUL BACTERIOLOGIC 2.1. Examenul direct: Se efectueaza direct din produsele patologice, prin doua tipuri de preparate: - intre lama si lamela: pentru aprecierea mobilitatii germenului, a prezentei sau absentei capsulei bacteriene; - pe frotiuri fixate si colorate: Gram, albastru de metilen si May-Grunwald Giemsa.

Frotiurile efectuate direct din produsele patologice, colorate Gram, evidentiaza coci Gram pozitivi sferici, asezati in gramezi (in ciorchine de strugure), nesporulati, uneori incapsulati, care, in cazul produselor normal contaminate, pot fi insotiti de alti coci sau bacili (flora de asociatie), polimorfonucleare (PMN) si celule epiteliale, intregi sau detritusuri (urile 1 si 2). Examenul direct intre lama si lamela evidentiaza germeni imobili. Coloratiile cu albastru de metilen si May-Grunwald Giemsa evidentiaza aspectul citologic si relatia dintre fagocite si germeni.

2.2. Izolare in vitro Se insamanteaza produsele pe medii de cultura simple (bulion glucozat, geloza simpla), stafilococii fiind germeni putin exigenti din punct de vedere metabolic, ca si pe geloza cu 5% sange defibrinat de berbec (geloza sange). De asemenea, se pot folosimediile de cultura hiperclorurate, lichide si solide, care contin NaCl in concentratie de 7,5 g%, deoarece permit dezvoltarea preferentiala a stafilococului inhiband flora de asociatie (pentru produsele patologice polimicrobiene sau alimente). Mediul hiperclorurat lichid Chapman este un mediu de imbogatire pentru stafilococ. Dupa insamantarea produsului pe acest mediu si incubare 48 de ore la 37C se fac treceri pe mediul hiperclorurat solid Chapman, care evidentiaza fermentarea manitei, caracter de patogenitate al stafilococului. Stafilococii sunt aerobi, facultativ anaerobi, iar incubarea mediilor se face la 37C fara precautii deosebite. 2.3. Identificare De departe, cea mai importanta specie incriminata in patologia umana este cea aS. aureus, dar, in cazul izolatelor repetate ce provin din hemoculturi, LCR, lichid intraarticular, seroase, in cazul purtatorilor de valve cardiace, imunodeprimati, sunt de aceeasi gravitate si identificarea altor specii de stafilococi, de ex. S. epidermidis, S. schleiferi, S. lugdunensis, S. warneri sau S. haemolyticus. In acest context, utilizarea termenului de stafilococ patogen, stafilococ auriu hemolitic in editarea buletinelor de analiza trebuie proscris, tinand cont de semnificatia clinico-epidemiologica, dar si datorita faptului, unanim acceptat astazi, ca specificitatea unor caractere precum hemoliza, pigmentogeneza sau fermentarea manitei este inconstanta si nu numai apanajul definitoriu al tulpinilor de S. aureus. De aceea stabilirea diagnosticului bacteriologic de certitudine in infectiile stafilococice trebuie sa reprezinte, in final, rezultatul colaborarii dintre medicul clinician si medicul microbiolog.

2.3.1. Caractere de cultura Pe mediile lichide

Stafilococii tulbura uniform mediul cu depozit moderat la fundul tubului de cultura. Pe mediile solide

Pe mediile cu geloza determina aparitia de colonii de tip S (smooth - neted), opace, convexe, de aspect cremos, cu diametrul de 2-3 mm, dar putand atinge si dimensiuni de 7 mm in cazul unei incubari prelungite, de la 48 la 72 de ore. Marginile coloniilor sunt regulate, suprafata lucioasa. Tulpinile de stafilococi cu alterari ale peretelui celular provenind din probe ce contin substante antimicrobiene pot da colonii de tip G (glossy- lucios), pitice, sau de tip G-R (rough- rugos), mici, cu margini imperfecte, granulate. Pe mediu lichid acest tip de germeni nu tulbura mediul, depunandu-se doar la baza tubului sub forma unui mic depozit granular. In cazul stafilococilor cu capsula polizaharidica (slime) acestia dezvolta colonii de tip M, mucoase, in special in cazul culturilor efectuate direct din prelevate. Coloniile sunt pigmentate diferit (alb, aureu, citrin). Clasic, coloniile de S. aureus sunt descrise ca producand un pigment de culoare galben-auriu (oranj), ca o caracteristica relativ constanta, dar acesta productie este descrisa si la alte specii cum ar fi S. saprophyticus, S. hominis, S. haemolyticus si de aceea are o valoare mai mult orientativa. Pigmentogeneza se intensifica dupa 1-2 zile la temperatura camerei. Mediile cu suplimente nutritive (ou, ser, lapte etc.), cum ar fi, de exemplu, geloza P cu lapte, favorizeaza pigmentogeneza. Mai sunt descrise si colonii de S. aureus de culoare galben citrin, portocalii sau albe (urile 3, 4 si 5). Pe mediul cu telurit Baird-Parker coloniile de S. aureus au diametrul de 1-l,5 mm, sunt convexe, negre stralucitoare cu bordura ingusta, alba si halou clar cu diametrul de 2-5 mm. Pe geloza cu 5% sange defibrinat de berbec (geloza sange) tulpinile de S. aureus, dar si S. haemolyticus, produc o zona de hemoliza completa, clara, neta, de tip alfa (se datoreaza eliberarii hemolizinei alfa). Mai pot determina si o hemoliza incompleta, nebuloasa dupa 24 de ore de termostatare, dar dupa depunerea la frigider a placii cu mediu se accentueaza (hemoliza de tip cald-rece), datorata hemolizinei beta. 2.3.2. Caractere morfologice Examenul microscopic al frotiurilor efectuate din culturile crescute in medii lichide sau pe mediile solide si colorate Gram evidentiaza coci Gram pozitivi sferici, asezati in gramezi neregulate, necapsulati, nesporulati (urile 6 si 7). Pe preparatul nativ intre lama si lamela se observa lipsa mobilitatii.

2.3.3. Caractere metabolice Fermentarea hidratilor de carbon

Stafilococii au un metabolism oxidativ fermentativ, spre deosebire de micrococi. Eifermenteaza hidratii de carbon, precum: glucoza, lactoza, maltoza, zaharoza, acidificand mediul. Stafilococii tolereaza medii cu concentratie crescuta de NaCl (7,5 g%), iar 94% dintre tulpinile de S. aureus, spre deosebire de majoritatea celorlalte specii de stafilococi fermenteaza manita cu productie de acid. Aceste proprietati sunt exploatate de mediul Chapman, care contine 7,5 g% NaCl (ceea ce face mediul selectiv pentru genul Staphylococcus) si manita care este fermentata de catre S. aureus.Acidifierea mediului se traduce prin virajul culorii indicatorului de pH (rosu metil) in galben.(ura 8). Testul catalazei

Stafilococii ca si micrococii, spre deosebire de streptococci, poseda o catalazacapabila sa transforme peroxidul de hidrogen in oxigen si apa. Testul se efectueaza pe o lama de sticla port-obiect (prin descarcarea unei colonii dintr-o cultura de stafilococi intr-o picatura de peroxid de hidrogen) sau in tub. Degajarea unor bule de gaz traduceprezenta catalazei. Se prefera recoltarea coloniilor de pe mediul nutritiv gelozat, evitand geloza sange, deoarece pot apare reactii fals positive, in cazul existentei streptococilor, prin antrenarea de hematii din mediu