Sunteți pe pagina 1din 13

Punerea in evidenta a mucinei

se efectueaza prin precipitare cu acizi diluati, alcool, solutie saturata de sulfat de amoniu SO4(NH4)2 . Modul de lucru : se pun intr-o eprubeta 3-4 ml de saliva, la care se adauga cateva picaturi dintr-o solutie de acid acetic 20% sau alcool. Formarea unui precipitat care apare in portiunea superioara indica prezenta mucinei in saliva, care prin adaugarea in exces de acid acetic nu se redizolva.

In eprubeta 5 se adauga 0,5 ml saliva si se lasa sa stea 5-10 minute, interval in care hidroliza amidonului trece prin stadiile de amilodextrina(albastruviolet), eritrodextrina(roz-violet), ajungand la stadiul de acrodextrina(incolora). In eprubeta 6, dupa adaugarea de 0 ,5 ml de saliva se lasa fermentul sa actioneze asupra amidonului timp de 10-30 minute, interval in care amidonul se hidrolizeaza pana la faza de maltoza. Maltoza se pune in evidenta prin reactia Trommer.

Punerea in evidenta a actiunii amilazei salivare se bazeaza pe


proprietatea ei de a hidroliza amidonul. Principiu : amilaza hidrolizeaza amidonul fiert sau compt pana la stadiul de maltoza trecandu-l prin stadiile de dextrine (amilodextrine, eritrodextrine,acrodextrine), care pot pune in evidenta prin clorurarea diferita a acestora in prezenta unei solutii de iod iodurat. Mod de lucru : se iau 6 eprubete ; in fiecare se introduce cate 5 ml solutie de amidon 1% si cate 2-3 picaturi solutie de iod iodurat 1% ; se observa aparitia culorii albastre caracteristica, datorita formarii iodurii de amidon. -Prima eprubeta se pastreaza ca martor. - in a doua eprubeta se adauga 0 ,5 ml saliva fiarta. Datorita inactivarii amilazei prin fierbere, nu se produce nici o modificare de culoare. - in eprubeta a3-a se introduce 0 ,5ml saliva ; dupa 2-3 min se observa aparitia culorii albastre caracteristica amilodextrinei. Pentru a opri hidroliza amidonului la acest stadiu, se fierbe continutul eprubetei inactivandu-se amilaza. Se constata ca prin fierbere, coloratia dispare, continutul epribetei devenind incolor. Se raceste aprubeta la curent de apa, dupa care culoarea specifica amilodextrinei (violet-albastru), reapare. In caz ca nu reapare, se mai adauga 1-2 picaturi din solutia de iod iodurat. In eprubeta 4 se adauga deasemenea 0,5 ml saliva si se constata ca dupa 2-3 minute apare culoarea violet-albastru(amilodextrina) , iar la 3-5 min aceasta culoare vireaza spre roz-violet, caracteristica eritrodextrinei, un stadiu mai inalt in hidroliza amidonului. Pentru a opri hidroliza amidonului la acest stadiu, se fierbe continutul eprubetei, procedandu-se ca mai sus.

Punerea in evidenta a maltozei- reactia lui Trommer.


Principiu : in mediul alcalin si calsd, maltoza (glucid reducator) reduce solutia de sulfat de cupru la oxid cupros. Metoda de lucru : se iau intr-o eprubeta 3-4 ml solutie de maltoza si un volum egal de hidroxid de sodiu, se omogenizeaza, se adauga picatura cu picatura din solutia de sulfat de cupru 10%, agitand mereu. Se continua adaugarea sulfatului de cupru pana cand precipitatul albastru de hidroxid cupric care se formeaza nu se mai dizolva. Firband lichidul albastru inchis, care s-a obtinut, se observa formarea unui precipitat rosu-caramiziu de oxid cupros. Reactiile care au loc sunt : in prezenta functiilor alcool ale glucidului, hidratul cupric albastru, care se formeaza cand se adauga sulfat de cupru peste hidratul de sodiu, se dizolva, deoarece s e formeaza complexe moleculare solubile datorita functiilor alcool din componenta glucidelor. In absenta substantelor cu functii alcool sau dupa ce aceste functii au fost legate, hidratul de cupru nu se mai dizolva si ramane sub forma unui precipitat albastru. SO4Cu+2NaOH=SO4Na2+Cu(OH)2 Prin fierberea hidratului de cupru, in absenta unui reducator, acesta trece in oxid cupric (negru) . in prezenta unui glucid reducator (prezenta gruparilor aldehidice libere din compozitia glucidelor) , hidratul cupric este redus la hidrat cupros si apare sub forma unui precipitat rosu-caramiziu, iar functia aldehidica se oxideaza in acid (acid gluconic).

Influenta temperaturii asupra activitatii amilazei


Amilaza salivara (ptialina) este o alfa-amilaza, a carei actiune este conditionata de pH-ul mediului care trebuie s fie slab acid, neutru sau alcalin (pH optim = 6,6) ; prezenta clorului (metalele grele inhiba activitatea) ; temperatura optima este de 38C. Influenta temperaturii se poate evidentia prin urmatoarea experienta : Modul de lucru : in trei eprubete se ia cate 3 ml din sol de amidon 1% , 5ml saliva si o picatura de iod iodurat. Solutia de amidon din cele 3 eprubete se colreaza in albastru. Se trece imediat fiecare eprubeta intr-un pahar cu apa de temperaturi diferite : 30-40C , 20C(temperatura de camera) si unu la 15-16C(apa din robinet). Se da drumul la cronometru si se urmareste timpul in care se produce hodroliza pentru fiecare temperatura in parte. Se observa ca hidroliza se produce mai intai la temperatura de 38-40C , apoicea de la temperatura camerei, iar la temperatura de robinet se produce mult mai tarziu. Temperatura scazuta sau temperatura de 0C inhiba reversibil activitatea amilazei din cauza denaturarii suportului proteic al enzimei.

Evidentierea tiocinatului
In saliva se gaseste sulfociant (SCN-) de sodiu si potasiu. Exista un produs de excretie rezultat al metabolismului proteic ; eliminarea lui prin saliva reprezinta un mecanism de detoxofoere a organismului de cianuri. In saliva fumatorilor si dupa ingestia de fructe se gaseste in cantitati mai mari. Se pune in evidenta sub forma de sulfociant feric. Modul de lucru : se inghite capsula ce contine iodura de potasiu. Dupa 10 minute se recolteaza saliva intr o serie de eprubete. Intr-o alta serie de eprubete se gateste un emestec de 1ml de nitrit de sodiu si 1 ml acid sulfuric. Peste acest amestec se adauga saliva, se omogenizeaza si se adauga 1 ml solutie de amidon. In prezenta iodului din iodura de potasiuxcretata in saliva, amidonul se coloreaza in albastru. Amestecul de nitrit de sodiu si acid sulfuric pune in libertate acid azotos, care descompune iodura de potasiu excretata prin saliva si iodul pus in libertate coloreaza amidonul in albastru.

Dozarea acidului clorhidric din sucul gastric.


Principiu: prin metoda titrimetica, aciditatea sucului gastric se neutralizeaza cu o solutie de hidroxid de sodium N/10, in prezenta reactivului Topffer (10,25 paradimetilaminobenzen in 100 ml alcool) si a ftenoftalinei 1% in alcool. Modul de lucru:intr-un pahar Ehrlenmeyer se iau 10 ml suc gastric si 3-4 picaturi reactive Toppfer. In prezenta acidului clorhidric liber se coloreaza in rosu. Se adauga dintr-o biureta picatura cu picatura hidroxid de sodiu N /10, pana ce culoarea vireaza spre galben- portocaliu. Se noteaza cu n1 numarul de millilitri de NaOH intrebuintat pentru neutralizarea HCl liber. Se adauga in fiecare flacon 2-3 picaturi de fenoftaleina sis e continua titrarea cu NaOH pana ce culoarea devine roz, indicand neutralizarea HCl combinat si prezenta unui exces de hidroxid. Se noteaza numarul de mililitri de NaOHintrebuintat pentru neutralizarea aciditatii legate din cei 10ml suc gastric cu n2. Rezultatele se exprima in unitati clinice sau unitati Jaworski, sau in grame de HCl pentru 100 sau 1000 ml suc gastric. O unitate Jaworski reprezinta nr de ml NaOH n/10 unitati utilizati pentru neutralizarea HCl din 100 ml suc gastric. 2

Evidentierea fosforului salivar


Fosforul se pune in evidenta sub forma de fosfomolibdat de amoniu. Modul de lucru : se ia intr-o eprubeta 3-4 ml de saliva, se aciduleaza cu 3-4 picaturi de acid azotic si se adauga molibdat de amoniu in exces. Prin incalzire atenta in prezenta fosforului apre un precipitat galben de fosfomolibdat de amoniu.

Evidentierea calciului salivar


Calciul se pune in evidenta sub forma de oxalat de calciu. Modul de lucru : se iau intr-o eprubeta 2-3 ml de saliva pe care se adauga cateva picaturi dintr-o solutie de oxalat de amoniu 10%. In prezenta Ca, se obtine un precipitat alb insolubil de oxalat de calciu. Examenul microscopic evidentiaza cristale octoedrice.

Nr de ml NaOH N/10 intrebuintat pentru neutralizarea a 10ml de suc gastric se inmulteste cu 10 pentru a exprima rezultatul in ml NaOH N/10 la 100ml suc gastric. Acidul clorhidric liber= n1 x 10= UC Acidul clorhidric combinat = n2 x 10= UC Acidul clorhidric total = n1+n2=UC(n1+n2) x10 =UC Pentru a exprima rezultatul in g de HCl la 1000, se inmulteste n1 si n2 cu echivalentul gram al solutiei de HCl n/10= 0,00365 x 100= gHCl %0 Acidul clorhidric liber= n1x0,00365 x 100= gHCl %0 Acidul clorhidric combinat = n2 x 0,00365 x 100= gHCl %0 Acidul clorhidric total = n1+n2 x 0,00365 x 100= gHCl %0 Valorile normale ale aciditatii sucului gastric : Unitati clinice (Jaworski) UJ HCl liber =15 UJ ; HCl combinat= 25 UJ Aciditatea totala =40 UJ In grame la %0 HCl liber =0,9-1g%0; HCl combinat= 1-2,5g %0 Aciditatea totala= 2-3,5 g %0 Calculul in mEq/l: 1 Eq HCl contine 3,6 g; 1 mEq HCl contine 0,0 365g Aciditatea in mEq/l = 

Modul de lucru: se pun pe o capsula de portelan, cateva picaturi de suc gastric filtrat si apoi 3-4 picaturi de reactiv Gunsburg (solutie alcoolica de vanilina si fluoroglucina). Se incalzeste la o flacara pana la evaporare. Daca exista acid clorhidric liber apare culoarea rosie. Evidentierea aciditatii libere a sucului gastric trebuie efectuata pe lichid proaspat, intrucat HCl liber se volatilizeaza. *** In cazuri patologice, in lipsa acidului clorhidric din sucul gastric, se produc la nivelul stomacului, sub actiunea florei microbiene, procese de fermentatie, ce determina aparitia de acizi organici mici (acid lactic, butiric).

Punerea in evidenta a acidului lactic.


Sucul gastric normal nu contine acid lactic. In hipociditate sau anaciditate (din cancerul gastric) si in staza gastrica (din stenoza pilorica), glucidele fermenteaza producand acid lactic. Punerea in evident a acidului lactic se bazeaza pe proprietatea oxiacizilor de a da cu sarurile ferice reactii de culoare. Reactia Berg Principiu: acidul lactic, in prezenta sarurilor de fier, formeaza lactate de fier de culoare galbena . Modul de lucru : se iau intr-o eprubeta 8-10ml din reactivul Berg peste care se adauga 1-1,5ml din sucul gastric. In prezenta acidului lactic se obtine o culoare galbena, datorita lactatului de fier. Reactia nu este influentata de acidul buturic sau acetic, ce eventual se pot gasi in stomac. Reactia Uffelman Se iau intr-o eprubeta 5-6 ml din reactivul Uffelman, peste care se adauga 1 ml din sucul gastric de cercetat. In prezenta acidului lactic, culoarea violeta a reactivului vireaza in galben.

HCl combinat = Aciditatea totala = (n1+n2) 10 Valoarea aciditatii totale = 100mEq/l - 120mEq/l

Punerea in evidenta produsilor de digestive gastric a proteinelor.


Principiu: produsii de scindare a proteinelor din sucul gastric se separa prin precipitarea cu saruri neutre, se izoleaza prin filtrare si se identifica prin reactia biuretelui. Tehnica de lucru : 3

Punerea in evident a acidului clorhidric liber in sucul gastric


Principiu:incalzim pana la evaporare acidul clorhidric liber in prezenta unei solutii de fluoroglucina. Se obtine o culoare rosie.

-precipitarea acidalbuminelor intr-o eprubeta se iau 10ml de suc gastric (cu produsi de digestie peptica), se adauga cu pipeta picatura cu picatura solutie de NaOH 4%, se agita dupa fiecare picatura pana apare o usoara tulburare care prin lasarea eprubetei in repaus se intensifica. Aceasta se datoreaza aparitiei unui strat fin de acidalbumine, format in mediul neutru ; Depasirea punctului izoelectric, prin adaugarea de NaOH in exces, impiedica obtinerea precipitatului de acidalbumine, deoarece acestea, in mediul alcalin, se transforma in alcalbumine, solubile in mediul bazic. Se filtreaza, recoltandu-se filtratul intr-o alta eprubeta ; precipitatul de acidalbumine este retinut, iar albumozele primare, secundare si peptonele trec in filtrat. Acidalbuminele de pe hartia de filtru se dizolva cu 3-4 picaturi solutie de NaOH 4% si 2-3 ml apa distilata. In solutia astfel obtinuta se face reactia biuretelui care pune in evidenta legatura peptidica, prin adaugarea in exces de solutie de NaOH 20% si o picatura de CuSO4 1%. Continutul eprubetei se coloreaza in albastru-violet , datorita prezentei acidalbuminelor. -precipitarea albumozelor primare : se face adaugand filtratul obtinut dupa retinerea acidalbuminelor un volume gal de solutie saturate se sulfat de amoniu. Precipita albumozele primare, care se retin prin filtrarea acestui precipitat de pe hartia de filtru si care se dizolva cu apa distilata ; din produsul de solvire se face reactia biuretelui. Continutul se coloreaza in albastru-violet, tocmai datorita prezentei albumozelor primare. -precipitarea albumozelor secundare se face adaugand filtratului obtinut dupa retinerea albumozelor primare sulfat de amoniu cristale pana la obtinerea unei solutii saturate. Precipita albumozele secundare care se retin pe hartia de filtru dupa filtrarea acestui precipitat . precipitatul retinut se dizolva cu apa distilata si din produsul obtinut se face reactia biuretelui. Continutul se coloreaza in violet rosietic. Ultimul filtrat obtinut dupa precipitarea albumozelor secundare contine peptone care se evidentiaza tot prin reactia biuretelui, prin care se coloreaza in roz.

Acidul clorhidric din sucul gastric transforma albuminele in acidalbumine, iar pepsin hidrolozeaza acidalbuminele pana la peptone, trecandu-le prin stadiile intermediare de albumoze primare si secundare. Daca in sucul gastric nu se afla acid clorhidric sau pepsina, digestia proteinelor nu are loc. Dintre aceste component ale sucului gastric, acidul clorhidric poate fi diminuat sau poate lipsi uneori din sucul gastric, in schimb pepsin lipseste in foarte rare cazuri. Principiu: proteina (albusul de ou fiert sau fibrina) este hidrolizata in prezenta unei solutii de HCl si pepsina la pH 1,4-1,7. Modul de lucru : se iau 2 eprubete in care se pun cate 10 ml suc gastric si numai in a doua eprubeta se adauga cateva picaturi de acid clorhidric n/10. Se trec eprubetele la termostat la 37C timp de 3 ore. Interpretarea rezultatelor : -proteina din ambele eprubete este dizolvata. Aceasta inseamna ca sucul gastric contine cei doi factori proteolitici (HCl si pepsina). -proteina a ramas intacta in prima eprubeta si s-a dezolvat in a doua. Inseamna ca sucul gastric contine cei doi factori proteolitici (HCl si pesina).

Evidentierea actiunii labfermentului


Labfermentul din sucul gastric a noilor nascuti are rol in coagularea cazeinei(protein din lapte); pH-ul optim de actiune al reninei este cuprins intre 4,5-5,5. Principiu : Cazeina din lapte, la pH 4,6 , sub actiunea labfermentului trece in paracazeina, care in prezenta ionilor de Ca++ trece in paracazeinat de calciu. Materiale necesare : eprubete, termostat, solutie de clorura de calciu 10%, sol de labferment 1% si lapte. Modul de lucru Se iau 4 eprubete in care se introduce cate 4 ml de lapte. -in eprubeta 1, peste lapte se adauga 0,5 ml din solutia de labferment, se lasa la temostat la 38C, dupa 30 minute se observa coagularea cazeinei. -in eprubeta 2, se adauga peste lapte 0,5 ml solutie de labferment, care in prealabil a fost inactivat prin fierbere. Lasand eprubeta la termostat 38C, coagularea nu se produce. 4

Activitatea clorhidopeptica a sucului gastric.

- in eprubeta 3, peste lapte se adauga 1 ml solutie de oxalat de potasiu, pentru a bloca ionii de calciu si apoi se adauga labferment. Lasand eprubeta la termostat 38C timp de 30 minute, coagularea nu are loc. -in eprubeta 4, peste lapte se adauga 1 ml oxalat de potasiu 1% si 0,5 ml labferment si se lasa la termostat 30 min. Coagularea nu are loc. Adaugam 1 ml din solutia de clorura de calciu. Se observa ca imediat se produce coagularea. Aceste experiente explica cele 2 faze care au loc : Faza 1 : cazeina de lapte, sub actiunea labfermentului , trece in paracazeinat, care este solubil. Aceasta faza nu necesita prezenta ionilor de calciu. Faza 2: paracazeina solubila, in prezenta ionilor de Ca++, trece in paracazeinat de calciu, care este insolubil.

Solubilitatea acizilor grasi Principiu: sarurile biliare din acizii biliari au proprietatea de a solubiliza acizii grasi(care rezulta din hidroliza lipidelor, sub actiunea lipazei) si de a forma cu acestia complecsi coleinici, care reprezinta una din formele de absorbtie a lipidelor la nivelul intestinului. Modul de lucru: se ia intr-o eprubeta 5-6 ml solutie diluata de sapun. Se adauga cateva picaturi de acid sulfuric diluat. Se observa in eprubeta aparitia unui precipitat datorita acizilor grasi eliberati. Acizii grasi nefiind solubili se aduna la fundul eprubetei. Se adauga peste acesti acizi grasi 3-4 ml din solutia care contine sarurile biliare si se observa ca, dupa agitare, precipitatul de acizi grasi se solubilizeaza. Solubilizarea colesterolului Colesterolul din compozitia bilei se mentine in solutie datorita prezentei sarurilor biliare. Modul de lucru : se ia intr-o eprubeta 2-3 ml solutie coloidala de colesterol. Se adauga 4-5 ml solutie de saruri biliare si se incalzeste eprubeta in baie de apa. Dupa catva timp se observa ca solutia devine limpede.

Evidentierea actiunii sarurilor biliare


Constituientii active ai bilei sunt sarurile biliare, reprezentate de glicocolatul de sodiu si taurocolatul de sodiu, saruri alcaline ale acizilor biliari. Efectul de emolsionare a lipidelor Principiu : sarurile biliare scad tensiunea superficiala ce apare la contactul dintre apa si particolele de grasime, emulsionand lipidele. Modul de lucru : peste solutia de saruri biliare se adauga 1ml untdelemn ; se agita bine pentru omogenizare si apoi se lasa in repaus. Se observa ca cele doua straturi, solutia de saruri biliare si untdelemn, care initial erau nemiscibile, se prezinta sub forma de emulsie. Efectul de scadere a tensiunii superficiale.a lichidelor in care se afla dizolvate sarurile biliare se evidentiaza prin reactia Hay. Principiu: floarea de sulf presarata pe suprafata apei se mentine la suprafata ; presarata la suprafata unei solutii cu saruri biliare, cade la fundul eprubetei, in 2-3 min. Modul de lucru: se iau intr-o eprubeta 3-4 ml apa si se presara usor cu floare de sulf, care ramane la suprafata. In prezenta sarurilor biliare, cade la fundul eprubetei.

Evidentierea sarurilor minerale Reactia Pettenkofer


Principiu: sarurile biliare dau cu oximetilfurfurolul un produs colorat in rosu-violet. Modul de lucru : se ia intr-o eprubeta 1ml zaharoza 10%, peste care se adauga 3-4 ml din solutia de saruri biliare sau bila. Se agita bine. Se tine eprubeta inclinata si se lasa sa se prelinga incet pe peretele eprubetei 1ml acid sulfuric concentrat in asa fel ca acesta sa se stratifice cu lichidul din eprubeta . Acidul sulfuric cade la fundul eprubetei. Pentru evitarea incalzirii este bine sa se tina eprubeta in jet de apa la robinet. Se observa la limita de separare intre solutia de bila si acidul sulfuric aparitia unui inel rosu-violet.

Evidentierea pigmentilor biliari


Pigmentii biliari sunt produsi ai metabolizarii protoporfirinei IX, rezulta din degradarea hemoglobinei la nivelul sistemului reticulo-endotelial (ficat, splina, maduva osoasa). Sunt reprezentati prin bilirubina si biliverdina. 5

Punerea in evidenta a pigmentilor biliari se realizeaza prin mai multe metode.

Metoda Gmelin
Material necesar: eprubeta, solutie de pigmenti biliari (bila), acid azotic concentrat in care se adauga cristale de nitrat de sodiu. Modul de lucru : intr-o eprubeta se iau 5-10 ml solutie de cercetat. Cu o pipeta efilata se introduce in fundul paharului acid azotic concentrate, avand grija ca cele 2 lichide sa nu sa se amestece. Se observa ca la limita de separare apar o serie de inele, galben-rosu, violet-albastru si verde datorita oxidarii inegale a pigmentilor biliari. Prezenta bilirubinei este indicata de inelul verde.

Reactia Rosenbach
Material necesar : hartie de filtru, solutie de cercetat, acid azotic concentrat in care se adauga cristale de nitrit de sodiu. Modul de lucru : se lasa sa cada pe o hartie de filtru asezata pe o placa de portelan, 2-3 picaturi de solutie de cercetat. In mijlocul hartiei de filtru, peste pata formata se mai adauga o picatura de acid azotic concentrat. In jurul picaturii apar pe hartie cercuri concentrice colorate in galben-rosu, violet-albastru si la exterior verde, caracteristic biliverdinei.

Evidentiaza si dozeaza bilirubina perehepatica (indirect, neconjugata) si posthepatica (directa, conjugata). Principiul metodei: bilirubina da cu sarurile de diuazoniu azoderivati colorati in rosu. Reactia este directa pentru bilirubina posthepatica si indirecta pentru bilirubina perhepatica (necesita mai intai desfacerea de pe proteina transportoare). Materiale necesare: colorimetru, pipete, eprubete de centrifuga. Modul de lucru: bilirubina conjugata da reactie directa. -se iau 1ml ser si 1ml reactiv diazo in cuva colorimetrului. Se constata imediat, in 10-30 secunde aparitia unei culori violet, datorita formarii diazobilirubinei. Intarziat dupa 3-15 minute sau chiar mai mult, apare o coloratie rosietica ce variaza treptat spre violet. Serul care da reactie indirecta o da sip e cea indirect, dar invers nu. Bilirubina neconjugata da reactia indirecta: Se iau intr-o eprubeta de centrifuga 1ml ser si 2 ml alcool, pentru precipitarea -albuminei. Se agita si se centrufugheaza ; din supernatant se ia 1ml, se adauga 0,25 ml din reactivul diazo si 0,5 ml alcool. O coloratie rosie-violacee apare aproape imediat. Determinarea cantitativa a pigmentilor biliari: se iau in eprubeta de centrifuga 1 ml de ser, se adauga 0,5 ml reactiv diazo si se agita. Dupa 5 minute, se adauga 2,5 ml alcool. Se centrifugheaza. Se dozeaza bilirubina spectofometric, in supernatant, citirea facandu-se fata de o solutie etalon de sulfat de cobalt. Concentratia normala a bilirubinei totale in sange= 0,5- 1,2 mg%, bilirubina indirecta reprezentand maximum 0,4% . cresterile bilirubimiei totale se poate datora cresterii predominante a uneia dintre componente (bilirubina indirecta creste in hemolize patologice icter hemolitic, cea directa in blocarea evacuarii bilei in duoden- icter mecanic) sau cresterii ambelor tipuri de bilirubina (in afectarea functiei hepatice- hepatite, ciroze, cancere hepatice).

Reactia cu albastru de metilen


Material necesar: eprubeta, solutie albastra de metilen 2%0, solutie de cercetat. Modul de lucru: se ia intr-o eprubeta 3ml din solutia de cercetat, se adauga 1-3 picaturi din solutia de albastru metilen; solutia capata culoarea verde datorita biliverdinei. In absenta biliverdinei, solutia se coloreaza in albastru. Cu cat cantitatea de bilirubina este mai mare, cu ata cantitatea de albastru de metilen necesara spre a vira in culoarea albastru este mai mare. Aceasta metoda poate fi utilizata si pentru determinarea cantitativa a bilirubinei.

Reactia van der Bergh

Determinarea amilazei din urina (a amilazuriei) cu metoda Wohlgemuth


6

Amilaza serica are o concentratie de 16-32 UW, iar cea urinara in jur de
32-64 UW (UW=unitati Wohlegemuth). Tehnica de lucru: Se ia un stativ cu 10 eprubete in care se realizeaza dilutii crescande de urina, deci si de amilaza ; astfel, in prima eprubeta se pun cate 2ml urina,in celelate 9 cate 1 ml solutie de clorura de sodiu 0,9% (ser fiziologic). Din prima eprubeta se ia 1 ml urina si se pune in eprubeta a doua, se amesteca si din acest amestec se ia 1 ml si se trece in eprubeta a treia si asa mai departe. Se obtin urmatoarele dilutii de urina si de amilaza urinara : 1/1 ;1/2 ;1/4 ;1/8 ;1/16 ;1/32 ;1 /64 ;1/128 ; 1/256 ; 1/512 . In fiecare eprubeta se adauga cate 2 ml din Solutia de amidon 1%0 (2mg de amidon), se agita si se lasa la termostat la 37C timp de 30 minute, timp in care se desfasoara actiunea amilazei. Se racesc eprubetele la un curent de apa, se adauga in fiecare cate 3-4 picaturi solutie iodurata. Eprubetele care contin amidon nehidrolizat au o culoare albastra, in cele cu amidon hidrolizat continutul nu se coloreaza. Se noteaza ultima eprubeta in care continutul este incolor, acesta avand o cantitate suficienta de amilaza, care sa scindeaze in intregime cele 2 mg de amidon. Rezultatul se exprima in unitati Wohlemuth. O unitate Wohlemuth = cantitatea de amilaza ce poate hidroliza 1 mg amidon in 30 de minute, la 37C. Cum in fiecare eprubeta s-au introdus cate 1 mg amidon, inseamna ca in eprubeta notate exista 2 unitati Wohlemuth amilaza. Daca a fost vorba de eprubeta 6, in care dilutia amilazei este de 1/32, iar daca la aceasta dilutie se gasesc 2 unitati Wohlemuth in urina diluata, vor fi 2x 32=64 UW in urina nediluata. Daca amilaza este crescuta, mai multe eprubete raman incolore dupa adaugarea de amidon, si doar cateva se coloreaza. La amilazurie scazuta rezultatul este invers : cele mai multe eprubete se coloreaza in albastru si doar primele 2-3 raman incolore. Valori crescute ale amilazuriei si amilazemiei se inalnesc in :

-afectiuni ale glandelor salivare (parotidite, sialoliti), -pancreatitele acute, uneori si in cele cronice. In pancreatitele cronice si insuficienta pancreatica concentratia amilazei poate scadea.

Studiul absorbtiei intestinale si ale sindromului de malabsorbtie


Absorbtia intestinala cuprinde 2 etape importante: digestia principiilor nutritive complexe in lumenul intestinal si traversarea peretelui intestinal de catre produsii de digestie. Cand se suspecta un sindrom de malabsorbtie sunt necesare doua tipuri de explorari functionale:  Explorari statistice biologice, sanguine si urinare, care depisteaza stari carentiale, consecinte nespecifice ale malabsorbtiei.  Explorari dinamice care evidentiaza selectiv malabsorbtia unor substante nutritive sau vitamine. Explorari statistice Hemograma Hemograma poate decela: - anemie hipocroma monocitara prin carenta de fier. - anemie macrocroma prin carenta de vitamina B12 sau acid folic. - anemie cu anizocitoza (micro si macrocitoza) prin lipsa concomitenta de fier si folati. Lipidograma Hipolipemia totala cu hipocolesterolemie denota o malabsorbtie lipidica globala. Proteinemia si elecroforeza proteinelor serice Hipoproteinemia cu hipoalbuminemie reflecta o malabsorbtie proteica posibil asociatta cu o enteropatie axudativa (in acest caz apare si o hipergamaglobulinemie). Calcemia si calciuria pe 24h Hipocalcemia si hipocalciuria sunt martore ale unei carente de vitamina D. Timpul Quick si testul Koller 7

Un timp Quick patologic corectat prin administrarea parenterala de vitamina K arata carente de vitamina K. Aceasta poate sa apara prin deficit de aport, deficit de absorbtie, dismicrobism intestinal.

Algoritm de explorare a bolnavului cu sindrom de malabsorbtie. elemente orientative

biologice -hipoproteinemie -anemie feripriva/macrocitara -hipocalcemie

Clinice -scadere ponderala -edeme carentiale -diaree (>300g/24h)

Criterii de certitudine : -steatoree peste 5g/24h -test D-xiloza : xilozurie < 3,5 g (malabsorbtie jejunala) -test Schilling : eliminare urunara de vit B12 marcate <8% (malabsorbtie ileala)

Diagnostic etiologic : Eliminam : -maldigestoia prin afectiuni gastrice, insuficienta pancreatica sau biliara prin examene paraclinice specifice -parazitoze, prin examen coproparazitologic -tumori IS, prin tranzit baritat. -iatrogen : iradiere, medicamente, rezectii IS-prin anamneza Biopsia jejunala : -atrofie totala regresiva sub regim fara gluten (boala celiaca) -absenta atrofiei totale (deficit de Ig, dismicrobism IS, boala Whipple, alte boli rare).

Teste de laborator utile in diagnosticul sindromului de malabsorbtie (SM) EXAMENUL VALORILE NORMALE VALORI IN SM Dozari serice -albuminele 4-5,2 g/dl -calciu 9-11 mg/dl -colesterol 150-250 mg/dl scazute -potasiu 3,5-4,7 mEq/l -magneziu 1,7-2 mEq/l -vitamina B12 100-700 pg/ml -acid folic 5-21 ng/ml Dozari plasmatice - testul Quick 12-15 secunde Crescut Teste de toleranta -D-xiloza Excretie urinara > 4,5g/ -scazuta mai ales in boala (25g, po) 5h celiaca -glucoza Glicemia creste cu -curba plata in boala (100g, po) minim 35mg/dl caliaca, malabsorbtie DZ -lactoza Glicemia creste cu -curba plata in boala (50-100g, po) minim 20 mg/dl celiaca, deficit de lactaza -sucroza Glicemia creste cu -curba plata in boala (100g, po) minim 20 mg/dl celiaca, afectari enterocitare -vitamina B12 Excretia urinara peste -scazuta in deficit de F1, 7% in 24ore rezectie/ disfunctie ileala Lipide in scaun -eliminarea zilnica la -sub 6g sau 6-9% din Crescuta ingestia de 100g lipidele ingerate Diverse -indicanuria -< 100 mg/24h Crescuta -5-HIIA urinar -1,7-8 mg/24h Teste respiratorii -colil 14C-glicina -eliminare respiratorie de cantitati mici de 14C in 4-8h -eliminare crescuta in dismicrobismul sau disfunctia ileala

-14C-xiloza -glucoza (50g, po)

-idem -eliminare expiratorie de cantitati mici de H2 in 4-8 h -idem -idem

-eliminare crescuta in dismicrobism -idem

-lactuloza(10g,po) -lactoza (50g, po)

-idem -eliminare crescuta in deficit de lactaza

EXPLORARILE DINAMICE 1 Absorbtia glucidelor. TTGO sau hiperglicemia provocata pe cale orala TTGO poate da o idee generala asupra absorbtiei glucidelor, dar metabolismul glucozei este prea legat de functia pancreasului endocrin pentru a reflecta fidel absorbtia enterocitara. Testul la D-xiloza D-xiloza este o pentoza absorbita avtiv in jejun. Dupa absorbtie ea se metabilizeaza leant, independent de functia pancreatica si se elimina urinar. Nivelul sanguin si excretia urinara reflecta absorbtia intestinala. Xilozuria in 5 ore dupa ingesttia a 25g de D-xiloza este normala peste 5g. Valorile scazute sub 5g apar in leziuni ale mucoasei jejunale sau colonizarea bacteriana a intestinului subtire. Testul pozitiv D-xiloza isi creste semnificatia de afectare a absorbtiei intestinale daca se asociaza cu steatoreea. Testul de incarcare orala cu lactoza Se foloseste pentru depistarea dificitului de lactaza. Pacientul a jeun ingera 50g lactoza. Normal nivelul D-glucozei plasmatice sau capacitatea reducatoare a plasmei cresc minimum 30% fata de valoarea initiala.

Testele respiratorii cu glucite marcate cu 14C.


Principiul metodei Testele respiratorii determina eliminarea in aerul expirat a unor metaboliti ai substantelor ingerate. In cazul marcarii substantelor cu 14C se masoara cantitatea de CO2 radioactiv expirat. 14 C provine din degradarea glucidelor de catre bacteriile din intestinul subtire si atunci CO2 apare rapid in aerul expirat sau provine din catabolizarea in organism a metabolitilor dupa absorbtia intestinala si atunci CO2 marcat apare mai tarziu. Se utilizeaza : -lactoza marcata pentru evidentierea unui deficit de lactaza. -D-glucoza si D-xiloza marcate pentru diagnosticul leziunilor mucoasei intestinului subtire sau al dismicrobismului intestinal. Interpretarea rezultatelor In caz de malabsorbtie glucidica debitul expirator precoce al 14CO2 este scazut, glucidele sunt metabolizate de flora colica si apare o crestere tardiva si durabila a 14CO2 expirat. In caz de dismicrobism cu proliferare bacteriana anormala in intestinul subtire debitul 14CO2 expirat creste precoce si tranzitor Diabetul poate stimula o malabsorbtie prin scaderea metabolizarii celulare a glucozei. Testele respiratorii care masoara H2 expirat Principiul metodei Se determina H2 eliminat in aerul expirat, la fiecare 30 minute, dupa ingestia unei doze standard de glucide. H2 provine excluziv din degradarea bacteriana a glucidelor in intestilul subtire sau colon. Cca 20% din H2 produs difuzeaza rapid prin peretele intestinal si se elimina respirator. Se utilizeaza : -lactoza pentru evidentierea unei carente de lactaza. -D-glucoza si D-xiloza pentru malabsorbtia enterala sau dismicrobism. -zaharoza sau alte dizaharide pentru evidentierea unei carente de lactaza. -lactuloza (dizaharid neabsorbabil) pentru masurarea timpului de tranzit in intestinul subtire si pentru evidentierea insufuicientei bacteriene colice.

Interpretarea rezultatelor In caz de malabsorbtie glucidele ingerate ajung in colon unde sunt degradate in flora bacteriana. H2 creste in aerul expirat mai ales in a 2a ora de la ingestie. In caz de dismicrobism cu proliferare bacteriana anormala in intestinul proximal bacteriile catabolizeaza local glucidele si H2 expirat creste precoce. Accelerarea tranzitului in intestinul subtire, tratamente orale sau clismele recente reprezinta surse de eroare. 2 Absorbtia proteinelor. Absorbtia proteinelor este mai greu de explorat. De obicei se determina creatoreea (azotul eliminat fecal) care reflecta global si nespecific absorbtia preteinelor. Creatoreea normala este sub 1,5 g/24h (sub 107 mmol/ 24h) la un aport proteic de 1g/kgcorp/zi. In general enteropatiile exudative nu duc la cresterea creatoreei deoarece proteinele exudate sunt digerate si reabsorbite. 3 Absorbtia lipidelor Absorbtia lipidelor la nivelul intestinului subtire se evalueaza prin dozarea lipidelor fecale. Principiul metodei Se analizeaza scaunul cel putin 3 zile consecutiv. Aportul zilnic de lipide alimentare este de 100 g/zi in cele 3 zile care preced testul si pe durata lui. Interpretarea rezultatelor Normal coeficientul de absorbtie lipidica este de 94%. Steatoreea reprezinta eliminarea fecala de grasimi peste 5 g/24h sau eliminarea de acid stearic peste 21mmol/ H; Testul analizeaza global digestia si absorbtia grasimilor. Nu poate diferentia o malabsorbtie prin deficit parietal de o maldigestie prin deficit de saruri biliare sau lipaze.

10

4 Absorbtia vitaminelor Absorbtia vitaminei B12 (testul Schilling) Acest test investigheaza functia de absorbtie a ileonului si completeaza testul la D-xiloza care exploreaza mucoasa jejunala. Se adauga factor intrinsec exogen pentru asigurarea conditiilor optime de absorbtie. Absorbtia acidului folic Testul studiaza absorbtia deudonala si jejunala deoarece in aceste zone se absoarbe acidul folic. Principiul metodei In cele 3 zile care preced testul se administreaza 15 mg folinat de calciu i.m. zilnic, pentru a satura nevoile organismului. Se preleva o proba sanguina martor, apoi pacientul ingera acidul folic 40mg/kgc. Se dozeaza folatii serici la 60 si 90 minute dupa ingestie. Interpretarea rezultatelor Folatii serici sub 35 ng/ml la 60 si 90 minute semnifica prezenta malabsorbtiei. Absorbtia vitaminei D Se administreaza vitamina D titriata si se determina eliminarea ei fecala. Putem afirma originea intestinala a unei osteomalacii (malabsorbtia de vitamina D) daca cea mai mare parte din vitD radioactiva se regaseste in scaun. Pot aparea maldigestie si malabsorbtie de vit D si in cazul insuficientei biliare deoarece vitamina D este insolubila, deci necesita prezenta sarurilor biliare pentru absorbtie.

Studiul florei intestinale. Evidentierea unui dismicrobism cu proliferare anormala bacteriana


Studiul florei intestinale. Tubajul bacteriologic Flora intestinului subtire se studiaza cantitativ si calitativ prin prelevarea de lichid din prima ansa jejunala. Mod de lucru -La subiectul a jejun se preleveaza lichid din prim ansa jejunala. Sonda se pozitioneaza radiologic. -Recoltarea se face protejat de aerul atmosferic. -Se fac culturi in aero si anaerobioza, pe medii selective se neselective. -Rezultatele cantitative se exprima in numar de bacterii/ml lichid jejunal. Interpretarea rezultatelor -Numarul bacteriilor este mai important decat tipul lor. -La europeanul sanatos nr. Bacteriri jejunale este sub 105/ml. -Flora este reprezentata de bacterii de origine orofaringiana. -In sindroamele de malabsorbtie prin dismicrobism si colonizarea intestinului subtire se gasesc 108-109 bacterii/ml, iar la flora normala se adauga enterobacterii si multi bacili Gram pozitivi si Gram negativi strict aneorobi. -Tubajul jejunal se recomanda cand proliferarea bacteriana in intestin este sugerata prin alte teste: respiratorii, de conjugare a sarurilor biliare etc. Testul respirator cu H2 Acesta urmareste dozarea in aerul expirat a H2 produs de flora bacteriana digestiva. Normal H2 se produce la nivelul cecului prin fermentarea bacteriana a alimentelor care contin hidrati de carbon: fasole, varza etc. 15-20% din H2 produs traverseaza peretele colic si se elimina expirator in cateva minute de la producere. Principiul metodei Se recolteaza aerul expirat si se masoara cu H2 (in ppm) prin metode electrochimice. Daca suspectam colonizarea anormala a intestinului subtire cu bacterii de tip colic se administreaza D-glucoza si D-xiloza care normal se absorb complet pana la cec. Prezenta florei intestinale anormale va produce 11

fermentarea lor precoce, inainte de absorbtie si in aerul expirat va aparea rapid H2 . Cand in tubul digestiv se gaseste flora normala acest test respirator serveste la determinarea timpului de tranzit oro-cecal. Testul de degradare a triptofanului Triptofanul din intestin este metabolizat de flora bacteriana in indican (indoxil-sulfat) care absoarbe in plasma si se elimina urinar. Eliminarea urinara (indicanuria) peste 100 mg/24h reflecta dismicrobism cu proliferarea florei intestinului subtire. Testul terapeutic cu atibiotice In cazul in care perturbarile sunt produse prin dismicrobism, ele dispar dupa administrarea de tetraciclina (1,5-2 g /zi)sau metrodinazol (1-2 g/zi) timp de 7-5 zile.

Exudarea proteica duce la cresterea eliminarii de 131I doar daca se produce in a doua parte a tubului digestiv (ileon si colon). Daca exudatia se produce gastric sau jejunal proteinele marcate sunt hidrolizate, 131I se absoarbe si nu mai apare in scaun. Testul cu 51Cr-albumina Principiul metodei Albumina marcata 51Cr exudata in tubul digestiv proximal este hidrolizata si absorbita pana la cec. Izotopul 51Cr nu este absorbabil si apare in scaun. Se injecteaza intravenos 20-30 micro Ci serumalbumina marcata sau se marcheaza in vivo proteinele plasmatice prin injectarea i.v. de 51CrCl3 . in al doilea caz se asteapta 48 h pentru ca 51Cr nefixat sa se elimine urinar. Se determina zilnic radioactivitatea plasmatica si a scaunului, timp de 6-10zile. Clearance-ul digestiv este dat de raportul

Evidentierea unei eritropatii axudative


Enteropatia exudativa reprezinta un sindrom caracterizat prin pierderea anormala de substante, in special proteinele, in lumenul digestiv. Substantele provin din sange, limfa si lichidul interstitial. Testele utilizate evidentiaza trecerea anormala de proteine plasmatice, in special albumine si imunoglobuline in lumenul gastric si intestinal. Un procent variabil din pool-ul proteinelor plasmatice se catabolizeaza fiziologic la nivelul tubului digestiv. Se admite cca 10% din totalul serumalbinelor sunt distruse in tractul digestiv in 24 ore. Aceasta cantitate creste mult in gastroenteropatiile exudative. Testul cu serumalbumina marcata 131I Principiul metodei -se satureaza in prealabil tiroida cu iod. -se injecteaza intravenos albumina marcata cu 131I -se determina eliminarea de 131I in scaun. Interpretarea rezultatelor Normal cantitatea de 131I eliminata fecal in 24 ore dupa administrare este sub 0,2% din cea administrata.

Cl.digestiv !

radioactivitatea. fecala / 24h radioactivitatea. plasmatica

Interpretarea rezultatelor Clearance-ul digestiv normal al 51Cr-serumalbuminei este de sub 40ml/24h. Valorile crescute semnifica un proces de exudatie gastrointestinala. Daca se administreaza direct serumalbumina marcata se poate masura radioactivitatea scaunului in primele 24 ore dupa injectare. Se considera ca exista o exudatie proteica daca eliminarea fecala este de peste 1% din doza administrata in primele 24h. Pentru diferentierea sediului gastric de cel intestinal al enteropatiei exudative se determina radioactivitatea sucului gastric. Determinarea se poate face in conditii bazale (a jeun) sau dupa stimulare cu pentagastrina. Testul cu alfa1-antitripsina (alfa1 AT) Alfa1 AT este o alfa1-globulina plasmatica rezistenta la activitatea enzimelor digestive si ale bacteriilor din intestin. Ea este un marker endogen, adica se gaseste fiziologic in sange. Dozarea ei in scaun da relatii despre pierderile proteice gastrointestinale. 12

Principiul metodei Se determina nivelul plasmatic al alfa1AT. Se masoara eliminarea fecala de alfa1AT in 24 ore. Rezultatul se exprima in termeni de clearance digestiv al alfa1AT , care este dat de raportul : Cl digestiv alfa1AT =

concentratia. fecala.medie / 24h concentratia. plasmatica

Interpretarea rezultatelor In mod normal clearance-ul digestiv al alfa1AT este sub 12ml/ 24h. Valorile crescute semnifica o enteropatie exudativa. Alfa1AT este degradata la pH sub 3,5, deci metoda nu evidentiaza o exudatie gastrica. In acest caz se inhiba secretia acida gastrica cu blocanti de receptori H2 sau cu inhibitori ai pompei de protoni si se dozeaza alfa1AT fecala.

Explorarea imunologica
Explorarea imunologica a intestinului subtire este complexa. Sunt enumerate cateva directii de cercetare: -testele generale: IDR la PPD, electroforeza proteinelor serice si imunoelecroforeza, dozarea complementului, cautarea autoanticorpilor antinucleari si antigliadina. - in cazul unui deficit imun sau al bolii celiace: determinarea fenotipului HLA, a populatiilor limfocitare. -studiul imunitatii locale: dozarea Ig in saliva si in sucul intestinal, reactii de imunofluorescenta pe biopsii de mucoasa etc.

13