Controle de Qualidade de Injetveis

Febre
Estudos h + 2000 anos funo teraputica

Sculos depois experimentos com material ptrido

IV em animais

Vacinas com S. typhosa

Incio sc. XIX: Pelletier e Caventue quinina

(incio estudos pirexia e antipirticos)

Fim sc. XIX: Centanni estudos sobre pirogenia

1884: GRAM

Febre
1912: Hort e Penfold esterilizao trmica ou
filtrao no eliminava a febre das injees

1923: Seibert febre por IV advinha de substncias

filtrveis, termoestveis e produzidos por GRAM (-)

1942: USP XII 1 teste em coelhos

1952: Westphal e cols produo LPS purificados
febre em coelhos (1ng/Kg)

Dcada de 70: reaes biolgicas e poro lipdica

Pirognios
Pirognio exgeno (PEx): endotoxinas e outros de origem microbiana ou no.

Pirognio endgeno (Pen): produzido em resposta ao Pex Mediador primrio da febre (~15.000 daltons) Produo de PGs

Endotoxina X LPS

LPS

LPS de Bactrias GRAM (-)

Estrutura da superfcie cellular de uma bactria GRAM (-)

Arquitetura geral de um lipolissacardeo

LPS de Bactrias GRAM (-)

Arquitetura geral de um lipolissacardeo

Ao biolgica
Estrutura geral do LPS de Salmonella : Glc = glicose; Gal = galactose; Etn = etanolamina; GlcNac = N-acetil- glicosamina; Hep = heptose; P = fosfsto; R1 and R2 = fosfoetanolamina ou aminoarabinose.

Antigenicidade

Disperso

Endotoxinas
Ao biolgica (Lipdio A): Toxicidade letal
Leucopenia leucocitose Necrose da medula ssea PA Agregao plaquetria Induo de resistncia no especfica infeco Atividade de macrfagos Induo produo de interferon Induo produo de fator necrtico Hipotermia em camundongos Gelificao do amebcito de Limulus Etc. etc.

Endotoxinas
Mecanismo de induo: Fagocitose lipdio A produo de PEn Travessia da BH-E
Ao hipotalmica Lipdio A tb. age no crebro Ratos e camundongos X Humanos e coelhos
No hipertermia Lipdio A ou PEn no atravessam BH-E Hipotermia ao vascular perifrica

Outros Pirognios
Exotoxinas Enterotoxinas Outros mo. Substncias em geral

DESPIROGENIZAO: Por Inativao

1) Hidrlise cido-base (HCl 0,05 N 30 minutos 100
C HAc 1% - 2 a 3 horas 100 C)

2) Oxidao 3) Alquilao 4) Calor seco 5) Radiao ionizante 6) Polimixina B

DESPIROGENIZAO: Por Remoo

1) Lavagem

2) Destilao 3) Ultrafiltrao 4) Osmose Reversa 5) Carvo ativado 6) Atrao (eletrosttica / por membrana hidrofbica)

Pirognios
Coelhos: qualitativa e quantitativamente semelhante ao ser humano. ~1,5 Kg (injeo de 10mL/Kg para gdes volumes tempo excessivo) Fator de segurana Raas pequenas Triagem Reutilizao dos animais Descanso Ateno para doses sub-pirognicas

Teste de Pirognios
Requisitos animal:
Mesmo sexo Adultos Sadios Mesma raa (preferencialmente) Peso mnimo: 1,5 Kg

Gaiolas individuais Temperatura 20 a 23C (variao mxima de 3C)

Teste de Pirognios
Condicionamento:
Ao menos 1 vez At 7 dias antes teste
Se temperatura 0,5C X

Teste:
Animais com T 39,8C Variao interindividual 1,0C

Teste de Pirognios
Registro T:
Preciso 0,1C Insero retal (~6 cm)

Procedimento prvio:
Suspenso alimentao 2 h antes Ambiente: No stress (Dont worry. Pode piorar) Registro T mx 40 min. antes (2 leituras a cada 30
min.) mdia a T controle

Teste de Pirognios
Injeo:
Produto a 37,0 2,0C Em 3 coelhos Veia marginal 0,5mL Volume injetado 10 mL / Kg (ou de
acordo com monografia)

No mais que 10 minutos (salvo indicao contrria

na monografia)

Registro a cada 30 min. por 3 horas.

Teste de Pirognios
Interpretao:
Decrscimos desconsiderados

T = > T durante teste T controle

1 estgio: Nenhum com T 0,5 APROVADO 2 estgio:
+ 5 coelhos

At 3 com T 0,5C e (dos 8) 3,3C APROVADO

Teste de Pirognios

LAL
Limulus polyphemus

LAL
Tachypleus tridentatus

LAL
Limulus polyphemus

LAL
Limulus polyphemus

Salvem os ferradurinhas!!!!!
The Lorch Foundation Detection of Pyrogens HORSESHOE CRABS FUTURE SECURED BY NEW INVENTION NEW DETECTOR FOR PYROGENS IN ULTRA PURE WATER AND WATER FOR INJECTION SAVES USING BLOOD FROM ENDANGERED HORSESHOE CRABS.

Optical biosensor utilising Surface Plasmon Resonance technology. Detection of pyrogens (endotoxin) to below the FDA and Pharmacopoeia limits (0.25 EU/ml). European and United States Patents applied for (Priority date 29 July 1998). Potential to develop a continuous, real-time on line monitor. Eliminates the use of blood extracts from the rare and endangered horseshoe crab species, Limulus. Use in pharmaceutical and micro-electronic manufacturing as well as research and analytical laboratories. Obviates the need for batch testing. "The ideal solution to the problem of ensuring that water is apyrogenic would be an on-line monitor installed at the point of collection. The discovery of such an instrument has been the holy grail of pharmaceutical and ultra pure water industries for several decades ." Leonard Saunders, D.Sc., F.R.S.C., Emeritus Professor of Pharmaceutical Chemistry, University of London The Lorch Foundation in collaboration with Cranfield University's Institute of BioScience and Technology has developed a sensor for the detection of pyrogens in ultra pure water. This sensor will supersede the existing LAL test, an assay utilising blood extract from the Limulus Horseshoe Cra b. The new sensor can detect endotoxin down to the level of 0.01 EU/ml (Endotoxin units per millilitre), which is below the FDA requirements an d those of the United States and European Pharmacopoeias for Water for Injection. The existing LAL test has severe limitations in that it requires discreet batch sampling, must be carried out by trained technicians in a laboratory environment and cannot provide instant results. In order to obtain the material, the rare and endangered horseshoe crabs are fished from the ocean and either bled and returned or crushed and their future is limited. The Lorch Foundation is now seeking an exclusive commercial licensee for the final development and marketing of this patented technology. The new instrument will be developed to provide on-line continuous results utilising optical technology without the need for laboratory batch testing. The product will be used in pharmaceutical and micro-electronic manufacturing as well as in research and testing laboratories. A paper: DETECTION OF PYROGENS IN ULTRA-PURE WATER BY A SURFACE PLASMON RESONANCE BIOSENSOR (Judith A Taylor, Gary Barrett, Walter Lorch, David C Cullen) was published in the peer reviewed journal Analytical Letters, volume 35 Issue 2, 22 February 2002. This can be accessed from: - http://www.dekker.com/servlet/product/DOI/101081AL120002525#abstract

Vantagens EB X Pirog.
Rapidez - 60 min. X 180 min. Maior sensibilidade Menos variabilidade Menos falsos positivos Mais econmico

Teste LAL
Preparao para o teste Padro Endotoxina: 10000 UE (UI) / frasco Sol. Me: reconstituio com H2O grau LAL (5 mL)
Agitao por 30 min. Conservao por no mx.14 dias (refrigerao)

Validao por Testes de inibio e potencializao Controles negativos Sol. Amostra: diluies seriadas da sol. me aps agitao
Ajuste de pH (6,0 a 8,0) com tampes.

Teste LAL
Coagulao em tubo

Lisado do Amebcito de Limulus Teste de formao de gel

Sequncia reacional
Endotoxina

1. Proenzima

Enzima Ativa
Enzima Ativa

2. Protena de coagulao

Cogulo

Teste LAL
Mtodos Fotomtricos

LAL Substrato Cromognico

Teste LAL Mtodo Cromognico

Seqncia Reacional Endotoxina

1. Proenzima

Enzima Ativa
Enzima Ativa

2. Substrato cromognico

COR

Teste LAL Mtodo turbidimtrico

Seqncia Reacional Endotoxina

1. Proenzima

Enzima Ativa
Enzima Ativa

2. Protena de coagulao

TURBIDEZ

Testes cinticos

Testes Cinticos
Slope = -0.204 Y-Int = 3.058 R = -0.998