ESCUELA POLITCNICA DEL EJRCITO DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA INGENIERA EN BIOTENOLOGA Nombre: Rosita Grijalva Richard Gordillo Curso:

Quinto B Fecha: 08-07-2009 Prctica N 9

TEMA: AISLAMIENTO DE RHIZOBIUM, UNA BACTERIA FIJADORA DE NITRGENO DE LOS NDULOS DE LAS RACES DE LA PLANTA DE CHOCHO SILVESTRE (ERYTHRINA CORALLODENDRON) INTRODUCCION Entre los microorganismos del suelo que realizan la fijacin del nitrgeno atmosfrico, los ms comunes y efectivos son los del genero Rhizobium, que colonizan y forman ndulos en las races de las leguminosas, las bacterias obtienen alimento de la planta y sta a cambio, recibe compuestos nitrogenados (Instituto Regional Federico Errzuriz). En las condiciones medioambientales adecuadas, las bacterias fijadoras de nitrgeno producen enzimas que toman el nitrgeno en su forma gaseosa de la atmsfera, y, con los azcares que obtienen de la planta, fijan el nitrgeno dentro de la biomasa bacteriana (Elaine R. Ingham, 2000) Se dan dos grandes divisiones de bacterias fijadoras de nitrgeno: las bacterias fijadoras de nitrgeno simbiticas y las bacterias fijadoras de nitrgeno asociativas (Elaine R. Ingham, 2000). Las bacterias fijadoras de nitrgeno simbiticas, tales como el Rhizobium, se dan en las legumbres. Estas bacterias forman ndulos en las races de las plantas. Y estos ndulos son fciles de contar. Las bacterias fijadoras de nitrgeno asociativas ocupan los espacios entre las clulas de las races de la planta, y no alteran la arquitectura de la raz en absoluto (Elaine R. Ingham, 2000). A finales de la dcada de los 70, Kloepper (1994) utiliz el trmino PGPR (plant growth promoting rizobacterias; rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal) para referirse a las rizobacterias capaces de provocar un efecto benfico en las plantas. Recientemente, la denominacin se ha extendido a microorganismos PGP para incluir hongos y cualquier organismo afn (Vessey, 2003). Sin embargo, en la ltima dcada un inters creciente ha sido dirigido hacia los microorganismos endfitos, los cuales al estar menos afectados por el estrs ambiental y ms aclimatados con su hospedero (Sturz y Nowak, 2000) podran representar una mayor ventaja ecolgica. Sin embargo, la presencia de bacterias endfitas y su papel dependen probablemente del cultivar y de su coevolucin con la especie microbiana (Yanni et al., 2001).

El objetivo de esta prctica es aislar bacterias fijadoras de nitrgeno del gnero Rhizobium de los ndulos de las races de la planta de chocho silvestre (Erythrina corallodendron). Se espera tambin probar diferentes medios de cultivo para el aislamiento de la mayor cantidad de microorganismos fijadores de nitrgeno. Adems se espera identificar mediante tincin Gram los microorganismos fijadores de nitrgeno aislados en los medios de cultivo y comparar cuantitativamente en que medio se obtuvo la mayor cantidad de microorganismos. METODOLOGA 1. Seleccionar una planta, de preferencia una leguminosa para obtener los ndulos de sus races. 2. Escoger una raz que tenga los ndulos y lavarlo con agua de la llave para eliminar la mayor cantidad de suelo. 3. Desprender cuidadosamente el ndulo de la raz y colocarlo en una caja petri 4. Colocar en dos cajas petri alcohol y en otra caja agua destilada 5. Con ayuda de una pinza flamearla en el mechero para esterilizarla, coger el ndulo y colocarlo en la caja con agua y dejarlo por 1 minuto. Repetir el procedimiento en las otras dos cajas con alcohol. 6. Colocar el ndulo en otra caja y machacarlo con un estilete o un hisopo hasta obtener un lquido de color rosado. 7. Inocular un 1ml del lquido obtenido en una caja de agar manitol con extracto de levadura y con ayuda de una asa sembrar por estras. 8. Igual procedimiento hacer en la caja con agar manitol sin extracto de levadura. 9. Invertir las cajas e incubar a temperatura ambiente de 3 a 4 das. RESULTADOS Despus de la incubacin se pudieron observar los siguientes resultados: Tabla 1: Unidades formadoras de Colonias de Rhizobium en las cajas de cultivo Agar Manitol con extracto de levadura Agar Manitol sin extracto de levadura 125 colonias 1.25x104UFC 80colonias 8x103UFC

En el agar Manitol con extracto de levadura se observaron colonias mas separadas, bien definidas, de color blanco aunque en los extremos de la caja se observ un poco de contaminacin. En el agar Manitol sin extracto de levadura se pudo observar colonias no en la misma proporcin que en el agar con extracto de levadura, aqu tambin se pudo observar contaminacin en la caja y algunas colonias de color blanco y otras que eran de color amarillo. Tabla 1: TINCIN GRAM Agar con extracto de levadura Agar sin extracto de levadura Presencia de Bacterias gram negativas, hongos en mayor proporcin, levaduras. Presencia de Bacterias gram negativas, hongos en menor proporcin

DISCUSIN Los resultados obtenidos despus de la prctica se pueden observar en las tablas 1 y 2, los cuales fueron satisfactorios; gracias a la Tincin Gram pudimos observar la presencia de bacterias Gram negativas. Rhizobium es una bacteria gram negativa ampliamente estudiada por su capacidad de fijar nitrgeno al asociarse simbiticamente con plantas leguminosas (Navarro, 1982). Para el aislamiento de las bacterias Rhizobium se utiliz medios de cultivo enriquecidos como es el manitol con extracto de levadura y sin extracto de levadura pudindose observar diferencias entre las cajas inoculadas. Rhizobium para su crecimiento requiere de una fuente de carbono obtenida del manitol y una fuente de nitrgeno que la obtiene del extracto de levadura (TIAEM). El extracto de levadura se a considerado como una de las mejores fuente de nitrgeno probadas, lo cual puede explicarse por la presencia de factores de crecimiento requeridos por la bacterias (Rubio, 19991). Es por ello que cuando se vario el medio y se aadi extracto de levadura, se pudo observar una mayor diversidad de microorganismos como indica la tabla 2 y una mayor cantidad de bacterias que se pudo observar mediante la tincin Gram, con respecto al medio solo con manitol. Adems de levadura, el medio contiene nitrato de calcio que pudo haber influenciado de cierta manera en el incremento de la poblacin microbiana, este incremento puede deberse al calcio, pues se ha comprobado la importancia de este micronutriente para la bacteria, pues ayuda en el crecimiento de la misma (Norris, 1959), la falta de este elemento produce un debilitamiento en las paredes celulares y en consecuencia, las bacterias producidas son ms dbiles.

CONCLUSIONES En este trabajo fue posible la inoculacin de bacterias fijadoras de nitrgeno del gnero Rhizobium de los ndulos de las races de la planta de chocho silestre (Erythrina corallodendron). Se pudo concluir tambin, que el medio de manitol con extracto de levadura es el mejor para el aislamiento de bacterias del gnero Rhizobium ya que report los mejores resultados. CUESTIONARIO Por qu el interior de los ndulos de Rhizobium en leguminosas es rosado y para que sirve? Los ndulos varan en su forma (redonda, alargada o ramificada) y tamao. Depende de la leguminosa, de la cepa de rhizobio, del contenido de N en el suelo y de los factores ambientales. El color interno rojo o rosado indica que los ndulos estn activos, por la presencia de leghemoglobina (protena que interacta con el oxgeno presente en el medio), si el color es blanco o verde, generalmente son inefectivos Los ndulos son efectivos cuando tienen la capacidad de fijar nitrgeno.

BIBLIOGRAFA JOHNSON, H. W., and V. M. MEANS. 1963. Serological groups of Rhizobium jajonicum recovered from nodules of soybean in field soils. Agron. J. 55: 269-271. consultado el 18 de Julio del 2009 Elaine R. Ingham, Andrew R. Moldenke, Oregon State University, Clive A. Edwards, The Ohio State University, Manual sobre la biologa del suelo [en lnea]. Disponible: soils.usda.gov/sqi/concepts/soil_biology/biology.html. consultado el 18 de Julio del 2009 JOHNSON, H. W., and V. M. MEANS. 1963. Serological groups of Rhizobium jajonicum recovered from nodules of soybean in field soils. Agron. J. 55: 269-271. consultado el 18 de Julio del 2009 ABEL, G. H., and L. W. ERDMAN. 1964. Response of lec soybeans to different strains of Rhizobium japonicum. Agron. J. 56: 423-424. consultado el 18 de Julio del 2009 CALDWELL, B. E., and GRANT VEST. 1968. Nodulation interaction between soybean genotipes and serogroups of Rhizobium japonicum. Crop Sci. 8: 680-682. consultado el 18 de Julio del 2009 Vessey K (2003) Plant growth promoting rhizobacter ia as biofertilizers. Plant Soil 255:571-586. consultado el 18 de Julio del 2009 Yanni Y, Rizkabd El-Fattah Y, Squartini A, Corich V, Giacomini A, De Bruijn F, Rademaker J, Maya-Flores J, Ostrom P, Vega-Hernndez M, Hollinswoth R, MartnezMolina E, Mateos P, Velzquez E, Wopereis J, Triplett E, Umali-Garca M, Anarna J, Rolfe B, Ladha J, Hill J, Mujoo R, Dazzol F (2001) The beneficial plant growthpromoting association of Rhizobium leguminosarum bv. trifolli with rice roots. Aust. J. Plant Physiol. 28: 1-26. consultado el 18 de Julio del 2009 Sturz A, Nowak J (2000) Endophytic communities of rizobacteria and strategies required to create yield enhancing associations with crops. Appl. Soil Ecol. 15: 183-190. consultado el 18 de Julio del 2009 Medios de cultivo generales TIAEM, en lnea consultado el 20 de julio del 2009 de http://personal.us.es/espuny/instrumentales/docs/tablas-teoria/Tablas_leccion_5.pdf Norris, D. 1959. The rol of calcium and magnesium in the nutrition of Rhizobium. Aust.J.Agric. Res. Pg: 651-698 consultado el 20 de Julio del 2009 Rubio, M. 1991. Factores que afectan al crecimiento y capacidad de fijar nitrgeno en Bacterias del grupo Rhizobium Leguminosaurum. Tesis Facultad de Ciencias. Departamento de Farmacia. Universidad Nacional de Colombia. Bogot. 133-139 consultado el 20 de Julio del 2009