Sunteți pe pagina 1din 7

Alcooloxidaza

(EC 1.1.3.13 ) Sursa de obtinere: basidiomicete drojdii metilotrofe Localizare : peroxizomi Functie: metabolismul aerob al mediului ce contine metanol drept sursa de carbon catalizeaza prima reactie in oxidarea secventiala a metanolului (metabolismul compusilor C1) Structura cuaternara: octamer alcatuit din 8 holosubunitati Masa moleculara: 643.000 669.000 kD Grupare prostetica: 1 molecula FAD Reactie totala: Alcool + O2 -----> aldehida + H2O2 Specificitate de reactie: activa fata de metanol, etanol, 1-propanol, 2-butanol inactiva fata de alcoolii al caror lant alchil este mai mare de 5, fata de alcoolii secundari si tertiari si fata de alcoolii aromatici

Biosinteza alcooloxidazei de origine microbiana


Sursa de obtinere : celule de Hansenula polymorpha Drojdie metilotrofa Parametrii biosintezei volum de lucru raport inoculare temp de lucru debit de aer in perioada de lag si in urmatoarele ore agitare pH mediu initial corectie pH antispumant durata procesului Caracteristica : alcooloxidaza este inhibata de prezenta apei oxigenate; din aceasta cauza este obligatoriu insotita la nivel celular de catalaza, enzima care descompune apa oxigenata Sistem analitic Sistem celular Alcooloxidaza Alcool + O2 -----> aldehida + H2O2 Catalaza 2 H2O2 --> 2 H2O + O2 Alcooloxidaza Alcool + O2 -----> aldehida + H2O2 Peroxidaza H2O2 +DH2 -----> 2 H2O + D unde D= o-dianisidina oxidata

SCHEMA DE LUCRU Mod de lucru

Mediu nutritiv agarizat Colonii izolate din cultur stoc

Selectie naturala in functie de capacitatea de biosinteza a alcooloxidazei

Mediu minimal de geloza

Mediu de cultura sterilizat

Preinocul pe tuburi cu geloza inclinata


72 h 370 C

Inocul: cultura agitata pe mediu la 380 C, 48 h

Biosinteza in cultura submersa, la 380 C, 36-44 h

Purificare par ial

Celule

Separare prin centrifugare

Celule Hansenula polymorpha

Permeabilizarea peretilor celulari Tampon fosfat de sodiu 0,050,2 M pH 7-9

Cicluri repetate de inghet-dezghet

Dezagregare celule in moara cu bile (Dyno-Mill)

Centrifugare Supernatant Temp 50 C Sulfat de amoniu

Proteine balast Debriuri celulare

Precipitare fractionata cu sulfat de amoniu 0-30% saturatie Centrifugare Supernatant 30% saturatie sulfat de amoniu Precipitat 0-30% saturatie

Sulfat de amoniu

Temp 50 C Precipitare fractionata cu sulfat de amoniu 30-60% saturatie Centrifugare Supernatant 60% saturatie sulfat de amoniu

Precipitat 60% saturatie Solubilizare Omogenizare prin agitare magnetica Dializa Centrifugare Temp 50 C Particule insolubile

apa distilata

Solutie de alcooloxidaza in prezenta de catalaza Filtrare

Adsorbant pe baza de silice Tampon fosfat de sodiu 0,050,2 M pH 7-9

Adsorbtie selectiva

Agitare magnetica

Centrifugare

Catalaza adsorbita

Solutie de alcooloxidaza fara catalaza Regenerare adsorbant Glicerina Conditionare

Produs finit: ALCOOLOXIDAZA


Aspect: lichid de culoare galbena, fara rezidii de decantare Proprietati fizico-chimice: complex solubil in apa Activitate alcooloxidazica: 32- 166 UI Activitate catalazica: max 3% din activitatea initiala

Metoda colorimetrica de dozarea activitatii alcooloxidazei Principiul metodei:cuplare doua reactii enzimatice Alcooloxidaza metanol+ O2 -----> aldehida formica+ H2O2 Peroxidaza H2O2 + o-dianisidina redusa -----> 2 H2O + o-dianisidina oxidata Determinarea activitatii enzimatice
Reactivi si solutii: 1. Reactiv 1: peroxidaza+odianisidina in HCl+tampon fosfat de sodiu 0,05 M pH 7,5+ metanol 2. Solutie H2O2 0,08 M (solutie stoc pentru construirea curbei etalon) 3. Solutie HCl 1,2 N Preparat enzimatic (ml) Apa distilata (ml Reactiv 1 (ml Proba 0,5 1,0 Martor 1,0 Blanc 0,5 1,0

Timp de reactie 30 secunde HCl 1,2 N (ml Preparat enzimatic (ml 1,0 1,0 0,5 1,0

Colorimetrare la 446 nm Calculare rezultate pe baza curbei de etalonare si exprimarea activitatii in Qmoli H2O2 consumat/ml preparat enzimatic/min