INTRODUO A bilirrubina o principal produto do metabolismo do heme

da hemoglobina. Aps 120 dias, as hemcias so fagocitadas pelo SRE (bao e fgado) e a frao heme da hemoglobina serve de fonte para a formao da bilirrubina. Assim, cerca de 80% da bilirrubina formada no organismo deriva da hemoglobina de hemcias. O restante (20%) deriva da degradao de hemoprotenas no hemoglobnicas como catalase e citocromos. A frao heme da hemoglobina degradada em biliverdina pela remoo do complexo ferro-protoporfirina da globina. A biliverdina, por sua vez, transformada em bilirrubina indireta pela ao da biliverdina-redutase. Neste processo, normalmente 300mg de bilirrubina indireta (BI) ou no conjugada (lipossolvel) so formados em 24 horas. A bilirrubina indireta, sendo lipossolvel, pode atravessar facilmente a barreira hemato-enceflica impregnando na clula nervosa, causando o Kernicterus (leso neurolgica grave no recm-nato). Por outro lado, no sendo hidrossolvel necessita ligar-se albumina para ser transportada at o hepatcito. Chegando ao hepatcito, captada na sua face sinusoidal por protenas intracelulares que funcionam como receptores, facilitando a transferncia do pigmento para o interior do hepatcito. O transporte intracelular realizado atravs do complexo proteicopigmentar que transportado dentro do citoplasma at os microcosmos do Retculo Endoplasmtico Liso (REL). Duas protenas chamadas y e z so responsveis por este transporte. Nos microssomos do retculo endoplasmtico liso, a bilirrubina indireta conjugada ao cido glicurnico por ao da enzima UDP-glicuroniltransferase, formando a bilirrubina direta (BD) ou conjugada. A bilirrubina direta hidrossolvel, podendo ser excretada pelos rins. No atravessa a barreira hemato-encefalica. A bilirrubina direta excretada do fgado sob a forma de um complexo micelar com o colesterol, fosfolipdios e sais biliares e atinge o intestino onde sofre ao das bactrias que promovem sua desconjugao, reduo e formao do urobilinognio e estercobilinognio. Uma parte do urobilinognio reabsorvido e recaptado pelo fgado (circulao entero-heptico). Pequena

quantidade (4 mg/24 horas) excretada pelos rins. O estercobilinognio oxidado estercobilina que eliminada pelas fezes. Excretam-se normalmente 200-300mg de estercobilinognio pelas fezes em 24 horas. Quando o trato biliar de um paciente fica bloqueado, a bilirrubina no eliminada nas fezes e as concentraes do soro aumentam,tornando o paciente ictrico (uma descolorao amarelada da pele ou da esclertica). As principais razes para explicar por que os nveis de bilirrubina do sangue podem aumentar na hemlise (onde um aumento da degradao de hemoglobina produz a bilirrubina, que sobrecarrega o mecanismo de conjugao), uma incapacidade do mecanismo de conjugao no interior do hepatcito, e uma obstruo no sistema biliar sendo, portanto a determinao da bilirrubina em amostras de sangue til na avaliao de doenas hepatobiliares e hematolgicas que cursam com alterao no metabolismo. MATERIAIS E MTODO y y y y y y y y y y y y Kit LabTest Ref: 32 ANVISA: 10009010022 Luvas para procedimento Seringa de 5 ml e agulha Garrote Tubos de ensaio Algodo e lcool Micropipetas (P10, P100 e P1000) Espectrofotmetro gua destilada Centrifuga Cubetas de quartz Cronmetro

PROCEDIMENTO Foi realizada a puno venosa de Neiviane Rodrigues Fialho, 21 anos, 52Kg, sexo feminino e no se encontrava jejum, utilizando seringa e agulha descartvel de 5ml, logo aps a retirada de sangue o mesmo foi colocado em 2

tubos de ensaio, cada um contendo 2ml de sangue e em seguida foram numerados, no tubo 1 o sangue foi colocado aplicando uma fora maior e a seringa ainda continha a agulha, logo em seguida foi adicionado 2ml de gua e no tubo agitando o mesmo para induzir uma hemlise, no tubo 2 o sangue foi colocado de forma mais delicada e sem a presena de agulha tentando assim eliminar a possibilidade de hemlise. Aps esse procedimento os tubos foram deixados de repouso por 15 minutos para a coagulao. Logo aps os tubos foram levados a centrifuga por 15 minutos a uma rotao de 3500 rpm. Logo aps a separao do soro, o mesmo foi utilizado com o quit da Labtest que segue o seguinte principio, a bilirrubina dosada por diazotizao e formao de azobilirrubina vermelha com absoro mxima em 525 nm. A bilirrubina direta (diglicurnide) dosada em meio aquoso, enquanto que a total (direta e indireta) dosada por ao de potente solubilizador de ao catalisadora. O sistema Bilirrubina Labtest um procedimento simples,rpido e de grande especificidade para a determinao das bilirrubinas direta e total, em apenas 5 minutos.O reagente Aceletador ,composto de benzoato e cafena tamponada,promove rpida solubilizao e diazotizao da bilirrubina indireta possibilitando obter solues coradas totalmente livres de turvao.A estabilidade do nitrito de sdio constitui fator de segurana na dosagem permitindo o armazenamento de todos os reagentes a temperatura ambiente. AMOSTRA Para uma boa qualidade da analise a amostra deve seguir algumas normas padro para a dosagem de bilirrubina, essas normas pode variar de acordo com reagente utilizado e do kit comercial, algumas recomendaes so feitas pelo prprio fabricante, dentre elas esto o jejum do paciente que recomendado 8 horas de jejum, quanto ao material a ser utilizado pode ser soro ou plasma (EDTA, heparina), o analito quando protegido da luz estvel 4 dias entre 2 8 C e 3 meses a 20C negativos, quanto ao volume isso pode variar de laboratrio por causa do tamanho das cubetas utilizadas no espectrofotmetro.

PRODUTOS UTILIZADOS Bilirrubina, Catlogo 31 ANVISA 10009010022, Labtest Diagnstica, Av.

Paulo Ferreira da Costa, 600 Lagoa Santa, MG, 33400-000 Acelerador: Armazenar entre 15 25 C. Contm cafena 130 mmol/L, benzoato de sdio 260 mmol/L, acetato de sdio 460 mmol/L e surfactante. cido sulfanlico: Armazenar entre 15 25 C. Contm cido sulfanlico 5,75 mmol/L e estabilizador. Nitrato de sdio: Armazenar entre 15 25 C. Contm nitrito de sdio 72,5 mmol/L e estabilizador.

Foram utilizados para fazer a analise os soros dos tubos 1 e 2, o padro do teste mostrado na tabela abaixo.
Branco 1,0 mL ----0,1 mL ----0,05 mL Direta 1,0 mL --------0,1 mL 0,05 mL Total ----1,0 mL ----0,1 mL 0,05 mL

gua destilada ou deionizada Acelerador (n 1) cido sulfanlico (n 2) Diazo reagente Soro ou plasma

Mas devido ao espectrofotmetro do laboratrio de Bioqumica da Universidade Federal do Piau no fazer leituras de pequenas medidas devido ao tamanho de suas cubetas todo esse volume foi duplicado, sendo assim a tabela com as medidas ficaram da seguinte forma:
Branco 2,0 mL ----0,2 mL ----0,1 mL Direta 2,0 mL --------0,2 mL 0,1 mL Total ----2,0 mL ----0,2 mL 0,1 mL

gua destilada ou deionizada Acelerador (n 1) cido sulfanlico (n 2) Diazo reagente Soro ou plasma

O Diazo reagente utilizado tambm teve seu volume aumentado em 3 vezes, o motivo de sua triplicata foi devido a utilizao do teste em 2 amostras para a medida de bilirrubina total e 2 amostras de bilirrubina direta. O volume padro do teste : Preparo do Diazo Reagente: Adicionar 0,010 mL de Nitrito de Sdio (n 3) a 0,3 mL do cido Sulfanlico (n 2).Misturar e usar no dia da preparao. Com a mudana a preparao do Diazo reagente ficou da seguinte forma. Adicionar 0,030 mL de Nitrito de Sdio (n 3) a 0,9 mL do cido Sulfanlico (n 2). Misturar e esperar 5 minutos. Determinar as absorbncias das bilirrubinas direta e total em 525 nm ou filtro verde (500 a 540 nm), acertando o zero com o branco. A cor estvel por 30 minutos.

RESULTADOS Obter os valores em mg/dL para as bilirrubinas direta e total utilizando o fator de calibrao obtido com o Padro de Bilirrubina (Labtest Cat. 32). Bilirrubina (mg/dL) =
   

x 10

Devido a grande reprodutibilidade que pode ser obtida com a metodologia, o mtodo do fator pode ser empregado. Fator de calibrao =

Bilirrubina (mg/dL) = Absorbncia do teste x Fator Com os valores obtidos na analise do material temos os seguintes dados: Bilirrubina total tubo 1 (com hemlise)= 2,500 a

Bilirrubina total tubo 2 (sem hemlise)= 0,040 a Bilirrubina do padro = 0,337 a

Aplicando os clculos temos os seguintes resultados: Bilirrubina (mg/dL) tubo 1 = Bilirrubina (mg/dL) tubo 2 =

 x 10 = 74,18 mg/dL x 10 = 1,19 mg/dL

Os valores tambm so obtidos com a aplicao do fator de calibrao em ambas as amostras, devido a sua grande reprodutibilidade. Fator de calibrao = = 29,67

Bilirrubina (mg/dL) tubo 1 = 2,500 x 29,67 = 74,18 mg/dL Bilirrubina (mg/dL) tubo 2 = 0,040 x 29,67 = 1,19 mg/dL Sangue hemolisado Valor padro Valor encontrado at 1,2 mg/dL 74,18 mg/dL Sangue sem hemlise at 1,2 mg/dL 1,19 mg/dL

DISCUSSO Os mtodos para dosagem das protenas devem ser executados em soro e no em plasma, uma vez que o fibrinognio existente no plasma uma protena e constitu uma interferncia quando se dosam as protenas do soro. O soro hemolisado d resultados pouco exatos e por isso no deve ser usado. Intervalo de Referncia tem como valores normais de bilirrubina os seguintes para cada tipo de paciente. Recm-nascidos Bilirrubina Direta: at 0,4 mg/dL Bilirrubina Total: 1 dia: at 5,1 mg/dL 1 a 2 dias: at 7,2 mg/dL 3 a 5 dias: at 10,3 mg/dL. Crianas, Adolescentes e Adultos Bilirrubina Direta: at 0,4 mg/dL Bilirrubina Total: at 1,2 mg/dL

Nas analises feitas no laboratrio de Bioqumica ficou claro a falta de exatido dos testes aplicados com sangue hemolisado para a dosagem de bilirrubina, com o sangue sem hemlise os valores ficaram dentro do padro normal, enquanto no sangue hemolisado a leitura de absorbncia ficou muito acima do normal girando em torno de 2,500 o que no aceitvel em nenhuma analise bioqumica utilizando espectrofotmetro, pois a absorbncia do aparelho trabalha com luz visvel que tem leitura entre 0 e 1 valores acima ou abaixo dos mesmo no so aceitveis em amostras. Com isso mostra a importncia de uma boa coleta e qualidade da amostra a ser analisada minimizando os erros de analises tanto pr analticos e analticos. de grande importncia a utilizao de materiais de qualidade para as analises e uma boa higienizao das vidrarias utilizadas, pois no era sabidamente conhecido o mtodo utilizado para a limpeza das vidrarias utilizadas e as mesmas podem ter influencia direta na leitura das amostras.

CONCLUSO As causas mais comuns de aumento da bilirrubina direta so as doenas hepato-celulares e das vias biliares, tais como, hepatites, colangites, colecistites, neoplasias, cirrose, alcoolismo, obstruo biliar intra ou extraheptica, mononucleose infecciosa. A bilirrubina direta solvel em gua e, quando sua concentrao encontra-se elevada no soro, esta torna-se positiva na urina. O aumento da bilirrubina indireta indica: aumento da produo (hemlise); diminuio do transporte (anticorpos e medicamentos); defeito da captao (deficincia ou bloqueio das ligandinas) e defeito da conjugao (doena de Gilbert, entre outras). O que podemos concluir com essa aula pratica que a qualidade da amostra e a limpeza do laboratrio influenciam diretamente nos resultados de analises bioqumicas, tanto quanto o preparo do paciente para a coleta de grande importncia. Vale pena ressaltar a importncia de um POP

(Procedimento Operacional Padro), principalmente nos laboratrios em que fazem analises rotineiras com o intuito de minimizar erros e dar uma maior qualidade e confiabilidade nas analises feitas pelo mesmo.