Dicrosmo Circular

Estructura proteica
Lidia Freije Fuente

ndice
1. Introduccin..1 1.1Radiacin Electromagntica.1 1.2Espectroscopia electrnica..3 1.3Isomera.Actividad ptica.4 1.4Dispersin ptica rotatoria..5

2.Dicrosmo circular..6 2.1Fundamento6 2.2Instrumentacin..7 2.3Aplicaciones.8

3. Conclusiones13

4. Bibliografa.14

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1.-Introduccin
1.1 Radiacin Electromagntica

Las ondas electromagnticas constan de campos elctricos y magnticos oscilantes cuyos vectores son perpendiculares entre s y perpendiculares a la direccin la que viaja la onda.

Figura 1.- Onda electromagntica.1 En la Figura 1. se observa radiacin electromagntica polarizada en el plano, significando esto que los vectores de campo elctrico son coplanarios. Otros tipos de polarizaciones son: la polarizacin circular en la que la direccin del campo elctrico rota en torno a la direccin de propagacin a medida que se mueve a lo largo de la onda, haciendo una rotacin completa en una longitud de onda de la luz (puede ser a derecha o izquierda) dibujando un crculo y la polarizacin elptica donde el vector campo elctrico forma una elipse en su giro.

Figura 2.-Representacin de distintos tipos de polarizaciones.

1 Tipler, Mosca, Fsica para la ciencia y tecnologa, Vol. 2, 5ed, Editorial Revert S.A, Madrid 2005

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Muchas de las propiedades de la radiacin electromagntica se explican adecuadamente con un modelo sinusoidal que utiliza parmetros como la longitud de onda, la frecuencia, la velocidad y la amplitud. Adems, a diferencia de otros fenmenos ondulatorios, como el sonido, no necesita medio material para transportarte y se propaga, por tanto, fcilmente por el vaco. Cuando una onda cambia de medio, cambia su velocidad de

propagacin(la mxima es la del vaco) y, por tanto, su longitud de onda.

Figura 3.- Representacin bidimensional del vector elctrico2

El modelo ondulatorio falla al intentar explicar fenmenos asociados con la absorcin o la emisin de la energa radiante. Para comprender estos procesos hay que acudir a un modelo corpuscular en el que la radiacin electromagntica se contempla como un flujo de partculas discretas o paquetes ondulatorios, denominados fotones, en los que la energa de un fotn es proporcional a la frecuencia de la radiacin. El doble punto de vista no es mutuamente excluyente sino complementario. De hecho, la dualidad onda-corpsculo, se aplica al comportamiento de haces de electrones, protones y a otras partculas elementales y se puede racionalizar completamente por medio de la mecnica ondulatoria.

Skoog,Holler,Nieman; Principios de Anlisis Instrumental, 5 ed., McGraw-Hill,Madrid 2001.

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1.2 Espectroscopia electrnica

En espectroscopia se estudia la absorcin y emisin de radiacin electromagntica por la materia. La serie de frecuencias absorbidas por una muestra es su espectro de absorcin. Los espectros electrnicos implican transiciones de los electrones de valencia. El tratamiento mecano-cuntico muestra que una molcula en el estado estacionario Eo que es expuesta a la radiacin electromagntica puede absorber un fotn de frecuencia y originar una transicin a un estado de energa superior, Ef, si la frecuencia de la radiacin cumple que Eo-Ef=h (Figura 1). Esto es debido a la cuantizacin de la energa.

Figura 4 .-Transicin electrnica

La absorcin de luz UV, visible e IR por una muestra se expresa frecuentemente por la ley de Lambert-Beer donde es el coeficiente de absorcin molar o

absortividad molarde la sustancia i a la longitud de onda :

Ecuacin 1.-LeyLambert-Beer

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1.3 Isomera. Actividad ptica.

Figura 5.- Relacin de los distintos tipos de ismeros.

Las molculas con la misma frmula molecular pero con estructura diferente se denominan ismeros. Estos pueden ser de distintos tipos (Figura 5) segn difieran en el orden de unin de sus tomos (Constitucionales) o en la distinta orientacin espacial (Estereoismeros). En estos ltimos hay que destacar los enantimeros que guardan relacin de imagen especular sin ser superponibles distinguindose slo en la desviacin del haz de luz polarizado y son pticamente activos. Una molcula que no es superponible con su imagen especular se dice que es quiral y la relacin de imgenes especulares no superponibles se llaman enantimeros. Para que una molcula sea quiral debe carecer de de eje de rotacin impropio adems de presentar centros asimtricos. El ngulo de rotacin ptica es el ngulo a travs del cual ha girado el vector del campo elctrico de la luz al pasar a travs de la muestra. Para obtener una cantidad caracterstica de cada sustancia pticamente activa se define la rotacin especfica de una sustancia B:

Ecuacin 2.- Rotacin especfica. Lidia Freije Fuente

Depende, por tanto, de la concentracin msica de B por unidad de volumen (densidad si es una muestra pura), del camino recorrido por la luz, de la longitud de onda e, indirectamente, de la temperatura del disolvente. Si el haz de luz gira en el sentido de las agujas del reloj se dice que la sustancia es dextrgira y la rotacin especfica se define como positiva. En el caso contrario, la sustancia es levgira y la rotacin especfica negativa.

1.4 Dispersin ptica rotatoria

La variacin de la rotacin especfica frente a la longitud de onda da el espectro de dispersin de rotacin ptica (DRO) o curva de dispersin rotatoria. Para un compuesto carente de cromforo la actividad ptica disminuye progresivamente a medida que la longitud de onda aumenta y se observa una DRO continua. Para una sustancia con uno o varios cromforos, el DRO es discontinuo y presenta mnimos y mximos que indican la presencia de tales grupos. Cerca y a travs de las regiones de las regiones de absorcin donde hay transiciones de energa, las dispersiones rotatorias pticas se comportan, a menudo, bastante irregularmente. Estas irregularidades, mximos y mnimos provocados por la presencia de cromforos, son llamadas Efecto Cotton. Si la curva presenta un solo mximo y un solo mnimo presenta un efecto Cotton y si presenta varios ser de efecto Cotton mltiple. El Efecto Cotton es positivo cuando el extremo correspondiente a la mayor longitud de onda es positivo y negativo en el caso contrario.

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2.-DICROISMO CIRCULAR

2.1.- Fundamento

El Dicrosmo Circular (DC) es una tcnica espectroscpica de absorcin electrnica basado en la diferencia existente entre el coeficiente de absorcin molar para la luz polarizada circularmente a la derecha o a la izquierda. Las propiedades pticas reflejan la disposicin estereoqumica de un tomo en una molcula.

El espectro de dicrosmo circular de una sustancia es una grfica de frente a la longitud de onda, , donde son los coeficientes de absorcin molar ,

(Ecuacin 1) de la luz polarizada a la izquierda y a la derecha, respectivamente. En lugar de a veces se representa la elipticidad molar .

Los espectros de dicrosmo circular se obtienen generalmente en las regiones del ultravioleta cercano (250-350 nm) y lejano (180-250 nm) de la radiacin electromagntica. Las seales en la regin del UV cercano son extremadamente sensibles a los cambios en la conformacin en una molcula. Dado que la espectroscopia de dicrosmo circular es una tcnica de absorcin electrnica, tambin hablamos de grupos cromforos(grupo funcional responsable de la absorcin del compuesto).

Una molcula quiral (la que carece de eje de rotacin impropio), exhibe dicrosmo circular. Los enantimeros tendrn espectros DC que sern imgenes especulares uno del otro. Los espectros de DC se pueden comparar con espectros de absorcin convencionales para apreciar cosas que no se alcanzan a ver en los ltimos. Con espectroscopia DC se pueden identificar las configuraciones absolutas de los compuestos quirales por comparacin, ya que la misma configuracin absoluta de dos compuestos con configuraciones electrnicas semejantes, darn espectros DC del mismo signo. Tambin se puede comparar con un espectro terico obtenido mediante clculos de densidad electrnica.

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2.2.- Instrumentacin

Figura 6.- Ejemplo de instrumentacin para dicrosmo circular

Bsicamente, el instrumento utilizado para medidas de dicrosmo circular consta de una fuente de radiacin, la cual debe ser monocromada y polarizada circularmente antes de incidir en la muestra, para despus ser recogida por un detector que proporciona los espectros. Las medidas de dicrosmo circular de una sustancia se basan en la diferencia entre sus coeficientes de absorcin al ser irradiada con luz polarizada hacia la izquierda o derecha. Para conseguir este tipo de luz es necesario polarizar primero la luz en un plano y hacerla pasar despus a travs de un dispositivo que separe en sus dos componentes polarizados circularmente a derecha e izquierda. Esto se consigue retrasando uno de los dos componentes un cuarto de longitud de onda. Existen fundamentalmente dos tipos de

dispositivos comerciales que permiten descomponer la luz polarizada en un plano en las dos componentes polarizadas circularmente. Uno de ellos utiliza prismas, como un rombo de Fresnel, y el otro un modulador de retardo electroptico como una clula o celda de Pockels. La celda de Pockels consiste en un cristal tetragonal que en ausencia de campos elctricos tiene un solo eje ptico y que bajo campo elctrico presenta dos ejes pticos, es decir, presenta efecto Pockel. El efecto neto ser la transformacin de luz polarizada en un plano en luz polarizada circularmente hacia la derecha durante medio ciclo y hacia la izquierda durante el otro medio. Si la muestra presenta dicrosmo circular la radiacin neta que llegar al detector estar polarizada elpticamente. Este tipo de dispositivos permiten medir directamente (y no diferencialmente) el dicrosmo circular.

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2.3.- Aplicaciones. Determinacin de estructura proteica.

Muchas molculas biolgicas son pticamente activas. Los espectros de dicrosmo circular de protenas y cidos nuclecos son sensibles a las conformaciones de esas macromolculas y pueden usarse para seguir los cambios conformacionales, en funcin de la temperatura, aproximacin de ligandos, etc.

En el estudio de protenas nos interesa conocer su estabilidad, flexibilidad, interaccin con ligandos y, sobre todo, su estructura.

Figura 7- Mtodos de determinacin de estructura de protenas.

La estructura primaria de las protenas es la secuencia de aminocidos. La secundaria, es el plegamiento que la cadena polipeptdica adopta gracias a la formacin de puentes de hidrgeno entre los tomos que forman el enlace peptdico, es decir, un tipo de enlace no covalente. Los motivos ms comunes son la hlice alfa (Fig.8) y la beta lmina(Fig.9). La estructura terciaria es el modo en que la cadena polipeptdica se pliega en el espacio, es decir, cmo se enrolla una determinada protena, ya sea globular o fibrosa. Es la disposicin de los dominios en el espacio. Por ltimo, la estructura cuaternaria deriva de la conjuncin de varias cadenas peptdicas que, asociadas, conforman un ente, un multmero, que posee propiedades distintas a la de sus monmeros componentes.

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Figura

8.-

Estructura

hlice

Se

estabiliza con puentes de hidrgeno paralelos al eje de la hlice dentro del esqueleto de una sola cadena polipeptdica. Contando desde el extremo N-

terminal, el grupo carbonilo de cada residuo de aminocido forma un puente de hidrgeno con el grupo amino del aminocido que est a una distancia de 4 residuos de la cadena.

Figura 9.- Estructura lmina plegada: Se pueden formar puentes de hidrgeno entre diferentes partes de una sla cadena que se pliega sobre s misma o entre diferentes cadenas. Los puentes de hidrgeno entre cadenas en la lmina dan pie a una estructura repetida en zigzag. Las protenas pueden presentar las dos estructuras de manera alternada en distinta proporcin.

En el caso del dicrosmo circular podemos estimar con cierta precisin los porcentajes de -hlice, plegamiento , etc. Es decir, se puede estudiar la estructura secundaria de las protenas, seguir cambios conformacionales o medir la unin de ligandos.

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El comportamiento rotatorio en macromolculas se debe principalmente a tres factores: La estructura primaria es intrnsecamente asimtrica Las estructuras secundarias de muchas biomolculas son helicoidales La propia estructura terciaria de la molcula

As, la molcula pticamente activa, presenta diferente absorcin de radiacin a derecha e izquierda y por tanto, presenta dicrosmo circular. La absorcin, como ya se ha visto, es debida a la presencia de grupos cromforos en la molcula. En las protenas los principales grupos cromforos se encuentran en: Cadenas laterales de los aminocidos. (Figura 10)

Figura 10.-Aminocido

Enlace peptdico (unin amida creada en la condensacin del grupo amino de un aminocido y el grupo carboxlico de otro aminocido)

Figura 11.- Formacin enlace peptdico entre dos aminocidos

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Grupos prostticos y coenzimas (cofactores que activan la protena al unirse a ella).

El cromforo ms importante es el grupo amida del enlace peptdico, un carbono asimtrico entre dos grupos amida. Las estructuras secundarias formadas por enlaces peptdicos son asimtricas y presentan espectros de dicrosmo

circular caractersticos.

n* *

220 nm 190 nm

La intensidad y energa de estas transiciones dependen de y

El espectro de dicrosmo de una protena nativa depende de la fraccin de sus componentes de estructura secundaria. Cambios en las conformaciones de pptidos y protenas debidas a calentamiento, cambio de disolvente u otra variacin pueden seguirse fcilmente por dicrosmo circular. Adems el espectro de los cromforos en protenas puede indicar interacciones con las molculas en la vecindad inmediata.

Muchas protenas contienen o interaccionan con cofactores o coenzimas (grupos hemo, retinol, etc.) y presentan dicrosmo circular inducido, es decir, se puede observar dicrosmo en la regin de absorcin del soluto no quiral. Esto mismo ocurre con las cadenas laterales de los aminocidos aromticos al formar parte de la estructura tridimensional de una protena.

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En la figura 12 se observa un ejemplo de espectro de dicrosmo circular para las estructuras secundarias proteicas de hlice , lmina y ovillo estadstico (cadena aleatoria) .

Figura 12.- Espectro de dicrosmo circular3

Observamos una banda negativa a 222nm (n *) para la hlice . Para la hoja , una banda negativa a 215-218 nm (->*) y una banda positiva a 196-198 nm (n->*). Por ltimo, para la cadena desordenada hay una banda positiva a 212 nm (->*) y una negativa a 195 nm(n->*).

Thomas M.Devlin, Bioqumica: libro de texto con aplicaciones clnicas, 4ed, Editorial Revert, 2004.

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3.- Conclusiones
La tcnica de dicrosmo circular presenta una serie de ventajas e inconvenientes:

VENTAJAS
Mtodo no destructivo. Estudio de cambios de entorno: pH, agentes desnaturalizantes Desempea un papel importante en la determinacin de los componentes estructurales de las protenas Es rpido y requiere poco material. Capaz de detectar cambios estructurales en una protena que ha sufrido alguna perturbacin Comparacin de estructuras manipuladas por ingeniera frente a la especie nativa.

DESVENTAJAS
Hay que trabajar con tampones muy diluidos que no interfieran en la absorcin. Medidas sujetas a errores experimentales Poca informacin de estructura terciaria o cuaternaria.

El dicrosmo circular es por tanto muy utilizado en el estudio de protenas tanto para estimar el contenido de estructura secundaria, seguir cambios conformacionales o para medir la unin de ligandos.

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4.-Bibliografa

Tipler, Mosca, Fsica para la ciencia y tecnologa, Vol. 2, 5ed, Editorial Revert S.A, Madrid 2005 Skoog,Holler,Nieman; Principios de Anlisis Instrumental, 5 ed., McGraw-Hill, Madrid 2001. Levine, I.N., Fisicoqumica, 5 ed., McGraw-Hill, Madrid, 2004. K.Peter, C.Vollhardt, Neil E.Schore, Qumica Orgnica: Estructura y funcin, 3 ed, Editorial Omega, Barcelona 2000. L.O.Smith,Jr. S.J.Cristol, Qumica Orgnica, Editorial Revert, Barcelona 1970-1972. Actividad ptica, dispersin rotatoria ptica y dicrosmo circular para la qumica orgnica. Monografa n11, Serie Qumica. Whashington,D.C ,1974. Armando Garrido Pertierra, Jos Mara Teijn Rivera; Fundamentos de bioqumica estructural, 2 ed, Editorial Tbar, Madrid 2006. Thomas M.Devlin, Bioqumica: libro de texto con aplicaciones clnicas, 4ed, Editorial Revert, 2004. Eugene D.Olsen, Mtodos pticos de Anlisis, Editorial Revert, 1990. http://www.biologia.ed.ar http://www.phy.ntnu.edu.tw/java/

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