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LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS

FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

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INTRODUCCION

La microbiologa es una ciencia relativamente reciente con respecto a otras ramas de la biologa. El estudio de los microorganismos se inicio a partir de que ANTONIE van LEEUWENHOOK en 1670 invento el microscopio, y que a partir de los estudios de Luis Pasteur en 1876, se logro el mayor desarrollo y reconocimiento de los microorganismos como actores de una gran diversidad de procesos. Aunque durante mucho tiempo estos microorganismos causaron graves problemas de enfermedades en plantas, animales y humanos tambin es cierto que desde la antigedad algunas especies microbianas han sido utilizadas en procesos de produccin de alimentos fermentados como los quesos, vino, pan y cerveza, entre otros y actualmente se ha reconocido su importancia en diversas areas de investigacin bsica, en la industria alimentaria, ambiental y farmacutica. El objetivo general del curso de Microbiologa de Alimentos es que el alumno se inicie en el conocimiento bsico de los microorganismos de importancia en el manejo de alimentos, en sus caractersticas morfolgicas, nutricionales de crecimiento, control y que adquiera las habilidades necesarias para su recuperacin e identificacin en el laboratorio. Este manual contiene 10 prcticas, diseadas para que el estudiante se familiarice gradualmente con los procedimientos de cultivo y observacin de bacterias y hongos recuperables de los diferentes alimentos y agua. El orden de presentacin, corresponde al programa del curso terico de Microbiologa de Alimentos que forma parte del plan de estudios de las carreras de Nutricin y Tecnologa de Alimentos as como de la Licenciatura en Biotecnologa impartidas en la Universidad Interamericana En cada prctica se presentan los objetivos y una breve introduccin para facilitar la compresin de los mismos, despus se indican los materiales necesarios y procedimientos a realizarse en forma de instrucciones numerales que se complementan con figuras y esquemas. Esperamos que este manual ayude a los estudiantes en la comprensin del maravilloso mundo de los microorganismos.

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Recomendaciones para el estudiante Reglas de laboratorio 1. 2. 3. Durante las sesiones siempre se deber usar bata de laboratorio bien abotonada, que deber quitarse antes de abandonar el laboratorio. No deber sacar del laboratorio ningn equipo, medios o cultivos microbianos. Evitar la acumulacin sobre la mesa de trabajo de objetos no relacionados con la prctica de laboratorio. Colocar todos los objetos personales (libros, mochilas, etc.) en la zona especificada por el profesor Se prohbe ingerir y/o almacenar cualquier tipo de alimento o bebida dentro del laboratorio. Se prohbe fumar, aplicarse cosmticos o tocarse la cara con las manos o algn otro objeto. Se deber lavar las manos meticulosamente con jabn y agua antes de salir del laboratorio. Incluso cuando salgas por breves periodos. Por seguridad no se deber pipetear oralmente ningn tipo de cultivos microbianos, esta actividad deber realizarse con pipetas accionadas de forma mecnica o automtica, tratando de evitar la formacin de aerosoles. No se admiten visitas personales que distraigan la atencin y pongan en riesgo la seguridad en el trabajo que se realiza

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Procedimientos de laboratorio 1. Antes y despus de cada sesin practica los alumnos debern limpiar las mesas de trabajo con el desinfectante que se les proporcionara para este fin. Cuando se utilice el mechero, este deber colocarse alejado del microscopio y otros equipos as como de sus cuadernos o prendas de vestir. Al concluir cada sesin el estudiante deber asegurarse que los materiales de desecho u objetos contaminantes sean colocados en recipientes especficos para ello, colocados en lugares apropiados, que les indicara el profesor

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Siempre deber dejar perfectamente limpios todos los equipos utilizados (microscopios, balanzas analticas, autoclave, potencimetros, etc.) y reportar al maestro cualquier irregularidad en el funcionamiento. En caso de producirse un incendio o una herida personal, el alumno deber notificarlo de inmediato al profesor. En el caso de derrame de cultivos o rotura de recipientes con cultivos, deber conservar la calma y adems de informar al profesor, seguir inmediatamente el procedimiento: a) Colocar toallas de papel sobre el material derramado para evitar su dispersin b) Poner abundante solucin desinfectante sobre las toallas c) Dejar trascurrir al menos 15 minutos, retirar las toallas y tirarlas al receptculo destinado a la eliminacin de materiales contaminados

Materiales indispensables en cada sesin de laboratorio. 1. 2. 3. Bata de laboratorio limpia y con botones El protocolo de la practica (practica impresa) Un pedazo de tela limpia y sin pelusa, cerillos, tijeras y marcador indeleble.

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Practica 1 Conocimiento del laboratorio de microbiologa de alimentos y medidas de seguridad


Introduccin El estudio de las bacterias, virus, parsitos, hongos y otros agentes infecciosos que pueden ser patgenos para el hombre, los animales u otras formas de vida comporta riesgos que varan segn el agente infeccioso y los procedimientos utilizados. Las normas de Seguridad Biolgica pretenden reducir a un nivel aceptable el riesgo inherente a la manipulacin de material peligroso y son muy rigurosas para los agentes ms peligrosos y menos exigentes para los que causan problemas de menor entidad. Deben ser consideradas como compromisos destinados a conseguir que las personas que trabajan con agentes infecciosos en el Laboratorio de Microbiologa estn expuestas al mnimo riesgo posible .En el laboratorio de Microbiologa de Alimentos es necesario tener en cuenta que aparte de nuestra seguridad es necesario preservar la seguridad y no contaminacin de los diferentes alimentos a investigar a fin de evitar los resultados falso positivos debido a la contaminacin cruzada. Pongamos pues las siguientes premisas para plantear un esquema de trabajo hacia la prevencin y la seguridad en el laboratorio o en cualquier rea de trabajo. y y y y La seguridad es responsabilidad en lnea jerrquica Todos los accidentes pueden ser evitados Las personas son la base fundamental en la gestin de la prevencin de riesgos Una gestin eficaz de la prevencin de riesgos produce una mejora en el sistema de calidad , as como el aumento de produccin ( das / clase )

La prevencin efectiva de riesgos evita das perdidos debido a las bajas causadas por accidente o por enfermedades derivadas del trabajo . Principios bsicos de Bioseguridad y Agentes biolgicos (segn RD 664/97). Microorganismos, con inclusin de los genticamente modificados, cultivos celulares y endoparsitos humanos susceptibles de originar cualquier tipo de infeccin, alergia o toxicidad. Microorganismo (segn RD 664/97). Toda entidad microbiolgica, celular o no, capaz de reproducirse o de transferir material gentico. Cultivo celular (segn RD 664/97). El resultado del crecimiento in vitro de clulas obtenidas de organismos multicelulares. Peligro. Todo aquello que puede producir un dao o un deterioro de la calidad de vida individual o colectiva de las personas.

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Dao. Es la consecuencia producida por un peligro sobre la calidad de vida individual o colectiva de las personas. Riesgo. Probabilidad de que ante un determinado peligro se produzca un cierto dao, pudiendo por ello cuantificarse. Desinfeccin (segn la OMS). Eliminacin de agentes infecciosos que estn fuera del organismo por medio de la exposicin directa a agentes qumicos o fsicos. Contaminacin (segn la OMS). Presencia de un agente infeccioso en la superficie del organismo; tambin en vestimenta, ropa de cama, juguetes, instrumentos quirrgicos, apsitos u otros objetos inanimados o substancias, incluyendo el agua y los alimentos. Esterilizacin (segn la OMS). Destruccin de todas las formas de vida por calor, radiacin, gas o tratamiento qumico. Limpieza (segn la OMS). Eliminacin, mediante fregado y lavado con agua caliente, jabn o un detergente adecuado, o por el empleo de una aspiradora, de agentes infecciosos y substancias orgnicas de superficies en las cuales stos pueden encontrar condiciones adecuadas para sobrevivir o multiplicarse.

Clasificacin de los agentes biolgicos por grupos de riesgo y y Agente biolgico del grupo 1. Aqul que resulta poco probable que cause una enfermedad en el hombre. Agente biolgico del grupo 2. Aqul que puede causar una enfermedad en el hombre y puede suponer un peligro para los trabajadores, siendo poco probable que se propague a la colectividad y existiendo generalmente profilaxis o tratamiento eficaz. Agente biolgico del grupo 3. Aqul que puede causar una enfermedad grave en el hombre y presenta un serio peligro para los trabajadores, con riesgo de que se propague a la colectividad y existiendo frente a l generalmente profilaxis o tratamiento eficaz. Agente biolgico del grupo 4. Aqul que causando una enfermedad grave en el hombre supone un serio peligro para los trabajadores, con muchas probabilidades de que se propague a la colectividad y sin que exista generalmente frente a l profilaxis o tratamiento eficaz.

Cada laboratorio debe adoptar un manual de seguridad o de trabajo en el que se identifiquen los riesgos conocidos y potenciales y se especifiquen las prcticas y los procedimientos encaminados a eliminar o reducir al mnimo esos riesgos. Las tcnicas microbiolgicas apropiadas son fundamentales para la seguridad en el laboratorio y no pueden sustituirse por equipo de laboratorio especializado, que no pasa de ser un complemento.

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Objetivos: y Conocer el laboratorio de microbiologa, los materiales, los reactivos, las instalaciones elctricas, de gas, de agua y el funcionamiento de cada uno de ellos, sus interacciones, utilidades, modos de desecho, etc. Aprender el manejo de todo lo anterior en las prcticas a realizar, en casos extremos de riesgos y contingencias. Reactivos y y y y Slidos cidos Soluciones Medios de cultivo

Material y y y y y y y y Mesas de laboratorio Tomas de gas Agua Electricidad Material de vidrio De metal Aparatos Instrumental

Procedimiento experimental: A travs de la observacin y conocimiento del equipo de laboratorio, los reactivos y materiales, se plantearan formas de trabajar (vestimenta, organizacin, lentes, guantes), de prever posibles accidentes (distribucin de espacio, rutas de evacuacin, anaqueles), zonas de riesgo, puntos crticos, y todos los casos que requieran revisin y modificacin para mejorar la seguridad al interior del lugar de trabajo. Acceso al laboratorio 1. El smbolo y signo internacional de peligro biolgico (figura 1) deber colocarse en las puertas de los locales donde se manipulen microorganismos del grupo de riesgo 2 o superior. 2. Slo podr entrar en las zonas de trabajo del laboratorio el personal autorizado. 3. Las puertas del laboratorio se mantendrn cerradas. 4. No se autorizar ni permitir la entrada de nios en las zonas de trabajo del laboratorio.

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Figura 1. Smbolo internacional de peligro biolgico-infeccioso Proteccin personal 1. Se usarn en todo momento batas o uniformes especiales para el trabajo en el laboratorio. 2. Se usarn guantes protectores apropiados para todos los procedimientos que puedan entraar contacto directo o accidental con sangre, lquidos corporales y otros materiales potencialmente infecciosos o animales infectados. Una vez utilizados, los guantes se retirarn de forma asptica y a continuacin se lavarn las manos. 3. El personal deber lavarse las manos despus de manipular materiales y animales infecciosos, as como antes de abandonar las zonas de trabajo del laboratorio. 4. Se usarn gafas de seguridad, viseras u otros dispositivos de proteccin cuando sea necesario proteger los ojos y el rostro de salpicaduras, impactos y fuentes de radiacin ultravioleta artificial. 5. En las zonas de trabajo estar prohibido comer, beber, fumar, aplicar cosmticos y manipular lentes de contacto. 6. Estar prohibido almacenar alimentos o bebidas para consumo humano en las zonas de trabajo del laboratorio. Procedimientos 1. Estar estrictamente prohibido pipetear con la boca. 2. No se colocar ningn material en la boca ni se pasar la lengua por las etiquetas. 3. Todos los procedimientos tcnicos se practicarn de manera que se reduzca al mnimo la formacin de aerosoles y gotculas. 4. Todos los derrames, accidentes y exposiciones reales o potenciales a materiales infecciosos se comunicarn al supervisor del laboratorio. Se mantendr un registro escrito de esos accidentes e incidentes. 5. Se elaborar y seguir un procedimiento escrito para la limpieza de todos los derrames.
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6. Los lquidos contaminados debern descontaminarse (por medios qumicos o fsicos) antes de eliminarlos por el colector de saneamiento. Puede ser necesario un sistema de tratamiento de efluentes, segn lo que indique la evaluacin de riesgos del agente con el que se est trabajando. 7. Los documentos escritos que hayan de salir del laboratorio se protegern de la contaminacin mientras se encuentren en ste. Zonas de trabajo del laboratorio 1. El laboratorio se mantendr ordenado, limpio y libre de materiales no relacionados con el trabajo. 2. Las superficies de trabajo se descontaminarn despus de todo derrame de material potencialmente peligroso y al final de cada jornada de trabajo. 3. Todos los materiales, muestras y cultivos contaminados debern ser descontaminados antes de eliminarlos o de limpiarlos para volverlos a utilizar. 4. El embalaje y el transporte de material debern seguir la reglamentacin nacional o internacional aplicable. 5. Las ventanas que puedan abrirse estarn equipadas con rejillas que impidan el paso de artrpodos. Cuestionario 1. Elabora un proyecto que implique un plan de seguridad para casos de contingencia en el laboratorio, detectando puntos crticos, manejo de reactivos, posibles soluciones y estrategias para asegurar la estancia y evacuacin de las personas presentes durante el fenmeno correspondiente (sismo, incendio, accidente, etc.) 2. Por qu es importante limpiar las mesas con fenol antes y despus de realizar las prcticas en el laboratorio de microbiologa? 3. Cul es la importancia de trabajar a no ms de 15 cm de la flama del mechero cuando se trabaja con medios y especmenes microbiolgicos? 4. Es importante lavarse las manos antes y despus de las prcticas Por qu? 5. Qu esperas de las prcticas a realizar en el rea de microbiologa general, y el porqu de tu respuesta?

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Practica 2 Toma y Manejo de muestras


Proveer a los alumnos encargado del muestreo las directrices necesarias para una adecuada toma, manejo y transporte de muestras que garanticen resultados representativos del producto o lote de donde provienen.

0bjetivo

- rea analtica (toma de muestras) - rea de recepcin de muestras (muestras forneas) - rea de transporte de muestras (recoleccin de muestras).

Campo de aplicacin

Aspticamente, forma de mantener la ausencia completa de microorganismos vivos en un medio. Fecha de caducidad, fecha lmite en que se considera que un producto almacenado en las condiciones sugeridas por el fabricante, conserva las caracteristicas sanitarias que debe reunir para su consumo. Despus de esta fecha no debe comercializarse ni consumirse. Muestra representativa, es un nmero de unidades tomadas de un lote, que se han sido seleccionadas en forma aleatoria y cuyas caracteristicas son lo ms similar posible al as del lote del que procede. Muestra testigo, muestra que queda en poder del interesado y a disposicin de la autoridad competente. Productos perecederos, grupo de alimentos que por su naturaleza biolgica y fisico-qumica, su vida til es de haste 30 das, dando lugar al establecimiento de una fecha de caducidad, la cual debe ostentarse en su etiqueta o envase. Toma de muestra, es el procedimiento que se requiere para elegir el material a analizar a partir de la totalidad del lote o partida. Vida til o vida de anaquel,es el tiempo durante el cual un alimento es seguro y conserva un nivel de calidad sanitaria aceptable para su consumo, bajo condiciones especficas de procesamiento, envasado y almacenamiento.

Definiciones

- MUESTREADOR: ser responsable de tomar y transportar las muestras adecuadamente siguiendo este procedimiento de manera cabal para garantizar la representatividad. - RECEPCIONISTA: ser responsable de recibir y aplicar los criterios de aceptacin o rechazo de las muestras con el fin de garantizar que estas llegan en condiciones aceptables para el anlisis microbiolgico.

Responsable de ejecucin

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LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS - MENSAJERO: ser responsable de servir como primer filtro de aceptacin, aplicando los criterios de aceptacin o rechazo al momento de recibir las muestras, as como de su transporte y custodia hasta la entrega en el laboratorio. - ANALISTA: ser responsable de recibir las muestras nicamente por conducto de la recepcionista hacindose responsable ste de la custodia y anlisis.

Fundamento
El anlisis microbiolgico de alimentos, la adecuada seleccin de la muestra, la toma correcta, los medios de conservacin y su transporte al laboratorio, son de primordial importancia para obtener resultados significativos y confiables. Es necesario precisar el objetivo del estudio, la naturaleza de las muestras y la cantidad, el tamao o volumen, del producto y del lote de donde provienen. La recoleccin de la muestra se debe efectuar evitando toda contaminacin externa, tanto ambiental como humana, para asegurar la integridad de la misma. Mtodo Proyecto de Norma Oficial Mexicana NOM-109-SSAI-1994 Procedimientos para la toma, manejo y transporte de muestras de alimentos para su analisis microbiologIco. NOM-014-SSAI-1993.Procedimientos sanitarios para el muestreo de agua para uso y consumo humano.

Reactivos No aplica Aparatos - Frascos de boca ancha con tapa de rosca o tapn esmerilado de material esterilizable, no txico y de tamao acorde con la cantidad de muestra deseada. - Bolsas de polietileno estriles de varias medidas - Hieleras de poliestireno o de otro material aislante - Papel aluminio - Papel estraza - Etiquetas autoadheribles - Cinta testigo - Marcadores indelebles - Algodn - Cerillos o encendedor - Instrumentos para toma de muestra: muestreadotes, cucharones, cucharas, esptulas, cuchillos, pinzas, etc. (de acero inoxidable o de cualquier otro material que no provoque cambios que puedan afectar el resultado). - Lmparas de alcohol FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS - Frasco con etanol o isopropanol al 70% - Frascos con tiosulfato de sodio, para toma de muestra. - Hielo o bolsas refrigerantes - Bata, cubre boca, cofia y guantes estriles. - Autoclave -Termmetros metlicos para toma de temperaturas de alimentos con rangos de -40 a 100 C. . Sistema analtico Segn el Proyecto de Norma Oficial Mexicana NOM-109-SSAI-1994. Procedimientos para la toma, manejo y transporte de muestras de alimentos para su analisis microbiologico. Y NOM-014-SSAIProcedimiento sanitario para el muestreo de agua para uso y consumo humano. Preparacin del material - Todo el material e instrumentos de muestreo que se utilicen para la toma, manejo y transporte de muestras, que van a estar en contacto directo con el alimento, debe estar limpio, estril y libre de substancias que pudieran afectar la viabilidad de los microorganismos. El material para toma de muestra que requiera esterilizacin se envolver con papel estraza en forma individual antes de esterilizarlo. La tapa de los frascos se proteger con papel estraza o aluminio fijndolos adecuadamente. Colocar cinta testigo en el material a esterilizar, El material que se utilice para la toma de muestra debe ser esterilizado en autoclave a 121C durante 15 min. De ser necesario, si se requiere mayor nmero de utensilios, limpiar los que hayan sido usados y flamearlos con etanol o isopropanol al 70%, y emplearlos de inmediato. El procedimiento para la toma de muestra, depender del tipo de producto y de la finalidad del examen. Obtencin de muestras: Es importante que la persona que tome las muestras se lave las manos y utilice cubre bocas, cofia y guantes. 1. Toma de nuestras de productos envasados para su venta al menudeo se llevar a cabo tomando el producto tal y como se vende al consumidor, pueden ser alimentos enlatados o en frascos de vidrio, o empacados en bolsas o cualquier otro tipo de envase, en cantidad suficiente para su anlisis, no se requieren condiciones especiales para su muestreo. En caso de que el producto se encuentre en recipientes grandes, es necesario abrirlos y extraer la muestra de tal forma para evitar cualquier tipo de contaminacin externa, empleando utensilios limpios y si es posible estriles. 2. Para alimentos expuestos al aire libre y otras contaminaciones, no se requieren condiciones tan estrictas en la toma de muestra ya que se deben tomar las muestras en las condiciones en se consumen. 3. En el caso de alimentos en donde se requieran condiciones ms estrictas para su muestreo, se deben tomar en sitios en donde las condiciones de posibles FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS contaminaciones externas sean mnimas, el personal que efecte este procedimiento se debe lavar las manos antes del muestreo as como utilizar bata, cofia, cubre bocas y guantes estriles. La toma de muestra debe hacerse con rapidez, pero cuidadosamente. Los recipientes para la toma de muestra deben abrirse nicamente al momento de introducir sta y cerrarlos de inmediato. Para alimentos preparados sin envasar de consumo inmediato, se recomienda que la persona que elabora los alimentos, sea la que introduzca la muestra a los recipientes o bolsas estriles con los utensilios que emplea normalmente. Los alimentos que se muestrean en caliente se deben conservar y trasladar a la temperatura que fueron muestreados, esto slo si su traslado es menor a una hora, de lo contrario se deben enfriar a temperatura ambiente y transportarse en condiciones de refrigeracin. En el caso de alimentos lquidos o semilquidos se deber agitar o mezclar hasta conseguir homogeneizar y despus efectuar la toma de la muestra en diferentes partes del contenedor. En alimentos slidos cuando sea necesario cortar el producto, debe muestrearse con ayuda de utensilios bien limpios y si es posible estriles, como cucharas, cuchillos, tenedores etc. Pasarlas a los recipientes adecuados o proporcionados. Cuando la toma de muestra se realice en un conducto de salida o una compuerta antes de obtener la muestra se deben dejar pasar las primeras fracciones del producto para limpiar dicha salida con el flujo. En el caso de superficies vivas e inertes se debe delimitar una superficie representativa del total a muestrear. Se humedece un hisopo en una solucin para ese fin y se frota homogneamente en la superficie a muestrear, posteriormente se sumerge en dicha solucin se cierra y se enva al laboratorio lo antes posible para su anlisis. En el caso de agua cuando esta proviene de un grifo deben removerse los accesorios externos antes de tomar la muestra. Limpiarse el orificio externo con una torunda Debe dejarse correr el agua aproximadamente 3 min Tomar la muestra sin llenar el frasco y tapar inmediatamente despus de obtenida la muestra En captacin de agua superficial o tanque de almacenamiento deben lavarse manos y antebrazos con agua y jabn y sumergir el recipiente hasta una profundidad de 15 a 30 cm. debe ser de la parte media. En pozo profundo si tiene grifo se proceder como en el paso 9 :De lo contrario se har del tubo de desfoge dejando correr el agua 3 min.. Las cantidades requeridas son:

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-Para anlisis de agua: Preferentemente: 250 ml Mnimo: 100 ml. - Para anlisis de alimentos: Preferentemente: 250 g ml. Mnimo: 100 g ml. La toma de la muestra debe hacerse con rapidez pero cuidadosamente. Los recipientes para la toma de muestra deben abrirse nicamente al momento de introducir esta y serrarlo de inmediato no tocar el interior de los envases y evitar que la tapa se contamine. FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS Cuando sea necesario tomar la temperatura la muestra que se utilice para tal fin deber ser diferente de la que se envi para su anlisis. Las muestras para su anlisis debern estar bien identificadas con el nombre del producto, y cualquier otro dato pertinente, con etiqueta o marcador de tinta indeleble para evitar su deterioro. Los datos que se deben consignar en la etiqueta son: fecha, lugar, hora del muestreo, nmero de lote y temperatura. Y la etiqueta deber colocarse entre la tapa y el cuerpo del frasco, la caja en el nudo o sierre de la bolsa de tal forma que se evite que la muestra sea violada o alterada. Conservacin y transporte El manejo y transporte de las muestras deber efectuarse de tal manera que se impida su ruptura, alteracin o contaminacin, evitando su exposicin a la luz solar directa. Las muestras deben entregarse al laboratorio lo ms rpidamente posible. Los alimentos perecederos se transportan bajo condiciones de temperatura de 2 a 8 C y se debe iniciar su anlisis dentro de las 24 horas siguientes a su recoleccin. En caso de alimentos congelados la temperatura no debe ser mayor a 0C Para la refrigeracin es recomendable el empleo de lquido refrigerante o hielo potable contenido en bolsas de plstico impermeables para evitar que el agua de deshielo alcance los envases de los alimentos y que de alguna manera se puedan contaminar. No sobrellenar los recipientes que contengan los alimentos con el fin de evitar que el contenido se derrame en el transporte y se pueda originar derrame del contenido y se puedan contaminar las muestras originales. En caso de muestras individuales blandas evitar que la presin que puedan ejercer otros recipientes la deforme u originen derrames provocando que el contenido se ponga en contacto con el exterior de la envoltura. En caso de muestras de agua deben trasportarse al laboratorio a una temperatura de 4-10 C L0s productos con presentacin comercial deben ser transportados en sus envases originales a temperatura ambiente, siempre y cuando esta no exceda de 45C. Para la conservacin durante el transporte de la muestras no esta permitido el empleo de sustancias qumica.

Cumplir con las norma correspondiente proyecto de norma NOM-109-SSAI-1994.

Criterios de aceptacin

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Materiales
y y y y y y y y y y Frascos esteriles de boca ancha Pinzas esteriles Espatulas esteriles Cuchillos esteriles Algodon Torundas con alcohol Hielera Refriferantes Etiquetas Plumon indeleble

Procedimiento. 1. Elegir las muestras a tomar 2. Abrir el frasco al momento de tomar la muestra y con utencilios esteriles o con las cucharas que se sirven estos alimentos, tomar una muestra representativa, es decir, de diferentes sitios del contenedor , de la superficie y el fondo, en caso de ser necesario tomar la temperatura. 3. Etiquetar el frasco, con la fecha, nombre del alimento,sitio de muestreo, temperatura y cantidad aproximada 4. Trasladar la muestra al lugar de analisis en las condiciones adecuadas. 5. En caso de agua obtenida de grifos, limpiar la boca de la llave , dejar correr el agua por 2 minutos y colectar la muestra..

Cuestionario. 1. Cul es la importancia de una buena toma de muestra? 2. Como realizara la toma de muestra en un recipiente que contenga un guisado en una barra de alimentos calientes ,en un comedor industrial.? 3. Para recolectar una muestra de agua de cisterna.cual seria el procedimiento a seguir? 4. Qu datos debe contener la etiqueta de identificacin de la muestra? 5. Cmo se debe transportar una muestra al laboratorio y cuanto tiempo debe transcurrir antes de su proceso? Referencias

Literatura Microbiologa e Inocuidad de los alimentos. Eduardo Fernndez Escartn. Universidad de Quertaro, 2000. Manual del Ing. en alimentos.Ed.Grupo Latino Ltda.edicin2006 Proyecto de Norma Oficial Mexicana NOM-109-SSAI-1994 y NOM-014-SSAL-1993. FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

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Practica 3 Preparacin y dilucin de muestras de alimentos

Reducir el nmero de microorganismos por unidad de volumen, para permitir la cuenta de colonias en medios slidos o lquidos.

Objetivo

Dilucin primaria, es la solucin, suspensin o emulsin obtenida despues de pesar o medir una cantidad del producto bajo examen y mezclarla con una cantidad de nueve veces en proporcin de diluyente. Diluciones decimales adicionales, las suspenciones o soluciones obtenidas al mezclar un determinado volumen de la dilucin primaria con un volumen nueve veces un diluyente y que por repeticin de esta operacin con cada dilucin as preparada , se obtiene la serie de diluciones decimales adecuadas para la inoculacin de medios de cultivo.

Definiciones

Introduccion
El mtodo se basa en la preparacin de diluciones primarias, para obtener una distribucin, lo ms uniforme posible de los microorganismos presentes en la porcin de la muestra. El nmero de diluciones que se vayan a preparar depende del nmero de microorganismos esperado en la muestra. Segn la norma NOM-110 SSA1-1994 Preparacin y dilucin de muestras para su anlisis microbiolgico

Reactivos Solucin de hidrxido de sodio 1,0 N : Solucin reguladora de fosfatos (solucin concentrada) FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS . Solucin de trabajo:  Tomar 1,25 ml de la solucin concentrada y llevar a un litro con agua.  Esterilizar a 121C durante 15 minutos. AGUA PEPTONADA

Si este diluyente no es usado inmediatamente, almacenar en lugar oscuro a una temperatura entre 0 a 5C por u tiempo no mayor de un mes, en condiciones tales que no alteren su volumen o composicin.

Muestreo y muestra Se aceptan muestras colectadas en recipientes esterilizados y que hayan sido transportadas adecuadamente. La muestra deber ser suficiente para su estudio (50 a 100 g ml) segn las tcnicas para el muestreo y anlisis microbiologico de alimentos y bebidas . Sistema analtico Segn la Norma Oficial Mexicana NOM-110-SSAI-194 para la preparacin y dilucin de muestras de alimentos. Uso del sistema analtico Preparacin de la dilucin primaria A partir de muestras lquidas: Para muestras lquidas no viscosas (agua, leche, refrescos, etc.,) en las cuales la distribucin de microorganismos es homognea o fcilmente homogeneizable por medios mecnicos (agitacin, etc.). Para muestras congeladas de un alimento originalmente lquido o licuable, fundir por completo en bao de agua de 40 a 45C un tiempo mximo de 15 minutos y homogeneizar agitando vigorosamente. Para la parte lquida de una muestra heterognea la cual sea considerada suficientemente representativa de la muestra total (por ejemplo la fase acuosa de grasas animales y vegetales).

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LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS Agitar la muestra manualmente con 25 movimientos de arriba abajo en un arco de 30 cm. efectuados en un tiempo de 7 segundos. Tomar 1ml de la muestra y diluir con 9ml del diluyente el cual debe encontrarse a una temperatura similar a sta, evitando el contacto entre la pipeta y el diluyente. Siempre que la cantidad de muestra lo permita, tomar alcuotas mayores, por ejemplo volmenes de 10 u 11 ml, diluidos con 90 o 99 ml, de la misma forma que se describi anteriormente. A partir de muestras slidas o semislidas. Las muestras slidas y semislidas congeladas, deben descongelarse en refrigeracin de 4 a 8C durante 18 horas y no ms de 24 horas antes de proceder a su anlisis. Pesar una cantidad de 10 u 11 g de la muestra por analizar en un recipiente o bolsa plstica estriles de tamao adecuado. Adicionar un volumen de 90 a 99 ml de diluyente llevado a una temperatura similar a la de la muestra. Operar la licuadora o el homogeneizador peristltico de 1 a 2 minutos hasta obtener una suspensin completa y homognea segn se indique en la tcnica correspondiente para cada alimento .Aun en los equipos ms lentos, este tiempo no debe exceder de 2,5 minutos. Permitir que las partculas grandes se sedimenten, y transferir la cantidad deseada tomando de las capas superiores de la suspensin. Cuando la dilucin primaria es muy viscosa o pegajosa, adicionar ms diluyente, lo cual debe tomarse en cuenta para las operaciones subsecuentes o expresin de resultados. El homogeneizador peristltico (Stomacher) puede no ser adecuado para algunos productos (por ejemplo, aquellos con partculas agudas o constituyentes que no se dispersen fcilmente). Debe ser utilizado slo cuando exista evidencia (publicada o por ensayos) de que los resultados obtenidos no difieren significativamente con aquellos obtenidos con licuadora. Algunos componentes de los alimentos como la grasa dificultan la dispersin homognea de los microorganismos, por lo que en estos casos se recomienda que para realizar la primera dilucin, el diluyente se calienta ligeramente (40C) en un bao Mara para lograr la distribucin homognea de la grasa y con ello una dispersin homognea de microorganismos. Para obtener datos reproducibles en los anlisis, al realizar las diluciones es necesario estandarizar la agitacin que se realice. Adems, es importante recalcar que la viabilidad de bacterias, hongos y levaduras puede resultar afectada al entrar en contacto con el diluyente, por lo que se recomienda que el tiempo que transcurre desde que el alimento entra en contacto con el diluyente hasta que se incorpora el inoculo al medio de cultivo, no exceda los 20 minutos. FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS PREPARACIN DE LAS DILUCIONES DECIMALES ADICIONALES Transferir 1ml o un mltiplo, por ejemplo, 10 u 11 ml de la dilucin primaria 1 + 9 (10), en otro recipiente contenido nueve veces el volumen del diluyente estril a la temperatura apropiada, evitando el contacto entre la pipeta y el diluyente. Mezclar cuidadosamente cada botella de diluyente siempre de la misma manera que se describe anteriormente. La seleccin de diluciones que se vayan a preparar y de aquellas que se van a inocular, dependen del nmero esperado de microorganismos en la muestra, con base a los resultados de anlisis previos y de la informacin que se obtenga del personal de inspeccin que la haya colectado. En ausencia total de informacin, trabajar con las diluciones de la primera a la sexta. Utilizar pipetas diferentes para cada dilucin inoculado simultneamente las cajas que se hayan seleccionado. El volumen que se transfiera nunca debe ser menor al 10% de la capacidad total de la pipeta. Si la pipeta es terminal y se transfiere un volumen de lquido equivalente a su capacidad total, escurrir aplicando la punta de la pipeta una sola vez en un rea de la caja Petri sin lquido. Mientras se afora el lquido de la pipeta, la punta de sta debe apoyarse en el interior del cuello del frasco y mantenerla en posicin vertical, para lo cual este ltimo debe inclinarse lo necesario. En estudios donde la presencia o ausencia de una determinada especie de microorganismos en 0,1 g, no es necesario preparar diluciones mayores. El criterio para seleccionar las diluciones a preparar de acuerdo con el nmero de microorganismos esperados es: Para la tcnica del nmero ms probable utilizar tres tubos: donde sea posible demostrar el microorganismo en 10 ml de la solucin ms alta. Para la tcnica de cuenta en placa, considerar aquellas en las que se puedan contar de 25 a 250 colonias en un mnimo de una de tres diluciones en el mtodo de cuenta de Bacterias aerobias en placa. En el caso de otros grupos microbianos, considerar el nmero especificado de colonias en la norma Oficial Mexicana correspondiente No aplica Cuestionario. 1. cual es la finalidad de realizar diluciones en una muestra? 2. que relacin se guarda al hacer las diluciuones de las muestras? 3. Qu medio se emplea como solvente para hacer las diluciones? 4. como debe encontrarse el medio empleado para las diluciones .?explique 5. Cuantas diluciones deben prepararse de una muestra? Explique.

Bibliografia
Microbiologa e Inocuidad de los alimentos. Eduardo Fernndez Escartn. Universidad de Quertaro, 2000. Manual del Ing. en alimentos.Ed.Grupo Latino Ltda.edicin200) NOM-110-SSA1-1994 FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

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Practica 4 Mtodo para la cuenta de bacterias aerobias en placa

0bjetivo
Establece el mtodo para estimar la cantidad de microorganismos viables presentes en un alimento, agua potable y agua purificada, por la cuenta de colonias en un medio slido incubado aerbicamente.

Unidades Formadoras de Colonias (UFC), trmino que debe utilizarse para reportar la cuenta de colonias en placa, las cuales pueden surgir de una clula o de un cmulo de clulas.

Definiciones

Introduccin
Cuando se requiere investigar el contenido de microorganismos viables en un alimento, la tcnica comnmente utilizada es la cuenta en placa. En realidad esta tcnica no pretende poner en evidencia todos los microorganismos presentes. La variedad de especies y tipos diferenciables por sus necesidades nutricionales, temperatura requerida para su crecimiento, oxgeno disponible, etc., hacen que el nmero de colonias contadas constituyan una estimacin de la cifra realmente presente y la misma refleja si el manejo sanitario del producto ha sido el adecuado Se considera que cada colonia que desarrolla en el medio de cultivo de eleccin despus de un cierto tiempo de incubacin a la temperatura adecuada, proviene de un microorganismo o de un agregado de ellos de la muestra bajo estudio; ese microorganismo o microorganismos son capaces de formar la colonia, es decir una UFC. Mtodo Segn la norma NOM-092- SSA1-1994 Mtodo para la cuenta de bacterias aerobias en placa.

Reactivos
Los reactivos que a continuacin se mencionan deben ser de grado analtico y cuando se indique agua debe entenderse como agua destilada. Medios de cultivo Agar Triptona-Extracto de Levadura (agar para cuenta estndar).

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SOLUCIONES Solucin reguladora de fosfatos (solucin concentrada). . Solucin de trabajo: o o Tomar 1,25 ml de la solucin concentrada y llevar a un litro con agua , distribuir en porciones de 99, 90 y 9 mL segn se requiera.

Agua peptonada

Si este diluyente no es usado inmediatamente, almacenar en lugar oscuro a una temperatura entre 0 a 5C por un tiempo no mayor de un mes, en condiciones tales que no alteren su volumen o composicin.

Muestreo y muestra Se aceptan muestras colectadas en recipientes esterilizados y que hayan sido transportadas adecuadamente. La muestra deber ser suficiente para su estudio (50 a 100 g ml) segn las tcnicas para el muestreo y anlisis microbiologico de alimentos y bebidas) Sistema analtico Segn la Norma Oficial Mexicana NOM-092-SSAI-1994. Para la cuenta de bacterias aerobias en placa. Uso del sistema analtico Procedimiento Distribuir las cajas estriles en la mesa de trabajo de manera que la inoculacin; la adicin de medio de cultivo y homogenizacin, se puedan realizar cmoda y libremente. Marcar las cajas en sus tapas con los datos pertinentes previamente a su inoculacin y correr por duplicado. Despus de inocular las diluciones de las muestras preparadas segn Preparacin y dilucin de muestras de alimentos para su anlisis microbiolgico, en las cajas Petri, agregar de 12 a 15 ml del medio preparado, mezclarlo mediante 6 movimientos de derecha a izquierda, 6 en el sentido de las manecillas del reloj, 6 en sentido contrario y 6 en sentido contrario y 6 de atrs a adelante, FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS sobre una superficie lisa y horizontal hasta lograr una completa incorporacin del inculo en el medio; cuidar que el medio no moje la cubierta de las cajas. Dejar solidificar . Incluir una caja sin inculo por cada lote de medio y diluyente preparado como testigo de esterilidad. El tiempo transcurrido desde el momento en que la muestra se incorpora al diluyente hasta que finalmente se adiciona el medio de cultivo a las cajas, no debe exceder de 20 minutos. Incubar las cajas en posicin invertida (la tapa hacia abajo) por el tiempo y la temperatura que se requieran, segn el tipo de alimento y microorganismo de que se trate, vase la Tabla 1. Tabla 1. Tiempo y temperatura de incubacin para bacterias aerobias (1). Grupo bacteriano Termoflicos aerobios Mesoflicos aerobios Psicrotrficos Psicroflicos Temperatura (C) 55 2C 35 2C 20 2C 5 2C Tiempo de incubacin 48 2 h 48 2 h 3 5 das 7 10 das

En la lectura seleccionar aquellas placas donde aparezcan entre 25 a 250 UFC, para disminuir el error en la cuenta. Contar todas las colonias desarrolladas en las placas seleccionadas (excepto las de mohos y levaduras), incluyendo las colonias puntiformes, hacer uso del microscopio para resolver los casos en los que no se pueden distinguir las colonias de las pequeas partculas de alimento o de levaduras. Procesamiento de datos VALORES DE RESULTADOS. Despus de la incubacin, contar las placas que se encuentren en el intervalo de 25 a 250 colonias, usando el contador de colonias y el registro de la cuenta de colonias. Las placas de al menos una de tres diluciones deben estar en el intervalo de 25 a 250. Cuando slo una dilucin est en el intervalo apropiado, vase el cuadro 2, ejemplo 1. Calcular la cuenta promedio por gramo o mililitro de dicha dilucin y reportar. Cuando dos diluciones estn en el intervalo apropiado, determinar la cuenta promedio dada por cada dilucin antes de promediar la cuanta de las dos diluciones para obtener la cuenta en placa por gramo o mililitro, vase el cuadro 2, ejemplo 2. FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS Con el fin de uniformar los criterios para el reporte de las cuentas en ensayos donde las placas presenten situaciones no contempladas en los ejemplos anteriores, se presentan las siguientes guas: Placas con menos de 25 colonias.- cuando las placas corridas para la menor dilucin muestran cuentas de menos de 25 colonias, contar el nmero de colonias presentes en dicha dilucin, promediar el nmero de colonias y multiplicar por el factor de dilucin para obtener el valor estimado de cuenta en placa, aclarar en su informe esta situacin agregando la leyenda valor estimado , vase el cuadro 2, ejemplo 3. Placas con ms de 250 colonias.- cuando el nmero de colonias por placa exceda de 250, contar las colonias en aquellas porciones de la placa que sean representativas de la distribucin de colonias, contar por ejemplo, una cuarta parte o una mitad del rea de la caja y multiplicar el valor obtenido por 4 2, respectivamente. Si solamente pueden contarse algunos cuadros, considerar que el fondo de una caja petri de 100 mm de dimetro contiene 65 cuadros de la cuadricula del contador. Aclarar en el informe esta situacin agregando la leyenda valor estimado . Colonias extendidas.- las colonias extendidas pueden presentarse en las siguientes formas: Cadenas de colonias no separadas claramente entre si, que parecen ser causadas por la desintegracin de un cmulo de bacterias. Colonias que se desarrollan en pelcula entre el agar y el fondo de la caja. Colonias que se desarrollan en pelcula en la orilla de la caja sobre la superficie del agar. Colonias de crecimiento extendido y en algunas ocasiones acompaadas de inhibicin del crecimiento, que en conjunto exceden el 50% de la caja o represin del crecimiento que por si mismo excede el 25% de la superficie de la caja. Placas sin colonias.- cuando las placas de todas las diluciones no muestran colonias, reportar la cuenta en placa como menor que una vez el valor de la dilucin ms baja usada. Placas corridas por duplicado, una con crecimiento dentro del intervalo adecuado y otra con ms de 250 colonias.- cuando una placa tiene entre 25 y 250 colonias y su duplicado ms de 250 colonias, contar ambas placas incluyendo la que est fuera del intervalo para determinar la cuenta en placa. Placas corridas por duplicado, una placa de cada dilucin dentro del intervalo de 25 a 250 colonias.- cuando una placa dentro de diferentes diluciones contiene el nmero de colonias especificadas en el intervalo, contar el nmero de colonias de las cuatro placas para calcular la cuenta en placa. FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS Placas corridas por duplicado, ambas placas con una dilucin dentro del intervalo de 25 a 250 y slo una de otra dilucin dentro del mismo, contar las cuatro cajas incluyendo aquella con menos de 25 o ms de 250 colonias, para calcular cuenta en placa Despus de contabilizar las colonias en las placas seleccionadas, multiplicar por la inversa de la dilucin para obtener el nmero de UFC por mililitro o gramo de la muestra, redondear la cifra obtenida en la cuenta de manera que solo aparezcan dos dgitos significativos al inicio de esta cifra, para redondear, elevar el segundo digito al nmero inmediato superior cuando el tercer digito de la derecha sea cinco o mayor(por ejemplo: 128 redondear a 130).Si el tercer digito es cuatro o menos, reemplazar el tercer digito con cero y el segundo digito mantenerlo igual(por ejemplo:2417 a 2400). Los ejemplos para el clculo de UFC para casos especficos INFORMAR Unidades formadoras de colonias------UFC/g o ml, de bacterias aerobias en placa en agar triptona extracto de levadura o agar para cuenta estndar, incubadas -------horas a -----oC

Cuestionario 1. que importancia tiene la determinacin de bacterias aerobias en alimentos? 2. que medio de cultivo de utiliza para esta determinacin .? 3. cuantas colonias se cuentan? 4. Como se reporta el resultado .? 5. en que NOM se basa esta determinacin.?

Anexos
La norma NOM-092- SSA1-1994

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Practica 5 Mtodo para la cuenta de mohos y levaduras en alimentos Objetivo

Establecer la cuenta de mohos y levaduras viables en alimentos por medio de la cuenta en placa a 251C.

Definiciones Colonias, agrupamiento de clulas en forma de masas visibles, sobre el agar de cultivo. Levaduras, son microorganismos cuya forma dominante de crecimiento es unicelular. Poseen un ncleo y se multiplican por reproduccin sexual o asexual, por gemacin o por fisin transversal. La reproduccin sexual cuando ocurre, es por medio de ascosporas contenidas en un saco o asca. Mohos, grupo de hongos microscpicos; organismos pertenecientes al reino Fungi, que se caracterizan por tener un cuerpo formado por estructuras filamentosas con ramificaciones, que se conocen con el nombre de hifas, el conjunto de hifas constituye el micelio, carecen de clorofila, se alimentan por absorcin pudiendo propagarse por esporas flageladas o no, las paredes celulares pueden ser de queratina, celulosa o manana. Crecen formando colonias en un medio selectivo a 25 C. Unidades Formadoras de Colonias (UFC), trmino que debe utilizarse para reportar la cuenta de colonias en placa, las cuales pueden surgir de una clula o de un cmulo de clula

Los hongos son organismos que poseen ncleo verdadero, carecen de clorofila, se reproducen sexual o asexualmente por esporas y pueden tener forma multicelular filamentosa (moho) o ser clulas individuales en gemacin (levaduras). Los mohos y las levaduras estn ampliamente distribuidos en la naturaleza y se pueden encontrar formando parte de la flora normal de un alimento, o como agentes contaminantes y en los equipos sanitizados inadecuadamente, provocando el deterioro fisicoqumico de estos, debido a la utilizacin en su metabolismo de los carbohidratos, cidos orgnicos, protenas y lpidos originando mal olor, alterando el sabor y el color en la superficie de los productos contaminados. Adems los mohos y levaduras pueden sintetizar metabolitos txicos termo resistentes, capaces de soportar algunas sustancias qumicas, as como la irradiacin, permitiendo el crecimiento de bacterias patgenas. El mtodo se basa en inocular una cantidad conocida de muestra de prueba en un medio selectivo especifico acidificado a un pH 3.5 e incubado a una temperatura de 251C. FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

Introduccin

LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS Mtodo Segn la Norma Oficial Mexicana NOM-111-SSA1-1994. Mtodo para la cuenta de mohos y levaduras en alimentos.

Reactivos Los reactivos que a continuacin se mencionan deben ser de grado analtico y cuando se indique agua debe entenderse como agua destilada. Medios de cultivo Agar papa- dextrosa, comercialmente disponible en forma deshidratada.

A fin de preservar las propiedades gelificantes del medio, no calentar despus de agregar el cido tartrico. SOLUCIONES .Solucin reguladora de fosfatos (solucin concentrada) Solucin de trabajo. .Tomar 1.25 ml de la solucn concentrada y llevar a un litro con agua .Esterilizar a 121 1.0 C durante 15 minutos. Solucin esteril de cido tartrico al 10%

Muestreo y muestra Se aceptan muestras colectadas en recipientes esterilizados y que hayan sido transportadas adecuadamente. La muestra deber ser suficiente para su estudio (50 a 100 g ml) segn las tcnicas para el muestreo y anlisis microbiologico de alimentos y bebidas

Sistema analtico Norma Oficial Mexicana NOM-111-SSA1-1994, Bienes y Servicios. Mtodo para la cuenta de mohos y levaduras.

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Uso del sistema analtico PREPARACIN DE LA MUESTRA Debe ser de acuerdo a lo establecido en la prctica de preparacin y dilucin de muestras Sembrado en placa Colocar por duplicado en cajas petri 1 ml de la muestra lquida directa o de la dilucin primaria, utilizando para tal proposito una pipeta estril. Repetir el procedimiento tantas veces como diluciones decimales se requiera sembrar, utilizando una pipeta estril para cada dilucin . Verter de 15 a 20 ml del agar dextrosa papa acidificado, fundido y mantenido a 45 0.1 C en un bao de agua. El tiempo trascurrido entre la preparacin de la dilucin primaria y el momento en que es vertido el medio de cultivo, no debe exceder de 20 minutos. Mezclar cuidadosamente el medio con seis movimientos de derecha a izquierda, seis en el sentido de las manecillas del reloj, seis en el sentido contrario y seis de atrs para adelante, sobre una superficie lisa. Permitir que la mezcla se solidifique dejando las cajas petri reposar sobre una superficie horizontal fra. Preparar una caja control con 15 ml de medio, para verificar la esterilidad. Invertir las cajas y colocarlas en la incubadora a 25 1C Contar las colonias de cada placa despus de 3,4 y 5 das de incubacin . Procesamiento de datos cuenta de colonias

Considerar las cuentas de placas con 10 a 150 colonias como las adecuadas para el informe. multiplicar por el inverso de la dilucin, tomando en consideracin los criterios de la NOM-092SSA1-1994 . Mtodo para la cuenta de bacterias aerobias en placa, para la expresin de resultados. Contar las colonias de cada placa despus de 3, 4 y 5 das de incubacin. despus de 5 das, seleccionar aquellas placas que contengan entre 10 y 150 colonias. si alguna parte de la caja muestra crecimiento extendido de mohos o si es difcil contar colonias bien aisladas, considerar los FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS conteos de 4 das de incubacin y an de 3 das. en este caso, informar el periodo de incubacin de 3 o 4 das en los resultados del anlisis. INFORMAR: Unidades formadoras de colonias por gramo o mililitro (UFC/g o mL) de mohos o levaduras en agar papa-dextrosa acidificado, incubadas a 25 1C durante 5 das.

Cuestionario. 1. Cul es la importancia de la busquedad de hongos y levaduras en alimentos:? 2. que medio de cultivo se emplea .? 3. Por qu se siembra por duplicado? 4. en que NOM se basa esta tcnica? 5. como reporta sus resultados? Anexos

Segn la norma NOM-111- SSA1-1994

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Practica 6 Mtodo para la cuenta de microorganismos coliformes totales en placa

0bjetivo
Establece el mtodo microbiolgico para determinar el nmero de microorganismos coliformes totales en alimentos por medio de la tcnica de cuenta en placa.

Coliformes, bacilos Gram negativos, no esporulados, aerobios o anaerobios facultativos que a 35 C fermentan la lactosa con formacin de cido, ocasionando en las colonias desarrolladas el vire del indicador rojo neutro presente en el medio y la precipitacin de las sales biliares.

Definiciones

El mtodo permite determinar el nmero de microorganismos coliformes presentes en una muestra, utilizando agar rojo violeta bilis en el que se desarrollan bacterias a 35C en aproximadamente 24 horas dando como resultado la produccin de cidos orgnicos que viran el indicador de pH y precipitan las sales biliares El grupo de los microorganismos coliformes es el ms ampliamente utilizado en la microbiologa de los alimentos como indicador de prcticas higinicas inadecuadas.

Introduccion

Segn la norma NOM-113- SSA1-1994, Bienes y Servicios. Mtodo para la cuenta de microorganismos coliformes totales en placa.

Reactivos
Los reactivos que a continuacin se mencionan deben ser de grado analtico y cuando se indique agua debe entenderse como agua destilada.

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Medios de cultivo Agar-rojo- violeta-bilis -lactosa (RVBA ) Solucin reguladora de fosfatos (solucin concentrada).

Se aceptan muestras colectadas en recipientes esterilizados y que hayan sido transportadas adecuadamente. La muestra deber ser suficiente para su estudio (50 a 100 g ml) segn las tcnicas para el muestreo y anlisis microbiologico de alimentos y bebidas. Sistema analtico Segn la Norma Oficial Mexicana NOM-113-SSAI-1994 para la cuenta de microorganismos coliformes totales en placa.

Uso del sistema analtico Preparacin de la muestra Segn lo establecido en la practica 3

Sembrado de placas

Colocar en cajas Petri por duplicado 1 ml de la muestra lquida directa o de la dilucin primaria, utilizando para tal propsito una pipeta estril. Repetir el procedimiento tantas veces como diluciones decimales se requiera sembrar, utilizando una pipeta estril diferente para cada dilucin. Verter de 15 a 20 ml del medio RVBA fundido y mantenido a 45 1,0C en bao de agua. En el caso de utilizar cajas de Petri de plstico se vierte de 10 a 15 ml del medio. El tiempo transcurrido entre la preparacin de la dilucin primaria y el momento en que se vierte el medio de cultivo, no debe exceder de 20 minutos. FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS Mezclar cuidadosamente el inculo con el medio con seis movimientos de derecha a izquierda, seis movimientos en el sentido de las manecillas del reloj, seis movimientos en el sentido contrario al de las manecillas del reloj y seis de atrs para adelante, sobre una superficie lisa y nivelada. Permitir que la mezcla solidifique dejando las cajas Petri reposar sobre una superficie horizontal fra. Preparar una caja control con 15 ml de medio para verificar la esterilidad. Despus de que est el medio completamente solidificado en la caja, verter aproximadamente 4 ml del medio RVBA a 45 1,0C en la superficie del medio inoculado. Dejar que solidifique. Invertir las placas y colocarlas en la incubadora a 35C, durante 24 2 horas. Despus del periodo especificado para la incubacin, contar las colonias con el contador de colonias y registrar las cuentas en el formato MB-F00001. Seleccionar las placas que contengan entre 15 y 150 colonias. Las colonias tpicas son de color rojo oscuro, generalmente se encuentran rodeadas de un halo de precipitacin debido a las sales biliares, el cual es de color rojo claro o rosa, la morfologa colonial es semejante a lentes biconvexos con un dimetro de 0,5 a 2,0 mm. En caso de que el recuento sea en da inhabil, la revisin y conteo la realizara personal capacitado Procesamiento de datos Recuento de colonias Placas que contienen entre 15 y 150 colonias caractersticas. Separar las placas que contienen el nmero antes mencionado de colonias caractersticas en dos diluciones consecutivas. Contar las colonias presentes. Calcular el nmero de coliformes por mililitro o por gramo de producto, multiplicando el nmero de colonias por el inverso de la dilucin correspondiente, tomando los criterios del Mtodo para la Cuenta de Bacterias Aerobias en Placa. Placas que contienen menos de 15 colonias caractersticas. Si cada una de las placas tiene menos de 15 colonias caractersticas, reportar el nmero obtenido seguido de la dilucin correspondiente. Placas con colonias no caractersticas. Si en las placas no hay colonias caractersticas, reportar el resultado como: menos de un coliforme por 1/d por gramo, en donde d es el factor de dilucin. INFORMAR: UFC/g o ml en placa de agar rojo violeta bilis, incubados a 35C durante 24 2 h. FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS En caso de emplear diluciones y no observar crecimiento, informar utilizando como referencia la dilucin ms baja utilizada, por ejemplo dilucin 10-1. En caso de no observar crecimiento en la muestra sin diluir se informa: "no desarrollo de coliformes por ml". Cuestionario. 1. Que son los coliformes? 2. porque es necesario cuantificarlos en las muestras de aguas y alimentos? 3. que medio de cultivo emplea ? 4. a que temperatura y por cuanto tiempo incuba las placas antes de hacer el conteo.? 5. En caso de tener una cuenta de 56 colonias en una dilucin a la -3 . Como reportaria su resultado:?

Anexos

Segn la norma NOM-113- SSA1-1994

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Practica 7 Determinacin de bacterias coliformes por la tcnica del numero mas probable ( NMP)

0bjetivo
Determinacin de bacterias coliformes en alimentos por el mtodo de Nmero ms probable (NMP).

Coliformes, bacilos Gram negativos, no esporulados, aerobios o anaerobios facultativos, que a 35 C fermentan la lactosa con la produccin de gas bajo las condiciones especificadas en esta norma.

Definiciones

El nmero de microorganismos coliformes puede estimarse mediante el uso de cuenta en placas o por medio de la tcnica del nmero ms probable. Esta ltima, tambin llamada tcnica de dilucin en tubo, proporciona una estimacin estadstica de la densidad microbiana presente con base a que la probabilidad de obtener tubos con crecimiento positivo disminuye conforme es menor el volumen de muestra inoculada. El primero, es que Escherichia coli es aceptada como bacteria coliforme, la especie contiene variantes que no producen gas de la lactosa o lo hacen despus de 48 horas, por lo que no se les identifica por medio de esta tcnica. El mtodo se basa en que las bacterias coliformes, fermentan la lactosa incubadas a 35 1C durante 24 a 48 horas, resultando una produccin de cidos y gas el cual se manifiesta en las campanas de fermentacin. Mtodo Segn la norma NOM-112- SSA1-1994, Determinacin de bacterias coliformes tcnica del nmero ms probable. Reactivos
Los reactivos que a continuacin se mencionan deben ser de grado analtico y cuando se indique agua debe entenderse como agua destilada. Medios de cultivo Caldo lactosado (medio de enriquecimiento para agua potable y hielo). Caldo lauril sulfato triptosa (medio de enriquecimiento selectivo). Caldo lactosa bilis verde brillante (medio de confirmacin). En el caso del anlisis de agua potable y hielo puede utilizarse caldo lactosado o caldo lauril sulfato triptosa con prpura de bromocresol (concentracin 0,01 g/l de medio), como alternativa al uso de campanas de fermentacin. Los tubos positivos se manifiestan por el vire del indicador a color amarillo

Introduccin

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. . .

Muestreo y muestra Se aceptan muestras colectadas en recipientes esterilizados y muestras que hayan sido transportadas adecuadamente. La muestra deber ser suficiente para su estudio (50 a 100 g ml) segn las tcnicas para el muestreo y anlisis microbiologico de alimentos y bebidas Sistema analtico Segn la Norma Oficial Mexicana NOM-112-SSAI-1994 para deteminacin de bacterias coliformes tcnica del nmero ms probable. Uso del sistema analtico Para agua potable y hielo Prueba presuntiva Inoculacin. Agitar la muestra. Transferir volmenes de 10 ml de muestra a cada uno de 5 tubos con 20 ml de caldo lactosado de mayor concentracin y 1,0 ml y 0,1 ml de muestra a cada uno de los tubos de las series de 5 respectivamente con 10 ml de caldo lactosado de concentracin sencilla o caldo lauril sulfato triptosa con prpura de bromocresol. Incubacin. Incubar los tubos a 35 C. Examinar a las 24 2 h y observar si hay formacin de gas o la formacin de gas no se observa en este tiempo, incubar por 48 2 h. Prueba confirmativa De cada tubo que muestre formacin de gas, tomar una azada y sembrar en un nmero igual de tubos con medio de confirmacin, caldo lactosa lauril bilis verde brillante. Incubar a 35 0,5 C por 24 2 horas o si la formacin de gas no se observa en este tiempo, incubar por 48 2 horas. En este procedimiento, para el anlisis de agua potable, agua purificada as como hielo, se emplea la serie de 5 tubos inoculados, 5 tubos con 10 ml, 5 tubos con 1 ml y 5 tubos con 0,1 ml, vese el cuadro 4. Para alimentos. Preparar suficiente nmero de diluciones para asegurar que todos los tubos correspondientes a la ltima dilucin rindan un resultado negativo. FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

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Prueba presuntiva Inoculacin. Tomar tres tubos de medio de enriquecimiento de mayor concentracin. Usar una pipeta estril para transferir a cada tubo 10 ml de la muestra si es lquida o 10 ml de la dilucin primaria inicial, en el caso de otros productos. Tomar tres tubos de concentracin sencilla del medio selectivo de enriquecimiento. Usar una pipeta estril para transferir a cada uno de estos tubos 1 ml de la muestra si es lquida o 1 ml de la dilucin primaria en el caso de otros productos. Para las diluciones subsecuentes, continuar como se indica en el prrafo anterior, usando una pipeta diferente para cada dilucin. Mezclar suavemente el inculo con el medio. Incubacin. Incubar los tubos a 35 0,5 C por 24 2 horas y observar si hay formacin de gas, en caso contrario prolongar la incubacin hasta 48 2 horas.

Prueba confirmativa De cada tubo que muestre formacin de gas, tomar una azada y sembrar en un nmero igual de tubos con medio de confirmacin. Incubar a 35 0,5 C por 24 2 horas o si la formacin de gas no se observa en este tiempo, prolongar la incubacin por 48 2 horas. En este procedimiento se considera una combinacin de tres tubos por cada dilucin de la serie. Para algunos productos y siempre que se requiera una mayor precisin en los resultados, ser necesario inocular una serie de cinco o diez tubos.

Procesamiento de datos Tomar la serie de tubos de la prueba confirmativa que d formacin de gas despus del periodo de incubacin requerido y buscar el NMP en los cuadros correspondientes.

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Indice del NMP y lmites de confianza 95% para varias combinaciones de resultados positivos cuando son usados varios nmeros de tubos. (Diluciones 10-1, 10-2 y 10-3) 3 TUBOS POR DILUCION COMBINACION DE POSITIVOS 0-0-0 0-0-1 0-1-0 0-2-0 1-0-0 1-0-1 1-1-0 1-1-1 1-2-0 2-0-0 2-0-1 2-1-0 2-1-1 2-2-0 2-2-1 2-3-0 3-0-0 3-0-1 3-0-2 3-1-0 3-1-1 3-1-2 3-2-0 INDICE DEL 95% NMP POR G <3 3 3 ----4 7 7 11 11 9 14 15 20 21 28 ----23 39 64 43 75 120 93 LIMITES ALTO <9 9 13 ----20 21 23 36 36 36 27 44 89 47 150 ----120 13 380 210 230 380 380 11 14 ----14 2,0 4,0 ----4,0 25 34 ----34 CONFIANZA BAJO <0,5 <0,5 <0,5 ----<0,5 1 1 3 3 1 3 3 7 4 10 ----4 7 15 7 14 30 15 5 TUBOS POR DILUCION DE INDICE DEL NMP POR G <2 2 2 4 2 4 4 6 6 5 7 7 9 9 ----12 8 11 95% LIMITES ALTO <7 7 7 11 7 11 11 15 15 13 17 17 21 21 ----28 19 25 DE CONFIANZA BAJO <0,5 <0,5 <0,5 <0,5 <0,5 <0,5 <0,5 <0,5 <0,5 <0,5 1,0 1,0 2,0 2,0 ----3,0 1,0 2,0

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LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS 3-2-1 3-2-2 3-3-0 3-3-1 3-3-2 3-3-3 4-0-0 4-0-1 4-1-0 4-1-1 4-1-2 4-2-0 4-2-1 4-3-0 4-3-1 4-4-0 5-0-0 5-0-1 5-0-2 5-1-0 5-1-1 5-1-2 5-2-0 5-2-1 5-2-2 5-3-0 5-3-1 5-3-2 5-3-3 5-4-0 5-4-1 5-4-2 150 210 240 460 1100 >1100 --------------------------------------------------------------------------------------------------------30 35 36 71 150 >150 --------------------------------------------------------------------------------------------------------440 440 130 240 480 >480 --------------------------------------------------------------------------------------------------------17 --------------------13 17 17 21 26 22 26 27 33 34 23 31 43 33 46 63 49 70 94 79 110 140 180 130 170 220 5,0 --------------------3,0 5,0 5,0 7,0 9,0 7,0 9,0 9,0 11 12 7 11 15 11 16 21 17 23 28 25 31 37 44 35 43 57 46 --------------------31 46 46 63 78 67 78 80 93 93 70 89 114 93 120 150 130 170 220 190 250 340 500 300 490 700

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LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS 5-4-3 5-4-4 5-5-0 5-5-1 5-5-2 5-5-3 5-5-4 5-5-5 ------------------------------------------------------------------------------------------------280 350 240 350 540 920 1600 >1600 90 120 68 120 180 300 640 >640 850 1000 750 1000 1400 1200 5800 >5800

INFORMAR: "Nmero ms probable (NMP) de coliformes por gramo o mililitro de muestra". En caso de muestras de agua informar NMP/100 ml. Cuestionario. 1. En que se basa este mtodo .? 2. Por cuanto tiempo se incuban los tubos? 3. Cuantas series de tubos inocula en caso de agua , y cuantas en caso de alimentos.? 4. Que caractersticas debe tener un tubo para darlo como positivo? 5. Si obtuvo un resultado 3-3-2 como reportara su resultado , en caso de un alimento liquido?

Anexos

Segn la norma NOM-112 SSA1-1994

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LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS Practica 8 Metodo para la determinacin de Staphylococcus aureus en alimentos

0bjetivo
Identificacin y cuenta de Staphylococcus aureus en alimentos

Definiciones

Staphylococcus aureus, microorganismo que se desarrolla en medios de cultivo selectivo y diferencial, que es capaz de dar positiva la prueba de coagulasa y termonucleasa.

Este mtodo permite hacer una estimacin del contenido de Staphylococcus aureus en alimentos, se efectua directamente en placas de medio de cultivo selectivo y diferencial, con la confirmacin mediante las pruebas de coagulasa y deneasa. Mtodo Segn la norma NOM-115- SSA1-1994, Bienes y servicios. Mtodo para la determinacin de Staphylococcus aureus en alimentos.

Introduccin

Reactivos
Los reactivos que a continuacin se mencionan deben ser de grado analtico y cuando se indique agua debe entenderse como agua destilada.

Medios de cultivo
Medio de Baird-Parker.

Caldo de infusin cerebro-corazn (BHI) ADN helicoidal de timo de ternera Solucin de telurito .

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. SOLUCIONES Solucin reguladora de fosfatos (solucin concentrada). Solucin de trabajo: o o o Tomar 1,25 ml de la solucin concentrada y llevar a un litro con agua Esterilizar a 121 1,0C durante 15 minutos.

Agua peptonada. Solucin salina isotnica Solucin de cloruro de calcio anhidro 0,01M . Solucin de azul de toluidina 0,1 M

Solucin amortiguadora 0,05 M tris-(hidroximetilaminometano) Reactivo biolgico plasma de conejo

Muestreo y muestra Se aceptan muestras colectadas en recipientes esterilizados y que hayan sido transportadas adecuadamente. La muestra deber ser suficiente para su estudio (50 a 100 g ml) segn las tcnicas para el muestreo y anlisis microbiologico de alimentos y bebidas Segn la Norma Oficial Mexicana NOM-115-SSAI-1994. Metodo para la determinacin de Staphylococcus aureus en alimentos. Uso del sistema analtico Preparacin de la muestra La preparacin de la muestra se debe realizar de acuerdo a lo establecido en practica 3 Sembrado en placa Utilizando diferentes pipetas de 1 ml para cada dilucin, depositar 0,1 ml sobre la superficie de las placas de agar Baird-Parker. Distribuir el inculo sobre la superficie del agar con varillas estriles de vidrio en ngulo recto, utilizando una para cada dilucin. Mantener las placas en su posicin hasta que el inculo sea absorbido por el agar. FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS Invertir las placas e incubar de 45 a 48 h a 35C. Seleccionar las placas que tengan entre 15 y 150 colonias tpicas de Staphylococcus aureus; si no es posible, seleccionar las placas de las diluciones ms altas no obstante tengan ms de 150 colonias. Cuando las placas tengan menos de 15 colonias tpicas tambin pueden ser utilizadas y al informe se debe agregar la nota de "valor estimado". Las colonias tpicas son negras, circulares, brillantes, convexas, lisas, de dimetro de 1 a 2 mm y muestran una zona opaca y un halo claro alrededor de la colonia. Seleccionar las colonias de acuerdo con el siguiente cuadro para realizar las pruebas de coagulasa y termonucleasa: Cuadro 1 Cuadro 1 Nmero de colonias sospechosas Nmero de colonias por probar en placa Menos de 50 3 51 a 100 5 101 a 150 7 Seleccionar el nmero de colonias y sembrar cada una en tubos con 0,5 ml de caldo de infusin cerebro-corazn. Incubar a 35C durante 24 h. Inocular en la misma forma cepas conocidas de Staphylococcus aureus y Staphylococcus epidermidis como testigos positivo y negativo. Despus del periodo de incubacin pasar con una pipeta de 1 ml, 0,3 ml de cada cultivo a otro tubo de 10 mm x 75 mm y conservarlo para la prueba de termonucleasa. el resto del cultivo se usa para la prueba de coagulasa. Prueba de coagulasa Agregar a los 0,2 ml del cultivo anterior, 0,2 ml de plasma de conejo diluido volumen a volumen con solucin salina estril. Incubar en bao de agua de 35 a 37C y observar durante 6 h a intervalos de 1 h; si no hay formacin de cogulo, observar a las 24 h. considerar positiva la prueba si hay formacin de cogulo. Para comprobar la coagulabilidad del plasma de conejo se aade una gota de cloruro de calcio al 5% a 0,5 ml de plasma reconstituido empleado, formndose un cogulo en 10-15 seg. Prueba de termonucleasa Calentar durante 15 min, 0,3 ml de cultivo en caldo de infusin cerebro-corazn en bao de agua hirviendo. Pasar una gota de cada cultivo por medio de una pipeta pasteur a un orificio del medio, incluye testigo. Incubar a 35C en cmara hmeda de 4 a 24 h. La aparicin de un halo color rosa extendido de por lo menos 1 mm alrededor de la perforacin se califica como positiva. FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

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Procesamiento de datos Hacer el clculo del contenido de microorganismos en el producto tomando en cuenta el nmero de colonias totales, el nmero de colonias confirmadas, la dilucin y el volumen inoculado (0,1 ml). Ejemplo 1: Si la caja tiene 80 colonias en la dilucin 1:1000 Se toman 5 colonias para la prueba, de stas dan 4 positivas, el clculo es:

80 x 4 ! 64 x1000 x10 ! 640000 5


Ejemplo 2: Si la caja tiene 14 colonias en la dilucin 1:10 Se toman 3 colonias para la prueba, de stas dan 2 positivas, el clculo es:

INFORMAR: Segn ejemplo 1:

14 x 2 ! 9,3 x10 x10 ! 930 3

Informar como Staphylococcus aureus: 640 000 UFC/g segn ejemplo 2: Informar como Staphylococcus aureus: 930 UFC/g valor estimado Si las pruebas confirmativas resultan negativas en todas las colonias probadas, informar como: 0 UFC/g en muestras directas CUESTIONARIO. 1. QUE TIPO DE MEDIO DE CULTIVO SE EMPLEA EN ESTA TECNICA:? 2. EN QUE ALIMENTOS SE BUSCA ESTE MICROORGANISMO.? 3. CUANTAS COLONIAS DEBE PROBAR SI SU CONTEO ESTA ENTRE 50 Y 100 ? 4. SI CONTO 26 COLONIAS Y PROBO 3 Y 2 DIERON POSITIVAS,COMO REPORTARIA SU RESULTADO.? 5. EN QUE NOM ESTA BASADA ESTA DETERMINACIO? 6. PORQUE ES IMPORTANTE LA DETERMINACION DE ESTE MICROORGANISMO?

La norma NOM-115 SSA1-1994

Anexos

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Practica 9 Metodo para la determinacin de Salmonella spp en alimentos Objetivo La deteccin y el control de salmonella spp en alimentos.

Definiciones Deteccin de Salmonella: determinacin de la presencia o ausencia de estos microorganismos en una masa determinada de producto, cuando las pruebas se llevan a cabo de acuerdo con esta norma. Salmonella: microorganismo patgeno perteneciente al grupo de Enterobacterias. Bacilo gram negativo, aerobio, no esporulado que forman colonias tpicas en medios selectivos slidos y que presentan adems las caractersticas bioqumicas y serolgicas descritas cuando los procedimientos se efectan de acuerdo con esta norma.

Las especies del gnero Salmonella (Salmonella spp) han sido muy estudiadas como patgenas cuando se encuentran presentes en los alimentos. La deteccin de este microorganismo depende en cierta medida del mtodo analtico en muestras clnicas y los mtodos empleados para estos casos se adaptaron posteriormente para su deteccin en alimentos. Las modificaciones a los mtodos consideraron dos aspectos importantes, el primero es el debilitamiento o dao de las celular bacterianas presentes en un alimento, debido al proceso a que esta sujeto (por ejemplo: tratamiento trmico, secado, etc.) y el segundo, la variabilidad inherente a la naturaleza del producto bajo estudio. Mtodo Segn la norma NOM-114 SSA1-1994 para la determinacin de Salmonella en alimentos.

Introduccin

Reactivos
Los reactivos que a continuacin se mencionan deben ser de grado analtico y cuando se indique agua debe entenderse como agua destilada.

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Medios de cultivo Medios de pre-enriquecimiento Medios de aislamiento

Agar verde brillante (VB) Agar XLD

Agar salmonella-shigella (SS). Agar entrico Hektoen

Medios para pruebas bioqumicas Agar de tres azcares y hierro (TSI) Agar de hierro y lisina (LIA) AGAR NUTRITIVO. Medio de SIM (para Sulfuro, Indol y Movilidad) Agar citrato de Simmons

Caldo MR-VP (Rojo de metilo-Voges Proskauer) Caldo manitol Caldo malonato Caldo urea Caldo infusin cerebro corazn (BHI) SOLUCIONES Solucin verde brillante al 0,1% (1:1000) Solucin de yodo-yoduro Solucin salina al 0,85% Solucin salina formalizada Reactivo de Kovac Solucin de alfa-naftol al 5% Solucin de rojo de metilo Solucin de gelatinasa al 5%

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Antisueros o Antisuero polivalente somtico (O) o Antisuero polivalente flagelar (H) o Antisuero polivalente capsular

Muestreo y muestra Se aceptan muestras colectadas en recipientes esterilizados y que hayan sido transportadas adecuadamente. La muestra deber ser suficiente para su estudio (50 a 100 g ml) segn las tcnicas para el muestreo y anlisis microbiologico de alimentos y bebidas Sistema analtico Segn la Norma Oficial Mexicana NOM-114-SSAI-1994 para la determinacin se salmonella spp en alimentos. Uso del sistema analtico preparacin de la muestra Los siguientes mtodos se basan en el anlisis de 25 g de la muestra analtica en una proporcin de 1 parte de muestra por 9 de caldo (para una dilucin final de 1:10). Esta cantidad puede variarse siempre que se mantenga la misma proporcin. Se recomienda una muestra de 25 g o ms (25 g de muestra en 225 mL de caldo). Procedimiento general para la preparacin de muestras Pesar aspticamente 25 g de la muestra en un vaso estril de licuadora o en bolsa estril para trabajar en homogeneizador peristltico (stomacher). Adicionar 225 ml del medio de preenriquecimiento estril (generalmente caldo lactosado, a menos que se indique otro) y licuar si es necesario durante un min. Transferir aspticamente la mezcla homogeneizada a un recipiente estril de boca ancha con tapn de rosca y dejar reposar por 60 min a temperatura ambiente con la tapa bien enroscada. Mezclar bien y determinar el pH aproximado con papel pH. Ajustar, si es necesario, a un pH 6,8 0,2 con hidrxido de sodio 1N o cido clorhdrico 1N estriles. Mezclar y cubrir el recipiente enroscando suavemente la tapa. Incubar 24 2 h a 35C. Continuar como se indica en5.9.1.

Procedimiento especfico para la preparacin de muestra segn el producto. Huevo en polvo, claras de huevo en polvo, yema de huevo en polvo, huevos lquidos pasteurizados y congelados, frmulas infantiles y mezclas preparadas en polvo (harinas para hot cakes, galletas, donas, bisquets y pan). De preferencia no descongelar la muestra. Si se requiere, preparar los alimentos congelados justo antes de tomar la muestra analtica descongelndolos a FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS 45C por 15 min aproximadamente con agitacin constante en un bao de agua o por 18 h a una temperatura entre 2-5C. Los productos que no son en polvo se trabajan como indica el procedimiento general (9.4.1). Para los productos en polvo, pesar 25 g de muestra analtica en el medio de pre-enriquecimiento, dejando que el polvo se humecte lentamente. Si es necesario homogeneizando poco a poco con una varilla de vidrio estril u otra herramienta tambin estril. Continuar igual que el procedimiento general. Productos no pasteurizados congelados de huevo. Descongelar la muestra como se indica en 9.4.2.1. Pesar aspticamente y por duplicado 25 g de muestra. Colocar en un matraz con 225 ml de caldo selenito cistina una de las muestras y la otra en un matraz con 225 ml de caldo tetrationato, sin verde brillante. Proceder como en 9.4.1 hasta ajustar el pH. Adicionar 2,25 ml de verde brillante al 0,1% y 4,5 ml de solucin yodo-yoduro a la muestra contenida en el caldo tetrationato y mezclar bien. Incubar como se indica en 9.5.2. Productos que contienen huevo en su formulacin (pastas para sopa, rollos chinos, etc.); ensaladas preparadas (jamn, huevos, pollo, atn, pavo); frutas frescas, congeladas o secas; crustceos (camarones, cangrejos, jaibas, langostinos, langostas) y pescado. Preferentemente no descongelar la muestra antes de su anlisis, si esto es necesario, proceder igual que en 9.4.2.1. utilizando caldo lactosado como medio de pre-enriquecimiento, licuar dos min. Continuar despus de la incubacin como en 9.5.1. Leche en polvo, entera, semidescremada o descremada. Seguir el procedimiento general para el pesado de la muestra y adicionarla lentamente a un matraz Erlenmeyer con 225 ml de solucin verde brillante al 0,1%, procurando que el polvo quede en la superficie del lquido y se hidrate suavemente. Dejar la mezcla en reposo por 60 min, e incubar como se indica en 9.4.1 Queso. Proceder igual que en 9.4.1. utilizando agua de peptona tamponada como medio de preenriquecimiento. Casena. Seguir el procedimiento sealado en 9.4.1, licuar por dos min y ajustar cuidadosamente el pH. Coco. Proceder como se indica en 9.4.1 hasta ajustar, si es necesario, el pH a los valores indicados. Adicionar hasta un mximo de 2,25 ml de Tergitol aninico 7 estril (121C 1C/15 min) y mezclar bien. Puede utilizarse Tritn X-100 estril. Usar la cantidad necesaria de estos detergentes utilizando el volumen mnimo para que se inicie la formacin de espuma. Puede ser, para el Tritn X-100 de dos a tres gotas. Incubar como se indica en 9.4.1. Levadura seca. Seguir el procedimiento de 9.4.1, utilizando como medio de enriquecimiento caldo soya tripticasa estril. Mezclar para formar una suspensin homognea. Ajustar el pH y terminar el procedimiento como en 9.4.1. Para levadura seca inactiva, continuar como en 9.5.1. Para levadura seca activa, mezclar la muestra incubada y transferir 1 ml a cada tubo de 10 ml de caldo FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS tetrationato y 10 ml de caldo lauril triptosa. Incubar los medios selectivos por 24 2 h. Continuar como se indica en 9.5.2. Carnes, sustitutos de carnes, derivados crnicos, sustancias de origen animal, productos glandulares y harinas (pescado, carne y hueso). Productos procesados trmicamente y productos secos. Se sigue el procedimiento sealado en 9.4.1 hasta la homogeneizacin. Si la muestra es en polvo o molida, el licuado puede omitirse. Despus de reposar, mezclar bien y ajustar el pH como se indica en el procedimiento general. Para emulsionar las grasas, agregar los detergentes en las mismas proporciones y con las mismas recomendaciones que para el coco. La cantidad de los mismos depender en gran medida de la composicin del alimento. Los detergentes no sern necesarios en los productos glandulares en polvo. Incubar las muestras como se indica en 9.4.1. Productos crudos o altamente contaminados. Pesar porciones de 25 g de producto en dos vasos para licuadora. Si la muestra es en polvo o molida, el licuado puede omitirse y el producto puede pesarse directamente en matraces Erlenmeyer estriles de 500 ml. Adicionar 225 ml de caldo selenito-cistina o 225 ml de caldo tetrationato (sin verde brillante) a cada muestra analtica. Licuar por dos min y pasar aspticamente a matraces Erlenmeyer de 500 ml. Dejar reposar y ajustar el pH como se indica en 9.4.1. Adicionar 2,25 ml de solucin de verde brillante 0,1% y 4,5 ml de solucin yodo-yoduro a la muestra que se enriquecer con caldo tetrationato. Homogeneizar e incubar. Continuar como se indica en 9.5.1. Dulces y dulces cubiertos (incluyendo chocolate). Pesar aspticamente 25 g de la muestra en un vaso para licuadora agregando 225 ml de leche descremada reconstituida. Licuar por dos min. Manejar igual que en 2.4.1 hasta despus de ajustar el pH. Adicionar 0,45 ml de la solucin verde brillante al 0,1% y mezclar bien. Incubar como se indica en 9.4.1. Especias Pimienta negra, pimienta blanca, semilla de apio, comino, perejil seco, romero, tomillo, chile en polvo, paprika o pimentn, ajonjol, hojuelas de vegetales (vegetales secos). Pesar aspticamente 25 g de la muestra y verter en un recipiente de tapn de rosca de 500 ml con 225 ml de caldo soya tripticasa estril y mezclar bien. Continuar con el procedimiento 9.4.1. Ajo en polvo u hojuelas; cebolla en polvo u hojuelas. Pesar aspticamente 25 g de la muestra y verter en un recipiente de tapn de rosca de 500 ml con 225 ml de caldo soya tripticasa estril adicionado con sulfito de potasio y mezclar bien. Continuar con el procedimiento 9.4.1. Pimienta de Jamaica (Pimienta inglesa), clavo de especia, canela y organo. No se conoce un mtodo para neutralizar la toxicidad de estas cuatro especias. Diluir por lo tanto, ms all de su poder de toxicidad. Examinar la pimienta, canela y organo en una proporcin 1:100 muestra/caldo, y el clavo a 1:1000 muestra/caldo. Seguir el procedimiento igual que en 9.4.2.11.1 FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

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Gelatina. Pesar aspticamente 25 g de muestra en un recipiente de boca ancha y tapn de rosca de 500 ml. Adicionar 225 ml de caldo lactosado estril con 5 ml de solucin acuosa de gelatinasa al 5% y mezclar bien. Dejar reposar 60 min y continuar igual que el procedimiento 9.4.1. Aislamiento Cerrar firmemente el tapn de rosca de los matraces con los cultivos de pre-enriquecimiento y agitar suavemente, transferir respectivamente 1 ml de la mezcla a un tubo que contenga 10 ml de caldo tetrationato y a otro con 10 ml de caldo selenito cistina. Como alternativa, en sustitucin del caldo tetrationato puede emplearse el medio Vassiliadis-Rappaport. Incubar de 18 a 24 h a 35C o, para alimentos fuertemente contaminados a 42C por el mismo periodo. Estriar los productos que fueron directamente enriquecidos en medios selectivos. Mezclar el tubo con caldo selenito cistina y estriar en agar xilosa lisina desoxicolato (XLD), agar verde brillante (VB) y una tercera caja con cualquiera de los medios selectivos adicionales (agar entrico Hektoen, agar Sulfito de Bismuto o Agar SS). Efectuar el mismo procedimiento para el caldo tetrationato. Incubar las placas 24 2 h a 35C. Examinar las placas para investigar la presencia de colonias tpicas de Salmonella, de acuerdo con las siguientes caractersticas: Agar XLD: colonias rosas o rojas que pueden ser transparentes con o sin centro negro. En algunos casos las colonias pueden aparecer completamente negras. Agar VB: colonias rojas o rosas que pueden ser transparentes rodeadas por medio enrojecido; las bacterias fermentadoras de la lactosa dan colonias amarillas. Agar entrico Hektoen: colonias verdes o azulverdes con o sin centro negro. En algunos casos las colonias pueden aparecer completamente negras. Agar Sulfito de Bismuto: las colonias tpicas de Salmonella spp pueden ser cafs, grises o negras; con o sin brillo metlico. Generalmente el medio circundante (halo) es caf, tornndose posteriormente negro. Algunas cepas producen colonias verdes sin la formacin del halo oscuro. Si las placas no muestran colonias tpicas o no se observa crecimiento, incubar 24 h adicionales. Agar SS: colonias translcidas, ocasionalmente opacas. Algunas colonias dan centro negro. Las colonias fermentadoras de la lactosa son rojas. Identificacin bioqumica

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LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS Seleccionar al menos dos colonias tpicas de cada medio selectivo, que se encuentren bien aisladas. Tocar levemente el centro de cada colonia e inocular dos tubos, uno con agar triple azcar hierro (TSI) y otro con agar hierro lisina (LIA), por estra en la superficie inclinada y por puncin en el fondo. Incubar por 24 2 h a 35C. Almacenar en refrigeracin de 5 a 8C las placas con medios selectivos por si es necesario retomar ms colonias. Observar el crecimiento en los tubos y considerar presuntivamente positivas para Salmonella las colonias que den las siguientes reacciones: Agar TSI, en el fondo del tubo se observa vire del indicador debido a la fermentacin de la glucosa; en la superficie del medio se observa un color rojo ms intenso que el medio original debido a la no fermentacin de la lactosa ni de la sacarosa. En la mayora de los casos se observa coloracin negra a lo largo de la puncin debido a la produccin de cido sulfihdrico. Agar LIA, se observa intensificacin del color prpura en todo el tubo por la descarboxilacin de la lisina. Considerar negativos aquellos cultivos que produzcan claramente color amarillo en el fondo del agar. La mayora de las cepas de Salmonella spp producen cido sulfihdrico en este medio con ennegrecimiento a lo largo de la puncin. Retener todos los cultivos que muestren las reacciones caractersticas de Salmonella spp en los medios TSI y LIA para las pruebas adicionales, indicadas en 3.2.3. Los cultivos con TSI que no parecen de Salmonella spp pero que presentan reacciones en LIA tpicos, deben trabajarse como cultivos presuntivos positivos, ya que en estos casos, el medio LIA permitir detectar S. arizonae y cepas atpicas de Salmonella spp que utilicen lactosa o sacarosa. Descartar solamente los cultivos que muestren reacciones atpicas en ambos medios. Continuar el anlisis a partir de los tubos de TSI con reacciones tpicas. Si el cultivo presenta reacciones atpicas en este medio, tomar colonias adicionales de las placas de donde se obtuvo el cultivo atpico anterior y sembrar las pruebas bioqumicas nuevamente. Continuar la identificacin bioqumica y serolgica a partir de los cultivos recuperados de TSI. Se recomienda trabajar seis cultivos por cada 25 g de unidad analtica seleccionando colonias procedentes de ambos medios de enriquecimiento. Prueba de ureasa Prueba de ureasa (convencional). Con un asa estril, tomar crecimiento del cultivo presumiblemente positivo de cada tubo de medio TSI e inocular tubos de caldo urea. Utilizar un control de medio para comparar el vire prpura de las reacciones positivas con el color del medio original. Incubar 24 2 h a 35C.

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LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS Prueba de ureasa (rpida). Tomar dos asadas de crecimiento del cultivo presumiblemente positivo de cada tubo de medio TSI e inocular tubos de caldo urea (rpida). Incubar 2 h a 37 0,5C en bao de agua. Descartar todos los cultivos que den ureasa positiva. Retener los cultivos que den la prueba negativa (sin cambio de color del medio). Identificacin serolgica Ensayo de los antgenos somticos de Salmonella spp (Antisuero polivalente O) Colocar con un asa dos gotas separadas de solucin salina estril sobre un portaobjetos o en dos secciones de una placa para aglutinacin. Suspender en cada una de las gotas, una porcin del cultivo desarrollado en TSI. Agregar a una de ellas una gota del antisuero polivalente somtico (O) y mezclar con el canto del asa o empleando aplicadores de madera. Agitar inclinando la lmina hacia atrs y hacia adelante durante aproximadamente un min. Observar bajo buena iluminacin sobre un fondo oscuro. Considerar cualquier grado de aglutinacin como positiva. La prueba positiva resulta cuando se presenta aglutinacin en la gota con el cultivo y el antisuero y no aglutinacin en la gota que contiene el cultivo y la solucin salina. Si se observa aglutinacin en ambas gotas, la prueba no es definitiva y se debe continuar con las pruebas bioqumicas complementarias. Cuando la aglutinacin es positiva con el suero polivalente O, puede determinarse el subgrupo empleando antisueros para los diferentes subgrupos (los grupos B, C, D y E, suelen ser los ms frecuentes). Si la aglutinacin con el antisuero O es negativa, utilizar antisuero Vi y efectuar la prueba. Si hay aglutinacin con Vi calentar el cultivo a ebullicin y repetir la aglutinacin con el antisuero polivalente O. Si no se cuenta con los sueros grupo especficos, solicitar la tipificacin de la cepa al Laboratorio de Enterobacterias del Centro Nacional de Diagnstico y Referencia de la Secretara de Salud o al Laboratorio Nacional de Salud Pblica. Si se requiere, practicar el ensayo de los antgenos flagelares de Salmonella (Antisuero polivalente H). Inocular el crecimiento del tubo de TSI en agar infusin de cerebro corazn e incubar de 4 a 6 h a 35C hasta que se observe crecimiento (para ensayo en el mismo da), o bien, en caldo soya tripticaseina e incubar por 24 2 h a 35C (para ensayo al da siguiente). Adicionar 2,5 ml de solucin salina formalizada a 5 ml del cultivo en caldo o al cultivo en agar cerebro corazn (BHI). FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

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Colocar 0,5 ml del antisuero polivalente flagelar (H) preparado en un tubo para serologa (13 x 100 mm aproximadamente). Adicionar 0,5 ml del cultivo formalizado. Preparar un control de solucin salina mezclando 0,5 ml de solucin salina formalizada con 0,5 ml del antgeno formalizado. Incubar las mezclas en bao de agua a 48-50C. Observar a intervalos de 15 min por espacio de una hora. Una prueba positiva es cuando se observa aglutinacin en la mezcla de prueba pero no en el control. Debe interpretarse como negativa una prueba en la que ninguna de las mezclas muestre aglutinacin. Cuando ambas mezclas se aglutinan, se considera la prueba inespecfica. Pruebas bioqumicas complementarias Cuando las pruebas serolgicas o bioqumicas iniciales, dan resultados atpicos o no concluyentes, realizar las pruebas que se describen a continuacin: Inocular los cultivos positivos provenientes de TSI y LIA en: medio SIM, agar citrato de Simmons, caldo manitol y caldo RM-VP. Usar caldo malonato para confirmar la presencia de la especie S. arizonae. Interpretar los cambios en los medios inoculados conforme lo siguiente: Agar citrato Simmons Inocular por estra el tubo. Incubar 96 2 h a 35 2C. Prueba positiva: crecimiento acompaado de un cambio de color de verde a azul. Prueba negativa: ausencia de crecimiento y sin cambio de color. Medio SIM Inocular por puncin. Incubar 24 h a 35 2C. Movilidad. Prueba positiva: crecimiento a lo largo de la puncin y en el seno del medio de cultivo. Prueba negativa: crecimiento a lo largo de la puncin exclusivamente. Produccin de cido sulfhdrico. Prueba positiva: desarrollo de un color negro a lo largo de la puncin que puede extenderse a todo el medio. Prueba negativa: ausencia de color negro. Produccin de indol. Adicionar al tubo con medio SIM que presente crecimiento, de 0,2 a 0,3 ml de reactivo de Kovac. Prueba positiva: desarrollo de un anillo de color rojo. FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

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Prueba negativa: sin cambio de color. Caldo RM-VP. Inocular un tubo con el medio. Incubar 48 2 h a 35 2C para la prueba de VP y 96 h para la prueba RM. Prueba de Voges-Proskauer (VP): Prueba positiva: desarrollo de color rojo ladrillo. Prueba negativa: sin cambio de color. Reincubar el resto del medio RM-VP 48 h ms a 35 2C. Prueba de rojo de metilo (RM) Adicionar al medio de cultivo de 96 h de incubacin de dos a tres gotas de solucin de rojo de metilo. Interpretar los resultados inmediatamente. Prueba positiva: desarrollo de color rojo. Prueba negativa: desarrollo de color amarillo. Caldo malonato. Inocular un tubo conteniendo el medio. Incubar 40 2 h a 35 2C. Prueba positiva: desarrollo de color azul. Prueba negativa: sin cambio de color. Caldo manitol. Inocular un tubo conteniendo el medio. Incubar 24 2 h a 35 2C. Prueba positiva: desarrollo de color amarillo. Prueba negativa: sin cambio de color. Consultar los resultados obtenidos en el cuadro 2 para la identificacin de los gneros de las bacterias investigadas. Nota: los sistemas bioqumicos comerciales validados pueden ser usados como alternativa para las pruebas bioqumicas convencionales. FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS Interpretacin de reacciones bioqumicas y serolgicas. CUADRO 1 Reacciones bioqumicas Tpica Tpica Tpica Reacciones atpicas Reacciones atpicas Reacciones Serolgicas Antgeno O, Vi o H positivo Todas las reacciones negativas No probadas Antgeno O, Vi o H positivo Todas las reacciones negativas No debe ser considerada Salmonella spp Puede ser Salmonella spp Interpretacin Cepas consideradas como Salmonella spp

Reacciones bioqumicas y serolgicas de Salmonella Prueba o sustrato TSI (glucosa) LIA (Lisina descarboxilasa) H2S (LIA y TSI) Ureasa Caldo de lisina descarboxilasa Caldo dulcitol rojo de fenol Caldo KCN Caldo malonato Prueba de indol Antgeno flagelar (H) Antgeno somtico (O) Caldo lactosa rojo de fenol Prpura Amarillo o gas Crecimiento Azul Superficie color violeta Aglutinacin Aglutinacin Amarillo o gas Positivo Amarillo Prpura Negro Rojo prpura Negativo Rojo Amarillo No negro Sin cambio de color Amarillo Sin cambio de color ni gas Sin crecimiento Sin cambio de color Superficie color amarillo Sin aglutinacin Sin aglutinacin Sin cambio de color ni gas FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS -c + + -c Reaccin tpica + + + + +b

LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS Caldo sacarosa rojo de fenol Prueba Voges-Proskauer Prueba rojo de metilo Citrato de simmons Amarillo o gas De rosa a rojo Rojo difuso Crecimiento color azul Sin cambio de color ni gas Sin cambio de color Amarillo difuso Sin crecimiento, sin cambio v + -

a +, 90% o ms positivos en 1 o 2 das; -, 90% o ms negativas en 1 o 2 das;. b La mayora de los cultivos S. arizonae son negativos. c La mayora de los cultivos S. arizonae son positivos. v, variable

Procesamiento de datos INFORMAR: presencia o ausencia de Salmonella en __________ g o ____________ ml de muestra. Cuestionario. 1. porque es importante buscar Salmonella en alimentos? 2. Mencione por lo menos tres medios de enriquecimiento 3. Cmo se realiza la dilucin del alimento para buscar Salmonella? 4. que medios de cultivo en placa emplea para buscar este microorganismo? 5. De las pruebas bioqumicasCules son las iniciales que se emplean? Anexos Segn la norma NOM-114- SSAI-1994

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LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS Practica 10 Metodo para la determinacin de Listeria monocytogenes en alimentos 0bjetivo El aislamiento e identificacin de Listeria monocyitogenes en alimentos. Definiciones -hemolsis , zona transparente alrededor de la colonia debida a la lisis total del eritrocito. Listeria monocytogenes, bacilo corto, gram positivo , no esporulado, mvil, aerobio, capaz de crecer en condiciones de mictroaerofilia, catalasa positivo y oxidasa negativo. En agar sangre da origen a colonias puntiformes, circulares, lisas y translucidas de color azul grisceo con una zona de -hemolsis. Introduccion El mtodo para detectar la presencia de Listeria monocitogenes se basa en el aislamiento y la diferenciacin de especies de Listeria spp., principalmente por la fermentacin de carbohidratos y la actividad hemoltica de los miembros de este genero. Mtodo Segn la NOM-143-SSA1-1995. Mtodo de prueba microbiolgico para alimentos. Determinacin de Listeria monocytogenes.

Reactivos

Los reactivos que a continuacin se mencionan deben ser de grado analtico y cuando se indique agua debe entenderse como agua destilada.

Acido actico 5 N Acido clorhdrico 1 M Acido sulfanlico (cristales) Alfa-naftilamina Alfa-naftol 5% en etanol absoluto Etanol absoluto Granalla de zinc Hidrxido de sodio 1 M Lactamato de glicil-glicina (anhdrido de glicina) FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

y y y y y y y y

LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS y y y y y y y Regulador de fosfatos glicerinado con pH 9,0 0,2 Sangre de carnero desfibrinada Solucin al 3% de perxido de hidrgeno Solucin salina fisiolgica 0,85% estril Sueros comerciales para tipificacin de Listeria spp Sulfato de cadmio al 20% Zinc pulverizado

Reactivos para Tincin de Gram Alcohol-acetona Cristal violeta Solucin de Yodo-yoduro Solucin de Safranina Reactivos para la determinacin de nitritos Solucin de sulfato de cadmio al 20% Medios de cultivo.

Caldo soya tripticasena con 0,6 % de extracto de levadura (CSTEL) Caldo de enriquecimiento (EB) pH 7,3

Medio de cloruro de litio feniletanol -moxolactam (LMP)

Medio Oxford

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Agar soya tripticasena con 0,6% de extracto de levadura (ASTEL).

Agar sangre de carnero

Caldo nitratos Medios para la prueba de movilidad Medio de SIM Medio MTM Caldo prpura para fermentacin de carbohidratos .

Muestreo y muestra Se aceptan muestras colectadas en recipientes esterilizados y que hayan sido transportadas adecuadamente. La muestra deber ser suficiente para su estudio (50 a 100 g ml) segn las tcnicas para el muestreo y anlisis microbiologico de alimentos y bebidas Sistema analtico Segn la Norma Oficial Mexicana NOM-143-SSA1-1995. Mtodo de prueba microbiologico para alimentos determinacin de Listeria monocytogenes. Uso del sistema analtico Este mtodo debe realizarlo un microbilogo experimentado, en un ambiente controlado, aislado de reas de produccin de alimentos. Se debe tener especial cuidado en la disposicin de aquellos materiales y equipo que hayan estado en contacto con alimentos sospechosos, antes de desecharlos o volver a utilizarlos. Procedimiento de enriquecimiento Tomar una muestra representativa del alimento, tanto de la superficie externa como del interior colocar 25 ml o 25 g de la muestra en un recipiente conteniendo 225 ml de medio de enriquecimiento (EB), homogeneizar e incubar por 48 h a 30C. En el caso de muestras en donde se sospecha que tienen clulas de Listeria spp. daadas, se recomienda la incubacin en un caldo de enriquecimiento que contenga piruvato de sodio al 0.1% (p/v) incubado a 30C por 6 horas sin suplementos. Despus de las 6 h de incubacin los suplementos deben agregarse y continuar la incubacin a 30C hasta un total de 48 h.

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LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS Aislamiento Despus de 24 y 48 h de incubacin en el medio EB, resembrar en los medios LMP y OXA. Incubar las placas del medio LMP a 30C por 24 a 48 h y las de medio OXA a 35C por el mismo periodo. Observar el crecimiento en las placas del medio LMP con luz blanca en un ngulo de 45 (iluminacin de Henry), a simple vista o con la ayuda de una lupa. En este medio generalmente aparecen las colonias de color blanco o azul iridiscentes. En el medio OXA las colonias de Listeria son negras, con halo negro. Algunas colonias pueden aparecer con un tono caf oscuro que se define mejor a los siete das de incubacin. Seleccionar cinco o ms colonias tpicas del medio OXA o LMP y pasar a placas de medio ASTEL. Este paso es importante debido a que las colonias aparentemente aisladas en los medios OXA y LMP pueden estar contaminadas con flora competitiva parcialmente inhibida, invisible a simple vista. Debido a que puede estar presente ms de una especie de Listeria en una muestra, deben identificarse como mnimo cinco colonias. Identificacin se deben utilizar cepas de referencia para cada prueba. Seleccionar colonias tpicas y sembrar en medio ASTEL. Incubar a 35C por 24 h. Estos cultivos pueden mantenerse a 4C y utilizarse como inculo para realizar las pruebas de identificacin. Prueba de catalasa Emulsificar un cultivo puro, con una gota de solucin de perxido al 3%. La formacin inmediata de burbujas indica que la prueba es positiva. Las especies de Listeria son catalasa positivo. Tincin de Gram Hacer una tincin de Gram de cultivos de 16 a 24 h. Todas las especies de Listeria son bacilos cortos Gram positivos. Prueba de hemlisis Dibujar una cuadricula de 20 a 25 espacios en el fondo de la placa de agar sangre de carnero al 5% . Inocular por picadura un cuadro por cada cultivo. Incubar por 48h a 35C. al inocular, observar la reaccin hemoltica en las placas. L. monocytogenes y L. seeligeri producen una zona ligeramente clara alrededor del punto de picadura. Confirmar las reacciones dudosas con la prueba de CAMP. Prueba de reduccin de nitratos Inocular los tubos conteniendo caldo nitratos, incubar a 35C por 5 das. Para la lectura se debe agregar 0.2 ml del reactivo A y 0.2 ml del reactivo B, un color rojo indica una prueba positiva (presencia de nitritos). Si esta coloracin no se observa, adicionar zinc en polvo. El desarrollo de color rojo despus de una hora confirma una prueba negativa (presencia de nitratos). Prueba de movilidad en agar Inocular el medio SIM o MTM, incubar por 7 das a temperatura ambiente (20-25C), observar diariamente. Las especies de Listeria son mviles, dando un crecimiento tpico en forma de paraguas. Prueba de utilizacin de carbohidratos. Inocular tubos de caldo prpura para fermentacin de carbohidratos al 0.5%: dextrosa, esculina, maltosa, ramnosa, manitol y xilosa. Incubar 7 das a 35C. Una coloracin amarilla FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS indica una prueba positiva. Todas especies dan positivas las pruebas para dextrosa, esculina y maltosa. Consultar el cuadro 1 para reacciones con ramnosa, xilosa y manitol.

Cuadro 1 Diferenciacin de las especies Especies Hemolisis (beta) + + + Reduccin nitratos Produccin de CAMP cidos de M R X S.a R.e + + bV bV bV + + + + +1 + -

L. monocitogenes L. ivanovii L. innocua L. welshimeri L. seeligeri L. grayic

bV

Prueba de Cristie-Atkins-Munch-Peterson (CAMP) Para la prueba de CAMP se emplean las siguientes cepas de coleccin de Staphylococcus aureus Rhodococcus equi ATCC 49444 ATCC 6339 NCTC 7428 NCTC 1621 ATCC 25923 CIP 5710 Las cepas empleadas en la prueba de CAMP pueden obtenerse de diversas colecciones nacionales e internacionales. En una placa de agar sangre de carnero sembrar una estra de la cepa de S. aureus y paralelamente una de R. equi, separadas lo suficiente para que entre stas se puedan estriar perpendicularmente las cepas sospechosas de Listeria, sin que lleguen a tocarse (aproximadamente 5 mm de separacin). Despus de 34 y 48 h de incubacin a 35C observar el organismos entre las hemolisis de S. aureus, R. equi y Listeria que se manifiesta como una zona hemoltica ms intensa.

Procesamiento de datos Comparar los resultados obtenidos con el cuadro 1 y determinar el gnero y especie de las cepas aisladas. La correspondencia de resultados con el cuadro anterior indica la presencia del gnero Listeria, El nico miembro del gnero Listeria de importancia es Listeria monocytogenes.

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LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS Informe de la prueba Cuando los resultados sean positivos para L. monocytogenes informar la presencia en 25g o 25 ml de muestra. Y si los resultados son negativos informar ausencia en 25g o 25 ml de muestra Cuestionario. 1. Describa brevemente el genero listeria 2. en que alimentos se busca este microorganismo .? 3. mencione algunas pruebas para la identificacin del mismo. 4. Como se reporta el resultado? 5. De las especies de Listeria cual es la que se reporta? Anexos La norma NOM-143- SSA1-1995.

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LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS Practica 11 Proyecto final Anlisis de un alimento Haciendo uso de este manual el alumno realizara un anlisis del alimento que se le proporcione reportando..microorganismos hemoflicos aerobios, coliformes totales en placa y en tubo, salmonella, hongos y levaduras, Staphylococcus etc. Para este propsito, prepara los medios necesarios y efectuara las diluciones correspondientes

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