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LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA GENERAL

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INTRODUCCION

La microbiologa es una ciencia relativamente reciente con respecto a otras ramas de la biologa. El estudio de los microorganismos se inicio a partir de que ANTONIE van LEEUWENHOOK en 1670 invento el microscopio, y que a partir de los estudios de Luis Pasteur en 1876, se logro el mayor desarrollo y reconocimiento de los microorganismos como actores de una gran diversidad de procesos. Aunque durante mucho tiempo estos microorganismos causaron graves problemas de enfermedades en plantas, animales y humanos tambin es cierto que desde la antigedad algunas especies microbianas han sido utilizadas en procesos de produccin de alimentos fermentados como los quesos, vino, pan y cerveza, entre otros y actualmente se ha reconocido su importancia en diversas areas de investigacin bsica, en la industria alimentaria, ambiental y farmacutica. El objetivo general del curso de Microbiologa General es que el alumno se inicie en el conocimiento de la biologa bsica de los microorganismos, en sus caractersticas morfolgicas, nutricionales de crecimiento, control y que adquiera las habilidades necesarias para su manipulacin en el laboratorio. Este manual contiene 9 prcticas, diseadas para que el estudiante se familiarice gradualmente con los procedimientos de cultivo y observacin de bacterias, hongos y protozoarios. El orden de presentacin, corresponde al programa del curso terico de Microbiologa General, que forma parte del plan de estudios de las carreras de Nutricin y Tecnologa de Alimentos as como de la Licenciatura en Biotecnologa impartidas en la Universidad Interamericana En cada prctica se presentan los objetivos y una breve introduccin para facilitar la compresin de los mismos, despus se indican los materiales necesarios y procedimientos a realizarse en forma de instrucciones numerales que se complementan con figuras y esquemas. Esperamos que este manual ayude a los estudiantes en la comprensin del maravilloso mundo de los microorganismos.

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Recomendaciones para el estudiante Reglas de laboratorio 1. 2. 3. Durante las sesiones siempre sebera usar bata de laboratorio bien abotonada, que deber quitarse antes de abandonar el laboratorio. No deber sacar del laboratorio ningn equipo, medios o cultivos microbianos. Evitar la acumulacin sobre la mesa de trabajo de objetos no relacionados con la prctica de laboratorio. Colocar todos los objetos personales (libros, mochilas, etc.) en la zona especificada por el profesor Se prohbe ingerir y/o almacenar cualquier tipo de alimento o bebida dentro del laboratorio. Se prohbe fumar, aplicarse cosmticos o tocarse la cara con las manos o algn otro objeto. Se deber lavar las manos meticulosamente con jabn y agua antes de salir del laboratorio. Incluso cuando salgas por breves periodos. Por seguridad no se deber pipetear oralmente ningn tipo de cultivos microbianos, esta actividad deber realizarse con pipetas accionadas de forma mecnica o automtica, tratando de evitar la formacin de aerosoles. No se admiten visitas personales que distraigan la atencin y pongan en riesgo la seguridad en el trabajo que se realiza

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Procedimientos de laboratorio 1. Antes y despus de cada sesin practica los alumnos debern limpiar las mesas de trabajo con el desinfectante que se les proporcionara para este fin. Cuando se utilice el mechero, este deber colocarse alejado del microscopio y otros equipos as como de sus cuadernos o prendas de vestir. Al concluir cada sesin el estudiante deber asegurarse que los materiales de desecho u objetos contaminantes sean colocados en recipientes especficos para ello, colocados en lugares apropiados, que les indicara el profesor Siempre deber dejar perfectamente limpios todos los equipos utilizados (microscopios, balanzas analticas, autoclave, potencimetros, etc.) y reportar al maestro cualquier irregularidad en el funcionamiento. En caso de producirse un incendio o una herida personal, el alumno deber notificarlo de inmediato al profesor. En el caso de derrame de cultivos o rotura de recipientes con cultivos, deber conservar la calma y

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adems de informar al profesor, seguir inmediatamente el procedimiento: a) Colocar toallas de papel sobre el material derramado para evitar su dispersin b) Poner abundante solucin desinfectante sobre las toallas c) Dejar trascurrir al menos 15 minutos, retirar las toallas y tirarlas al receptculo destinado a la eliminacin de materiales contaminados

Materiales indispensables en cada sesin de laboratorio. 1. 2. 3. Bata de laboratorio limpia y con botones El protocolo de la practica (practica impresa) Un pedazo de tela limpia y sin pelusa, cerillos, tijeras y marcador indeleble.

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Practica 1 Conocimiento del laboratorio de microbiologa y medidas de seguridad


Introduccin El estudio de las bacterias, virus, parsitos, hongos y otros agentes infecciosos que pueden ser patgenos para el hombre, los animales u otras formas de vida comporta riesgos que varan segn el agente infeccioso y los procedimientos utilizados. Las normas de Seguridad Biolgica pretenden reducir a un nivel aceptable el riesgo inherente a la manipulacin de material peligroso y son muy rigurosas para los agentes ms peligrosos y menos exigentes para los que causan problemas de menor entidad. Deben ser consideradas como compromisos destinados a conseguir que las personas que trabajan con agentes infecciosos en el Laboratorio de Microbiologa estn expuestas al mnimo riesgo posible. Pongamos pues las siguientes premisas para plantear un esquema de trabajo hacia la prevencin y la seguridad en el laboratorio o en cualquier rea de trabajo. y y y y La seguridad es responsabilidad en lnea jerrquica Todos los accidentes pueden ser evitados Las personas son la base fundamental en la gestin de la prevencin de riesgos Una gestin eficaz de la prevencin de riesgos produce una mejora en el sistema de calidad , as como el aumento de produccin ( das / clase )

La prevencin efectiva de riesgos evita das perdidos debido a las bajas causadas por accidente o por enfermedades derivadas del trabajo . Principios bsicos de Bioseguridad y Agentes biolgicos (segn RD 664/97). Microorganismos, con inclusin de los genticamente modificados, cultivos celulares y endoparsitos humanos susceptibles de originar cualquier tipo de infeccin, alergia o toxicidad. Microorganismo (segn RD 664/97). Toda entidad microbiolgica, celular o no, capaz de reproducirse o de transferir material gentico. Cultivo celular (segn RD 664/97). El resultado del crecimiento in vitro de clulas obtenidas de organismos multicelulares. Peligro. Todo aquello que puede producir un dao o un deterioro de la calidad de vida individual o colectiva de las personas. Dao. Es la consecuencia producida por un peligro sobre la calidad de vida individual o colectiva de las personas. Riesgo. Probabilidad de que ante un determinado peligro se produzca un cierto dao, pudiendo por ello cuantificarse.

y y y y y

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y y

Desinfeccin (segn la OMS). Eliminacin de agentes infecciosos que estn fuera del organismo por medio de la exposicin directa a agentes qumicos o fsicos. Contaminacin (segn la OMS). Presencia de un agente infeccioso en la superficie del organismo; tambin en vestimenta, ropa de cama, juguetes, instrumentos quirrgicos, apsitos u otros objetos inanimados o substancias, incluyendo el agua y los alimentos. Esterilizacin (segn la OMS). Destruccin de todas las formas de vida por calor, radiacin, gas o tratamiento qumico. Limpieza (segn la OMS). Eliminacin, mediante fregado y lavado con agua caliente, jabn o un detergente adecuado, o por el empleo de una aspiradora, de agentes infecciosos y substancias orgnicas de superficies en las cuales stos pueden encontrar condiciones adecuadas para sobrevivir o multiplicarse.

Clasificacin de los agentes biolgicos por grupos de riesgo y y Agente biolgico del grupo 1. Aqul que resulta poco probable que cause una enfermedad en el hombre. Agente biolgico del grupo 2. Aqul que puede causar una enfermedad en el hombre y puede suponer un peligro para los trabajadores, siendo poco probable que se propague a la colectividad y existiendo generalmente profilaxis o tratamiento eficaz. Agente biolgico del grupo 3. Aqul que puede causar una enfermedad grave en el hombre y presenta un serio peligro para los trabajadores, con riesgo de que se propague a la colectividad y existiendo frente a l generalmente profilaxis o tratamiento eficaz. Agente biolgico del grupo 4. Aqul que causando una enfermedad grave en el hombre supone un serio peligro para los trabajadores, con muchas probabilidades de que se propague a la colectividad y sin que exista generalmente frente a l profilaxis o tratamiento eficaz.

Cada laboratorio debe adoptar un manual de seguridad o de trabajo en el que se identifiquen los riesgos conocidos y potenciales y se especifiquen las prcticas y los procedimientos encaminados a eliminar o reducir al mnimo esos riesgos. Las tcnicas microbiolgicas apropiadas son fundamentales para la seguridad en el laboratorio y no pueden sustituirse por equipo de laboratorio especializado, que no pasa de ser un complemento.

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Objetivos: y Conocer el laboratorio de microbiologa, los materiales, los reactivos, las instalaciones elctricas, de gas, de agua y el funcionamiento de cada uno de ellos, sus interacciones, utilidades, modos de desecho, etc. Aprender el manejo de todo lo anterior en las prcticas a realizar, en casos extremos de riesgos y contingencias. Reactivos y y y y Slidos cidos Soluciones Medios de cultivo

Material y y y y y y y y Mesas de laboratorio Tomas de gas Agua Electricidad Material de vidrio De metal Aparatos Instrumental

Procedimiento experimental: A travs de la observacin y conocimiento del equipo de laboratorio, los reactivos y materiales, se plantearan formas de trabajar (vestimenta, organizacin, lentes, guantes), de prever posibles accidentes (distribucin de espacio, rutas de evacuacin, anaqueles), zonas de riesgo, puntos crticos, y todos los casos que requieran revisin y modificacin para mejorar la seguridad al interior del lugar de trabajo. Acceso al laboratorio 1. El smbolo y signo internacional de peligro biolgico (figura 1) deber colocarse en las puertas de los locales donde se manipulen microorganismos del grupo de riesgo 2 o superior. 2. Slo podr entrar en las zonas de trabajo del laboratorio el personal autorizado. 3. Las puertas del laboratorio se mantendrn cerradas. 4. No se autorizar ni permitir la entrada de nios en las zonas de trabajo del laboratorio.

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Figura 1. Smbolo internacional de peligro biolgico-infeccioso Proteccin personal 1. Se usarn en todo momento batas o uniformes especiales para el trabajo en el laboratorio. 2. Se usarn guantes protectores apropiados para todos los procedimientos que puedan entraar contacto directo o accidental con sangre, lquidos corporales y otros materiales potencialmente infecciosos o animales infectados. Una vez utilizados, los guantes se retirarn de forma asptica y a continuacin se lavarn las manos. 3. El personal deber lavarse las manos despus de manipular materiales y animales infecciosos, as como antes de abandonar las zonas de trabajo del laboratorio. 4. Se usarn gafas de seguridad, viseras u otros dispositivos de proteccin cuando sea necesario proteger los ojos y el rostro de salpicaduras, impactos y fuentes de radiacin ultravioleta artificial. 5. En las zonas de trabajo estar prohibido comer, beber, fumar, aplicar cosmticos y manipular lentes de contacto. 6. Estar prohibido almacenar alimentos o bebidas para consumo humano en las zonas de trabajo del laboratorio. Procedimientos 1. Estar estrictamente prohibido pipetear con la boca. 2. No se colocar ningn material en la boca ni se pasar la lengua por las etiquetas. 3. Todos los procedimientos tcnicos se practicarn de manera que se reduzca al mnimo la formacin de aerosoles y gotculas. 4. Todos los derrames, accidentes y exposiciones reales o potenciales a materiales infecciosos se comunicarn al supervisor del laboratorio. Se mantendr un registro escrito de esos accidentes e incidentes. 5. Se elaborar y seguir un procedimiento escrito para la limpieza de todos los derrames.
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6. Los lquidos contaminados debern descontaminarse (por medios qumicos o fsicos) antes de eliminarlos por el colector de saneamiento. Puede ser necesario un sistema de tratamiento de efluentes, segn lo que indique la evaluacin de riesgos del agente con el que se est trabajando. 7. Los documentos escritos que hayan de salir del laboratorio se protegern de la contaminacin mientras se encuentren en ste. Zonas de trabajo del laboratorio 1. El laboratorio se mantendr ordenado, limpio y libre de materiales no relacionados con el trabajo. 2. Las superficies de trabajo se descontaminarn despus de todo derrame de material potencialmente peligroso y al final de cada jornada de trabajo. 3. Todos los materiales, muestras y cultivos contaminados debern ser descontaminados antes de eliminarlos o de limpiarlos para volverlos a utilizar. 4. El embalaje y el transporte de material debern seguir la reglamentacin nacional o internacional aplicable. 5. Las ventanas que puedan abrirse estarn equipadas con rejillas que impidan el paso de artrpodos. Cuestionario 1. Elabora un proyecto que implique un plan de seguridad para casos de contingencia en el laboratorio, detectando puntos crticos, manejo de reactivos, posibles soluciones y estrategias para asegurar la estancia y evacuacin de las personas presentes durante el fenmeno correspondiente (sismo, incendio, accidente, etc.) 2. Por qu es importante limpiar las mesas con fenol antes y despus de realizar las prcticas en el laboratorio de microbiologa? 3. Cul es la importancia de trabajar a no ms de 15 cm de la flama del mechero cuando se trabaja con medios y especmenes microbiolgicos? 4. Es importante lavarse las manos antes y despus de las prcticas Por qu? 5. Qu esperas de las prcticas a realizar en el rea de microbiologa general, y el porqu de tu respuesta?

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Practica 2 MANEJOY USO DEL MICROSCOPIO

Objetivos: Que el alumno aprenda el uso y manejo del microscopio ptico. Que el alumno observe algunos microorganismos tpicos y diferencie sus formas bsicas Material y y y y y y y Microscopio ptico Asa bacteriolgica Piseta Cubreobjetos y portaobjetos Agua destilada Mechero bunsen Material biolgico: cultivos bacterianos y alimentos en descomposicin Reactivos y y Soln. KOH al 15% Aceite de inmersin

Marco terico: Ya los antiguos saban que los espejos curvos y las esferas de cristal llenos de agua aumentaban el tamao de las imgenes. En las primeras dcadas del siglo XVII se iniciaron experiencias con lentes y los instrumentos para aumentar la visin de los objetos, comenzaron a usarse progresivamente. Existan dos tipos de microscopios: el sencillo y el compuesto. El sencillo era una lente montada. El compuesto estaba formado por una combinacin de lentes y fue inventado por Zacharias Jansen en Holanda. En los aos siguientes hubo, en Europa, un gran nmero de diseadores de microscopios. El siguiente avance tcnico fue el paso de un sistema de 2 lentes a uno de 3, este sistema se mantiene en los microscopios de hoy. Marcello Malpighi fue uno de los microscopistas ms grandes de la historia. Sus primeros estudios los realiz con pulmones de rana, pudiendo observar en ellos una compleja red de vasos sanguneos, demasiado pequeos para ser vistos por separado. Cuando sigui su recorrido comprob que se unan con otros mayores, que eran venas en una direccin y arterias en direccin contraria. Por lo tanto, las arterias y las venas se hallan unidas por una red de vasos sanguneos llamados capilares. Al cientfico ingls Robert Hooke el microscopio lo fascinaba y en 1665 public un libro llamado Micrographia en el cual pueden encontrarse algunos de los mejores
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dibujos que se han hecho de observaciones microscpicas. Descubri que estaba constituido por una fina trama de pequeas celdillas rectangulares en las cuales se encontraba aire, que l llam clulas. Los primeros en usar el microscopio, usaron sistemas de lentes que producan aumentos mucho mayores que los obtenidos con una sola lente. Sin embargo, empleaban lentes imperfectos, de superficies irregulares y con fallas internas. Si se intentaba lograr un aumento apreciable, la visin de los detalles se haca confusa. El comerciante holands, Antn van Leeuwenhork usaba lentes simples de pequeos trozos de cristal perfecto. Pulindolos cuidadosamente, logr aumentar un objeto hasta 270 veces sin perjuicio de la nitidez. Tena 419 lentes alguna de las cuales eran de cristal de roca y hasta de diamante, en algunos casos no eran mayores que el tamao de un alfiler, por lo que sus microscopios tenan un tamao diminuto comparados con otros de la misma poca. Con esas lentes observaba todo lo que poda y logr describir los glbulos rojos de la sangre y los capilares con mayor detalle. Fue el primero en ver a lo que ms tarde se llamaran bacterias y a los protozoarios, que l denomin animalculos. En el siglo XVIII aparecieron una gran variedad de microscopios. Estos son algunos de ellos: El microscopista dans Otto Muller consigui en 1773 distinguir lo suficientemente bien a aquellos pequeos seres para clasificarlos en dos tipos: bacilos (que significa pequeos vstagos) y espirilos (por su forma espiral). El microscopio se fue perfeccionando con gran lentitud, uno de los defectos de los microscopios primitivos era que sus lentes descomponan la luz blanca en los colores que la constituyen. Los objetos pequeos se vean rodeados de anillos de color (aberracin cromtica) que impedan observar con claridad los detalles. Pero alrededor de 1820 se perfeccionaron cuando Joseph Jackson Lister, un ptico ingls, dise un microscopio acromtico capaz de eliminar los anillos de color que limitaban la claridad de la imagen. Lister descubri que los glbulos rojos eran en realidad, discos bicncavos. El microscopio acromtico constituy un gran avance, iniciando una serie de perfeccionamientos que dieron como resultado el moderno microscpio ptico. En 1930 el mundo submicroscpico se ampli con la aparicin del microscopio electrnico cuya ventaja principal con respecto al microscopio ptico es un aumento de 1000 veces en la magnificacin del material observado acompaado de una mayor capacidad de resolucin generando una mejordefinicin y una ampliacin del mundo microscpico. ADN, virus y pequeas organelas fueron observadas por primera vez con este microscopio. La mayora de los pioneros en la microscopa electrnica en biologa siguen vivos y los dos de los ms importantes son: Albert Claude y George Palade, quienes recibieron el Premio Nobel de Medicina en 1974 por sus logros en biologa celular utilizando el microscopio electrnico.
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Existen dos tipos bsicos de microscopios electrnicos los cuales fueron inventados al mismo tiempo pero tienen diferentes usos. El microscopio electrnico de transmisin (MET) proyecta electrones a travs de una fina capa de tejido o material a observar produciendo una imagen en dos dimensiones sobre una pantalla fosforescente. icroscopio electrnico de barrido (MEB) produce una imagen que da la impresin de ser en tres dimensiones. Este microscopio utiliza dos o tres puntos de la muestra donde llegan los electrones que escanean la superficie del espcimen a observar y salen del espcimen como electrones secundarios siendo detectados por un sensor. La imagen se produce como el espcimen entero, a diferencia del MET donde la imagen corresponde slo a los electrones transmitidos. El microscopio cuntico fue presentado por Binning y Rler en 1982 y recibieron en 1986 el Premio Nobel de Fsica. Este microscopio forma parte de los instrumentos llamados nanoscopios porque posibilitan ver objetos del tamao en nanmetros. Se lo conoce como "microscopio de barrido de efecto tnel".

Figura 1. Levaduras en gemacin

Figura 2. Paramecios

Procedimiento experimental: 1. Colocar una gota de agua 2. Tomar una muestra directamente del alimento o medio de cultivo homogenizando hasta formar una suspensin. 3. Colocar el portaobjetos. 4. Enfocar a 40x 5. Realiza el mismo procedimiento con todas las muestras de alimentos o medios de cultivo

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Cuestionario 1. 2. 3. 4. En tu reporte inserta las fotografas de lo observado. A que reino pertenecen las estructuras que observaste? A que dominio? Escribe las caractersticas principales (como tamao, forma de reproduccin, forma de alimentacin etc.) de los organismos que observaste en el microscopio. 5. Investiga los diferentes tipos de microscopios que existen.

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Practica 3 Preparaciones temporales

OBJETIVO: Aprender a realizar una preparacin temporal, til en la observacin de diversos tipos de muestras. FUNDAMENTO: Las preparaciones pueden ser temporales, frescas y permanentes. Una preparacin temporal es aquella que es utilizada en el momento de la observacin, ya que requiere que el medio de montaje no se evapore tan rpidamente y que sea posible que el material biolgico se conserve por un tiempo (algunos das) en condiciones de ser observado; las frescas solo se usan durante la prctica y posteriormente se lavan. Y las permanentes son aquellas preparaciones que duran para siempre, por lo que se debe hacerse con un material especial como el blsamo de Canad, para que el cubreobjetos permanezca perfectamente adherido al portaobjetos durante aos (Ver Fig. 3.1).(2)

Fig. 3.1 Preparacin temporal

GENERALIDADES: En general una preparacin microscpica se define como el resultado de una serie de operaciones destinadas a colocar material de observacin en una capa de poco espesor, lo ms pequea y representativa posible. Pudiendo ser en seco, lquido o en vivo, o en partes sobre una superficie de vidrio transparente (portaobjetos) y cubierta algunas veces con otra de menor aumento y ms delgada (cubreobjetos). (Ver Fig. 3.2) (4)

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Fig. 3.2 Material para montaje de muestras

Los portaobjetos deben ser de vidrio lo ms transparente posible, de un espesor aproximado de 2 mm y de unas medidas estndar de 16 x 26 mm. Los bordes pueden ser o no esmerilados. Algunos tienen una concavidad circular en su centro destinada a recibir gotas de lquido con elementos para su estudio. Los cubreobjetos son de muchos tamaos, los habituales son de 18 x 18 mm, 20 x 20 mm y 22 x 32 mm y diversas formas, los ms comunes son cuadrangulares. Su espesor es aproximadamente de 0.25 mm. A manera de sugerencia, tanto el portaobjetos como el cubreobjetos antes de ser utilizados debern limpiarse con alcohol para eliminar la grasa y el polvo.(3) MATERIAL: y Microscopio compuesto. y Portaobjetos. y Cubreobjetos. y Pipeta pasteur o gotero. y Frasco gotero con agua. y Aguja de diseccin. REACTIVOS y Agua destilada y Acetona

MATERIAL BIOLOGICO: y Hongo de pan. y Cultivos microbianos y Tejidos vegetales

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TCNICA: 1. Colocar en un portaobjetos una gota de agua con el gotero. 2. Tomar una pequea muestra con la aguja de diseccin del hongo de pan y extindelo sobre la gota de agua que aplicaste en el portaobjetos. 3. Colocar el cubreobjetos sobre tu muestra, cuidando que no vaya a tener aire al momento de que sea colocado. 4. Proceder a observar con el objetivo seco dbil y seco fuerte, cuidando que al momento de enfocar no rompas el cubreobjetos. 5. Repetir el procedimiento con cada una de las muestras 6. Toma una fotografa de cada preparacin y explica en tu reporte. 7. Para el tejido vegetal realiza cortes lo mas fino posible y procede desde el punto 1.

CUESTIONARIO: 1) Por qu son importantes las preparaciones temporales? 2) Qu propiedades tiene este medio de montaje? 3) Cules son las preparaciones que se pueden hacer en el laboratorio 4) Reporta las observaciones hechas en la practica.

BIBLIOGRAFA: 1. Alberts, B. 2006. "Introduccin a la biologa celular". Madrid. Segunda edicin. Editorial Mdica Panamericana. Pgs. 24-27 2. Curtis, H. 2004. Biologa. Mxico D.F. Sexta edicin. Editorial panamericana. Pgs. 17-18 3. Johnson, G. 2006. Biologa Celular. Mxico D.F. Segunda edicin. Editorial Panamericana. Pgs. 13-15

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Practica 4
TINCION DE GRAM Objetivo y y Aprender a realizar la tincin de Gram Diferenciar microorganismos Gram (+) y Gram (-)

Marco Terico La tincin de Gram es uno de los mtodos de tincin ms importantes en el laboratorio bacteriolgico y con el que el estudiante debe estar perfectamente familiarizado. Su utilidad prctica es indiscutible y en el trabajo microscpico de rutina del Laboratorio de Microbiologa las referencias a la morfologa celular bacteriana (cocos, bacilos, espirilos, vibriones, etc) se basan justamente en la tincin de GRAM. Esta tincin se denominada as por el bacterilogo dans Christian Gram, quien la desarroll en 1844. Sobre la base de su reaccin a la tincin de Gram, las bacterias pueden dividirse en dos grupos, grampositivas y gramnegativas (en este caso, los trminos positivo y negativo no tiene nada que ver con carga elctrica, sino simplemente designan dos grupos morfolgicos distintos de bacterias). Las bacterias gram-positivas y gram-negativas tien de forma distinta debido a las diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares. La pared de la clula bacteriana sirve para dar su tamao y forma al organismo as como para prevenir la lisis osmtica. El material de la pared celular bacteriana que confiere rigidez es el peptidoglucano. La pared de la clula gram-positiva es gruesa y consiste en varias capas interconectandas de peptidoglicano as como algo de cido teicoico, generalmente, 80%-90% de la pared de la clula gram-positiva es peptidoglucano (Figura 1). Por otro lado, la pared de la clula gram-negativa, contiene una capa mucho ms delgada, nicamente de peptidoglucano y est rodeada por una membrana exterior compuesta de fosfolpidos, lipopolisacridos, y lipoprotenas. Slo 10% - 20% de la pared de la clula gram-negativa es peptidoglicano (Figura 2). Las bacterias Gram positivas tienen muchas capas de peptidoglucano, las cuales a su vez, sostienen molculas de cido teicoico. El cido teicoico reacciona con el cristal violeta y el yodo utilizado en este proceso de tincin. Un complejo de las molculas cristal violeta-yodo-cido teicoico es muy difcil de remover. Como la pared celular de las clulas Gram positivas retiene estos compuestos, es ms difcil decolorar una clula Gram positiva que una Gram negativa. Una mezcla de alcohol remueve el cristal violeta de la clula Gram negativa, pero no de la Gram positiva. Esta mezcla de alcohol tambin disuelve mucho de la capa exterior de lipopolosacrido de la pared celular de la pared Gram negativa, lo cual acelera la remocin del colorante primario cristal violeta de estas clulas FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA GENERAL Las bacterias gram positivas (GP) se tien de azul-violeta y las bacterias gram negativas (GN) se tien de rojo

Figura 1. Pared celular de bacterias Gram positivas, Martinko (2002) Biologa de los microorganismos 10 Edicin.

Figura 2. Pared celular de bacterias Gram negativas, Martinko (2002) Biologa de los microorganismos 10 Edicin.

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Material y y y y y y y y 1 microscopio ptico 1 asa bacteriolgica 1 piseta 1 charola de tincin 1 gotero 1 mechero bunsen Cubreobjetos Cultivos bacterianos (preferentemente en caldo)

Reactivos y y y y y Agua destilada Soln. Safranina Soln. de cristal violeta Soln. de yodo-lugol Soln alcohol (etlico)-acetona 50%

Procedimiento 1. Preparar los frotis bacterianos: Toma una asada del caldo y distribuye uniformemente sobre un portaobjetos. 2. Dejar secar al aire (por 30s aprox.) 3. Fijar con calor: Pasar el cubreobjetos por la llama del mechero en forma rpida varias veces a. Figura 3 4. Teir con cristal violeta: Agregar unas gotas de cristal violeta y colocar en la charola de tincin, esperar 20 segundos (Figura 4-1). 5. Lavar con agua el exceso de colorante: A gotas para no arrastrar el frotis (Figura 4-2). 6. Cubrir con Lugol: Agregar unas gotas de yodo-lugol y colocar nuevamente en la charola de tincin, esperar 1 min (Figura 4-3). 7. Decolorar con alcohol: Agregar unas gotas de alcohol-acetona hasta que la preparacin deje de perder color, 10-20 seg (Figura 4-4). 8. Lavar con abundante agua para eliminar el resto de disolvente (Primero a gotas y posteriormente con un chorro ligero) (Figura 4-5) 9. Teir con Safranina: Agregar unas gotas de safranina y colocar nuevamente en la charola de tincin, esperar 20 segundos (Figura 4-6) 10. Lavar con agua para eliminar el colorante de contraste (con chorro de agua ligero, Figura 4-7) 11. Secar la preparacin (Figura 4-8) 12. Examinar al microscopio a 40X fijndose sobre todo en el color de cada preparacin.

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Figura 3. Procedimiento para fijar al calor las muestras para tincin, Benson H.J. Microbiological Applications: A Laboratory Manual in General Microbiology 5 Edicin. FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

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Figura 4. Procedimiento de la tincin de Gram, Benson H.J. Microbiological Applications: A Laboratory Manual in General Microbiology 5 Edicin. Cuestionario 1. Reporta las fotografias de lo observado. 2. Describe la morfologa de cada frotis 3. Que es una tincin de gram mixta?

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Practica 5

Esterilizacin y preparacin de medios de cultivo

Objetivos: Que el alumno conozca los principios generales de las tcnicas de esterilizacin, as como la preparacin y vertido de los diferentes medios de cultivo.

Introduccin La esterilizacin es un procedimiento que nos permite contar con medios de cultivo y material de laboratorio libre de microorganismos, y esta se logra de diferentes maneras de acuerdo al material, instrumental mdico, medios de cultivo de que se trata. En el laboratorio los mtodos ms comnmente usados son el calor seco y el calor hmedo. En el primero se hace uso de estufas que alcancen temperaturas por arriba de los 100 C y una vez colocado el material perfectamente envuelto en papel de estraza se deja por un lapso de 2 horas, este mtodo de calor seco se emplea generalmente para material de vidrio, esptulas, pipetas, etc. La esterilizacin por calor hmedo se lleva a cabo en autoclaves y como su nombre lo indica se realiza haciendo circular vapor de agua a 121 C y 15 libras de presin por espacio de 12 a 15 minutos .Este mtodo se emplea para esterilizar medios de cultivo lquidos, slidos y semislidos, as como placas y tubos ya sembrados antes de desecharlos. Un medio de cultivo en microbiologa es toda sustancia que contenga los nutrientes necesarios para el desarrollo de microorganismos. Los componentes bsicos de un medio de cultivo son: y Fuente de carbono (carbohidratos) y Fuente de nitrgeno(peptonas , o sales inorgnicas de nitrgeno) y Fuente de iones ( NaCl u otra sal) y Agua y Agar-agar (medio gelificante) en el caso de medios slidos. A los medios que contienen todos los elementos anteriores menos agar se les llama medios lquidos o caldos. La fuente de carbono les proporciona a los microorganismos los requerimientos energticos necesarios para el desarrollo y crecimiento de estos. FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA GENERAL La fuente de nitrgeno, proporciona la materia prima necesaria para la elaboracin de aminocidos indispensables para su supervivencia. La fuente de iones se emplea para la generacin de coenzimas y otros elementos propios de su metabolismo. El agua es necesaria para la disolucin de los elementos anteriores y como fuente de esta para los microorganismos que se van a desarrollar en el medio. El agar es una sustancia gelatinosa que tiene como funcin la suspensin de todos los elementos que componen el medio. De acuerdo a la composicin del medio estos pueden ser: y Medios nutritivos y Medios enriquecidos y Medios selectivos y Medios diferenciales Un medio nutritivo es aquel que le brinda al microorganismo lo indispensable para su crecimiento. Un medio de enriquecimiento es aquel al que se le ha adicionado un componente ms, por ejemplo sangre, para tener un mejor desarrollo del microorganismo. Un medio selectivo es al que se le ha adicionado un inhibidor o un enriquecimiento de tal manera que solo crecern los microorganismos para los cuales fue diseado Un medio diferencial es aquel que nos permitir diferenciar directamente de que microorganismo se trata pues adems de ser nutritivo, enriquecido y selectivo estar adicionado de un compuesto extra que lo har diferencial.

Material y y y y y y y y y y y y 1 matraz erlenmeyer de 250 ml 1 balanza granataria 1 esptula 1 autoclave 4 cajas petri de vidrio o plstico 1 mechero bunsen 1 paquete de algodn Papel de estraza Cinta testigo Papel aluminio Ligas Tubos con tapn de rosca

Reactivos y Agua y Caldo lactosado y Agar tripticasa soya y Agar saboraud

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. Procedimiento experimental: Preparacin del medio de cultivo. Seguir las instrucciones del fabricante para prepara 50 ml de cada medio de cultivo. El caldo lactosado verterlo en los tubos de tapn de rosca 10 ml en cada uno tapando sin apretar. El agar saboraud verterlo tambin en tubos con tapn de rosca 7 ml en cada tubo, cerrar sin apretar. El agar tripticasa soya dejarlo en el matraz erlenmeyer tapando con un tapn de algodn, despus aluminio y finalmente papel de estraza sujetando con una liga. Colocar a todos un rectngulo de cinta testigo y llevar a la autoclave. Esterilizar por 12-15 minutos a 121 C y 15 libras de presin. Dejar que se enfri la autoclave sacar los medios, los caldos dejarlos enfriar en posicin vertical, el saboraud inclinarlo sobre una superficie de manera que gelifique de manera inclinada, y el tripticasa soya verterlo en placas petri estriles. Vertido en placa. y Enfriar los medios a una temperatura de 40-45 C, cuidando que no gelifique. y Cuida de hablar lo menos posible mientras viertes el medio. y Por ningn motivo tosas, estornudes o introduzcas las manos en el medio. y Si algo de esto sucede desecha la placa. y Sigue las siguientes instrucciones. 1. Desinfecta el rea de trabajo (mesa) con una solucin de cloro , yodo , fenol , o alcohol etlico usando un algodn 2. Enciende los mecheros bunsen 3. Con los mecheros encendidos acerca el matraz que contiene el medio y las placas 4. Toma una de ellas 5. Retira la tapa de la placa cerca del mechero (15 cm) cuidando de no quemarte 6. Vierte aproximadamente de 20-25 ml del medio 7. Coloca la tapa y deja cerca del mechero 8. Repite los pasos anteriores hasta terminar 9. Deja un tiempo suficiente a que gelifique 10. Invierte las placas para evitar el agua de condensacin caiga sobre el medio 11. Llvalas a la estufa para prueba de esterilidad(incubacin por 24 horas a 35 C )

Cuestionario. FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA GENERAL 1. Describe la clasificacin de los medios de cultivo en funcin a su utilidad y contenido de agar 2. El agar que preparaste a qu clasificacin pertenece? 3. Investiga 5 medios de cultivo con agentes reductores ,nombre , utilidad y formulacin 4. Investiga todos los medios de cultivo para enterobacterias, nombre, utilidad y formulacin. 5. Escribe el procedimiento que seguiste para preparar tu medio de cultivo, hasta la esterilizacin.

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Practica 6 Pruebas Bioquimicas Objetivo.


Conocer los diferentes tipos de pruebas bioqumicas empleadas para la identificacin de los diferentes microorganismos. Introduccin. Las pruebas bioqumicas como su nombre lo indica son pruebas basadas en las diferentes reacciones metabolicas de los microorganismos como parte de su desarrollo y nos sirven para identificarlos .Existen pruebas comunes a bacterias bacilares y cocos ,como son las pruebas de catalasa ,movilidad ,etc. Y otras que solo presentan los bacilos cocos y otras mas especificas para Gram negativos y otras para Gram positivos. Aunque generalmente nos referimos a pruebas bioqumicas las empleadas para identificar enterobacterias. A continuacin analizaremos las pruebas bioqumicas mas utilizadas para la identificacin de diferentes enterobacterias. Las siguientes pruebas se deben realizar con los distintos microorganismos obtenidos en los aislamientos en placa. Se llevarn a cabo : Prueba de la oxidasa, Test de la Catalasa, Prueba de TSI ,LIA ,Urea ,MIO y Citrato de Simons . Adems se llevar a cabo una prueba compuesta por varias reacciones bioqumicas , el API20E Prueba de la Oxidasa. Se trata de determinar si un microorganismo posee citocromo c-oxidasa. Para ello se utiliza un compuesto orgnico que puede ser reducido por el sistema citocromo-oxidasa/citocromo c en presencia de oxgeno molecular, originando un producto coloreado fcilmente apreciable. oxidasa 1-naftol + dimetilparafenilendiamina azul de indofenol

Procedimiento Tomar con el asa de siembra una colonia de la placa de Mac Conkey XLD (o bien hacer una suspensin de una colonia en agua) y depositar en un portaobjetos. Poner la colonia sobre el porta y aadir una gota de sustrato cromgeno fresco (10 mg/ml). Esperar 20-60 segundos y observar si existe algn cambio en la coloracin. Si se pone azul es (+). Resultado: Si la tira se pone de color azul oscuro, el microorganismo es oxidasa positivo. Test de la Catalasa. Algunas bacterias poseen catalasa, una enzima capaz de destruir el agua oxigenada generada en algunos procesos metablicos. Esta enzima est presente en la mayora de las bacterias que contienen citocromos, bien aerobias o anaerobias facultativas.
catalasa

2 H2O2 2 H2O + O2 Procedimiento Coger con cuidado una colonia con el asa de siembra (evitar coger agar) de la placa de MacConkey (Enterobacteriaceae) Poner la colonia directamente sobre un portaobjetos sin aadir agua.
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Echar sobre la colonia una gota de agua oxigenada pura o al 30 %. Observar si se forman burbujas de oxgeno. Resultado: La aparicin de burbujas indica que el microorganismo es catalasa positivo. 30 Test deTSI. En este test se utiliza el medio de cultivo triple azcar y hierro y proporciona varios datos fisiolgicos importantes para determinar si un microorganismo es capaz de utilizar la lactosa, produce gas o cido sulfhdrico. Es un medio que requiere un procedimiento de inoculacin especial. Procedimiento Inocular los microorganismos aislados en la placa de Mac Conkey en un tubo de medio TSI con el asa de siembra en punta. La siembra se har de la siguiente manera: sembrar la superficie por estra y sembrar la parte interna del medio por picadura. Incubar 18-24 h a 37C. Observar e interpretar los cambios producidos en el medio. En este medio se puede obtener la siguiente informacin fisiolgica: a) Fermentacin de glucosa y/o lactosa. El medio contiene una pequea cantidad de glucosa y una gran cantidad de lactosa. Los microorganismo capaces de fermentar cualquiera de estos compuestos darn lugar a la formacin de cidos que bajan el pH del medio. Como consecuencia el rojo fenol vira a amarillo. La sucesin de eventos metablicos es la siguiente (ver dibujo): 1) El microorganismo utiliza la fuente de carbono ms asequible en el medio, la glucosa, pero como se encuentra en el medio en muy baja concentracin se agota rpidamente. Los productos de su degradacin acidifican el medio que cambia de rojo a amarillo. 2) Al agotarse la glucosa empieza a utilizar las peptonas, pero slamente en aerobiosis (se corresponde a la zona de la lengeta del tubo). Este consumo da lugar a residuos amoniacales, produciendo una basificacin del medio. El indicador vira a rojo en esta parte del tubo. 3) Posteriormente se produce el consumo de lactosa, en el caso de los microorganismos que sean capaces de utilizar este disacrido. Esto da lugar a un descenso de pH por lo que cambiar el medio de rojo a amarillo. La razn de que la lactosa se utilice despus es debido al tipo de regulacin de la galactosidasa, que es la enzima que hidroliza este disacrido para dar los correspondientes monosacridos. Se trata de una enzima inducible, lo que significa que existe un periodo de latencia entre el agotamiento de la glucosa y la produccin de las primeras molculas de galactosidasa, de tal forma que despus de un tiempo de consumo de peptonas se comienza a utilizar lactosa. Medio TSI Extracto de carne 3 g/l Extracto de levadura 3 g/l Peptonas 15 g/l Lactosa 10 g/l Glucosa 1 g/l Tiosulfato sdico 0,3 g/l Sulfato ferroso (Fe2+) 0,2 g/l Rojo de fenol 0,024 g/l ClNa 5 g/l Agar 12 g/l pH 7,4
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b) Produccin de gas. La produccin de gas se detecta por la formacin en el medio de burbujas de gas perfectamente visibles ya que cuartean el medio. El gas se origina mediante la reaccin catalizada por la formiato liasa a partir de cido frmico. formiato liasa H-COOH CO2 + H2 Por tanto, son gas (+) aquellos microorganismos que produzcan esta enzima. c) Produccin de SH2. Algunas bacterias son capaces de llevar a cabo la siguiente reaccin a partir del tiosulfato aadido al medio:
tiosulfato reductasa

2 SO3 + 4 H

2 SO

+ 2 SH

El cido sulfhdrico se detecta porque reacciona con las sales de metales pesados (Fe2+) presentes en el medio. Esto da lugar a la formacin de sulfuro de hierro que se deposita en gran parte del tubo, sobre todo en el fondo, oscureciendo el medio. MIO Es un medio semislido para detectar la movilidad de las bacterias. Este medio contiene manitol como fuente de carbono. Si el microorganismo es capaz de usar el manitol se produce una acidificacin del medio, lo que da lugar a un viraje del indicador de pH de morado a amarillo.

Medio MIO
Peptona de caseina 10 g/l Nitrato potsico 1 g/l Manitol 7,5 g/l Purpura de bromocresoll 0,04 g/l Agar 3,5 g/l pH 7,6 Procedimiento Inocular por picadura un tubo de medio semislido con cada uno de los distintos microorganismos aislados. Incubar 24 horas a 37C. Observar la zona de crecimiento del microorganismo y si ha habido cambio en la coloracin del medio. Resultado: El test de la movilidad se hace mirando el desplazamiento del microorganismo. Si el crecimiento se limita a la zona de la picadura, el microorganismo no es mvil. Si el crecimiento se produce por todo el medio, el microorganismo es mvil. Gneros Gas Escherichia + Shigella Salmonella + Citrobacter + Klebsiella + Enterobacter + Serratia + Proteus + Yersinia SH2 + + + Lactosa + + + + + Movilidad + + + + + + + +

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El medio MIO ,adems nos sirve para observar la prueba de Indol y desaminacin descarboxilacin de aminoacidos en este caso ornitina. Medio LIA. Este medio esta compuesto por aminocidos ,lisina y arginina y nos servir para observar desaminacn y descarboxilacin con el consecuente cambio de color del indicador dependiendo si el medio se acidifica o alcaliniza. Citrato se Simon s. En este medio crecern las bacterias que puedan utilizar el cxarbono del citrato como fuente de energa para su crecimiento ,se inocula en superficie y se dara compo positivo,si se observa crecimiento y cambio de color de varde a azul. Urea. Es un medio de cultivo el que se vera el crecimiento de microorganismos que como parte de su metabolismo lleven a cabo la hidrlisis de la urea virando el color del medio de naranja a rosa mexicanoBatera de pruebas API20E La batera de pruebas API20E es un sistema de identificacin rpida para enterobacterias y otras bacterias Gram(-). Bsicamente consta de 20 tests bioqumicos estandarizados y miniaturizados y una base de datos. Este sistema presenta las ventajas de ser rpido, eficaz y de permitir realizar numerosas pruebas a la vez. Cada tira de API 20E contiene 20 microtubos o pocillos con distintos sustratos deshidratados. Cada tubo es una prueba bioqumica distinta (ver tabla "sumario de los resultados con API 20E "). Los microtubos se inoculan con una suspensin de microorganismos, en agua o solucin salina, que rehidrata los medios. Las tiras se incuban a 37C y por efecto del metabolismo bacteriano se van a producir cambios de color espontneos o bien al aadir reactivos. La lectura de las reacciones se hace mediante comparacin con una tabla de lectura donde se indica si los microorganismos deben considerarse positivos o negativos para cada reaccin segn el color aparecido. Procedimiento Preparacin de inculo. Tomar una colonia bien aislada de cada microorganismo y resuspenderla homogneamente en 5 ml de solucin salina (1% de ClNa) o 5 ml de agua estril. Inoculacin de los pocillos. Cada pocillo tiene un tubo y una cpula (ver dibujo). Llenar el tubo y la cpula de los pocillos | CIT | , | VP |, | GEL | con la suspensin de bacterias. Llenar los tubos, no la cpula, de los dems pocillos. Llenar con parafina las cpulas de los pocillos ADH, LDC, ODC, URE, H2S para obtener anaerobiosis. Poner la tira en la cmara de incubacin. Previamente poner agua en los alveolos de la cmara para proporcionar una atmsfera hmeda durante la incubacin. Incubar a 37C durante 24 h.

Interpretacin de los resultados


La lectura de los resultados se lleva a cabo por comparacin de los colores de cada pocillo con los de la tabla de lectura. Para la lectura se tienen en cuenta los siguientes criterios:
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Si la glucosa es positiva y/o 3 o ms tests son positivos se revelan los test que requieren reactivos: VP: Aadir una gota de KOH 40 % y una gota de -naftol 6% y esperar 10 minutos. Positivo= color rojo o rosa fuerte. TDA: Aadir una gota de Cl3Fe 10 %. Positivo=color marrn oscuro. IND: Aadir una gota de reativo de Kovacs. Positivo= aparece un anillo rojo en los dos primeros minutos de la reaccin. Si la glucosa da negativo y los tests positivos son 2 o menos de 2, no hay que aadir reactivos. Cuando esto ocurre se hacen otros tipos de API como el API OF, el API M o el API para ver determinados metabolismos especiales.

Identificacin: del conjunto de reacciones se obtiene un perfil numrico. Los pocillos


estn separados en grupos de tres. En total hay 7 tripletes (el test nmero 21 corresponde al test de la oxidasa). A cada pocillo se le da el valor 0, 1, 2 o 4 segn corresponda: 1. Si la reaccin es negativa 0 2. Si la reaccin es positiva. 1 (primer pocillo de un triplete) 2 (segundo pocillo de un triplete) 4 (tercer pocillo de un triplete) Se suman los valores de cada triplete y se obtiene un cdigo de 7 cifras. Con este cdigo se busca en la tabla de identificacin la especie de que se trata Material y Mechero bunsen y Asa bacteriolgica en punta y Estufa de incubacin

Reactivos
y y Cepa pura del microorganismo a probar Medios de cultivo necesarios para las pruebas bioqumicas a realizar

Procedimiento 1. Realizar la prueba de catalasa ,colocando una colonia de la bacteria a identificar ,aadir agua oxigenada y anotar el resultado 2. Realizar la prueba de Oxidasa , colocando una colonia de la bacteria a identificar , aadir el reactivo de oxidasa ,anotar los resultados. 3. Inocular los medios de la bioqumica de la siguiente manera:tomando una colonia con el asa en punta para toda la bioqumica. a)Citrato de Simons con el asa en punta inocular la superficie b) TSI ,inocular la superficie y picar hasta el fondo c) LIA ,inocular la superficie y picar hasta el fondo d)MIO, inocular solamente picando hasta el fondo e) UREA ,inocular solamente en superficie.
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Incubar las pruebas por 24 horas a 37 C ,leer y anotar los resultados-. Resultados : En base a los resultados obtenidos ,crecimiento en placa ,medio utilizado y tincin de Gram identificar nuestro microorganismo. Cuestionario. 1. Para que nos sirven las pruebas bioqumicas? 2. Qu son las pruebas bioqumicas? 3. De los componentes de los medios utilizados para pruebas bioqumicas Cul de ellos es de suma importancia? 4. En que consiste la prueba de indol? 5. Qu prueba de las experimentadas nos servira para diferenciar los siguientes microorganismos? E.coli de Klebsiella Proteus de Salmonella Citrobacter de E.coli

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Practica 7 Reino Fungi Hongos Microscopicos

Introduccin Desde tiempos de Aristoteles ( siglo IV A.C. ) hasta mediados del siglo XIX los organismos conocidos colectivamente con el nombre de hongos haban sido clasificados dentro del reino vegetal ( Reino Plantae )ya que para la mayora de los bilogos era suficiente dividir a los seres vivos en solo dos reinos,el de las plantas y los animales y era obio que los hongos se parecan mas a las plantas por el aspecto general de sus fructificaciones , su relativa inmovilidad y la produccin de esporas , al menos en el caso de hongos macroscpicos. Los hongos son seres macroscpicos o microscpicos que carecen de pigmentos fotosintticos , aunque si tienen pigmentos que les brindan colores muy variados,como no realizan fotosntesis su nutricin es de tipo hetertrofa y requieren de materia organica para vivir. La absorcin de los alimentos la realizan por medio de una membrana, o sea por osmosis por lo que se llaman osmotrofos. Algunos pertenecientes a la divisin de los mixomicota tienen la capacidad de movimiento ameboideo o en fases de plasmodio, esto los hace fagotrofos. Existen organismos fngicos comoparasitos o simbiticos de algn vegetal o de un animal , estos viven totalmente dependientes de ese sustrato que les de alimento aunque existen algunos facultativos y otros no-obligados a vivir dependientes del sustrato. Otros forman simbiosis con las races de algunos vegetales obteniendo proteccin y alimento de los alrededores de las races. Los hongos son considerados como los principales descomponedores de la biosfera. Objetivos: 1. Identificar las caractersticas generales de los hongos 2. Conocer los principales generos de hongos microscpicos 3. Ubicar en un esquema las principales partes de un moho Material y y y y y y Microscopio ptico Preparaciones Cultivo de hongos Porta y cubre objetos Asa bacteriolgica en punta Lactofenol azul de algodn FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA GENERAL y y y y y y Caja Petri Varilla de vidrio Papel filtro Agar Saboraud Tubo de ensaye esteril

Reactivos Biologicos y Cepa de hongo a identificar

Procedimiento Para poder clasificar los hongos es necesario tener en cuenta tres caractersticas primordiales. 1. Conocer datos del hospedero , como son sexo, edad, actividades que realiza ,as como lugar o zona donde habita. 2. Caractersticas morfolgicas macroscpicas del hongo, como pueden ser color, textura , forma de la colonia, aspecto, tiempo de crecimiento ,etc. 3. Caractersticas morfolgicas microscpicas, como son presencia o ausencia de micelios, esporas, ascas , formas levaduriformes , etc. para este ltimo paso es necesario realizar un microcultivo. Primero se har una siembra en una placa con agar Saboraud para observar las caractersticas macroscpicas del hongo ,para lo cual con el asa bacteriolgica y a la flama del mechero se inocula dicho medio colocando las escamas, ua ,pelo , etc. Segn sea el espcimen o directamente la cepa a investigar, se incuba a temperatura ambiente por 5-8 das, a veces es necesario incubar hasta 30 das. Para el microcultivo preparamos una cmara hmeda colocando dentro de una caja petri un crculo de papel filtro que se humedecer con agua, despus 2 varillas de vidrio sobre las cuales se coloca el portaobjetos que contiene los crculos de agar inoculados en los bordes con la muestra. Se cubre con un cubreobjetos, el cual al cabo de 7 das se retira y se coloca directamente sobre otro portaobjetos que contenga una gota de azul de algodn para observar directamente al microscopio. Hacer una lista con las observaciones para poder clasificar el hongo.

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Cuestionario 1. Cuantos tipos de mohos observaste? 2. De los observados Cules son parsitos y cules de vida libre? 3. Menciona tres aspectos negativos y tres positivos de los mohos 4. Seala la importancia econmica, medica y ecolgica del reino fungi. 5.Cual es la utilidad de realizar un microcultivo?

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Practica 8
Determinacin de crecimiento de un microorganismo

Introduccin El crecimiento microbiano se define como el incremento en el nmero de clulas, es decir, se refiere al crecimiento de poblaciones. Esto viene siendo como consecuencia del crecimiento de cada clula individual y su divisin celular. El crecimiento de un microorganismo depende de varios factores como: 1.-El microorganismo en si, por ejemplo E .coli en condiciones optimas tiene un ciclo de vida de 15 a 20 minutos mientras otros como M. tuberculosis su ciclo de vida es de 18 horas. 2.-La composicin del medio de cultivo 3.- Las condiciones de incubacin (temperatura, atmosfera) 4.-Procedencia y caractersticas del inoculo La curva de crecimiento variara dependiendo si se parte de un cultivo en fase estacionaria o de uno en fase de crecimiento exponencial. Existen varios mtodos de medir el crecimiento microbiano. Mtodos directos. Aquellos en que se cuenta el nmero total de clulas en un volumen conocido y se estima el nmero total de poblacin, el recuento de clulas se puede hacer con un microscopio, un contador electrnico o contando clulas viables por siembras en placa a partir de diferentes diluciones. Mtodos indirectos. Son aquellos que utilizan parmetros distintos del nmero de clulas, pero que pueden relacionarse con estos, como masa molecular, actividad metabolica, etc. Esto es posible porque durante el crecimiento de un cultivo hay un aumento ordenado de todos los constituyentes celulares y as la velocidad de crecimiento de la poblacin puede estimarse por la velocidad de crecimiento de cualquiera de estos parmetros. Entre estos mtodos estn: Determinacin del peso seco Determinacin de nitrgeno celular Determinacin de DNA Determinacin de actividad metablica Medida de la turbidez de un cultivo. Medida de la turbidez de un cultivo. Se basa en la capacidad de las clulas y partculas en general de absorber o dispersar la luz que incide sobre ellas. Un cultivo aparece turbio porque las clulas dispersan la luz que atraviesa la suspensin. La turbidez es proporcional al nmero de clulas y puede medirse empleando un espectrofotmetro. El espectrofotmetro es un aparato que hace pasar la luz a travs de una suspensin celular y detecta la luz no dispersada.

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Figura 1 De manera que a mayor nmero de clulas mayor turbidez del cultivo o densidad ptica y menor la cantidad de luz no dispersada, por lo tanto la densidad ptica de un cultivo es proporcional a la densidad celular; cuando es muy turbio hay que recurrir a hacer diluciones. Calculo del tiempo de generacin. El tiempo requerido para que una clula microbiana se divida dando lugar a dos se denomina tiempo de generacin (g) .Por tanto g es el tiempo que necesita una poblacin para duplicar el nmero de clulas. Si consideramos que entre el tiempo inicial (To) y otro final (Tf) han transcurrido n generaciones, el valor de g se expresa como g = ( Tf To ) / n Si inicialmente tenemos en el cultivo N0 clulas, despus de la primera divisin el nmero de clulas ser N0 21; despus de la segunda divisin N0 22; despus de la tercera divisin N0 23.; despus de n divisiones, el nmero final de clulas (Nf) ser N0 2n. Por tanto, se trata de una progresin geomtrica cuya sucesin se puede expresar como: Nf = No 2n (B) Despejando el valor de n se aplican logaritmos: Log Nf = log(No 2n) log Nf = log No + n log 2 n = (log Nf log No)/log 2 Conocido el valor de n, lo sustituimos en la ecuacin (A) y obtenemos el valor de g: g = 0,3 (Tf - To)/ (log Nf log No) El crecimiento de una poblacin en el que el nmero de clulas se dobla cada un tiempo g se conoce como crecimiento exponencial y est representado por la ecuacin (B).

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Cuando seguimos el crecimiento de una poblacin midiendo su densidad ptica en funcin del tiempo obtenemos una curva de crecimiento que nos da una grafica.

Figura 2 El incremento en el nmero de clulas es lento al principio y despus es exponencial. En la grafica se distinguen 4 fases. Fase de Latencia. Fase de adaptacin de las clulas a las nuevas condiciones del medio al que han sido transferidas.

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Fase exponencial. Fase en que la clula se est dividiendo regularmente a ritmo constante, en este periodo es donde se puede calcular el tiempo de generacin de un microorganismo. Fase estacionaria . El nmero de clulas no se incrementa mas porque los nutrientes del medio se van agotando y posibles sustancias toxicas se acumulas ;el nmero de clulas que se originan es igual al nmero de clulas que mueren. Fase de muerte celular .Las clulas mueren a una velocidad mayor a la que se originan debido al agotamiento total de nutrientes y / o excesiva acumulacin de sustancias toxicas ,y esto disminuye la absorvancia del cultivo. . Objetivos: Medir el crecimiento de una poblacin microbiana ( E . coli ) y determinar el tiempo de generacin Material

y y y y y

Asa bacteriolgica Mechero Estufa de incubacin Matraz erlenmeyer espectrofotmetro

Reactivos y Caldo lactosado y Cepa E. coli

Procedimiento experimental: 1. 2. 3. 4. Inocular el matraz con el medio de cultivo , con la cepa de E.coli Medir la absorvancia inicial a 600 nm Medir a diferentes tiempos por 24 horas cada 2 horas Con los datos obtenidos realizar la grafica de crecimiento diferenciando las 4 fases.

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Cuestionario 1.Cuales son las 4 fases de una curva de crecimiento microbiano? 2.En que fase encontramos al microorganismo en mejores condiciones para hacer pruebas microbiolgicas? 3.Que se entiende por crecimiento microbiano? 4.A que se debe la fase de latencia de un microorganismo? 5.Que es la absorvancia .?

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Practica 9 Proyecto final Recuperacin e identificacin de un microorganismo Con las tcnicas de toma de muestra ,preparaciones, tinciones ,medios de cultivo, pruebas bioqumicas, etc , se recupera e identificara un microorganismo tomado ya sea de un nicho , una secrecin o un espcimen predeterminado.

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