Introduccin a la Gentica Molecular

Gua de Problemas y TP
Curso del 2006 (8 al 27 de mayo)
Maestra en Biotecnologa
Facultad de Cs. Veterinarias Universidad de Buenos Aires
Coordinadores: Drs. Esteban Hopp, Graciela Marrube

Curso de postgrado

Coordinadores: Dr H. Esteban Hopp y Dra Graciela Marrube. Profesores: Dr. H. Esteban Hopp, Dra. Analia Berinstein y Dr. Oscar Taboga. Docentes Auxiliares:
P1 y P2: Biologa Molecular y Regulacin

Lic. Laura Klepp Lic. Mariela Carrica Lic. Julia Vernica Sabio y Garca
TP5: Bioinformtica

Dr. Fernando Carrari Dra. Marisa Lpez Bilbao Dra. Ana Distfano Lic. Natalia Almasia Lic. Vanesa Mongelli Lic. Guillermo Maroniche
P3 y 4: G. Bacteriana e Ing. Gentica

Dr. Guido Knig Ing. Agr. Paula Fernndez Lic. Paola Talia Luis Fernndez
P6: Genmica

Lic. Maria Carolina Martnez Lic. Corina Fusari Lic. Lucila Peluffo
P7: Inmunogentica

Dra. Fabiana Bigi Dr. Sebastin Asurmendi Lic. Betiana Parody

Dra. Andrea Peralta Lic. Romina Petrigh Dra. Anala Berinstein Dr. Oscar Taboga

CRONOGRAMA 8-27 de mayo Fecha/da+aula LUNES MARTES SEM 8-13 T1(a9) SEM 15-20 P3(a9) SEM 22-27 P6(a9) SEM 29/5? MIERC T2(a5) T5(a5) T7(a5) JUEVES VIERNES SABADO T3y4-P2 (mdulo) P1(a9) T6(a9) P4-TP5(a3) P7(a9) Consultas Examen

Horarios: Lunes, Mircoles y Viernes de 18 a 22 hs; Sbados de 9 a 17 hs CLASES TEORICAS: T1.- GENTICA MOLECULAR T2.- ORGANIZACIN DE LOS GENES EN CROMOSOMAS T3.- REGULACIN DE LA EXPRESIN GENTICA T4 y T5.- GENTICA DE MICROORGANISMOS E INGENIERA GENTICA T6: GENMICA T7: INMUNOGENTICA CLASES DE PROBLEMAS: P1 y P2: Biologa Molecular y Regulacin

P3 y 4: Gentica Bacteriana e Ingeniera Gentica TP5: Bioinformtica aplicada al anlisis genmico P6: Genmica P7: Inmunogentica
REGIMEN DE LA MATERIA 2006

La materia consta de clases de: 1) recapitulacin de temas tericos 2) terico-prcticas de discusin de problemas y TP Las clases de terico-prcticas de discusin de problemas y publicaciones son obligatorias y lo que se evala es que el estudiante maneje los conceptos bsicos detrs de las herramientas genticas necesarias para la

interpretacin, anlisis crtico y resolucin de los problemas que reflejan experimentos cientficos del campo de la Gentica. Debido al carcter intensivo de esta materia, las tericas magistrales no son suficientes, lo que requiere de una gran dedicacin del estudiante en cuanto a lectura de bibliografa. En este contexto, lo que se pretende es una lectura exhaustiva pero no su memorizacin. La memorizacin mecnica de textos ser de poca utilidad por dos razones: no sirve para resolver automticamente los problemas y como el examen ser a libro abierto, estarn disponibles durante el examen, si se los necesita. Lo importante ser poder entender y adquirir la capacidad de razonar molecularmente. Lo que se aprende de memoria se olvida con mayor facilidad con que se lo aprende. Para cada gua de Problemas, se indicar la bibliografa correspondiente que deber ser leda CON ANTERIORIDAD a la clase. Condiciones para aprobar: 1) Aprobar el examen obteniendo como mnimo 40/100 puntos (se podr recuperar una vez). 2) Haber asistido al 80% de las clases terico-prcticas (significa que se puede tener un total de 2 faltas). La nota final se convertir a una escala de 4 a 10 de acuerdo con las siguientes equivalencias: 40.0 44.9 = 4 45.0 54.9 = 5 55.0- 64.9 = 6 65.0- 74.9= 7 75.0- 84.9= 8 85.0- 94.9= 9 95.0- 100= 10 PROGRAMA: Clase 1.- GENTICA MOLECULAR Requisitos funcionales y estructurales del material gentico: codificacin y conservacin de la informacin, replicacin, expresin y variacin. Gen: puntos de vista estructural versus funcional u operacional. Organizacin interna de los genes: secuencias estructurales (codificantes) y secuencias regu-

latorias (no codificantes) en bacterias, virus, plantas y animales. Promotores, amplificadores (enhancers), silenciadores, exones, intrones, etc. Papel de secuencias nucleotdicas modulares (enhansones, homeoboxes y otras). Clase 2.- ORGANIZACION DE LOS GENES EN CROMOSOMAS: Tipos de genoma: a RNA, DNA, circulares, lineales, segmentados. Constitucin: genomas virales, bacterianos y eucariticos. Empaquetamiento del ADN y topologa. El cromosoma como vehculo de segregacin y conservacin de grupos de ligamiento. Condensacin de los genomas virales. Nucleoides bacterianos. Cromosomas eucariticos: estructura y organizacin de centrmeros y telmeros. Cromatina: eucromatina y hetrocromatina. Cromosomas artificiales de levaduras.El DNA repetitivo y paradoja del valor C. Repeticiones en tndem o dispersas. DNA medianamente repetitivo: el ejemplo de los genes ribosomales. Organizacin de las secuencias de copia nica. Operones versus familias multignicas Clase 3.- REGULACION DE LA EXPRESION GENETICA: - Regulacin pretranscripcional: rearreglos de secuencias locales de ADN (genes de inmunoglobulinas). Efectos de posicin. Dominios cromatnicos. - Regulacin transcripcional: interaccin ARN polimerasa-promotor (opern lactosa, genes de esporulacin en bacilos). Comparacin de las soluciones al problema de expresin coordinada de genes en pro- y eucariontes (activacin de un opern versus activacin simultnea de genes independientes). - Controles postranscripcionales: procesamiento del ARN ("splicing" de intrones), supresin y cambios de marco de lectura en virus. Controles postraduccionales: procesamiento de poliprotenas. - Fenmenos epigenticos involucrando metilacin: impronta gentica, silenciamiento e interferencia. Clase 4.- GENETICA DE MICROORGANISMOS

Conjugacin. Recombinacin. Transformacin. Plsmidos: propiedades generales y asociadas (resistencia a antibiticos, bacteriocinas, toxinas, fermentacin, etc.). Transduccin. Fagos lambda y M13. Organizacin y estrategias genticas de virus animales. Metodologas de clonado y concepto de clon heterogneo, variabilidad y teora de las cuasiespecies. Epidemiologa molecular. El caso del virus de la fiebre aftosa. Clase 5.- INGENIERIA GENETICA Enzimas para la manipulacin del DNA: endonucleasas de restriccin, transcriptasa reversa, ligasas, polimerasas. Principales tcnicas y estrategias para el clonado de genes en bacterias. Vectores: plsmidos, fagos, fsmidos y csmidos. Concepto de sonda molecular. Generacin de bancos o clonotecas de cDNA y genotecas. Tcnicas para el estudio de la organizacin gentica: mapeo de restriccin, secuenciacin nucleotdica, Southern, Northern, Western, hibridacin "in situ", etc. Mutagnesis dirigida. Amplificacin de genes mediante PCR Aplicaciones: - Sistemas de expresin de protenas recombinantes: bacterias, levaduras, baculovirus, plantas y animales. - Transferencia de genes en animales: microinyeccin de vulos fecundados, ejemplos de ratones y otros animales transgnicos, hormona de crecimiento, genes marcadores selectivos, protenas de inters farmacutico. - Vacunas recombinantes: uso de distintos vectores virales y bacterianos. - Introduccin de genes heterlogos en levaduras: transformacin con vectores plasmdicos combinados. Cromosomas artificiales. - Terapia gnica. Clase 6 y 7: GENMICA Concepto de marcador gentico y su uso. Diagnstico gentico y caracterizacin genotpica: hibridacin con sondas de cidos nuclicos y PCR (reaccin en cadena de DNA polimerasa). Caracterizacin ("fingerprinting") de genotipos por isozimas, RFLPs, VNTRs, microsatlites (SSR), RAPDs, AFLPs y STSs. Utilizacin de marcadores moleculares para fingerprinting, mejoramiento por seleccin asistida, seguimiento de in-

trogresiones, grado de homocigosis, etc. Concepto y utilizacin de mapas genticos saturados. Marcadores de caracteres cuantitativos, QTLs. Proyectos genmicos. Clonado de genomas. Vectores. Clculo de nmero de clones, su manejo y anlisis. Tcnicas de identificacin y mapeo de contigs. Secuenciacin de secuencias expresadas (EST). DNA microarrays y chips y anlisis por microscopa lser confocal (automatizacin y robotizacin). Protemica. Clase 8: INMUNOGENETICA Propiedades de las inmunoglobulinas y de la respuesta inmune. Diferenciacin de linfocitos. Seleccin clonal. Organizacin de los "genes" para dominios proteicos en la lnea germinal. Recombinacin somtica y cambio de clase de inmunoglobulinas. Mutaciones somticas. Exclusin allica e isotpica. Complejo mayor de histocompatibilidad. Respuestas alogeneicas. Polimorfismos. Aplicaciones. BIBLIOGRAFIA Y LINKS TILES Echenique V. Rubinstein C. Mroginski L. editores. 2004. Varios autores (entre los que se incluyen algunos de esta ctedra): Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal. Ediciones Instituto Nacional de Tecnologa Agropecuaria. Se puede bajar libremente de http://www.argenbio.org/h/biblioteca/libro.ph p Recomendable para las secciones que no estn bien en otros libros de texto como el Griffiths. Particularmente los captulos: Herramientas Bsicas de Ingeniera Gentica. Marcadores Moleculares. Transformacin Gentica. Genmica. Mtodos Para el Estudio de la Expresin de Genes. Anlisis Informtico de Secuencias Moleculares. Alberts, B., A. Johnson, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts, P.Walter Garland Science; N.Y. 2002. Molecular Biology of the Cell. 4th edition. Se lo recomienda para la parte de regulacin y otros tpicos moleculares. En: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?r id=mboc4 colocando la palabra que se quiere

consultar (en ingls) se tiene acceso a todo el texto del libro referente a ese tem. Brown, T. A. 2002. Genomes 2. 2nd edition. John Wiley & Sons. BIOS Scientific Publishers, Ltd. Se lo recomienda para todo lo relacionado a genmica http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?c all=bv.View..ShowTOC&rid=genomes.TOC &depth=10 Griffiths, A. J. F., J. H. Miller, D. T. Suzuki, R. C. Lewontin y W. M. Gelbart. 2004. Gentica. 8 Edicin. Editores: W. H. Freeman. Se lo puede consultar usando el buscador (poniendo ls nombres de los captulos en): http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?c all=bv.View..ShowTOC&rid=iga.TOC o bajar el pdf en la pgina Web de Gentica I http://www.fbmc.fcen.uba.ar/genetica1/griffit h.zip (en ingls). La ltima edicin en castellano es la 7 Edicin. McGraw-Hill. Interamericana. Espaa. Hartl, D.L. y Jones, E.W. Genetics. Analysis of genes and genomes. Ed. Jones and Bartlett. 2001. Caps. 1, 2 y 3 estn disponibles en versin electrnica en: http://www.jbpub.com/genetics/home.cfm Lewin, B. 2005. Genes VIII. PearsonPrentice Hall Ed. Uno de los mejores textos de biologa molecular. Se puede consultar parte del texto registrndose en http://www.prenhall.com/lewin/ ltima edicin en castellano: Genes VII. Marbn, S. L. Watson, J. D., M. Gilman, J. Witkowski, y M. Zoller. 1992. Recombinant DNA. 2 Edicin.Scientific American Books, Freeman, New York. Un clsico de la ingeniera gentica muy didctico. Accesible en la biblioteca de la FCEyN. Saladrigas, Vernica y otros autores: Diccionario ingls espaol de trminos cientificos que trae, adems, explicacin de muchos conceptos bsicos de gentica. Es decir, es til no slo para los que leen textos en ingls, sino tambin para estudiar: http://www.biorom.uma.es/contenido/Glosari o/index.html Otros links tiles En el sitio

http://www.nature.com/focus/rnai/animations /index.html se puede ver (o bajar) una animacin sobre el tema de iRNA Agencia de Promocin Cientfica http://www.agencia.secyt.gov.ar Pgina de Becarios http://www.becarios.org CONICET http://www.conicet.gov.ar Revistas Latinoamericanas http://www.scielo.org BSQUEDAS BIBLIOGRFICAS Para buscar citas de trabajos originales publicados en revistas cientficas en ingls mediante el uso de palabras presentes en sus ttulos o resmenes o el apellido de sus autores, se puede consultar la base de publicaciones ms importante en ciencias biomdicas y biotecnologa, llamada PubMed, a la siguiente direccin de internet: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/ CINE E INTRODUCCIN A LA GENTICA MOLECULAR Pelculas cuyo contenido est relacionado con temas que se discuten en la materia (se recomienda que las alquilen para su discusin con algunos de los problemas): - Gattaca (EEUU, 1997) Dirigida por Andrew Niccol, con Ethan Hawke, Urna Thurman, Alan Arkin, Ernest Borgnine. - Y la Banda Sigui Tocando (And the Band Played on) (EEUU, 1993) Dirigida por Roger Spottiswoode, con Mathew Modine, Alan Alda, Richard Gere, Lily Tonlin, Steve Martin, Anjelica Huston, Phil Collins. - Heredars el Viento (Inherit the Wind) (EEUU, 1960) Dirigida por Stanley Krarner, con Spencer Tracy, Fredric March y Gene Kelly. Basada en un caso real. - Heredars el Viento (Inherit the Wind) (EEUU, 1988) Telefilm remake del anterior con Jason Robards y Kirk Douglas. - Los Nios del Brasil (The Boys from Brazil) (EEUU, 1978) Dirigida por Franklin J. Shaffner, con Gregory Peck, Lawrence Olivier, James Mason y Lilli Palmer. Basada en la novela de Ira Levin.

Gua 0. CONCEPTOS Y TCNICAS BSICOS DE GENTICA MOLECULAR Bibliografa: Alberts, Griffiths y Recombinant cficas (revela 2 nucletidos y el verdadero se saca por comparacin con otra calle del gel. Esta razn dificulDNA (Watson et al.). ta, adems, la automatizacin. Resultan ms difciles Gua terica:
1) Qu son, de dnde se obtienen y para qu sirven las enzimas (mejor llamadas endonucleasas) de restriccin? Cmo hacen las bacterias que producen ER para evitar que su genoma se vea afectada por las mismas?Qu tipos de especificidad presentan? Qu tipos de extremos pueden generar en el ADN sustrato? R: Las endonucleasas de restriccin son producidas por bacterias como mecanismo de defensa contra los fagos. El genoma se encuentra protegido por metilacin especfica del sitio de restriccin mediante una metilasa con igual especificidad que la endonucleasa. Cortan el ADN en sitios especficos (secuencias definidas de ADN de 4 6 bases). Algunos dejan extremos cohesivos, otros dejan extremos romos. Siempre el sitio blanco (de reconocimiento) es un palndrome, aunque el sitio de corte puede no coincidir con el sitio de reconocimiento. Los fragmentos generados se pueden separar fcilmente mediante electroforesis en geles de azarosa o poliacrilamida, la velocidad de los fragmentos depende de su longitud: los ms pequeos migran mucho ms rpido. 2) En qu consiste la tcnica de secuenciacin de Sanger? Qu trascendencia tuvo y tiene en Gentica y Genmica? Porqu desplaz a la tcnica de Maxam & Gilbert?Cul es la ventaja de la secuenciacin automtica y en qu se diferencia de la manual? R: En la secuenciacin manual, se suele marcar con radioistopos y se corren 4 calles por secuencia (una para cada nucletido). Se revela por autoradiografa. Secuenciacin de Sanger (ver esquema de libro): secuenciacin por dideoxinucletidos - ADN simple cadena - Oligonucletido iniciador (primer) - Incubacin c/ 4 diferentes dideoxinucletidos - (Mono)deoxinucletidos (uno de ellos marcado, usualmente [32P]dCTP) - Electroforesis Existen mtodos no radiactivos (como tincin con nitrato de plata), pero son menos utilizados. En la secuenciacin automtica se marca con fluorocromos (aqu se marca el primer, con un color distinto para cada nucletido a detectar) y se corren las cuatro reacciones en el mismo carril (que suele ser un capilar). Los fragmentos se detectan mediante un lser a la salida del gel que distingue los 4 fluorocromos. No requiere detener la corrida electrofortica, por lo que revela un mayor nmero de nucletidos. Permiti la secuenciacin masiva de genes y genomas posibilitando el advenimiento de la genmica y proyectos como el genoma humano. La tcnica de M&G tiene 2 reacciones de terminaciones de nucletidos inespe-

de controlar las condiciones. Nomenclatura para los nucletidos: R=A o G K= G o T S= G o C Y=C o T M= A o C W= A o T B=no A (CoGoT) H=no G (AoCoT) N=cualquiera D=no C (AoGoT) V=no T (AoCoG) 2) Qu es un marco de lectura abierto (ORF) y cmo se lo busca? Cmo se puede saber si se relaciona con un gen funcional? Qu relacin tiene esto con la llamada Gentica Revertida? R: Marco de lectura abierto (open reading frame, ORFs): segmentos de ADN que contienen el codn de iniciacin ATG y el de finalizacin de lectura o stop codon). Pueden corresponder a un gen (genes potenciales). A veces no se reconoce la secuencia precisa de un gen en un fragmento clonado. Por computadora, ingresando la secuencia, la mquina busca en los seis posibles marcos de lectura (tres en cada direccin) un segmento con un codn de iniciacin y uno de terminacin. Hay varios mtodos: correlacionar cambios en la secuencia con mutantes fenotpicos, por ejemplo, o tambin mediante la bsqueda de homologas con otros genes conocidos de otras especies. Pero el mtodo ms definitivo es la mutagnesis dirigida del gen (por knock out, por ejemplo), para ver cmo afecta, fenotpicamente, al individuo (gentica revertida o inversa). En general, para estar seguros de la funcin, el experimento de knock out debe ser reconfirmado por otro experimento de complementacin gentica (restauracin del fenotipo normal por reintroduccin del alelo salvaje en el fondo gentico del mutante). Otro es sobreexpresar o expresar con otro promotor el mismo gen. Otro es clonar, expresar en bacterias para, con la protena sintetizada, producir anticuerpos que permitan identificar la protena correspondiente en el organismo en cuestin. El encontrar ORFs sin funcin conocida es muy frecuente con el advenimiento de la genmica, al revs de lo que pasaba antes en los que se conoca el fenotipo y sus leyes de herencia pero no su base molecular. 3) En qu consiste la PCR de punto final? Es una tcnica cualitativa o cuantitativa? Qu diferencias existen entre PCR de punto final y PCR de tiempo real? Es posible hacer una PCR a partir de RNA? Cmo? Puede utilizarse para diagnstico (la deteccin de HIV, por ejemplo)? Qu ventajas o desventajas tendra respecto a otras tcnicas diagnsticas como el ELISA? Es posible hacer PCR con un solo iniciador? Para qu servira?

R: PCR: polymerase chain raction (esquema del Recombinant DNA de Watson et al.) Taq polimerasa: Thermus aquaticus - Permite amplificar segmentos especficos de ADN. - No requiere digestin del ADN. - No requiere clonar el segmento - Se requiere poca cantidad de ADN. Es una tcnica fundamentalmente cualitativa, debido a que llega a una meseta de amplificacin por limitantes que no suelen ser la concentracin del templado. La PCR en tiempo real va siguiendo la cintica de amplificacin permitiendo comparar las fases logartmicas de amplificacin entre s y as cuantificar con precisin los templados frente a una referencia o estndar. Se puede hacer RT-PCR (se llama igual que la otra una por Retro Transcriptasa y la otra por Real Time-): realizar la primera reaccin con retrotranscriptasa y despus continuar con Taq pol. S. Ventajas: mtodo directo (detecta al virus y no los anticuerpos con los que reacciona el paciente). Por eso sirve para la deteccin en recin nacidos o personal mdico de alto riesgo que trabaja con pacientes antes de los 6 meses que tarda en generase una respuesta inmunolgica. No da falsos positivos (salvo por contaminacin de amplicones: un problema general de las PCRs). Desventajas: ms complejo, caro y menos automatizable que un ELISA. Hay que purificar RNA e implica mayor exposicin al virus por parte del personal que hace el diagnstico. Amplicones. S. Es el caso de los RAPD. Sirven como marcadores moleculares annimos (no se sabe qu es lo que se amplifica) de mucha utilidad cuando no se tiene informacin de secuencia nucleotdica. 4) En qu consiste un Southern blot? y el Northern? y el Western? Para qu se usan y qu tipo de molculas se detectan en cada caso?Qu relacin tiene el Southern con los RFLPs? Mencione 4 aplicaciones de los RFLPs. Compare la utilizacin de Southern vs. PCR, Northern vs. RT-PCR y Western vs. ELISA. R: Southern blotting: - ADN (genmico de alto peso molecular en el caso de los RFLP) - Enzimas de restriccin - Fragmentos de ADN se separan por electroforesis en gel de agarosa. - Pasaje a un filtro de nylon o nitrocelulosa - Incubacin con una sonda radiactiva especfica del gen en estudio. - Lavado y exposicin del filtro. - Deteccin autoradiogrfica o fluorogrfica. Esta tcnica permite determinar: a) Presencia y nmero de sitios de corte con una determinada enzima de restriccin en un fragmento de ADN dado y establecer la existencia de polimorfismos para fines diagnsticos o de estudio gentico (RFLP). b) N de copias (aproximado) del gen en el genoma Los RFLP surgen de comparar los patrones de restriccin de Southern blot entre distintos individuos, espe-

cies, etc. observando diferencias (polimorfismos) en sitios de corte. Aplicaciones de los RFLP: - mapeo gentico - diagnstico prenatal - diferenciacin de individuos (fingerprinting) - estudios evolutivos Northern blotting: - ARN celular total o mRNA se separa por tamao utilizando electroforesis en gel de agarosa (en presencia de un agente desnaturalizante como el formaldedo para evitar la formacin de estructuras secundarias en el ARN durante la corrida). - Pasaje de un filtro de nitrocelulosa o a un papel tratado qumicamente. - Hibridacin con una sonda apropiada marcada seguida por autoradiografa. Se revelan bandas que indican el nmero y tamao de los tipos de ARN complementarios a la sonda. Permite cuantificar aproximadamente y evaluar niveles de expresin de genes (para mejor precisin se usa RT-PCR en tiempo real). Tambin es til, entre otras cosas, como auxiliar del clonado de cDNA porque el tamao de un mRNA especfico puede compararse con el tamao de los cDNA copiados de ese mRNA, y revela si este cDNA est completo. En el Western blotting se transfieren protenas de un gel y luego se las visualiza por su reaccin con anticuerpos especficos. La PCR ha desplazado, paulatinamente, al Southern para varias de sus aplicaciones (por ser menos complejo, tener menos requerimientos de cantidad de templado, y porque puede automatizarse mejor) pero no en todos los casos (por ej., comparaciones evolutivas). Pero an en este ltimo caso, hoy en da emopiezan a ser reemplazados por los SNPs o por comparacin directa de la secuencia nucleotdica de genes diagnsticos. En algunos casos, se puede tener una sonda pero no conocer la secuencia nucleotdica para disear los iniciadores. Northern y RT-PCR, dem que con Southern. La PCR comn (denominada de punto final) no es cuantitativa, para ello se debe hacer PCR en tiempo real. El Western es ms especfico que el ELISA (se identifica la banda). No da falsos positivos. Es ms complejo y caro. Se utiliza para confirmacin del HIV, por ej. 6) Indique si las siguientes afirmaciones son verdaderas o falsas y justifique su respuesta: a) Un experimento de Northern requiere desnaturalizacin de la doble cadena de ADN. b) En un Southern el ADN es digerido con endonucleasas de restriccin, los fragmentos separados en base a su tamao mediante electroforesis y desnaturalizados en la doble cadena, en ese orden. c) En una reaccin de PCR estndar se utilizan dos primers complementarios a la cadena codificante. d) La secuenciacin por el mtodo de Sanger no requiere, en ningn paso, la desnaturalizacin de la doble cadena del ADN.

R: a) FALSO. Se trata de ARN de simple cadena el que se somete a electroforesis. b) VERDADERO. c) FALSO. Se utilizan dos primers complementarios a las dos cadenas. d) FALSO. En esta secuenciacin se requiere la desnaturalizacin del ADN. e) FALSO. Se observan 100 bandas en el gel. Problemas 1) Suponiendo un alineamiento al azar de nucletidos en un fragmento de ADN, cul es la probabilidad de que una endonucleasa de restriccin cuyo sitio de reconocimiento consta de cuatro bases pueda cortar el ADN? y para una enzima de seis bases? y para una de ocho? R: A T C G 4 bases X X X * 6 bases ( )6 = 2.4 10-4 8 bases ( )8 = 1.5 10-5 *(probabilidad de que c/base se encuentre y que al lado se encuentre una base cualquiera) = ( )4 = 3.9 10-3 Frmula general: (1/4)n, donde n = longitud de la secuencia que se busca. A medida que aumenta el nmero de bases disminuye la probabilidad de encontrar un sitio blanco de restriccin. 2) Un fragmento de ADN clonado, con extremos cohesivos generados por EcoRI, lleva el gen que codifica para un polipptido de la cpside de un virus que infecta a humanos, pero que enferma slo a personas que tienen las defensas inmunolgicas disminuidas. Ese fragmento de ADN, que tiene 8 kb de longitud, se inserta en el plsmido bacteriano pBR322 en su nico sitio para EcoRI. El plsmido recombinante es clivado por dos endonucleasas de restriccin (por separado o juntas) y luego es sometido a electroforesis en un gel de agarosa teido con bromuro de etidio. En la figura se muestra el patrn de bandas (visualizadas por 1 medio de luz UV) originado por cada uno de los tratamientos:

3) Suponga que un plsmido circular contiene 1000 pares de bases. Se corta con tres enzimas de restriccin, con los siguientes resultados: Enzimas Largo de los fragmentos (pb) A 1000 B 100, 300, 600 C 200, 800 A+B 50, 100, 300, 550 A+C 200, 375, 425 B+C 75, 100, 125, 225, 475 Reconstruya el plsmido, indicando dnde corta cada enzima y las distancias entre los cortes. 4) El interfern est codificado por un gen que no contiene intrones. Por clivaje con Bam HI, se genera un nico fragmento de restriccin conteniendo al gen completo, que puede ser identificado en un Southern blot con una sonda de cDNA marcada radiactivamente. Para determinar la posible causa de una inmunodeficiencia, muestras de sangre de pacientes y de personas no afectadas fueron utilizadas para estudiar el gen del interfern y la expresin del mismo. Se muestran a continuacin autorradiografas de Southern y Northern de dichos experimentos, as como tambin un western-blot representativo utilizando anticuerpos anti-interfern . Los individuos 1 y 2 no son afectados (sanos). En base a los resultados obtenidos en

Southern

Northern

Western

5 1

A) EcoRI B) BamHI C) BamHI+EcoRI 8 kpb 6 kpb 5.5 kpb 4.5 kpb 4.0 kpb 4.0 kpb 3.5-kpb 3.0 kpb 2.5 kpb 1.0 kpb
B) Al realizar Southern blots de los geles "b" y "c", qu fragmentos hibridarn con una sonda del gen de la cpside del virus? Bibliografa: Alberts (ver arriba) Gua terica: 1) Cul es el concepto moderno o molecular de gen? Hacer un esquema de un gen eucaritico tpico, sea-

Southern, Northern y Western: a) Cul sera la posible causa de la inmunodeficiencia en los pacientes 3, 4, y 5? b) Qu caracterstica particular tiene el individuo 2 para el gen del interfern ? 5) Dos individuos normales tienen un hijo con el Sndrome de Down (es decir que presenta un cromosoma 21 de ms o trisoma del cromosoma 21). Se realiza un anlisis de RFLP con una sonda de cromosoma 21 en los tres individuos. Basndose en los resultados del gel Qu puede concluir acerca del origen de los cromosomas 21?

1. REGULACION DE LA EXPRESION GENETICA

lar qu parte se transcribe como mRNA y qu parte se expresa como protena. Comparar con un gen procaritico.

R: La respuesta tpica sera que es una secuencia de lactosa no conforma un opern sino que se parece, en DNA codificante para una protena. Sin embargo, este sentido a los genes eucariticos). Debido a esto, esta definicin estructuralista se acota en un perodo en los libros se suele encontrar esquemas de operones de tiempo determinado entre mediados de los 50 y y no de genes individuales (ej. opern lac formado por los 80. Entre Mendel y Watson y Crick no se conoca los genes Z,Y,A). En estos esquemas se suele incluir, cmo el DNA poda codificar una protena y desde el adems de los 3 genes que conforman el opern, el descubrimiento de los intrones y el splicing (particu- gen del factor de transcripcin (I = represor) que est larmente el transplicing y el splicing alternativo) y la fsicamente ligado a 5 del opern, pero no a otros edicin de RNA rompieron la idea de la unidad y con- genes reguladores igualmente importantes (como el tinuidad transcripcional. que codifica a la protena CAPCRP- en el caso opeDefinicin funcionalista de gen: ron lac). No se suele esquematizar (en el opern lac) Unidades hereditarias que se transmiten de una gene- un segundo operador que es el sitio de unin (reconoracin a otra en forma uniforme y predecible conte- cimiento) de la protena CAP, que servira para que el niendo informacin decodificable sobre estructuras y opern lac constituyera un ejemplo de regulacin nefunciones. gativa (represor) y positiva (activador CAP). No se Definicin detallada de gen (combinacin de estructu- suele esquematizar tampoco el promotor del gen I, ni ra y funcin) los terminadores de transcripcin correspondientes y Unidad de informacin (fsicamente constituida por otras secuencias no codificantes importantes del futuun cido nucleico, DNA o RNA, que puede estar par- ro mensajero (por ej. la secuencia de unin a ribosoticionado, superpuesto con otros genes o no) codifi- mas llamada Shine-Dalgarno), los codones de iniciacante para una unidad de funcin (polipptido o cin (que muchos estudiantes suelen confundir con el RNA, por ej. ribosomal). Propiedades: tienen capaci- nucletido +1) y los codones de terminacin de lectudad de variar (mutar, recombinar, es decir evolucio- ra. nar) y de tener una dinmica poblacional (comportamiento frente a la I P O Z Y seleccin natural o artificial) dentro del contexto de especies biolgicas. Tienen capacidad de almaceTRANSCRIPCIN namiento y reproduccin fidedigna de la informacin, as como su decodificacin. Los esquemas de los genes en los libros suelen tener varios errores conceptuales. Por ejemplo: en el esquema que sigue, no se explicita que, as como hay un promotor, 2) Qu mecanismos moleculares postexiste tambin un terminador. Faltara incorporar el transcripcionales conoce que sean capaces de producir enhancer (que s aparece en otros libros). Estructura una sustancial modificacin en la secuencia de un gen eucariota: transcripto primario? Describa los 4 tipos de procesamiento (splicing). Describa la edicin del RNA. R: El procesamiento del ARN genera un ARNm maduro (para genes que codifican para protenas) o ARNr a partir del transcripto primario. El capping (agregado de una metilguanosina en el extremo 5), la poliadenilacin (agregado de una cola de poli A en el extremo 3), el splicing (remocin de intrones), el editing (cambio de bases) y el NMD (nonsense mediated decay) son ejemplos de mecanismos de modificacin del transcripto primario. Mediante sileciamiento post-transcripcional (o interferencia o quelling) tambin se produce degradacin o inactivacin especfica de ARNs. Otro mecanismo muy utilizado en bacterias es la utilizacin de ribointerruptores (riboswitches) y aptmeros (secuencias complementarias de ARN ubicadas en la regin 5no codificante del ARNm) En el caso de procariotas, la situacin es ms compleja dado que los genes individuales comparten sus se- que, segn el tipo de plegamiento secundario, pueden cuencias regulatorias con otros genes formando ope- inducir terminacin temprana de la transcripcin (aterones (no siempre, el gen I del represor del opern

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nuacin) o el autoclivaje del ARN mediante ribozimas autocatalticas. Muchos transcriptos sufren splicing alternativo, remocin de intrones y unin de los exones de un gen. Como consecuencia de esta modificacin post transcripcional se producen diferentes secuencias de ARNm que codifican distintas formas de protenas los cuales sern tejido especficas. Otro mecanismo de procesamiento es el ARN editing. En este proceso la informacin contenida en una molcula de ARN se ve alterada. Se trata de mecanismos que incluyen deaminaciones de C a U y de A a I, y tambin inserciones y deleciones. Afecta ARNt, ARNr y ARNm. En este ltimo caso, se ve afectada la secuencia aminoacdica de la protena de manera de que la misma difiera de la que se puede predecir a partir de la secuencia de nucletidos en la molcula de ADN. Se da mayormente en eucariotas y se relaciona con la presencia de variantes de protenas segn el tejido.La degradacin mediada por mutaciones terminadoras o nonsense mediated decay (NMD), es un proceso de eliminacin de ARNm portadores de una mutacin terminadora o de una mutacin del marco de lectura que derivan en la creacin de codones de finalizacin precoz de la sntesis de una protena. De no eliminarse estos ARNm se produciran polipptidos defectuosos o incompletos al ser traducidos. Se considera hoy en da como una modificacin post transcripcional del transcripto primario. 3) Cul es la diferencia entre un opern, que codifica para un mensajero policistrnico, y un gen que codifica para una poliprotena? En qu tipo de organismos se presenta cada uno de estos mecanismos? R: Un opern es una unidad transcripcional compuesta por una zona regulatoria de la transcripcin y una serie de genes ubicados hacia 3 de dicha zona promotora-reguladora. Este segmento de ADN u opern se transcribe como un todo y a partir del mensajero policistrnico, se producen varias protenas, como el caso del opern lactosa en bacterias. Un gen que codifica para una poliprotena es un gen cuyo producto se clivar post traduccionalmente para producir mltiples copias del mismo pptido. Los primeros son tpicos de los procariotas y los segundos de los eucariotas. 4) Qu es un nucleosoma? Qu protenas participan? R: Un nucleosoma es la unidad fundamental de empaquetamiento del ADN. Consiste en un core central de ocho protenas bsicas llamadas histonas que se ubican alrededor de un segmento de ADN superenrrollado de 146 pb. 5) Cmo influyen los distintos rdenes de empaquetamiento del ADN en la expresin gentica? Cmo vara el grado de empaquetamiento durante el ciclo celular? Cmo resulta la susceptibilidad de corte por DNAasa I en cromatina transcripcionalmente activa con respecto a la inactiva? R: Durante la mitosis, los cromosomas se condensan y son transcripcionalmente inactivos. Sin embargo,

durante la metafase, la mayora de las fibras de cromatina se descondensan. Este material se denomina eucromatina, la cual contiene zonas transcripcionalmente activas con regiones de ADN no transcribibles. Es decir que la condensacin de la cromatina se asocia a la prdida de la expresin gnica. La DNAsa I corta secuencias de ADN doble cadena. Si a las mismas se le unen factores de transcripcin, existe una proteccin a la digestin con la enzima ya que estas protenas ocultan el sitio de corte de la DNAsa I. 6) Cmo influye la metilacin de las citosinas sobre la expresin gentica en eucariotas? Comparar el grado de metilacin de la heterocromatina en relacin con el resto del genoma. R: La metilacin del ADN se relaciona con una represin de la transcripcin. La heterocromatina es cromatina altamente condensada a lo largo de todo el ciclo celular, a diferencia de la eucromatina que se condensa en metafase. Existen dos clases de heterocromatina, la facultativa, que puede ser geneticamente activa o inactiva, y la constitutiva que permanece siempre en estado inactivo. 7) Indique las caractersticas moleculares distintivas de los diferentes tipos de factores de transcripcin eucariotas. R: Los factores de transcripcin reconocen y unen una secuencia de nucletidos corta, como resultado de una complementariedad entre la superficie de la protena y la regin de la doble hlice en la zona del binding. En eucariotas, estos factores presentan un dominio de unin al ADN y otro de activacin. El de binding presenta un motivo estructural de -hlices y as se une al ADN. Los ms comunes son: cierres de leucina, hlice- vuelta- hlice y dedos de zinc. 8) a.- Comparar el efecto de la regulacin de la transcripcin en procariotas en los siguientes casos: I- Opern lactosa por el represor. II- Opern lactosa por CRP (o CAP)-AMPc. III- Opern triptofano por el represor. b. Qu utilidad tiene para la bacteria que la lactosa sea un inductor de su opern y en cambio el triptofano sea un co-represor del suyo? c. Qu diferencias funcionales existen entre los represores bacterianos y los factores de transcripcin eucariticos? y entre un operador y un enhansn (secuencia de unin de un factor de transcripcin localizado en un enhancer o en un promotor)? a)I- El represor del opern lac reprime la expresin del opern ya que se pega a la zona operadora impidiendo que la ARNpol inicie la transcripcin. Slo cuando en el medio haya ligando, en este caso, lactosa, habr transcripcin del opern por remocin del represor. Se trata de un mecanismo de regulacin negativa. II- En el caso del opern lactosa, la protena CAP (tambin llamada CRP) coopera en la expresin del opern. Normalmente, la ARNpol se pega muy debilmente a la zona promotora. Pero si adems se une la protena CAP en posicin 5 del promotor, se ve un

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aumento de los niveles de transcripcin. Se trata de un mecanismo de regulacin positiva. La protena CAP se une al ADN si en el medio existe AMPc. Si no es as, es porque existe en el medio otra fuente de carbono como la glucosa que ejerce lo que se conoce como represin catablica., inhibiendo la transcripcin del opern lac. III- En el caso del opern triptofano, un set de cinco genes adyacentes codifican las enzimas necesarias para la sntesis del aminocido. Existe un represor que se pega al ADN junto con el triptofano. Se trata de un mecanismo de regulacin negativa, ya que al igual que el opern lac, el binding de la protena regulatoria suprime la transcripcin. b) Que no se sintetice triptofano cuando haya trp en el medio, y que se induzca la sntesis de galactosidasa slo en presencia de inductor. c) Ninguna y ninguna. Distintos nombres para igual funcin. 9) Qu son los elementos genticos reguladores (de la transcripcin) en cis y en trans? Describirlos para: a) el opern lactosa. b) un gen eucaritico como el que codifica actina. c) el gen de una protena eucaritica inducida por una hormona esteroidea. R: Existen elementos genticos que modulan la transcripcin desde una dada posicin en el genoma (en cis), mientras que otros producen elementos difusibles como protenas que se unen a otras zonas del ADN (actan en trans). a) cis: operador, sitio de unin (binding de CAP) y promotor. trans: represor y CAP. b)Cis:enhancer y promotor, trans:factores de trancripcin que actuan sobre el promotor del gen de actina. c) Cis y trans: idem actina y la hormona que se une a una zona determinada del ADN despus de unirse a un receptor soluble intracelular (que es, a su vez, factor de transcripcin). 10) Cmo influyen los distintos rdenes de empaquetamiento del DNA en la expresin gentica? Cmo vara el grado de empaquetamiento durante el ciclo celular? Cmo resulta la susceptibilidad de corte por DNAsa I en cromatina transcripcionalmente activa, con respecto a la inactiva? R: Durante la mitosis, los cromosomas se condensan y son transcripcionalmente inactivos. Sin embargo, durante la metafase, la mayora de las fibras de cromatina se descondensan. Este material se denomina eucromatina, la cual contiene zonas transcripcionalmente activas con regiones de ADN no transcribibles. Es decir que la condensacin de la cromatina se asocia a la prdida de la expresin gnica. La DNAsa I corta secuencias de ADN doble cadena. Si a las mismas se le unen factores de transcripcin, existe una proteccin a la digestin con la enzima ya que estas protenas ocultan el sitio de corte de la DNAsa I. 11) Cmo influye la metilacin en citosinas sobre la expresin gentica en eucariotas? Cmo es el grado

de metilacin en heterocromatina comparado a la del resto del genoma? R: La metilacin del ADN se relaciona con una represin de la transcripcin. La heterocromatina es cromatina altamente condensada a lo largo de todo el ciclo celular, a diferencia de la eucromatina que se condensa en metafase. Existen dos clases de heterocromatina, la facultativa, que puede ser geneticamente activa o inactiva, y la constitutiva que permanece siempre en estado inactivo. 12) Indique las caractersticas moleculares distintivas de los diferentes tipos de factores de transcripcin eucariotas. R: Los factores de transcripcin reconocen y unen una secuencia de nucletidos corta, como resultado de una complementariedad entre la superficie de la protena y la regin de la doble hlice en la zona del binding. En eucariotas, estos factores presentan un dominio de unin al ADN y otro de activacin. El de binding presenta un motivo estructural de -hlices y as se une al ADN. Los ms comunes son: cierres de leucina, hlice- vuelta- hlice y dedos de zinc. 13) Qu son las ribozimas, los ribointerruptores y los aptmeros? Las ribozimas son enzimas cuya composicin qumica es ARN (en vez de protena). Tambin existen desoribosimas (de ADN). En forma natural se las descubri en el proceso de splicing autocataltico de intrones de mitocondrias del protozoo Tetrahymena. En este caso se trata de una ribonucleasa especfica de secuencia pero existen otras actividades naturales y sintticas. Los ribointerruptores (riboswitches) son secuencias de ARN que determinan la finalizacin de una transcripcin de un ARNm o un splicing a travs de secuencias que son parte del ARN llamadas aptmeros (que tienen la posibilidad de formar estructuras internas de doble cadena por su complementaridad de secuencia). Estas estructuras secundarias se ven afectadas porque la propiedad de inters de estos aptmeros es que tienen una afinidad muy fuerte de unin a un metabolito regulador (parecido al de una enzima por su sustrato), cuya presencia modifica el patrn de plegamiento del ARN desencadenando su degradacin por una ribozima o por terminacin temprana de transcripcin porque esta estructura secundaria acta como terminador informando a la transcriptasa que debe detener la transcripcin. 14) Qu es el silenciamiento gnico (pre) transcripcional y postranscripcional? En qu organismos se los ha descripto y en cules no? Qu relacin tiene esto con el iRNA (RNA interferente) de moscas o el quelling de los hongos? R: En el silenciamiento transcripcional se produce una metilacin del gen silenciado de una manera que recuerda a la de la impronta gnica (imprinting). En el postranscripcional se forma un complejo entre un ARN corto (small interfering) o micro (micro interfering) y una ribonucleasa llamada Dicer que desencadena una degradacin selectiva del ARN especfica-

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mente silenciado. Es lo mismo que la interferencia y el quelling y se ha descripto en todos los eucariotas en los que se lo busc.

Problemas:
1) El mapa del opern lac es: I P-O Z Y A El promotor (P) es el sitio donde se une la RNA polimerasa antes de comenzar la sntesis de mRNA. El operador (O) es donde se une el represor (en ausencia de inductor) codificado por el gen I. Dados los genotipos de los siguientes diploides parciales, completar la siguiente tabla con "+" si espera actividad de la protena codificada por "Z" (-galactosidasa) y de la coGenotipo
I+ P+ O+ Z + Y+ / I+ P+ O+ Z+ Y+ I- P+ O- Z + Y- / I+ P+ O+ Z- Y+ I+ P- O- Z - Y+ / I- P+ O- Z+ YIs P+ O+ Z + Y- / I+ P+ O+ Z- Y+ Is P+ O+ Z + Y+ / I- P+ O+ Z+ Y+ I- P+ O- Z + Y- / I- P+ O+ Z- Y+ I- P- O+ Z + Y+ / I- P+ O- Z+ YI+ P+ O+ Z - Y+ / I- P+ O+ Z+ Y-

dificada por "Y" (permeasa) o con "-" si no espera actividad. Considere que las mutaciones indicadas por "-" impiden: que las correspondientes regiones no codificantes del opern se unan al ligando especfico. que las correspondientes regiones codificantes del opern puedan originar por traduccin una protena biolgicamente activa. Is: gen del represor con una mutacin que origina una protena incapaz de unirse al inductor (pero su capacidad de unirse al operador est intacta). Permeasa sin lactosa con lactosa

galactosidasa sin lactosa con lactosa

2) La fig. muestra la estructura de un plsmido El gen R del fago lambda codiR PL fica un represor, que reprime la transcripcin de cierPRT Zrev tos genes del fago controlados por el promotor/operador PL; pero en este caso, R tiene una mutacin tal que la protena codificada resulta termosensible: reprime a 30C, pero no reprime a 42C porque su estructura 3-D se altera dramticamente. El gen R lleva su propio promotor PRM que, a los efectos de este problema, consideraremos constitutivo. El gen Zrev contiene la secuencia codificante de la -gal de E.coli en orientacin antisentido con respecto a su promotor: PL. Con este plsmido se transforman mutantes de E.coli con distintas caractersticas genotpicas, las cuales se detallan en la tabla a completar con "+" o con "-", segn si espera o no actividad enzimtica. Actividad -gal genotipo pls30 C 42 C mido s/IT PG c/ITPG s/IT PG c/ITPG I-P+O+Z+ Si + - + + I PO Z No I-P+O-Z+ Si I+P+O-ZSi IsP+O+ZNo I-P+O+Z+/ Si I+P+O+ZPara aquellos casos en los que indic que no hay actividad de -gal, indique adems para cada uno si se debe a: I- inhibicin de la transcripcin II- inhibicin de la traduccin III- Produccin de una -gal inactiva

3) En ausencia de glucosa, E. coli puede metabolizar y crecer en arabinosa (una pentosa), usando un grupo de genes inducibles que estn dispuestos en tres grupos en el cromosoma. En uno de stos, los genes araA, araB y araD codifican para enzimas del metabolismo de la arabinosa, mientras que el gen araC codifica para una protena constitutiva regulatoria que se une cerca de los promotores del opern arabinosa y coordina la expresin de los genes del mismo (los otros dos grupos de genes estn involucrados en el transporte de arabinosa). Para entender las propiedades regulatorias de la protena araC se asla una mutante con una delecin total de ese gen. Como se muestra en la tabla siguiente, la mutante no expresa el producto de araA cuando se agrega arabinosa al medio. Producto del gen araA Genotipo sin arabinosa con arabinosa 1 1000 araC+ 1 1 araCSugieren estos resultados que la protena araC es un regulador positivo o negativo del opern arabinosa? 4) La ribulosa bisfosfato carboxilasa (abreviada "rubisco") es una enzima localizada en el interior de los cloroplastos. Permite fijar CO2 en la sntesis de triosas en el estroma cloroplstico. Rubisco est formada por dos tipos de subunidades, la subunidad grande (LSU), codificada en el genoma del cloroplasto, y la subunidad chica (SSU), codificada en el genoma nuclear e importada desde el citoplasma, ensambladas entre s dentro del cloroplasto con ayuda de una chaperona. El estudio de la regulacin de la expresin de los genes LSU y SSU despert el inters de muchos investigadores. Con el objeto de encarar en un futuro, la produccin de plantas transgnicas con genes de resistencia a virosis reguladas por luz, se realiz el siguien-

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te experimento: se tom un fragmento de ADN ubicado entre -973 y -4 bp del gen de la SSU de papa (por convencin, se denomina +1 al sitio de iniciacin de la transcripcin) y se lig ro arriba de la secuencia codificante del gen de origen bacteriano de la cloranfenicol acetil-transferasa (CAT). Con esta construccin se transformaron protoplastos de hojas de tabaco y se las someti a condiciones de luz u oscuridad. Luego de varias horas, se aisl ARN para analizar la expresin de CAT dentro de esos protoplastos, mediante Northern blot usando como sonda el gen CAT. Los resultados fueron:

Luz Oscuridad

d) Finalmente, se realiz la siguiente construccin: el fragmento de -973/-722 de SSU se fusion en los sentidos posibles ro arriba del promotor (P) del gen nopalina sintetasa (nos). Este gen se expresa en vegetales. Esta construccin se fusion ro arriba de la regin codificante del gen CAT. Luego de transformar a los protoplastos con cada una de las 2 construcciones se hizo Northern, todo bajo las mismas condiciones que antes (ver fig. abajo) luz (-90/-4) eliminado oscuridad luz (-973/-90) eliminado oscuridad luz (-973/-722) eliminado oscuridad
e) De acuerdo a los resultados obtenidos, Qu tipo de

Posteriormente se eliminaron los siguientes fragmentos del gen, y con cada una de las nuevas construcciones se transformaron protoplastos y se sometieron a las mismas condiciones, de los que se aisl ARN para hacer nuevos Northerns. a) Qu conclusiones se pueden sacar con respecto al papel de las secuencias de SSU manipuladas? b) Qu conclusin se puede sacar del hecho que los protoplastos fueran de tabaco y no de papa?
-973 -772

SSU

P nos

luz

cat

oscuridad luz

-772

-973

SSU

P nos

cat

oscuridad

c) Podran haberse usado protoplastos preparados a elemento regulatorio est contenido en la secuencia partir de races de tabaco? 973/-90 aislada del gen SSU? 5) Imagine que las sin-herculitis son una serie de enfermedades genticas en humanos producidas por defectos recesivos en la expresin del gen de la herculina, una protena asociada al desarrollo y tono muscular.
Gen sano Exn 1 500 pb BamHI S 5 kpb 4 kpb 1,5 kb
50 kDa

Exn 2 200 pb BamHI 4000 X2 X3 X4

ayb

Exn 3 800 pb pb S X1 X2 BamHI X3 X4

ayb

1000 pb X1 X2 X3 X4
ayb

X1

1 kpb Southern Northern Western

La enfermedad no es mortal pero se caracteriza por una tendencia a la flaccidez y la pereza. Para analizar los distintos tipos de la enfermedad, se dispone de biopsias musculares de individuos sanos homocigotas, es decir

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no portadores (S) y de enfermos (homocigotas) (X1, X2 , ...), adems de un mapa de restriccin del gen de la herculina, un clon de cDNA de longitud completa y anticuerpos anti-herculina (ver figura de arriba). Otro experimento consisti en la construccin de plsmidos mediante fusin de: la zona 5' de un clon genmico de la herculina de individuos enfermos con un patrn tipo X4 (homocigotas) o de un individuo sano (S) + la parte codificante del gen cat. Y luego se realizaron las siguientes transfecciones: Lnea celular Plsmido Activ.CAT a) Interpretar los resultados caracterizando cada alelo mutante X1, X2, X3, X4(a), X4(b). Fibroblastos 3T3 p5S/CAT --b) Qu fenotipos tendrn individuos hetercigotas con Fibroblastos 3T3 p5X4 (a)/CAT --genotipos S/X1, S/X4(a), S/X4(b) y X4(a)/ X4(b)? Fibroblastos 3T3 p5X4 (b)/CAT --c) Dibujar el resultado de Southerns (con enzima B) de Mioblastos L6 p5S/CAT +++ individuos que sean portadores sanos de los alelos recesiMioblastos L6 p5X4 (a)/CAT +++ vos X1, X2, X3 y X4 (a). Mioblastos L6 p5X4 (b)/CAT --d) En qu casos el polimorfismo de sitios de restriccin con la enzima B ser til para el diagnstico prenatal de la enfermedad? e) Si se crea un ratn transgnico con una copia del gen humano sano completo y sabiendo que el gen sano de la herculina de ratn tiene el siguiente mapa de restriccin para la enzima B, dibujar los resultados de los Southern de ratones sanos (homocigotas) transgnicos y no transgnicos hibridizados con una sonda de herculina humana, a alta y baja sal

B /

1800

B //

5000

B /

6) El Dr. Zapn estudiaba el metabolismo acelerado

de las grasas del hgado. Despus de realizar el relevamiento (screening) de una genoteca (coleccin genmica) de unos 105 clones, logr identificar un clon de 14 kpb aproximadamente que, de acuerdo al tipo de sonda que se haba usado, probablemente contuviera el gen que le interesaba, junto con las secuencias regulatorias adyacentes. Para hacer honor a la verdad, el Dr Zapn estaba especialmente interesado en el estudio de la regin 5' de ese clon, donde sospechaba que se encontraban secuencias 1 2 3 4 5 que interactuaban con factores de transcripcin localizados en los hepatocitos (y que podran ser las responsables de que este gen se activara con slo mirar una taza de chocolate con churros rellenos). Lo cierto es que una fra, lluviosa y aburrida tarde de invierno, el Dr. Zapn se dispuso a probar su hiptesis sobre la interaccin de tal(es) protena(s) con esa regin del ADN. Para ello, tom seis alcuotas de la solucin del fragmento clonado de ADN doble cadena, marcado radiactivamente en uno de sus extremos (p.ej. en la hebra que termina con un -OH 5' fosforilado). Luego someti cada alcuota a uno de los siguientes tratamientos:

- Alcuota 1: Digestin parcial con DNAsa I sin preincubacin con extracto proteico. - alcuota 2-5: Incubacin con cantidades crecientes de extracto de protenas nucleares hepticas, seguido por digestin parcial con DNAsa I. Ms tarde, las corri en un gel de poliacrilamida desnaturalizante, que por ltimo sec y expuso a una placa radiogrfica. Al revelar, vio lo que se observa en la figura: a) Interprete los resultados y proponga un modelo molecular que explique la activacin de la expresin del gen en estudio causada por el chocolate con churros. b) Cree Ud. que el resultado del experimento cambiara dependiendo de si el extracto nuclear heptico hubiera sido obtenido a partir de personas que hubieran recibido o no el estmulo (es decir, mirar o no los churros)? 7) En una investigacin sobre mecanismos que gatillan la expresin diferencial de genes en la determinacin del sexo en moscas se observaron los siguientes patrones en experimentos involucrando Southerns (usando EcoRI), Northerns y Westerns de clulas de machos (m) y hembras (h) cuando se usaron como sondas a secuencias codificantes de a, b y c (de funciones desconocidas).

Southern Northern Western a b c a b c a b c m h m h m h m h mhm h m h mh m h

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a) Interprete los resultados proponiendo qu genes podran estar directamente involucrados y cules no. b) Existe expresin diferencial de algn gen? Cul/es? c) En caso de ser as, proponga mecanismo/s que lo/s gatille/n. 8) Para estudiar los elementos regulatorios presentes en el promotor del gen de hormona de crecimiento humano se realizan una serie de transfecciones con las siguientes construcciones, en las que distintas variantes del promotor dirigen la expresin del gen indicador CAT (cloranfenicol acetil transferesa). a) Cul es la conclusin del resultado obtenido en 2? b) Idem en 3. c) Idem en 4.
- 500 Actividad CAT relativa a 1.
CA

1. 2. 3.

100 % 150 % 10 % 150 %

- 350
CA

- 220
CA
- 350 - 220 - 50

4.

CA

d) Qu caracterstica fundamental debe tener la lnea celular en donde se realizan las transfecciones? e) Qu caracterstica fundamental debe tener la lnea celular en donde se realiza uno de los controles negativos del experimento? Cuando el mismo experimento fue realizado en presencia de un activador de los niveles intracelulares de AMPc se obtuvieron los siguientes resultados: (ojo!, los porcentajes son relativos dentro del experimentos y no entre experimentos, 100% en el primer experimento no es, necesariamente, igual a 100% en el segundo experimento). 1) 100 % 2) 180 % 3) 10 % 4) 60 % f) Evaluando estos resultados, Ud. cree que el AMPc estimula o reprime la expresin del gen de hormona de crecimiento humano? g) En qu regin del promotor se ubicara un posible sitio sensible a las variaciones de los niveles de AMPc? 9) Se desea desarrollar un mecanismo para expresar genes en el cerebro de ratn en un determinado momento de su vida. Para ello Chen y col. disearon una estrategia utilizando el sistema Tet off. El sistema funciona de la siguiente manera: el gen de inters se clona ro abajo de un promotor (PromTetOp) inducible por el factor de transcripcin tTA. A su vez el gen tTA se clona ro abajo de un promotor tejido especfico.La construccin es la siguiente:
PromTetOp Gen de inters PromTej. esp. tTA

Cuando se expresa tTA se induce la transcripcin del gen de inters dado que se une a las zonas regulatorias TetOp. El sistema tiene un paso ms de regulacin: En presencia de tetraciclina, tTA no se puede unir a TetOp debido a un cambio en su conformacin. Esta inhibicin es reversible. Una vez removida la tetraciclina, tTA se puede unir a TetOp. Se disearon ratones transgnicos con las siguientes construcciones: Lnea 1 (pTetOp-luciferasa): Lnea transgnica con una construccin que lleva el gen de la luciferasa ro abajo de TetOp. Lnea 2 (pEnolasa-tTA): Lnea transgnica que lleva una construccin con el gen tTA ro abajo de las zonas regulatorias del gen de la Enolasa (pEnolasa). Lnea 3 (pNestina-tTa): Lnea transgnica con una construccin que lleva el gen tTA ro abajo de las zonas regulatorias del gen de la Nestina (pNestina). Lnea 4 (pActina-tTA): Lnea transgnica con una construccin que lleva el gen tTA ro abajo de las zonas regulatorias del gen de la Actina (pActina). Se cruzaron los ratones pTetOp-luciferasa por cada una de las lneas fundadoras 2, 3 y 4. La F1 transgnica para ambas construcciones (corroborada mediante Southern blot) se utiliz para los ensayos de actividad de luciferasa en diferentes tejidos en ratones de 2 semanas de edad F1 F1 F1 Actividad lucifera- Lnea 1 sola (1x2) (1x3) (1x4) sa 2 semanas. Corteza (cerebro) 4 400 500 2300 Estriado (cerebro) 3 90 1400 2000 hgado 2 6 7 1900 corazn 3 7 6 2150 Nota: los nmeros representan medidas arbitrarias relativas de actividad de luciferasa. a) Teniendo en cuenta los resultados de la tabla, en qu se diferencia la regulacin de los promotores analizados (pNestina, pEnolasa, pActina y pTetOp)? b) Para qu sirve medir la actividad de luciferasa? c) Dibuj cmo espers que sean los Northern blots para Nestina y Enolasa en estriado y en corteza de ratas salvajes de dos semanas de edad. (PM del mensajero de Nestina:1800 bases, PM del mensajero de Enolasa: 3200 bases). Se quiere utilizar este sistema de expresin (TetOptTA) para el desarrollo de una terapia contra una enfermedad neurodegenerativa. El objetivo es expresar una protena neuroprotectora en el estriado de ratas sanas y enfermas en determinado momento de sus vidas y no en otro (NOTA: A las ratas se les puede dar de tomar agua con tetraciclina el tiempo que sea necesario y sta llegar a todos los tejidos). d) Bajo qu zonas regulatorias pondras a la protena neuroprotectora? Qu lnea transgnica utilizaras para hacer el experimento?

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2. GENTICA BACTERIANA
Bibliografia Microbial Genetics, D. Freifelder, Jones and Bartlett Publishers, Inc. Modern Microbial Genetics. Streps U.N. y Yasbin R.E. (1991). John Wiley Sons Inc. Pub. gado de una matriz inerte que sirve de sostn para el crecimiento bacteriano. Esta matriz es por lo general de gar, un polmero extrado de algas, de consistencia similar a una gelatina. El crecimiento bacteriano ocurre sobre la superficie del gar, de forma que los microorganismos no pueden moverse libremente y forman colonias aisladas. Los componentes solubles del medio difunden lentamente, por lo que disminuye considerablemente la competencia entre los microorganismos que comparten el medio de cultivo. El medio slido se suele realizar en cajas de Petri (de varios tamaos y formas), o en frascos chatos (de Roux, utilizados para clulas tipo fibroblastos). Cada microorganismo origina una colonia, que en muchos casos, por sus caractersticas, permite la identificacin del microorganismo que la gener. Los medios de enriquecimiento permiten aumentar la proporcin de un microorganismo determinado en una poblacin heterognea. Para ello debe haber competencia entre las distintas cepas microbianas, de forma tal que aumente la proporcin de aquellas para las cuales el medio de cultivo es adecuado. Es por ello que los medios de enriquecimiento son lquidos, de forma de facilitar la difusin de nutrientes y/o de inhibidores que se utilicen. El medio slido sirve para aislar colonias (clones) individuales (purificar). El medio lquido sirve para obtener masa (gran cantidad) de clulas, por ejemplo, para obtener plsmidos en forma preparativa. 4) Qu diferencia un medio selectivo de medio diferencial. R: Un medio selectivo es aqul donde slo crecern determinadas cepas o especies. Es un caso extremo de medio de enriquecimiento, pero dado que la competencia entre microorganismos no es necesaria, se utilizan medios slidos. Un ejemplo de medio selectivo es el que utiliza un antibitico que slo permite el crecimiento de las cepas resistentes. Un medio diferencial es aquel que permite diferenciar al menos una de las distintas cepas/especies de una muestra. Los medios diferenciales son slidos, para permitir el crecimiento aislado de las distintas colonias, de forma tal que puedan distinguirse. El medio diferencial no impide el crecimiento, simplemente permite diferenciar. (por ejemplo bacterias lac+ vs lac- en presencia de X-gal). 5) Diferencie entre un medio completo y uno definido Para qu los utilizara? R: Medio completo es el que contiene todos los nutrientes incluyendo fuentes de carbono y nitrgeno necesarias para el crecimiento pero no estn bien definidos en su composicin que puede variar levemente de partida a partida. Por ej. la triptona del medio LB es un hidrolizado de casena con tripsina, el extracto de levadura es un extracto soluble de levaduras hidrolizadas. El medio definido, en cambio, contiene componentes y concentraciones de aminocidos individuales y vitaminas (por ejemplo

Gua de Estudio:
1) Cmo es la estructura de una clula bacteriana? Como est organizado su genoma? R: La clula bacteriana (gram-) contiene dos membranas externas que encierran el espacio periplsmico y una pared celular, generalmente de pptidoglucano, que le otorga rigidez y protege de los shocks osmticos. La membrana interna encierra al citoplama, separndolo del periplasma. En el citoplasma encontramos toda la maquinaria necesaria para la sntesis de cidos nucleicos y protenas. La membrana interna es compuesta por una bicapa lipdica mayormente de fosfolpidos, mientras que la externa contiene una hemimembrana interna similar y una capa externa de lipopolisacrico. Las bacterias gram+ no tienen membrana externa y la pared de peptidoglicano es ms gruesa que la de las gram-. Si bien no existe un ncleo, como en las clulas eucariotas, el ADN se encuentra organizado en el nucleoide, que es una masa de ADN y protenas (80% ADN), que puede ser observado por microscopa. El nucleoide contiene dominios cuyo grado de superenrrollamiento no es afectado por los dominios vecinos. Este grado de independencia sugiere que los dominos estn asociados a una matriz que impide que se transfieran las tensiones entre ellos. El cromosoma bacteriano no est tan empaquetado como el de los eucariotas, pero se encuentra asociado a una serie de protenas que cumplen funciones anlogas a las de las histonas, como ser HU, HN-S, Fis e IHF. En la mayora de los casos conocidos, las bacterias poseen un nico cromosoma circular que se replica en forma bidireccional. Pueden contener plsmidos grandes (el factor F o el plsmido Ti, por ejemplo, pueden llegar a tener 200 kpb y pueden servir como vectores para ingeniera gentica: BAC). 2) Cmo se multiplican las bacterias? R: Se reproducen asexualmente por divisin binaria (aunque no es la nica forma). Es asexual y en los libros viejos se la llama fisin). Incluso las bacterias que esporulan (Bacillus y Clostridium) lo hacen asexualmente y son un ejemplo del fenmeno de diferenciacin celular. 3) Qu es un cultivo lquido? Y uno slido? Para qu se utiliza cada uno? R: Medio de cultivo lquido: es un medio que no tiene soporte slido, donde los microorganismos crecen en suspensin y los nutrientes difunden libremente, por lo que existe competencia por ellos entre los microorganismos. El medio lquido se puede realizar en tubos de ensayo (pocos ml), Erlenmeyers (decenas o cientos de ml) o en fermentadores de varias escalas. Medio de cultivo slido: difiere del lquido en el agre-

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biotina para E. coli) perfectamente establecidos y constantes. 6) Qu es la tcnica de plaqueo en rplica (replica plating)? Para qu sirve? R: Cuando obtenemos sobre la superficie del agar de una caja de petri un nmero de colonias, cada una de las cuales proviene de un solo microorganismo y debemos analizar su comportamiento en distintos medios de cultivo, existe la posibilidad de replicar dicha placa de petri. Esto implica obtener otra placa con la misma distribucin de colonias, cada una de las cuales debe ser genticamente idntica a la de la placa madre. Para ello se usa un trozo de terciopelo estril, que cubre un lado de un cilindro del dimetro de la caja de petri. El cilindro se coloca suavemente sobre la caja de petri a replicar, contactando el terciopelo con las colonias. Algunos microorganismos de cada colonia quedarn adheridos al terciopelo, y este se usa a la manera de un sello en una caja de petri vaca. En esta ltima, crecern colonias idnticas a las originales, en la misma posicin. Podramos evaluar, por ejemplo cuales son resistentes a un antibitico determinado, con lo que bastara con preparar una placa con dicho antibitico y hacer la rplica a dos placas, una con y otra sin antibitico. 6) Qu es una placa (playa o calva) de lisis? R: La difusin limitada que se observa en los medios slidos tambin puede ser utilizada para estudiar fagos (virus) bacterianos. Si distribuimos sobre una placa de petri un cultivo denso de bacterias, ellas crecern cubriendo toda la superficie, lo que llamamos csped. Si antes de sembrar la placa, mezclamos las bacterias con una suspensin diluda de fagos, stos infectarn y lisarn las bacterias y en la superficie del gar se observar un halo translcido por cada fago infectivo como consecuencia de la lisis localizada de bacterias. Es decir, las bacterias son el medio de cultivo de los fagos. Esto no slo permite titular (contar) suspensiones de fagos, tambin permite trabajar con ellos en forma anloga a lo que hacemos con otros microorganismos. Existe un mtodo anlogo para estudiar virus animales, aunque eso se hace sobre monocapas de clulas en cultivo. Para obtener un nmero bajo y cuantificable de placas se requiere mezclar un exceso de bacterias con una cantidad mucho menor de viriones (a esto se le llama baja multiplicidad) de manera que la probabilidad de que 2 partculas virales distintas penetren en la misma clula sea insignificante. Despus se plaquean las clulas sobre la caja de Petri. 7) Qu se entiende por "sexo" en organismos procariticos (NO en eucariticos!)? R: A los bizarras formas de transferencia parcial de ADN entre bacterias de la misma o de distinta especie: transformacin, a travs: bacterias muertas que actan como machos (donantes); transduccin, a travs de sus virus; conjugacin: a travs de plsmidos y estructuras de secrecin que conforman puentes celulares.

8) Describa brevemente el mecanismo de conjugacin. Siempre se observa transferencia de informacin gentica cromosmica? R: Se produce entre una bacteria conteniendo un plsmido conjugativo (histricamente denominado Factor F o episoma) llamada F+ y una que no lo contiene. La conjugacin es el mecanismo por el cual una bacteria transfiere a otra una hebra simple de ADN. El mecanismo es similar al de replicacin por crculo rodante (rolling circle). Primero se genera un corte (nick) en una de las cadenas, ms precisamente en la regin conocida como oriT, por origen de transferencia. En el sitio de corte, una helicasa comienza a separar ambas cadenas, a partir de ese punto comienza la transferencia de una de ellas. La transferencia termina cuando se transfiere la secuencia completa (plsmido, por ejemplo) o cuando se interrumpe el contacto entre la bacteria aceptora y la dadora (transferencia cromosmica). En el caso de los plsmidos, cuando finaliza la transferencia se recircularizan utilizando el oriT y la cadena complementaria se sintetiza de novo tanto en la bacteria dadora como en la aceptora. Adems del oriT, los plsmidos transmisibles contienen una serie de genes que son necesarios para la transferencia, los genes tra. Estos genes codifican para el pilus que es una estructura que protruye de la bacteria dadora y hace contacto con la bacteria receptora y facilita la formacin de complejos de secrecin tipo III. Adems del pilus, otros genes tra codifican para protenas que no tienen un rol estructural, como ser la endonucleasa que realiza el corte inicial y la helicasa .Otro tipo de plsmidos que no son transmisibles, pero si son movilizables se encuentran en la naturaleza. Dichos plsmidos no contienen el juego completo de genes tra, pero s contienen la regin mob, que permite que los genes tra de un plsmido transmisible puedan actuar en trans para transferir a los plsmidos movilizables. La regin mob contiene un origen de transferencia y algunas de las enzimas necesarias para la transferencia, como ser la endonucleasa y la helicasa. En el caso ms comn, slo se transfiere una copia (en general completa) del plsmido (ej. factor F) por lo que la clula receptor (F-) se convierte en F+. NO hay tranferencia de genes cromosmicos ni, por lo tanto, aparicin de recombinantes para genes crosomales; a menos que estos se encuentren transpuestos en el Factor F (sexduccin), lo que no es muy comn. Esta forma de apareamiento permite transferir horizontalmente (es decir, incluso entre especies distintas como E. coli y Salmonella typhimurium) genes nuevos importantes como pueden ser los genes de resistencia a antibiticos que pueden ubicarse en plsmidos por la susodicha transposicin. Se observa transferencia de ADN cromosmico en donantes Hfr (factor F cointegrado al genoma cromosomal) o en sexduccin (factor F recombinado = F conteniendo algn gen cromosomal).

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9) Cul es la diferencia entre una cepa Hfr y una F+? R: Hfr proviene de high frequency recombination. El plsmido F tiene aproximadamente unas 100 kpb y codifica para los genes tra que lo hacen transmisible, manteniendo en general una copia por clula. Las cepas F+, son las que contienen el plsmido F como episoma. Como el plsmido F tiene algunas secuencias homlogas a secuencias cromosmicas (transposones llamados elementos IS), en algunos casos ocurren eventos de recombinacin, donde el plsmido F se integra al cromosoma. En estos casos, el oriT y los genes tra siguen siendo funcionales, y promueven la transferencia del cromosoma, que puede llegar incluso a ser completa. La transferencia cromosmica es la causa de la alta frecuencia de recombinacin de estas cepas y de all su nombre Hfr. La cointegracin del plsmido (la cual se produce, usualmente, por entrecruzamiento via recombinasa (rec A combinada con recBCD) entre el cromosoma y el factor F en regiones con secuencias homlogas, usualmente transposones duplicados en ambos ADNs o, ms raramente, como producto de una transposicin sin resolucin). Resolucin quiere decir: separacin de los 2 crculos cointegrados despus de que se produjo la copia o transferencia del transposn entre el crculo de ADN dador al receptor). 10) Qu es un F' y cmo se origina? R: Un F es un plsmido derivado del F que contiene fragmentos de ADN cromosmico. Cuando un plsmido F se escinde de una cepa Hfr (resolucin), en general ocurre por recombinacin entre los sitios IS flanqueantes (los mismos que permitieron la integracin). Hay casos en que los eventos de recombinacin ocurren entre secuencias ms lejanas (otros elementos IS o secuencias homlogas) y el plsmido que se escinde es mayor que el original y contiene el fragmento cromosmico que estaba contenido entre las secuencias que recombinaron. Estos plsmidos F se denominan F. Tambin se pueden generar plsmidos F por otros mecanismos como ser la transposicin.Un F es una forma natural (in vivo) de clonado molecular en un vector plasmdico, sin uso de enzimas de restriccin, muy usada por los genetistas bacterianos. Los genetistas bacterianos suelen utilizar, para ello, un virus-que es, al mismo tiempo, un transposn llamado fago . 11) Cmo determinara orden y distancia entre genes utilizando la tcnica de "apareamiento interrumpido"? R: Cuando una cepa Hfr conjuga con una cepa F-, el ADN se transfiere desde el oriT. Puede llevar ms de una hora y media la transferencia completa, lo que generalmente no ocurre. El ADN transferido puede recombinar con el cromosoma de la cepa aceptora. Dado que en la suspensin, la interrupcin de la conjugacin ocurre durante todo el proceso, la frecuencia de recombinantes cae exponencialmente con la distancia al oriT. La frecuencia de recombinacin para un marcador es entonces una medida de la distancia al

oriT. Para determinar el orden entre dos marcadores se analizan la cantidad de recombinantes dobles. Cuanto mayor es la frecuencia de aparicin de los dobles recombinantes, menor es la distancia entre ellos (menor es la frecuencia de recombinantes entre ellos). Por lo tanto, se hace cronometrando la aparicin de recombinantes en una conjugacin entre una Hfr y una F-que se interrumpe artificialmente con una licuadora a distintos intervalos y que implique la transferencia de alelos diferenciables de los genes a estudiar. 12) Algunos bacterifagos tienen la capacidad de llevar a cabo dos tipos de ciclos dentro de su hospedador. Explquelos y ejemplifique. Qu es un profago o un provirus? R: Existen fagos en los cuales el proceso de infeccin puede tomar por dos vas antagnicas, lisis o lisogenia. En el ciclo ltico, la funciones tempranas y tardas codificadas por el fago son activadas en forma programada originando un gran nmero de partculas virales y provocando finalmente la lisis. En el ciclo lisognico, la mayor parte de los genes virales son reprimidos, el ADN viral se cointegra al genoma bacteriano formando un provirus (llamado profago en bacterias) y se multiplica silenciosamente en la bacteria. Hay procesos externos, como el dao al ADN que producen la activacin del ciclo ltico. Esta cointegracin puede ser mediada por enzimas de recombinacin codificadas por los virus como es el caso de la integrasa del fago que, a diferencia de la recombinasa del husped, produce recombinacin especfica de sitio (una secuencia de ADN llamada attB, presente entre los operones gal y bio de E. coli. Como esto es muy distinto a la recombinacin homloga tradicional, se lo denomina recombinacin ilegtima. El virus HIV (y otros retrovirus eucariticos) tambin tienen una fase proviral. Si bien el mecanismo es ms complejo, los retrovirus son capaces de transducir genes cromosomales (por ejemplo se ha estudiado mucho la transduccin de oncogenes entre clulas eucariticas, al igual que lo hacen los fagos en bacterias). 13) Pueden recombinar los virus entre s? Qu mecanismos estn involucrados? R: S. En los casos de virus con genoma de ADN de doble cadena: recombinacin homloga usando las enzimas de la clula husped. En los virus a ADN de simple cadena, la recombinacin puede realizarse entre las formas replicativas (que son de doble cadena). Hay mecanismos de (pseudo)recombinacin en virus a ARN cuya explicacin excede lo que se pretende ensear en la materia. 14) Describa algunas aplicaciones de la utilizacin de fagos para la ingeniera gentica. R: El fago es un vector ampliamente utilizado en ingeniera gentica en el que el ADN conteniendo los genes codificantes para lisogenia fueron artificialmente reemplazados por ADN (por ej. humano) que es transducido sin posterior lisogenizacin a bacterias

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(que no tienen otra opcin que ser lisadas) para su clonado molecular, conservacin y multiplicacin. Genes de salvaje En recombinante lisis lisogenia lisis lisis inserto lisis 15) Qu es la transformacin bacteriana? Se logra nicamente en forma artificial o tambin ocurre en poblaciones naturales? R: La transformacin bacteriana es un proceso por el cual las bacterias incorporan ADN del medio. Se logra en condiciones de competencia, es decir, cuando las bacterias son competentes para la transformacin. La competencia puede ser natural, lo que se observa en algunas especies o puede ser inducida en el laboratorio. La transformacin natural implica, entre otras cosas, el ingreso de ADN de simple cadena en la clula receptora despus de un reconocimiento por receptores ubicados en la periferia celular, un reemplazo allico en las colonias recombinantes. En la transformacin artificial (tambin llamada transfeccin), las clulas son forzadas a permeabilizar el ingreso de ADN (que suele ser de doble hebra como por ejemplo un plsmido) mediante mecanismos artificiales. E. coli, por ejemplo, no es una bacteria que intercambia ADN por transformacin en la naturaleza y es la bacteria que ms se transforma (= transfecta) en el laboratorio. Se puede esquematizar en un cuadro. 16) Se pueden mapear genes por transformacin? R: S; en forma similar a la transduccin, la eficiencia de cotransformacin es una medida de la cercana de dos loci determinados. Contrariamente a los mapeos utilizando cepas Hfr, pero en forma similar a la transduccin, la transformacin es til para los mapeos finos. Al igual que en la transduccin generalizada, el % de cotransformacin de 2 genes es inversamente proporcional a su distancia. Estos mtodos de mapeo gentico en bacterias han sido totalmente reemplazados, en la actualidad, por mtodos de mapeo fsico por lo que se les prestar menor importancia a la que se le da en los libros de texto. 17) Hermenigildito, el hijo de Eulalia y Casimiro, herva de fiebre y diarrea. El doctor, al observar al infante y sabiendo que muchos tratamientos haban sido ineficaces para controlar esta salmonelosis en otros pacientes, recet un cctel con un antibitico tradicional derivado de la penicilina: ampicilina y otro antibitico sinttico de ltima generacin llamado bacterminator III del prestigioso laboratorio BioTruch S.R.L. (Sociedad de Responsabilidad muy Limitada). Despus de una breve mejora, el prvulo volvi a recaer y el prestigioso mdico dictamin: las bacterias se volvieron resistentes al nuevo antibitico, no es la primera vez que veo que ciertos antibiticos inducen resistencia. Gumersindo, despierto hermano de la vctima, contest prontamente: - pero Doctor a m me ensearon en Gentica I que todas las mutaciones son preadaptativas. Los dems pusieron cara de no entender (o mejor dicho, no entendieron un pepino).

- los agentes selectivos como los antibiticos no inducen la resistencia, la seleccionan, algunas de las bacterias ya eran resistentes antes de que Ud. administrara los antibiticos. Ante la cara de incredulidad de todos los presentes, Gumersindo tuvo que aclarar. a) Qu pudo haber dicho el enigmtico Gmer? Despus de la explicacin, el mdico no qued muy convencido y le dijo: Cmo puede haber resistencias preexistentes a antibiticos con los que estas bacterias jams tuvieron contacto previo? Demustremelo. Gmer llev, entonces, al doctor a la FCEyN y prepar unos menjunjes para cultivar bacterias y le pidi al matasanos aislamientos de bacterias de distintos intestinillos tratados y no tratadas con el nuevo antibitico. b) Qu experimento reprodujo Gmer para convencer al terco galeno? Obviamente, Gmer utiliz para su demostracin bacterias de pacientes que no fueron tratados previamente con el antibitico por qu? c) Gmer aprovech los distintos aislamientos para estudiar la razn por la que estas bacterias eran resistentes a tantos frmacos distintos. l vio que la frecuencia de aparicin de colonias resistentes a bacterminator era de 10-2 y mientras que para la ampicilina (y otros antibiticos), los valores eran de 10-9. Qu concluy Gmer de estos resultados? Cuando busc evaluar colonias simultneamente resistentes a bacterminator y ampicilina, se gast todas las cajas de Petri de la facultad para encontrar apenas una colonia. Con cifras tan bajas era muy difcil explicar lo que le haba pasado a su hermanito. Sin embargo, hasta ese momento, slo haba estudiado la gua de problemas de Mutaciones. Cuando lleg a la de gentica bacteriana se le prendi la lamparita. Se puso a hacer experimentos con el aislamiento de su hermanito (a esa altura, Gmer sufra de una terrible fiebre, haca frecuentes visitas al bao y enflaqueca aceleradamente, vaya a saber porqu motivos). Cuando puso en contacto clulas del aislamiento con una cepa de E. coli Amp- Bac-, en cuestin de minutos fue capaz de aislar colonias de E. coli resistentes a ambos antibiticos con altsimas frecuencias. Sin embargo, Escherichia y Salmonella claramente pertenecen a especies (y gneros) distintos. Gmer no lo pudo explicar porque est en cama y estudiando Gentica para el parcial. d) Podr Ud.? R: a) No existen mecanismos por los cuales los antibiticos puedan modificar el ADN y los genes, slo lo pueden hacer los mutgenos pero de una manera inespecfica (no dirigida a un gen en particular) y no es el caso de los antibiticos. Lo que ocurre es que las poblaciones bacterianas se cuentan por miles de millones, lo que hace que un evento improbable (una mutacin al azar en algn lugar muy preciso de algn gen) se vea representada en una o en unas pocas clulas. Como todas se mueren salvo esos raros mutantes, se tarda un tiempo hasta que estas pocas clulas alcanzan un nmero importante (breve mejora hasta la recada).

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b) Hizo rplicas de placas de Petri sembradas con una suspensin conteniendo numerosas bacterias y que contenan el antibitico y le mostr al mdico que el nmero y la distribucin de las colonias resistentes fue idntica en todas las rplicas, lo que slo es posible si las clulas que originaron dichas colonias ya eran resistentes ANTES de la colocacin del antibitico. Si hubiesen sido inducidas por el antibitico, no existira ninguna razn para que seleccionara el mismo nmero y en la misma ubicacin en repetidas ocasiones. c) Que el antibitico puede ser neutralizado por varios mecanismos de accin diferentes: por una mutacin en un hot spot (nucletido con una frecuencia de mutacin muy superior al resto), por un aumento en el nivel de expresin del promotor que controla la cantidad de la protena afectada, diluyendo el efecto del antibitico; por transposicin del gen que codifica para la protena blanco a un plsmido de alto nmero de copias, aumentando su expresin, modificacin de enzimas con leves cambios (varios cambios diferentes alcanzan para la resistencia), por efecto de varias mutaciones distintas independientes entre s (lo que es lo mismo), etc. d) La conjugacin no suele reconocer barreras de especies. Adems, como lo que se suelen transferir son plsmidos (donde suelen ubicarse los genes de resistencia a antibiticos), ni siquiera se requiere de que los genomas de las bacterias conjugantes tengan homologa muy grande entre s ya que los mismos no se transfieren. La transferencia horizontal de plsmidos que combinan varios genes de resistencia a antibiticos es un conocido mecanismo de apilamiento y dispersin de dichos genes en varias especies de bacterias patognicas. 18) El grfico muestra el resultado de un experimento de apareamiento interrumpido entre las siguientes cepas de E. coli: Hfr: a+ b+ c+ d+ strps X F-: a- b- c- d- strpr

R: a) eje x: nmero de recombinantes / 100 bacterias Hfr; eje y: tiempo en minutos, posterior a la mezcla de los parentales. b) Frecuencia mayor: ms prximos al origen de transferencia. Los marcadores que entran antes estn representados en una proporcin mayor de recombinantes ya que tuvieron ms tiempo para integrarse. c) orden c a d b tiempo 3 4 9 14punto donde cruza eje x (y=0) 3 es el tiempo al cual se transfiere el primer marcador d) distinguir recombinantes a+ b+ c+d+ str R de los parentales Hfr a+ b+ c+ str s. Elimina a cepa dadora. 19) En la hmeda profundidad de la Baticueva, el Hombre Murcilago intenta olvidar su desengao amoroso con una famosa reportera de Ciudad Gtica mapeando una cepa bacteriana hilarante desarrollada en los laboratorios secretos del Guasn. Mientras Alfred le acerca un sabroso vaso de leche cultivada con una bacteria probitica genticamente modificada, el encapotado contempla los datos proporcionados por la BatiPC:
Resultados de la transferencia por conjugacin de material gentico en secuencias diferentes. Se indica tiempo de entrada en un receptor F- (dador Hfr):

50

c + strpr a + strpr

d + strpr b + strpr 5 10 15 20 Min.

a) Defina en forma precisa a las variables del eje X y del eje Y. b) Por qu algunos marcadores alcanzan valores de frecuencias ms altos que otros? c) Deduzca el orden y la distancia gentica en minutos. Qu puntos de la curva utiliz? d) Cul es la utilidad de la resistencia a antibitico que posee la cepa receptora?

genes ja je ji jo tiempo 15 21 32 48 genes ju ji jua jo jue 57 2 tiempo 10 17 22 33 genes jui juo juu ay jo jua 11 33 48 49 60 3 tiempo 6 genes juo jui ja ju 4 tiempo 18 23 35 45 Podr Bruno Daz construir un mapa gentico que incluya todos estos hilarantes marcadores y sealar la distancia de tiempo entre genes adyacentes? No se pierda la continuacin de este batiapasionante captulo, a la misma batihora, por el mismo baticanal y en la misma batimateria. R: JA JE JU JI JUA JO AY JUU JUE JUO JUI y, dando la vuelta, de nuevo JA. De una forma similar a esta se demostr por primera vez la circularidad del genoma de E. coli. Era la nica forma de justificar resultados como stos. Nota sobre el enunciado: las bacterias probiticas (tipo la Lactobacillus casei del Actimel) suelen producir una modificacin favorable o reconstitucin de la flora bacteriana intestinal (por ejemplo por cambio del pH intestinal). No hay evidencia cientfica clara de que produzcan ninguno de los efectos que muestra la publicidad. Es ms, este tipo de publicidad est prohibida en la mayora de los pases del primer mundo. Algunas bacterias del yogur (como el famoso Lactobacillus G de origen francs que comercializa La Serensima) estn genticamente modificadas e incluso contienen genes de resistencia a antibiticos, aunque fueron obtenidos por mecanismos de gentica bacteriana (como en los ejercicios de esta gua ingeniera gentica in vivo) por lo que las legislaciones no los consideran OGMs y los fabricantes (y los ecologis-

cepa 1

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tas) niegan su transgenicidad (fueron obtenidos por mejoramiento convencional y no por ingeniera gentica).

Problemas: 1) Bitcora de vuelo: fecha espacial 1654.9. Habla e1 capitn Kirk. Toda la tripulacin del Enterprise sufre una diarrea infernal. E1 seor Spock afirma que se trata de una extraa bacteria intestinal proveniente de la tercera luna del cuarto planeta de la segunda estrella del sistema Papanpulos XXXIII. Sospecho que la bacteria fue introducida involuntariamente por el seor Cheko despus de la ltima visita a su novia en Nueva Creta. En el tiempo que le queda libre despus de repartir pastillas de carbn, el doctor McCoy logr identificar cuatro genes implicados en la regulacin de un sistema enzimtico. Tambin aisl una mutante: F- a-,b-,c- y d- StrR, la cual normalmente da revertantes a+, b+, c+ o d+ a una frecuencia aproximada de 1 colonia revertante por cada 107 clulas sembradas en el medio selectivo correspondiente. Con esta cepa aisl un clon con las mismas auxotrofas (a-b-c-d-) y con la misma tasa de reversin hacia a+ y d+ pero con una frecuencia de aparicin de revertantes c+ y b+ reducida a niveles no detectables. Se utiliz esta cepa como receptora en un experimento de apareamiento con la Hfr a+ b+ c+ d+ StrS. La figura muestra los resultados obtenidos usando medios selectivos que carecen de a, b, c o d. c + strpr N recomb.

b+ c+ d+ 10 20 30 40 min. Luego se tomaron 100 colonias d+, 100 b+ y 100 c+ de las placas de 30 minutos y se ensay su genotipo para los d+ b+ c+ otros dos marcado+ ----93 93 res. Los resultados d 95 ----100 se resumen en la b+ 92 100 ---tabla. Explique los c+ resultados. 2) Cuando Sledge Hammer le dijo al capitn Tronk: -Confe en mi, s exactamente lo que hago-, a la teniente Dureau se le erizaron los pelitos de la nuca. Entonces Sledge se encerr durante siete das en el laboratorio del cuartel (despus de desalojar a punta de revlver al mdico forense). Cuando sali, Sledge anunci que haba re-

suelto el misterioso caso de los coliformes mutantes. Ms tarde, en una ronda de prensa sensacionalista, Sledge declar: - Bueno, se trataba de un aislamiento de la cepa bacteriana Mgnum 44 la cual es Hfr y Strs y, lo que es ms grave, completamente salvaje. De este condenado germen, aislamos un engendro mutante (F-Strr arg-lac-). La cuestin es que conjugu ambos demonios pero interrumpiendo su disgustante orga a distintos tiempos con lo que logr hacerles confesar lo ms ntimo de sus genes sometindolas a un medio con estreptomicina y suplementados como se indica en la tabla, con el sencillo trmite de contar el nmero de colonias al da siguiente. a) A qu distancia del opern lac mapea el origen de transferencia en la cepa Hfr usada? b) Cules son los ge- N de colonias observadas en notipos de t (min) lac glu arg+lac arg+glu las bacte- 1 0 0 0 500 rias que 5 0 128 0 491 crecen en 10 40 201 58 509 los distintos 15 80 199 127 498 medios? 20 82 203 139 504 c) Porqu los valores de la primer columna son menores que los de la tercer columna? d) Qu estrategia se podra seguir para clonar el gen (salvaje) involucrado en la sntesis de arginina cuya versin defectuosa est en la F-? 3) Se realiz una coinfeccin en medio lquido (a alta multiplicidad densidad- de fagos y sobre una cepa sensible), con dos fagos T4 mutantes: T4m- (playas pequeas) y T4tu (playas turbias). Una alcuota del lisado resultante fue usada para infectar (a baja multiplicidad de infeccin) nuevas bacterias de la misma cepa y se obtuvo un 7% de playas grandes y claras (salvajes). Qu porcentaje de playas pequeas y turbias se habr obtenido? 4) Teodorico Snopolsky permaneci 19 aos en el polo norte, donde se aboc a una tarea que le haba quitado el sueo durante la mayor parte de su vida: obtener bacterias que sintetizaran whisky y ginebra. A continuacin se reproduce una pgina del cuaderno de Snopolsky, encontrado por unos expedicionarios groenlandeses:
Anotacin N 12.506: Para transformar una cepa bacteriana incapaz sintetizar whisky (whi-) y ginebra (gin-) us, por una parte, una mezcla de ADN de dos cepas. Una whi+ gin- y la otra whi- gin+ y, por otra lado, e1 ADN de una cepa whi+ gin+. Obtuve clases transformadas en las siguientes proporciones:

22 ADN donante whi+ ginwhi- gin+ whi+ gin+ whi- gincepa receptora whi- ginclases transformadas whi- gin+ whi+ ginwhi+ gin+ whi- gin+ whi+ ginwhi+ gin+ N colonias 248 175 3 315 201 382

Por las barbas de Mendieta! A qu se debe la aparicin de un mayor nmero de colonias transformadas whi+ gin+ en el segundo caso? 5) Uno de los objetivos de la microbiologa es construir microorganismos recombinantes para que acten como limpiadores del medio ambiente dentro de un ecosistema contaminado, y (1) a (4) cepas de P. putida: TOL
opern Trp

que al terminar su funcin se autodestruyan. Existe un compuesto txico, 3-metil-benzoato (3MB) que es catabolizado por la bacteria Pseudomonas putida. Los genes responsables del catabolismo del 3MB estn organizados en un opern dentro de un plsmido denominado TOL. Los genes de este opern estn regulados positivamente en presencia de 3MB. Construya, mediante conjugacin, una cepa de Pseudomonas putida capaz de destruir al 3MB presente en un lago contaminado, y que esta cepa se autodestruya luego de eliminar el contaminante. Se dispone de los siguientes elementos:

TOL

TOL
p3MB -gal

TOL
p3MB lacI

(1) lac; leu / pTOL / pOpern Trp

(2) leu- / pTOL

(3) leu / pTOL / p[p3MB--gal]; kmR (I) leu; ala-; mob+; tra+ (en el cromosoma)

(4) lac; leu / pTOL / p[p3MB-lacI]; kmR (II) leu; ala-/ pRK2013 (mob+; tra+; bom+; kmR)

(I) y (II) cepas de E. coli

(A) a (C): Plsmidos que poseen origen de replicacin de amplio rango de husped (funciona en II I Pseudomonas y Escherichia), contienen un gen pRK2013 de resistencia a ampicilina y las siguientes caractersticas: - p3MB-gal: promotor del opern que cataboliza el leu+ leu+ leu 3MB a 5del gen de la enzima -galacosidasa. bom A B C bom - p3MB-lacI: promotor del opern que cataboliza plac gef ptrp gef plac gef 3MB a 5del gen del rea) Disee una estrategia para construir (mediante presor del opern lactosa. - lac y leu: La (delta) significa que lo que conjugacin) la cepa de Pseudomonas putida que sigue est delecionado (opern lac o leu, en este sea capaz de metabolizar el contaminante 3MB y caso la delecin involucra tambin al gen del que luego se autodestruya, indicando cules cepas y plsmidos elige y cmo se selecciona la bacterepresor I). ria de inters. - tra: genes de transferencia del plsmido F b) Justifique las/los que descarta. - mob: endonucleasa que corta en la regin bom c) Esquematice mediante un grfico la curva de - bom: origen de transferencia del plsmido F crecimiento (nmero de bacterias en funcin del - ptrp : promotor opern triptofano (otro distinto) tiempo) y el nmero de bacterias en funcin de la - plac: promotor del opern lactosa - gef: es un gen suicida, es decir que codifica concentracin de 3MB. Considere t=0 al lago para una protena que produce la muerte de la conntaminado en el momento del agregado de las bacterias limpiadoras. bacteria cuando se expresa. d) Por qu se debe evitarel escape de la bacteria limpiadora al medio ambiente?

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3. INGENIERA GENTICA Bibliografa: Recombinant DNA, Watson y colaboradores Gua de estudio:

1) Qu significa "clonar" un gen? Defina la expresin "ADN recombinante", "vector" e "inserto" Mencione un mtodo que sirva para reconocer fcilmente colonias de bacterias que llevan plsmidos que contienen insertos. R: Clonar un gen (o una secuencia de ADN) significa sinifica aislarlo de su contexto original y colocarlo en otro contexto donde pueda ser amplificado. Es decir, aislarlo del genoma (por ej. con enzimas de restriccin) para insertarla en un vector (por ej. un plsmido bacteriano) para que, despus de introducida la construccin recombinante en una bacteria como E. coli, se pueda multiplicar esta secuencia para su anlisis molecular (por ej. secuenciacin nucleotdica). El concepto difiere de la clonacin biolgica en el sentido de que ac estamos hablando de un segmento de ADN y no de un organismo completo. 2) Defina la expresin "ADN recombinante" R: ADN recombinante es un trmino que se origin cuando se desarrollaron las primeras tcnicas de Ingeniera Gentica y se refiere a un fragmento de ADN que se origina por la unin in vitro de dos fragmentos distintos, que pueden provenir, inclusive, de especies no relacionadas. Nota: La expresin recombinante (aqu) no es sinnimo de recombinacin homloga porque no hay un intercambio de segmentos homlogos. En todo caso, se parece a la llamada recombinacin ilegtima (como por ejemplo la integracin de fago lambda para hacerse lisognico, ver gua de gentica bacteriana). 3) Qu tipos de vectores de clonado conoce que funcionen en clulas procariotas? y en eucariotas? R: Vector se refiere a un fragmento de ADN que tiene la capacidad de replicarse en un determinado husped y , como el tmino lo indica, puede servir de vehculo para multiplicar otro fragmento de ADN que haya sido fusionado al mismo. Inserto se refiere a un fragmento de ADN que se fusiona al vector; en general representa el ADN de inters, que fusionado al vector puede replicarse en el husped adecuado En clulas procariotas hay plsmidos y fagos. Los primeros con circulares y tienen un origen de replicacin que permite que se repliquen y se mantengan en la clula. Los hay de alto y bajo nmero de copia. Los fagos pueden ser utilizados como vectores, donde el ADN se inters debe ser insertado en el genoma del fago. En ambos casos se puede tambin diferenciar a los vectores de expresin, ya sean fagos o plsmidos, que tienen promotores y terminadores que flanquean al inserto, de forma de producir un mRNA y la protena correspondiente. En clulas eucariotas tambin hay vectores virales y plsmdicos. Estos ltimos slo se se parecen a los bacterianos naturalmente en levaduras. En clulas de

mamferos se los ha fabricado articialmente utilizando orgenes de replicacin y replicasas de origen viral (como los plsmidos derivados de SV40 en clulas cos). Muchos de ellos fueron modificados para incorporar orgenes de eplicacin de E. coli para as poder replicar tambin en bacterias. Por eso se los denomina: de combinacin (shuttle). En levaduras tambin se desarrollaron cromosomas artificiales (YACs), que fueron los primeros en utilizarse para clonar grandes fragmentos que fueron secuenciados en los albores de la genmica estructural. Posteriormente fueron sustitudos por otro tipo de vectores com los BACs (Bacterial Artificial Chromosomes). 4) Qu es una genoteca (o library genmica) y cmo se construye? Qu diferencia tiene con una clonoteca (habitualmente llamada library) de ADNc (cDNA)?Cmo se realiza una bsqueda, prospeccin, relevamiento (habitualmente llamado screening)? Cmo se puede marcar una sonda? R: Genoteca o genomoteca es una biblioteca de ADN donde, en vez de colecciones de biblios. (que significa libros) dispongo de colecciones de segmentos de genomas. En general son especficas de un organismo determinado. Se utiliza ADN genmico que se corta ya sea con enzimas de restriccin o por mtodos fsicos y se liga a un vector, que puede ser un plsmido, un fago o un BAC. Este material se utiliza para transformar bacterias competentes o para infectarlas, si se utiliza un fago. La poblacin de bacterias obtenidas representa a todos los posibles fragmentos del ADN genmico original. En el caso de la library de cDNA se utiliza ADNc en lugar de ADN genmico, pero el proceso es similar, salvo que no es necesario cortar el ADNc. Hay varias formas de marcar sondas, las que numeramos a seguir. Random priming: se incuba el fragmento con una poblacin de oligonucletidos (hexmeros y/o octmeros) en presencia de fragmento Klenow (fragmento de la ADN polimerasa de E. coli), dNTPs, alguno de los cuales est marcado y Mg++. Despus de un proceso de desnaturalizacin y renaturalizacin se agrega la enzima, los oligonucletidos se unen al ADN y son utilizados como sustrato por la enzima. Nick translation: si una de las cadenas de un plsmido se corta exponindo un extremo 3OH, la ADN polimerasa I utiliza ese extremo como sustrato e inicia la sntesis de ADN, desplazando a la cadena existente, y corriendo el nick. Aqu tambin se lleva a cabo la reaccin con dNTPs, alguno de los cuales est marcado y Mg++, adems de la ADN Polimerasa I de E. coli. Marcacin terminal: se puede marcar el extremo de un fragmento utilizando una quinasa especfica y ATP marcado en gama. PCR: la reaccin de PCR puede utilizarse introduciendo un dNTP marcado en la reaccin o utilizando

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un primer previamente marcado en su extremo 5 con una cinasa. Ribroprobes: con el plsmido adecuado , en presencia de una ARN polimerasa como la T7 y de ribonucletidos, se puede transcribir un gen in vitro y marcarlo pasa ser utilizado como sonda. En el caso de las genotecas, se llama screening a la bsqueda del clon que contiene el fragmento de nuestro inters. Existen esencialmente dos formas. La primera es utilizar un fragmento y oligonucletido de nuestro gen marcado. Este fragmento se hibrida con una membrana obtenida de una placa de petri conteniendo mltiples colonias o playas de lsis, dependiendo del vector utilizado. El ensayo es anlogo al Southern blot. La marca (sea radiactiva o no radiactiva) indicar las colonias o placas positivas, las cuales se pueden recuperar de la placa madre. La segunda forma es utilizar una forma de detectar la protena expresada, en caso de los vectores de expresin. En general puede hacerse utilizando anticuerpos que detectan la protena producida y nos darn la posicin de la colonia o playa de lisis positiva, en un ensayo que es anlogo al de un western blot. 5) Cul es la diferencia entre una transformacin y una transfeccin? R: En animales, transformacin se refiere a la conversin de una clula o tejido en neoplsico, por lo que no es correcto sinonimizarlo con transfeccin. En bacterias, tambin es preferible decir transfeccin porque la transformacin natural que vimos en gentica bacteriana tiene diferencias con la artificial que se usa en ingeniera gentica. En plantas son sinnimos. 6) En qu situaciones usara Ud. las siguientes enzimas?: retrotranscriptasa ligasa Taq polimerasa DNAasa I RNAsa H R: RT: Es una ADN polimerasa dependiente de ARN por lo que se la usa para fabricar ADN a partir de ARN por ejemplo en el proceso de clonado molecular de ARNm. Nota: raramente se la puede usar como ADN polimerasa dependiente de ADN cuando hay dificultades en la secuenciacin manual de regiones con estructuras secundarias que dificultan la accin de las ADN polimerasas tradicionales. L: Para ligar fragmentos. Para unir un inserto a un vector. Taq pol: en PCRs. DNAasa I: para cortar ADN en forma inespecfica, por ejemplo para introducir los nicks en la marcacin por nick translation. RNAsa H: para eliminar la hebra de ARN despus de la accin de la tanscriptasa reversa. 7) Se quiere clonar el gen de una protena que se expresa en cerebro de ratn. Ud. no tiene, ni puede llegar a saber, la secuencia de aminocidos de la prote-

na y depende exclusivamente de anticuerpos. Qu tipo de genoteca usara para comenzar?: a) una genmica hecha con ADN obtenido de cerebro de ratn? b) una genmica obtenida de hgado de ratn? c) una de ADNc hecha con ARNm de corazn en pBR322? d) una de ADNc hecha con de ARNm de cerebro en pBR322? e) una genmica de expresin hecha en el fago gt11 hecha a partir de ADN de ganglios linfticos de ratn? f) una genmica de expresin hecha a partir de ADN genmico obtenido de cerebro de ratn? g) una de ADNc de expresin hecha en fago gt11 a partir de ARN de cerebro de ratn? R: La opcin g) porque es en el tejido en el que el ARNm es ms abundante 8) Qu es la mutagnesis dirigida in vitro? Mencione algn procedimiento para lograrla, uno usando clulas y el otro sin usarlas. R: Suponiendo que la secuencia que quiero mutar se encuentra entre 2 sitios de restriccin de tipo cohesivo dentro de un plsmido, puedo digerir con la enzima y religar para obtener una delecin. Otra: teniendo la secuencia clonada en un plsmido, se la desnaturaliza con calor (para obtener ADN de cadena simple) e hibrida (anilla) con un oligonucletido sinttizado artificialmente de forma de tener una secuencia complementaria, salvo por un nucletido (que es el que interesa modificar) y que est ubicado en el centro del oligo. El ADN heterodplex (tiene una base mal apareada o missmatch) se incuba con una ADN polimerasa que usa el oligo como iniciador (primer) para completar la cadena complementaria. Transformo bacterias con el plsmido heterodplex y su replicacin dentro de la clula originar 2 molculas hijas: una normal y la otra mutante. Un ejemplo de mutagnesis usando clulas es el reemplazo allico que se produce en un experimento de knock out de un gen. 9) Cul es la diferencia entre una transfeccin transitoria y una estable? En qu casos se utiliza la primera? R: En la transitoria (no se dice transiente) el ADN ingresa al ncleo y se expresa, pero no se integra al cromosoma. Despus de un tiempo se degrada o se pierde por dilucin a medida que no puede acompaar la replicacin del ADN cromosmico. Se usa para determinar ms rpidamente la especificidad y nivel relativo de expresin de un promotor. 10) Cules son los mtodos ms comunes para transfectar clulas animales?En qu casos o aplicaciones se utilizan la transfeccin de clulas animales cultivadas in vitro versus la de animales transgnicos? R: Coprecipitacin con fosfato de Ca (el ms antiguo, en desuso), microinyeccin (dem), electroporacin, liposomas e infeccin con vectores virales.

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Aplicaciones industriales-farmacolgicas (algunas comunes otras distintas en ambos casos) = molecular farming. Mejoramiento (aunque no hay casos de esto ltimo a nivel comercial). 11) A qu se llama organismo "transgnico" u OGM u OVM? D ejemplos. Las definiciones son necesariamente artificiosas y arbitrarias porque no basta con decir que se trata de un organismo que contiene ADN procedente de otra especie o forneo. Todos los cultivos modernos tienen esta caracterstica debido a que fueron mejorados mediante cruzamientos interespecficos y hasta intergenricos (el trigo, por ejemplo, fue cruzado con el centeno para incorporarle genes de resistencia a enfermedades fngicas) por lo que seran transgnicos. Por lo tanto, se denomina as a los organismos obtenidos por biotecnologa moderna, entendiendo por biotecnologa moderna a la ingeniera gentica y a la fusin celular entre clulas de especies que no se pueden cruzar entre s. OGM es nomenclatura del Codex-FAO, OVM del Protocolo de Bioseguridad del Tratado de Cartagenadependiente del Convenio de Biodiversidad de PNUMA (Prog. Nac. Unidas Medio Ambiente). 12) Qu utilidad tiene el plasmido Ti de Agrobacterium tumefaciens? R: El plsmido Ti contiene lo que se conoce como regin T, que es la regin que la bacteria transfiere a la planta en el proceso de infeccin, y otra que contiene los genes vir que se requieren en trans para que la regin T pueda ser transferida. En los primeros ensayos de obtencin de plantas transgnicas, la regin T se modific, agregando los genes de inters y manteniendo los bordes derecho e izquierdo que son importantes para la transferencia. De esta forma se logr transferir un ADN de inters a plantas. En este momento se utilizan plsmidos Ti desarmados, es decir, que no contienen la regin T, en conjunto con plsmidos pequeos que contienen los bordes de la regin T, flanqueando los genes de inters. Este tipo de plsmidos se denomina binarios y permiten que la manipulacin sea mucho ms simple que con el plsmido Ti completo ya que este ltimo tiene aproximadamente 250 kpb contra las 10 kpb de los plsmidos binarios. 13) Qu tipo de plantas se suelen transformar con el plasmido Ti de Agrobacterium tumefaciens y cuales por mtodos biolsticos y por qu? R: Si bien es posible utlizar ambos mtodos con todo tipo de plantas, las dicotiledneas suelen ser transformadas con Ti mientras que las monocotiledneas lo son por el mtodo biolstico debido a que existen grandes diferencias en su eficiencia relativa. Esto es as porque estas ltimas no son huspedes naturales de Agrobacterium. 14) A qu se llama "vacuna recombinante"? Hay alguna en el mercado? R: Vacuna recombinante es aquella producida por mtodos de ADN recombinante. En general consiste en la produccin del gen codificante para un antgeno

(protena recombinante) en un sistema viral heterlogo. El antgeno funciona como vacuna cuando logra despertar en el organismo una respuesta inmune que lo protege del ataque del patgeno que lleva ese antgeno. Un ejemplo muy utilizado es la vacuna contra la Hepatitis B. Vaccinia- rabia. Retrovirus felino para perros.... 15) Qu significa "terapia gnica"? R: Es una terapia que implica el uso de vectores para lograr introducir ADN conteniendo un gen funcional en clulas de un paciente con el propsito de revertir los sntomas de una enfermedad, generalmente producida por un gen defectuoso. 16) Cules son los riesgos para el ambiente y para la salud humana que pueden traer estas tecnologas? R: Las inquietudes, algunas genuinas, otras no tanto, pueden agruparse en 3 categoras: a) Potenciales efectos sobre la salud humana y animal (toxicidad, alergenicidad, transferencia horizontal de resistencia a antibiticos, ingestin de ADN forneo que modificara nuestra constitucin gentica, utilizacin de secuencias de ADN de origen viral) b) Potenciales consecuencias ambientales (dao a especies ajenas al proceso, como la mariposa Monarca; la aparicin de insectos resistentes; que el cultivo se convierta en una supermaleza; que haya flujo de genes desde cultivos a malezas; que las protenas transgnicas se difundan en el ambiente; que disminuya la biodiversidad y otros semejantes). c) Preocupaciones de tipo poltico, econmico o social: concentracin de beneficios monoplicos en empresas, particularmente multinacionales; limitacin de acceso a la biodiversidad gentica por un patentamiento concebido como apropiacin comercial no tica; avasallamiento del derecho de agricultores; acrecentamiento de brechas sociales y productivas entre productores pequeos y grandes; crecimiento de una agricultura industrial poco sustentable, en detrimento de prcticas que lo sean; dificultades de la coexistencia con la agricultura orgnica. Un riesgo que se debe considerar como de ocurrencia probable, es que el uso generalizado de plantas resistentes a plagas y herbicidas seleccione la aparicin de insectos y malezas capaces de superar dicha resistencia (ver problema de gentica de poblaciones en el anexo). La experiencia acumulada en 20 aos de comercializacin masiva del primer producto derivado de un OGM, la insulina humana, y en 10 aos de cultivos, no parece indicar que la mayora de estas inquietudes se puedan fundar genricamente en la tecnologa. Es decir, un OGM no conlleva riesgo por ser tal, si bien podra tenerlo por el transgn especfico que lleve incorporado. Debido a ello, los organismos nacionales e internacionales de anlisis y regulacin estudian caso por caso el producto final. Por ejemplo, los riesgos de soja con resistencia a herbicidas son distintos que los de maz con el mismo gen incorporado por ingeniera gentica (o transgn), o a los de soja con otro transgn. Es ms, los sistemas regulatorios

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suponen razonablemente que una soja resistente a un herbicida como resultado de acciones de ingeniera gentica tiene idnticos riesgos ambientales que una obtenida por mtodos convencionales. Los riesgos alimentarios se evalan de acuerdo con procedimientos bien establecidos y aceptados internacionalmente. Adems de analizar su toxicidad y su degradacin en jugos gstricos sintticos, se realizan pruebas de equivalencia entre alimentos derivados del cultivo convencional y otros preparados con el OGM. Si bien el riesgo de que los transgenes se incorporen por cruzamiento a otras plantas de la misma especie o de especies relacionadas demostr ser real, los perjuicios, segn se encontr, fueron ms comerciales que ambientales. En todo caso, la incidencia real de estos riesgos est muy lejos de obligar a la consideracin de un abandono de los cultivos OGMs. Por otro lado, se comprob que, a pesar de la demora en la liberacin de desarrollos realizados por instituciones pblicas de OGMs con caracteres que favorecen a los productores ms pequeos, stos tambin se beneficiaron notablemente al cultivar los OGMs de primera generacin. 17) Qu pas en Asilomar en la dcada del 70? Qu conoce del tema de la bioseguridad del manejo de OGMs en Argentina y en el mundo? Lo de Asilomar est en el Recombinant DNA de Watson: Poco despus de que se descubrieran las enzimas de restriccin y se produjeran las primeras molculas recombinantes, cuando an no exista Greenpeace, los propios cientficos plantearon inquietudes de bioseguridad del tipo: qu pasara si una E. coli (habitante habitual del intestino humano) recombinante con un oncogn se escapa al ambiente e infecta la humanidad? A partir de ese momento se disearon laboratorios con distintos niveles de seguridad: desde P1 (muy bajo) para trabajar con plantas (no se las consideraba peligrosas) hasta P4 (parecido a la pelcula epidemia, igual nivel de seguridad que para trabajar con bola). Posteriormente se demostr que la excesiva cautela no fue justificada y los niveles de seguridad se restringieron al nivel del problema estudiado, ms que a la metodologa. Es ms, hoy se considera ms seguro trabajar con secuencias clonadas de patgenos (como el HIV) que trabajar con el patgeno. La Secretara de Agricultura, Ganadera, Pesca y Alimentos public en su sitio de internet un documento donde responde a las preguntas que frecuentemente se hace la gente sobre los transgnicos: http://www.sagpya.mecon.gov.ar/new/0-0/programas/biotecnologa/respuestas.php Para ms informacin sobre el sistema regulatorio en Argentina: http://www.sagpya. mecon.gov.ar/new/0-0/programas/ conabia/index.php

Problemas: 1) Se desea clonar el gen que codifica a una entomotoxina proteica con propiedades insecticidas que se encuentra en Bacillus thuringiensis (bacteria del suelo originalmente aislada de insectos muertos), pensando en producir soja transgnica

resistente a lepidpteros. Para cumplir con la primera etapa del objetivo planeado, se cort el DNA total de B.t. con MboI en cantidad limitante (tubo 1). Por otra parte, el plsmido Bluescript (parecido al pUC19) fue incubado con BamHI (tubo 2, ver tabla de sitios de reconocimiento en la gua 1 y comparar BamHI y MboI). Despus se mezclaron los contenidos de los tubos 1 y 2 en presencia de ligasa, incubndose durante la noche a 16 C (tubo 3). Luego se transformaron clulas competentes (permeabilizadas con CaCl2) de una cepa de E. coli que era RecA-, AmpS, lac- en presencia de ampicilina, IPTG y X-gal (X-gal es un sustrato cromognico de la -galactosidasa que da un producto azul). Como la relacin entre colonias blancas y azules result apropiada, se decidi continuar haciendo rplicas de las colonias en filtros de nitrocelulosa. Finalmente, los filtros se revelaron con un anticuerpo anti-entomotoxina, mediante el mtodo del segundo anticuerpo conjugado a fosfatasa alcalina. Diga si es verdadero o falso y fundamente el razonamiento: a) Los extremos generados por BamHI no pueden ligarse a extremos generados por MboI. b) Se utiliz BamHI porque la enzima universalmente reconoce los codones de iniciacin de todos los genes permitiendo su correcta insercin en el vector utilizado con respecto a su posicin respecto del promotor lac. b) La ampicilina sirvi para seleccionar bacterias transformadas. c) La ampicilina sirvi para seleccionar bacterias transformadas con algn plsmido recombinante (es decir plsmido con inserto). d) Las colonias que llevaban algn plsmido recombinante (es decir con inserto) son azules. e) Dado que la maquinaria transcripcional de E. coli es similar a la de B.t. fue posible encontrar algunos clones positivos que contenan el gen de la entomotoxina completo (incluyendo su promotor) orientado en cualquiera de las dos sentidos respecto al vector. 2) Utilizando como sonda un cDNA de la subunidad mayor del receptor de GABA (un neurotransmisor) y empleando condiciones de baja rigurosidad, se aisl a partir de una genoteca de E. coli un fragmento de DNA conteniendo un marco de lectura abierto con cierta similitud de secuencia con la sonda usada. Con el objeto de identificar la funcin de este gen (la cual seguramente no es recibir neurotransmisores) se utiliz la siguiente estrategia: El plsmido pAMPR (ver Fig.) fue digerido con la enzima de restriccin Cla I y el fragmento de 1,6 kpb conteniendo el gen de la -

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lactamasa (enzima que hidroliza a la ampicilina y confiere resistencia a este antibitico) fue purificado e introducido en el sitio Cla I de pTETORF (ver Figura) Este plsmido contiene el fragmento clonado (ORF) y un gen (tet r) que confiere resistencia al antibitico tetraciclina. La replicacin de pTETORF es termosensible, funciona a 30C y se inhibe a 42C. Cla I ampR pAMPR 5 kpb

Cla I
pTETORF

ORF Cla I

6 kpb El plsmido recombinante obtenido, pTETORFAMP, fue amplificado por transformacin a 30C en una cepa de E. coli recA- (incapaz de hacer recombinacin homloga) competente y, luego, introducido por transformacin en una cepa de E. coli salvaje (recA+). Las bacterias fueron cultivadas a 42C durante 15 horas en presencia de ampicilina y luego una alcuota fue sembrada en gar conteniendo medio rico y ampicilina. Se hizo un plaqueo en rplica hacia una placa conteniendo el mismo medio ms tetraciclina. Las colonias resistentes a ampicilina y sensibles a tetraciclina fueron utilizadas en los ensayos siguientes. A-Cul es el objetivo del protocolo? Por qu fueron elegidas las bacterias ampr tets? Hubiera bastado con determinar la resistencia a ampicilina?Por qu? B-Qu hubiera pasado si las bacterias hubieran sido cultivadas a 30C? C-Qu ensayos hara para confirmar que las mutantes aisladas tienen el genotipo esperado? Una vez confirmada la mutacin, obtenemos como primera conclusin que sta no parece afectar la capacidad de la bacteria para crecer en medio rico. (D- De dnde saca esa conclusin?). El experimento siguiente fue plaquear las bacterias mutantes en medio mnimo. No se encontraron diferencias respecto de las salvajes en nmero ni en morfologa de colonias. Luego de tanto tiempo de trabajo infructuoso y, con tal de tener un resultado, los investigadores decidieron mapear por conjugacin el locus ORF aprovechando las caractersticas de la mutacin introducida. E-Que caracterstica de las mutantes facilita el

mapeo del locus ORF? Podra hacerlo si no la tuvieran? Muchos aos despus, un joven e inquieto estudiante de biologa, buscando tema para su tesis de Licenciatura, rescat de una congeladora esta vieja mutante y se propuso caracterizarla. Su razonamiento fue: si este gen no es esencial en condiciones de crecimiento normales, quizs sea necesario en condiciones de estrs (calor, fro, hiperosmoticidad, hipoosmoticidad). Haciendo curvas de crecimiento en medio lquido en estas condiciones, encontr que la cepa mutante mostraba una marcada deficiencia (comparando con la salvaje) para crecer a temperaturas mayores a 45C. Al mostrarle este resultado a su ya decrpito director ste lo desanim dicindole que seguramente tanto tiempo en la heladera haba introducido nuevas mutaciones en la cepa. Aunque extraado el estudiante enseguida pens y realiz un experimento que despej toda duda sobre la causa gentica de la deficiencia de la cepa congelada. F- Cul fue el experimento realizado? 3) Disee una estrategia detallada para expresar anticuerpos monoclonales contra el virus de la diarrea infantil (un rotavirus) en leche vacuna, usando las tcnicas de uso comn en ratones transgnicos. Para ello dispone de la lnea celular necesaria (hibridoma) produciendo dichos anticuerpos, todo tipo de variantes de bacterias y vectores utilizados en ingeniera gentica. 4) El tema de las patentes de secuencias nucleotdicas es polmico, particularmente en el caso de las secuencias humanas. Para analizar el tema se analiza el caso de la patente No. 4943674 de Calgene en Estados Unidos que protege a secuencias nucleotdicas de unin de factores transcripcionales especficos de fruto. La patente protege todo uso de estas secuencias en cuanto a su uso en la obtencin de plantas transgnicas que provoquen CUALQUIER tipo de cambio fenotpico en el fruto de CUALQUIER planta (desde vid, sanda, citrus, peras, cerezas, ciruelas, etc. hasta tomate, pepinos y zapallos). Para sustentar el reclamo, la empresa provee una serie de datos experimentales. A partir de una clonoteca (coleccin de clones) de cDNA diferencial se clon y caracteriz la secuencia codificante para la poligalactouronasa (PGU). Esta enzima se sintetiza en los tomates maduros y ataca la pared celular produciendo el ablandamiento del fruto, proceso no deseado comercialmente. La concentracin del mRNA para PGU aumenta ms de 2000 veces cuando se compara la concentracin en tomates rojos (maduros) con la de tomates verdes (inmaduros) por

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lo que hipotetizan que la regulacin del gen es fundamentalmente a nivel transcripcional. Posteriormente, clonaron y secuenciaron el gen completo de la PGU (incluyendo su promotor) e hicieron una construccin en la cual invirtieron la orientacin de la secuencia codificante la cual introdujeron en plantas de tomate (transgnicas para la misma). Como consecuencia, se transcribe un RNA complementario al mRNA para PGU que al formar una doble cadena con el mRNA bloquea su traduccin (esta forma de inactivacin de la expresin de genes se denomina estrategia RNA antisentido). De esta forma se obtuvo el tomate FlavSav (con mucho aroma y sabor) que constituy la primera planta transgnica comercializada a nivel mundial. i) Describa cmo obtuvieron la clonoteca diferencial. ii) Describa cmo clonaron el gen PGU completo. iii) Describa cmo hara para demostrar en forma ms precisa, usando secuencias indicadoras (reporteras), el control transcripcional ejercida por este promotor. No olvide detallar construcciones, vectores, mtodos de transformacin, evaluacin de la expresin, etc. iv) La descripcin de la patente viene acompaada por la secuencia nucleotdica completa del promotor del gen de la PGU. Sin embargo la empresa se preocupa particularmente en proteger no slo la secuencia completa sino tambin cualquier fragmento parcial de la misma por qu? v) La secuenciacin del gen incluy al terminador del gen. Sin embargo, a diferencia del promotor, la empresa no solicita su proteccin mediante esta patente por qu? vi) Si Ud. fuera funcionario de la oficina de patentes y le toca evaluar esta presentacin particularmente en cuanto a la amplitud de la proteccin solicitada (derechos extensivos a todas las plantas, por ej.) qu experimentos adicionales solicitara para sustentarla? 5) En la pelcula de los expedientes secretos X, se plantean una serie de situaciones cuya verosimilitud sera interesante constatar. Al principio de la pelcula (30.000 aos AC) un virus extraterrestre infecta a un humano primitivo. Posteriormente, ya en el presente, los "malos" de la pelcula tratan de multiplicar este virus para su transmisin de varias formas (en una escena la agente Scollie se infecta al ser picada por una abeja transmisora del virus). En otra parte de la pelcula se comenta que el virus est siendo producido (biotecnolgicamente) en unos maces "transgenticos". Imagine que resulta contratado por una activa organiza-

cin ecologista tratando de demostrar el peligroso uso de estas plantas transgenticas como arma biolgica de produccin de virus activos, cmo hara para demostrar que tales plantas pueden realmente ser producidas? Dispone para ello de viriones aislados de un picornavirus (virus de RNA+ a los que pertenecen, por ej. el virus de la poliomelitis, el de la fiebre aftosa. y que se caracterizan porque a partir de su genoma se traduce una nica protena autoclivable postraduccionalmente -poliprotena-) y todos los recursos posibles a su alcance. i) Detalle cada uno de los pasos del clonado de secuencias necesarias y de las construcciones genticas que realizara para su posterior introduccin en maz por ingeniera gentica. ii) Indique por qu va introducira esta construccin en maz y justifique brevemente. iii) Cmo seleccionaria las plantas transformadas? iv) Qu herramientas moleculares y biolgicas utilizara para confirmar que el virus se produce en esas plantas? 6) La hormona del crecimiento (HC) es una protena que se sintetiza y se secreta en la glndula pituitaria. La expresin de este gen depende de un factor de transcripcin especfico llamado Pit-1, el cual reconoce la secuencia de ADN (T/A)NCTNCAT. Adems de Pit-1, existen otros elementos regulatorios que juegan un papel importante en la expresin de este gen como CRE, GRE y TRE, cuyas secuencias de reconocimiento son conocidas. La zona promotora del gen HC de pollos (HCp), no ha sido tan bien estudiada como la de mamferos. Se describieron slo 500 pb de la regin promotora del gen HCp, lo cual no permita realizar un anlisis profundo de la regulacin de la transcripcin en esta especie. Ip, S et al. (Exp.Biol.Med 229: 640-649, 2004) decidieron entonces estudiar ms extensamente esta zona regulatoria, y lograron identificar un fragmento de 1,8 kbp de la regin promotora de HCp. a) Describa cmo le parece que hicieron los autores para clonar el gen completo de HCp (zona reguladora de 1,8 kpb + region codificante). Qu sonda/s habrn utilizado? b) Cmo se le ocurre que los autores determinaron los posibles sitios de unin de Pit-1 y de otros elementos regulatorios? Los resultados revelaron dos sitios de reconocimiento de Pit-1 en el fragmento de 1,8 kpb. : uno proximal 113/-104 pb y el otro distal 541/-533 pb, y un posible motivo TRE (CAATGAGGTA) a 137/128. Para caracterizar funcionalmente la

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zona 5 del gen HCp, se realizaron ensayos de transfeccin in vitro usando como gen reportero al gen de la luciferasa. c) Qu consideraciones cree Ud. que se deberan tener para elegir un gen reportero? d) Que construcciones genticas los autores podran haber utilizado para el ensayo de transfeccin? e) Qu clulas pudieron haber utilizado para el ensayo de transfeccin? Qu control/es considera Ud. que los autores deberan haber realizado? Con los ensayos de luciferasa concluyeron que la zona entre 187/+48 pb es la secuencia mnima para tener la mayor actividad promotora. Luego, para determinar si los sitios proximales y distales de unin de Pit-1 eran ambos funcionales, midieron actividad de luciferasa en el fragmento de 1,8 kbp al cual le haban introducido, previamente, mutaciones en la zona distal, proximal o ambas. Los resultados se muestran en la siguiente figura.
-1727pb -541pb -113pb + 48pb Act. Prom relativa a 1
LUCIF.

resistencia a enfermedades virales tiene larga data. Las primeras transgnicas resistentes a virosis, lo fueron por expresin de funciones (protenas) virales (como la cpside) las cuales interfirieren la estrategia de multiplicacin de los virus. Tambin se intent bloquear la traducibilidad de los mensajeros virales expresando secuencias de ARN complementario (llamadas de orientacin antisentido). En los ltimos tiempos se enfoc en el aprovechamiento del mecanismo de defensa llamado silenciamiento post-transcripcional mediante la expresin de secuencias nucleotdicas virales. En un trabajo reciente, Vazquez Rovere y col. (Arch. Virology 146:1337, 2001), obtuvieron papas transgnicas que expresaban las siguientes 3 construcciones genticas conteniendo el gen de la replicasa del virus PLRV (ORF2b):

100

Pit-1
LUCIF.

80

LUCIF.

100 80

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motivo ADN salvaje motivo de ADN mutado

Secuencia codificante del gen de la enzima luciferasa. f) Cmo interpreta Ud. estos resultados? Finalmente compararon las zonas regulatorias del gen HC de pavo (HCv) con las de HCp. Encontraron que dichas zonas en ambas aves tienen un 90% de identidad de secuencia. Sin embargo, informaron que existe poca similitud entre estas zonas del gen HCp y las zonas regulatorias de HCm (mamferos como rata y humanos). g) Qu le sugieren estos resultados? 7) La ingeniera gentica de plantas para conferir
LUCIF.

Aclaraciones: ATG-rep: Construccin que contiene el gen de la replicasa con el codn de iniciacin (ATG AUG); No codific-rep: Idem sin ATG; Anti-rep: construccin antisentido (la secuencia se encuentra invertida); RB y LB: bordes derecho e izquierdo del segmento T de Agrobacterium tumefaciens; 35S, mas5: promotores constitutivos fuertes; t-nos, mas3 terminadores de transcripcin; ORF2b: gen de la replicasa; nptII: gen de resistencia a kanamicina; Flechas: indican la orientacin en la direccin 5 3de la secuencia. a) Para qu se us el gen de resistencia a kanamicina?

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Las plantas transgnicas fueron desafiadas con el virus y se encontraron plantas con resistencia (y tambin con susceptibilidad) con cualquiera de las 3 construcciones. Para caracterizar el mecanismo que media esta resistencia, se bombardearon hojas de las papas transgnicas utilizando un can gnico y una construccin que codifica para una protena de fusin GUS::replicasa (Fig. 2, la GUS -glucouronidasa es detectable en forma similar a la -lac). La fusin, sin embargo, afecta parcialmente la actividad enzimtica. Es decir, la enzima funciona un poco peor, pero funciona. De esta forma se consigue la expresin (transitoria) de las construcciones genticas bombardeadas en las clulas impactadas y su fcil visualizacin en forma de puntos azules (fig.2). Nota: No se grafican las transgnicas con la construccin ATG-rep porque dan casi igual que las no codific-rep. b) Para qu se hicieron los experimentos de la Fig. 2? Interprete los resultados: i) Cmo me doy cuenta de cunto afecta a la actividad GUS la fusin con la replicasa? Qu resultados comparo para evaluarlo? ii) Para qu sirven, adems, los experimentos realizados con la construccin 2 (GUS slo)? iii) A qu atribuye las diferencias entre A1 y A2 y entre S1 y S2? Qu relacin tiene con la resistencia? iv) Cul mecanismo (mediado por protena, mediado por bloqueo de la traduccin antisentido-, mediado por silenciamiento posttranscripcional) media la resistencia?
Aclaraciones:GUS-rep:construccin gentica capaz de expresar una protena (y su mRNA) de fusin GUS+replicasa, GUS: Idem slo GUS. uid-A: gen codificante para GUS; A1 y A2 son 2 plantas transgnicas representativas para la construccin antisentido (Anti-rep); S1 y S2 plantas con la construccin sentido (no codific-rep). (S) y (R) representan plantas susceptibles y resistentes. Ken (NT) es un control de la misma variedad de papa que el resto (Kennebec) pero no transformada.

4. GENMICA Y POSTGENMICA

Gua de estudio 1) Para qu sirven los marcadores genticos (moleculares y no moleculares)?

R: Para mapear. Existen distintos mtodos de mapeo: fsico y gentico. Los mapas fsicos se construyen a partir de la secuenciacin del ADN y otras tcnicas moleculares, como el mapeo con enzimas de restriccin (como se vio en la gua 1 Biologa Molecular-) usando o no Southern blot, la hibridacin in situ, la alineacin de insertos genmicos clonados en BAC y YAC, caminatas cromosmicas, comparacin sintnica de genomas filogenticamente relacionados, etc. Los mapas genticos se construyen a partir de anlisis de ligamiento en poblaciones segregantes posteriores a la recombinacin y sumando distancias entre loci sucesivos lo ms prximos posibles (ver gua 7 de mapeo). Ambos mapas no coinciden en cuanto a las unidades utilizadas (nmero de nucletidos o pares de bases versus unidades de recombinacin) ni en las distancias relativas (las frecuencias de recombinacin no son parejas a lo largo de todo el cromosoma), pero s en el orden de los marcadores. 2) Compare el uso de marcadores genticos moleculares, bioqumicos y morfolgicos. R: Su uso para mapeo gentico es similar, salvo cuando los marcadores morfolgicos estn determinados por ms de un locus (epstasis) o son de distribucin

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continua (cuantitativos). Pero an en estos casos existen formas de utilizarlos que se vern en otras guas. Los marcadores morfolgicos pueden verse influidos por el ambiente, el momento de desarrollo, el rgano y otros factores. A menos que se conozca su base molecular (secuencia nucleotdica) no pueden ser usados para mapeo fsico (salvo que sean marcadores citogenticos = morfologa cromosmica). Los marcadores bioqumicos (fundamentalmente patrones de electroforesis de protenas e isozimas), tienen particularidades intermedias. 3) En qu medida los marcadores moleculares permiten relacionar los mapas genticos con los mapas fsicos? R: Una serie de clones solapados se denomina contig. Para formar el contig, se emplean secuencias cortas y nicas presentes en los insertos clonados como si fueran marcas distintivas (por ejemplo, un sitio de restriccin en el contexto de la secuencia nucleotdica de un gen que se puede revelar mediante un RFLP). Esas marcas especficas se denominan STS (sequencetagged sites). Es decir que un RFLP determinado puede ser un STS. Debido a lo tedioso y poco automatizable de la tcnica de RFLP, como usualmente se conoce la secuencia nucleotdica, se la convierte en una tcnica basada en PCR llamada CAPS. Como estos mismos RFLP (CAPS) pueden mapearse en poblaciones segregantes, esto permite superponer el mapa gentico con el mapa fsico. 4) Cmo clasificara de acuerdo a la metodologa a las distintas tcnicas conducentes a obtener marcadores genticos moleculares (RFLP, AFLP, RAPD, SSR, SNP). Haga una comparacin entre ellas. R: Los RFLP fueron los primeros marcadores de ADN en ser utilizados. Surgen de comparar los patrones de restriccin de Southern blot entre distintos individuos, especies, etc. observando diferencias (polimorfismos) en sitios de corte. Debido a que se basan en la hibridacin molecular lo que permite el reconocimiento entre secuencias que no son totalmente homlogas, se los considera marcadores relativamente conservados que permiten comparaciones evolutivas entre especies, gneros y familias relacionados (dependiendo de la secuencia, se puede progresar en la escala taxonmica hasta ms arriba). Se continan usando en estudios de sintenia (mapeo comparativo). Como contrapartida, resulta ms complicado encontrar variabilidad (polimorfismos informativos) intraespecficos para hacer, por ejemplo, genotipificacin (identificacin a nivel de individuo o fingerprinting). Hoy en da, los RFLPs han sido desplazados en gran medida por los SNPs (polimorfismo de nucletido simple nico-, se pronuncia SNiP). Los SNP no tienen una nica metodologa como los RFLP sino varias, aunque todas ellas requieren de PCR en alguno de sus pasos. Cualquier tcnica que permite visualizar un cambio en un nucletido se clasifica como SNP. Como ejemplo ya se mencion a los CAPs que implican la amplificacin y posterior digestin del producto

de PCR con una enzima de restriccin (aquel que fuera responsable del polimorfismo en el RFLP). Hoy en da, los polimorfismos a detectar son identificados a partir de estudios previos de secuenciaciones genmicas ms que de RFLP. No todos los SNPs requieren restriccin. Otra tcnica bastante clsica clasificada como SNP es la SSCP que consiste en desnaturalizar el ADN y diferenciar electroforticamente las diferencias de migracin de los plegamientos secundarios intracatenarios derivados del cambio nucleotdico. Estos marcadores ofrecen varias ventajas respecto de los RFLP: a) existe mayor nmero de alelos en la poblacin (en humanos se stima que hay un SNP cada 1000 pb) y b) el grado de heterocigosis es alto, con lo que resultan ser ms informativos. Comparten con los RFLP la ventaja de no ser annimos (se conoce su identidad secuencia, pertenencia a un gen, por ej.-) y su codominancia (posibilidad de diferenciar heterocigotas de homocigotas). Los otros marcadores de mayor utilizacin (junto con los SNPs) son los microsatlites o SSR (single sequence repeats) estn constituidos por un motivo (secuencia corta de ADN) de repeticin en tndem de di-, tri y tetranucletidos. La repeticin ms comn es la del dinucletido CA en animales y TA en vegetales. Aqu lo que vara no es un nico nucletido, sino el nmero de veces en que se repite el motivo de repeticin, lo que es detectado como productos de amplificacin que poseen tamaos que varan segn la cantidad de repeticiones. Son los marcadores ms utilizados para genotipificacin (tambin llamado genotipado o fingerprinting). Los RAPDs (randomly amplified polymorphic DNA, se pronuncia RAPiD) son marcadores moleculares que surgen luego de utilizar un nico oligonucletido iniciador (primer) en la reaccin de PCR. Son polimorfismos para fragmentos de ADN amplificados al azar del genoma, obtenindose una serie de bandas de distintos tamaos segn donde se haya pegado ese primer. Este conjunto de bandas sirve como una huella de ADN que puede emplearse para caracterizar a un individuo. Se dice que es al azar pues se utilizan primers que no se sabe en qu lugar del genoma hibridan. Por eso se dice que son annimos porque se desconoce la secuencia y (salvo mapeo especfico) su localizacin cromosmica. Como son oligonucletidos de 10 bases, en general pegan en varias regiones del genoma, por lo que al correr el producto de la PCR en geles de agarosa, generalmente se observan varios fragmentos, que miden hasta 2 kpb. Otra desventaja es que son marcadores dominantes (no se puede diferenciar al heterocigota del homocigota) y problemas de reproducibilidad. Su mayores ventajas son los costos y la posibilidad de usarlos con cualquier genoma de cualquier especie aunque se desconozca absolutamente todo de su secuencia genmica. Al igual que los RFLPs, se los puede mejorar secuenciando y convirtiendo en marcadores de PCR especfica (en este caso se llaman SCARs). Los AFLP representan una sofisti-

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cacin ms reproducible que combina restriccin con endonucleasas y amplificacin selectiva por PCR. Si bien comparte desventajas y ventajas con los RAPD (son dominantes y annimos, no requieren de informacin genmica previa), son ms costosos pero su mayor costo se ve compensado por la generacin de muchas ms bandas polimrficas por corrida (data points) y mayor reproducibilidad. restriccinPCRhibridacindominantesCodom. RFLP + + + AFLP + + + RAPD + + SSR + + SNP +/+ +

4) Cul es el origen de la variacin genmica (mutaciones) detectada por cada una de ellas y cul es su magnitud?
sustitucinINDELHiperAltaConservado RFLP + + AFLP + + RAPD + + SSR + + SNP + + -

Aclaraciones: sustituciones: cambio de nucletidos, INDELs: Inserciones o DELeciones, Hiper: hipervariables (altsima tasa de mutacin/evolucin, mximo polimorfismo), Alta: variacin, Conservado (particularmente cuando afecta secuencias funcionales codificantes) 5) Suponiendo que en un genoma dado las 4 bases posibles se encuentran representadas en forma similar y totalmente al azar (contenido de GC = 50% uniformemente distribuido a lo largo del genoma): a) Cul es la distancia promedio esperable entre sitios de restriccin para enzimas que reconocen especificidades de secuencia de 6 pares de bases, como EcoRI? y para una de 4 o de 8 pb? b) Cuntos sitios de restriccin y, por lo tanto, bandas de DNA en un gel, se generaran en un genoma humano (109 pb), bacteriano (106 pb), o mitocondrial humano (104 pb) se generaran con EcoRI? c) Cuntas bandas generaran los RAPD que usualmente se hacen con decmeros y se detectan por PCR?
R: a) Un sitio de restriccin de 6 bases aparecer, como promedio, una vez cada 46 bases, es decir 4.096 pb. Una de 4 ser cada 44 pb = 256 pb, uno de 8 pb ser de una cada 65.536 pb. b) 109 dividido por 4x103 = 250.000 bandas o sitios para el genoma humano; 250 para una bacteria y entre 2 y 3 para el genoma mitocondrial. c) Por un lado debemos considerar que los sitios complementarios a los primers tienen que ser perfectos (los 10 nucletidos tienen que ser perfectamente com-

plementarios, lo que no es necesariamente cierto). Por lo tanto la distancia se podra calcular como para los sitios de restriccin 410 = 1.048.576. En un genoma humano habra 1000 sitios, en uno bacteriano, uno slo. De todos modos, para que haya bandas se requieren 2 condiciones adicionales: que las orientaciones estn invertidas y apuntando hacia adentro entre primers vecinos (se reduce a un cuarto = 250 y la distancia media aumenta a 4 millones) y que la distancia sea menor a los 4000 pb porque la Taq polimerasa deja de funcionar eficientemente ms all de este tamao. La probabilidad de que 2 sitios distintos estn en una posicin arbitraria es de uno en 410 x 410 = 42x10 = 1.099.511.627.776 ~ 1012. Sabiendo que las distancias para una amplificacin detectable varan entre un poco menos de 100 y aproximadamente 2500-2600 pb, la probabilidad de encontrar 2 secuencias en alguno de esos nucletidos es 44-2x10 x 2500 = 10-12 x 2,5.103 = 2,5 x 10-9, lo que significa que espero encontrar entre 2 y 3 bandas por genoma de organismo superior por primer, es decir que de las 250 bandas potenciales, slo el 1% est a la distancia necesaria para dar bandas amplificables. Sin embargo, el nmero de bandas observadas es mayor, debido a que no es requerida una complementaridad de bases perfecta en las condiciones de anillado de los primers.

6) Qu ventajas tendra el usar enzimas que son sensibles (no cortan) a la metilacin de citosinas en el sitio de restriccin (como es el caso de PstI) y que ocurren con enorme frecuencia en el DNA heterocromatinizado de organismos eucariticos?
R: Si lo que se busca es clonar genes transcripcionalmente activos este comportamiento es una ventaja porque slo se clonara aquello que es digerido por la enzima. El DNA metilado dara fragmentos demasiado grandes para ser detectado o clonado (el DNA de muy alto peso molecular se transfiere pobremente a filtros en los Southerns y por su tamao no puede ser clonado eficientemente en los vectores ms comunes, entre otras razones). Tambin serviran para diferenciar alelos epigenticos (como los que estn en el cromosoma X en mujeres) o diferencias de estados del gen entre tejidos expresantes (hipometilados) versus silenciados (hipermetilados). 7) En qu consiste el clonado posicional y el "caminado cromosmico"? Para qu se utiliza? Clonado posicional: El clonado posicional se utiliza cuando no se dispone de otra informacin del gen que se desea clonar ms que su posicin cromosmica relativa respecto a un marcador molecular. La idea es poder disponer en el mismo inserto clonado en un vector, tanto el gen deseado como la secuencia del marcador molecular o en algn otro vector de secuencia vecina contigua (contig). Este tipo de clonados fueron posibles a partir de la aparicin de vectores que permiten clonar segmentos de ADN grandes (200.000 bases hasta 1.000.000 de bases) como los BAC y YAC.

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Caminado cromosmico: Los extremos de un fragmento clonado se usan como sondas para seleccionar otros clones de la genoteca. Estas sondas detectan clones de regiones del ADN que se superponen con el clon inicial Se aisla un pequeo segmento de ADN de un extremo del material, se inserta en el primer clon y se lo usa como sonda para volver a rastrear la genoteca en busca de un clon que contenga ese segmento y la secuencia contigua del genoma. Con el segundo clon se puede obtener un tercero, y as sucesivamente, hasta tener un conjunto de segmentos clonados que se solapan. Permite el clonado posicional. Es decir, conociendo la localizacin del gen y disponiendo de uno vecino clonado, se puede aprovechar esta vecindad para as clonarlo.

8) Cmo se encara un proyecto genmico? Por dnde se empieza? Qu tipo de vectores de clonado son los ms habitualmente usados?
R: Como no se puede secuenciar sobre los cromosomas (la longitud de ADN es muy larga y el ADN est mezclado) lo primero que debo hacer es segmentarlo en fragmentos manejables por las actuales tcnicas moleculares. Esto se hace en 2 etapas: primero se clona en vectores que permiten insertos grandes (BAC y YAC) y a stos ltimos se los subclona en vectores con insertos ms pequeos (fagos y plsmidos). Ahora bien, al segmentar un genoma pierdo el ordenamiento lineal que tena el ADN en el cromosoma por lo que tengo que organizar los clones en grupos de contigs y as rearmar el ordenamiento perdido. Esto se logra mediante mapeo fsico y gentico por lo que, en realidad, todo proyecto genmico comienza siendo un proyecto de mapeo.

9) Qu es el transcriptoma y los EST? Cmo se construyen y para qu sirven?

R: Como el procedimiento arriba descripto es largo, laborioso y a veces econmicamente inviable, se procede paralelamente (o exclusivamente) por otra va que aporta, adems herramientas que son necesarias para el mapeo. En este procedimiento se privilegia la secuenciacin de lo que ms interesa y que son los genes. Como los genes (a diferencia de las secuencias intergnicas no codificantes) se transcriben, una forma es armar clonotecas de ADNc de distintos tejidos y en distintas situaciones ambientales y fisiolgicas y secuenciarlas en forma grosera y masiva. De esta manera se obtiene una coleccin de secuencias representativas del transcriptoma denominadas EST (expressed sequence tags o secuencias expresadas) de las cuales se desconoce mayormente su funcin. En muchos casos, esta funcin puede deducirse en base a la homologa de las secuencias con las de genes caracterizados en otras especies mediante bsqueda y comparacin con las bases de datos de los bancos de genes. Estos ESTs pueden usarse para el diseo de micromatrices (chips de ADN) y para mapeo por RFLP/SNP y servir como marcas ancladas (STS).

10) A qu se llama genmica funcional y anlisis de proteoma? En este contexto para qu se usa el etiquetado mediante transposones o transposon-tagging? Qu son los microarreglos o microarrays y chips de DNA? Para qu se usan? Qu tcnicas para la caracterizacin de interacciones protena-protena conoce? Problemas: 1) El famoso detective Sherlock Molecularis se encuentra investigando un asesinato. La pista determinante del caso es una mancha de semen encontrada en la ropa de la vctima, de la que pudo extraerse DNA, el cual se someti a corte por una enzima de restriccin apropiada y posterior electroforesis, cuyo Southern blot se analiz por hibridacin con el fago M13 (sonda de Jeffreys, Nature 314 [1985]: 67-72). En un carril paralelo se corri, en idnticas condiciones, una muestra de DNA de linfocitos del sospechoso Jack Destripadorius. En la figura se muestra el resultado de la correspondiente autorradiografa: I.- Si Ud. fuera Watson (no James), cul de las siguientes afirmaciones creera correcta para asesorar a Sherlock?: a) Jack es presumiblemente culpable porque la sonda hibrida tanto con el DNA de la mancha como con el de Jack. La diferencia en el patrn de bandas se debe a que el semen contiene gametas y estas reflejan la constitucin haploide. Para confirmar la culpabilidad habra que repetir el anlisis con una muestra de semen de Jack. b) Jack no es culpable porque los patrones son diferentes a pesar de que ambos DNAs hibridan con la sonda y comparten buena parte del patrn de bandas. c) El presunto culpable pas a ser el hermano prfugo de Jack (con antecedentes policiales) porque el patrn de bandas de Jack no coincide, pero las bandas comunes (aproximadamente la mitad de todas las bandas) hacen sospechar de l. Se requiere, sin embargo, un anlisis del DNA del joven escurridizo para confirmar esta hiptesis. II.- Dado que estas secuencias son tan hipervariables (muy polimrficas), se supone que la tasa de mutacin (creacin de nuevos alelos por el mecanismo de recombinacin desigual o por deslizamientoresbalamiento de la DNA polimerasa) en

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gametas es considerable (se calcula un = 0,001). Cree Ud. que se puede usar este tipo de anlisis para tests de paternidad? III.- Qu % de bandas coincidentes se esperara encontrar, comparando los patrones de bandas de personas relacionadas por los siguientes parentezcos?: - madre e hijo - abuelo y nieto - to y sobrino 2) Mediante hibridacin in situ, se pudieron localizar 5 YACs de DNA humano (YAC-A a YACE) en una regin cromosmica determinada del genoma humano y se desea hacer un mapa fsico de alineamiento de dichos clones (mapa de contigs). Los 5 clones fueron evaluados mediante hibridacin con 3 STS (sequence-tagged sites o sitios de secuencia indicadora marcadora-) . Para obtener los STS, se digiri DNA con una enzima de restriccin y se construy una genoteca en fago lambda con los fragmentos resultantes. Se analizaron varios de los clones de esta genoteca mediante hibridacin con DNA genmico humano, descartando todos aquellos clones que hibridaban con DNA repetitivo. De aquellos que hibridaban con secuencias nicas, se seleccionaron 3, los cuales se hibridaron con los YACs obtenindose los siguientes resultados: a) Por qu no se trat de hacer Southerns con los YAC y realizar un mapeo por restriccin de esta manera? Porqu no hibridar directamente los YAC entre s, evitando recurrir a una subgenoteca en fago lambda de los mismos? Por qu se descartaron aquellos clones de la genoteca en fago lambda que no hibridaban YAC con secuencias nicas? STS A B C D E b) Dibuje un mapa fsico 1 + + + - con la alineacin de los 3 2 - + + + STS y ordene (en parale- 3 + + - - + lo) el mapa de contigs de los YACs. 3) La levadura fue la primera de las especies eucariticas que fue totalmente secuenciada y constituye un sistema modelo de investigacin debido al tamao relativamente chico de su genoma y el nmero tambin relativamente chico de genes. Se sabe que hay ~6000 genes codificantes para protenas, de los cuales hay 2400 para los que no se tiene ni idea de qu funcin cumplen. Uno de los temas que siempre concit inters es el proceso de esporulacin (que en levaduras est asociado a la meiosis). La misma se puede controlar y sincronizar con relativa sencillez ya que se incuban

levaduras diploides en un medio con deficiencia de nitrgeno, lo que dispara la meiosisesporulacin. La misma ocurre en 3 fases bien diferenciadas. La I o temprana, en la que se abandona el estado vegetativo para pasar al esporulado. La II o media, coincide con la meiosis I. La III o media-tarda coincide con la meiosis II. Previamente a la aparicin de los arreglos de DNA (DNA arrays) o chips de DNA, se haban identificado, mediante los cada vez ms obsoletos Northern blots unos 250 mRNAs. Con la llegada de los chips, el nmero cambi drsticamente (Chu y col. 1998, Science 282:699). Se prepar mRNA total de cada una de las fases y se hibrid contra las secuencias de los 6000 genes. Se identificaron 256 genes que se activan especficamente durante la fase I. En la gran mayora de ellos se identific la secuencia: 5GGCGCC3 a 600 pb del nucletido 1 del gen, en direccin 5. a) Qu le sugiere este resultado? Se identificaron 158 genes adicionales especficos de la fase II, de los cuales, el 70% tienen otra secuencia consenso denominada MSE. Adems, aparecieron otros 61 genes especficos de la fase III. Finalmente, una observacin curiosa fue que 600 genes que se encontraron activos en la fase vegetativa no pudieron ser detectados durante todo el proceso de esporulacin. b) Tendr algn inters este ltimo dato? c) Podr hacer una estimacin de qu proporcin de los genes est implicado, directa o indirectamente con el proceso de esporulacin? d) A qu se dedica el resto de los 6000 genes? 4) Pas sin llamar mucho la atencin una pelcula estrenada hace unos aos llamada GATTACA (que no debe su nombre a una gata muy agresiva sino a una secuencia nucleotdica y a la vez nombre de un centro de viajes al espacio del futuro cercano). Suponemos que como buen estudiante de Gentica, ya la habr visto en su momento y comentado hacindose el canchero/a con todas sus amistades que no tienen nada que ver con la biologa. Se trata de

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un tpico thriller con ambiente de ciencia-ficcin que se plantea un escenario futuro muy inquietante (ms detalles en: http://www.spe.sony.com/Pictures/SonyMvies/ movies/Gattaca/home.html). Gracias a la tecnologa del genoma humano, se podr predecir con bastante precisin las probabilidades de morir, por ejemplo, de un ataque cardaco antes de los 30 aos. Hasta aqu nada nuevo que no hayan destacado todos los diarios comentando las posibilidades de la ciencia real a partir de la secuenciacin del genoma humano. La pelcula avan-za en otro aspecto que es la posibilidad de planificar la composicin gentica (a-lelos) de los hi-jos de una pareja. No lo hace en un sentido tan declaradamente fascista (que todos sean arios, rubios y de ojos azules estilo Los nios de Brasil), sino tratando de evitar los alelos de la llamada carga gentica (alelos que predisponen a enfermedades coronarias, cncer, neurolgicas, etc.). No se trata de clonar un Hitler o un premio Nbel, sino de elegir entre los futuros hijos posibles disponibles, los mejores alelos del padre y la madre del futuro hijo/a, sin despreciar los clsicos color de ojos, coeficiente intelectual o altura. a) Le parece que esto sea factible en la ciencia real? Si Ud. fuera un cientfico convencido de las bondades de liberar a la especie humana de su carga gentica, basndose en las tcnicas que aprendi sobre clonacin e ingeniera gentica en animales (que no es este caso) Cmo diseara un sistema de anlisis de este tipo? b) Si bien en una parte de la pelcula, en menos de 5 minutos pueden generar un largo diploma con la secuencia nucleotdica de una muestra sacada de un pelo, an en el mejor escenario futuro (en el sentido cientfico), no se podrn secuenciar los 30.000 genes humanos para una aplicacin masiva como la mencionada Qu tipo de marcadores moleculares tendra que utilizar para esta deteccin? Podr detectar todas las mutaciones posibles? Discuta este punto. c) Despus de resolver el ltimo problema de la gua de mutaciones le parece que librar a la humanidad de todos los alelos deletreos es un objetivo alcanzable por mejoramiento? Para premiar la planificacin gentica familiar, la sociedad de GATTACA se divide en 2 clases bien diferenciadas. Aquellos que fueron planificados tienen acceso a los mejores empleos, mientras que aquellos que son hijos del azar son considerados invlidos o de-generados y slo pueden ser barrenderos o tener

profesiones mal pagas. En la pelcula, una familia tiene 2 hermanos (uno de cada clase). El hermano no planificado genticamente inferior logra engaar al sistema y acceder a un buen empleo aprovechando la complicidad de una persona genticamente calificada que le da muestras de tejido (de su DNA, bah). Todo va bien hasta que se produce un asesinato y.... no le vamos a contar la parte sustanciosa de la pelcula (por si Ud. no es tan buen estudiante de gentica, an no la vio y quiere hacer buena letra alquilando el video para resolver este problema, la ctedra de Gentica ha comprado las acciones de la pelcula y quiere recuperar ganancias). El tema es que hay una chica linda (ni ms ni menos que Umma Thurman) que se enamora del muchacho que, si bien ser genticamente inferior, es tambin tan bueno y lindo! Bueno, la chica lleva pelos a una empresa que, por pocos dlares, le analiza (por computadora) la huella digital gentica de identidad del muchachito (obviamente tiene sus dudas y no es cuestin de juntar sus alelos con un desconocido). d) Es esto posible? Qu tcnicas utilizara para poder hacer una cosa as? (no estamos hablando de predisposicin a enfermedades, sino de identidad). 5) Mgy y colaboradores (Genome Biology, 2002) publicaron un trabajo de identificacin de ESTs (secuencias transcriptas) especficamente expresadas en el corazn. Entre los ESTs identificados encontraron: NADH dehidrogenasa, ubiquinona, miosinas, tropomiosina y actina (involucrados en la contraccin muscular), coligina (interacta con el colgeno cardaco), 13 no mostraron poseer funciones relacionadas (hasta este trabajo) con el corazn y 11 no tenan funcin alguna conocida. Adems, 5 de ellos (TG114, TG13, TG131, TG132_7, TG78) fueron relacionados previamente con problemas cardacos. Es decir, la enfermedad se relaciona con la malfuncin de los mismos. La figura muestra la topologa de la regin regulatoria en el extremo 5 de 17 promotores de genes cardacos. Figura CAAT, GC, TATA y CAP son secuencias consenso relacionadas a la unin de la RNA polimerasa II. Otros motivos llamados TRANSFAC y MEME se representan como puntas de flecha. Los cuadrados oscuros (GKLF) representan sitios de unin de un factor de transcripcin parecido al Krppel de Drosophila. Similarmente, (Tcf11 _Rora, TCf11_API_C) se representan otros motivos nucleotdicos identificados.

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a) Qu son y qu funcin cumplen estas secuencias en la regin 5 no codificante de estos genes? b) Porqu algunas secuencias estn en la mayora de los genes y otros no? Es esta una muestra representativa? c) Dado que a esta altura est totalmente secuenciado el genoma humano porqu estos investigadores utilizaron esta metodologa ms antigua para poder identificar genes cardacos? Es decir, porqu no les alcanz esa informacin previa? Se podran haber utilizado chips (microarreglos de DNA)? d) Encuentra alguna relacin entre unin de factores de transcripcin y patologas cardacas? Cul? Podra proponer a uno (o varios) gen/es sospechoso/s a la lista? e) Con estos datos limitados podra proponer una hiptesis de explicacin molecular de las patologas cardacas? f) Cmo confirmara sus hiptesis de la relacin establecida en el punto d y e a nivel funcional? Recuerde que, por razones de tica (hacia nuestra especie) todos los experimentos se hacen con ratones 6) P36 es una protena de 36 kDa de Mycobacterium tuberculosis cuya funcin fue asociada a los mecanismos de virulencia del bacilo. La ahora Licenciada Laura Klepp estudi durante su trabajo de tesis de Licenciatura, la interaccin de dicha protena con el proteoma micobacteriano empleando un sistema de doble hbrido en bacterias basado en la induccin, mediada por cAMP del opern lactosa via protena CAP. El sistema se basa en la expresin, por un lado, del dominio T25 de la adenilato ciclasa y por otro lado, del dominio T18. Cuando estos dominios estn separados, no se detecta actividad de adenilato ciclasa. En cambio cuando se produce una interaccin protena-protena que las acerca fsicamente, se recompone dicha actividad. Se clon el gen P36 en el plsmido pKT25 (anzuelo codifica el dominio T25) y tambin se construy una genoteca de M. tuberculosis en el plsmido pUT18C (codifica el dominio T18 en fusin con el gen de la prote-

na a pescar). Para ello, lo primero que se llev a cabo fue la amplificacin del gen P36 por PCR. a) El oligonucletido 5 fue diseado de manera que se respete el marco de lectura del fragmento codificante para T25 presente en el sitio de clonado Por qu? b) Luego de llevada a cabo la ligacin y la transformacin, los clones positivos se identificaron en la placa por presentar color blanco en presencia de IPTG (anlogo de la lactosa) y XGal (sustrato incoloro de la -galactosidasa y que se convierte en un producto azul). Qu hubiera significado que fueran colonias azules? c) Ya obtenido y caracterizado el anzuelo, vino la parte de la protena a pescar: se subclonaron fragmentos producidos al azar del genoma de M. tuberculosis en pUT18C. Los plsmidos recombinantes se introdujeron, junto con los que contienen secuencias del gen para P36, en clulas competentes de E. coli por cotransfeccin y se obtuvieron clones positivos. Cmo identificaron aquellos clones en los que las protenas derivadas de P36 se reconocieron y unieron con otras expresadas en el vector pUT18C? d) Las secuencias con capacidad de unin pudieron ser asignadas a 2 genes ya secuenciados (Rv1417 y Rv2617) de funcin desconocida, pero que posiblemente sean protenas de membrana y transmembrana. Cmo se hizo para asignar las secuencias a estos 2 genes? Cmo hara para investigar la funcin de estas secuencias nuevas? e) El plmido pKT25 (donde se clon el anzuelo tiene un gen de resistencia a neomicina, mientras que el pUT18C (donde van insertos los potenciales pescados) tiene un gen de resistencia a ampicilina. Por qu esta diferencia? f) Cmo es el genotipo de las E. coli que se utilizan para este tipo de experimentos en cuanto al gen de la adenilato ciclasa? Ac+ o Ac-? Por qu? Qu hubiera pasado si E. coli expresaba algn gen propio muy similar a Rv1417, Rv2617 o P36? g) Cmo fue la composicin del medio de seleccin? mnimo o rico (conteniendo glucosa)? 7) Una pareja afligida llega a Ud. para que le de asesoramiento gentico. Su segundo hijo falleci poco despus de nacer debido a una enfermedad gentica y la madre esta nuevamente embarazada. El hijo fallecido ha sido el segundo en la familia afectado por la enfermedad (el primer afectado ha sido un hermano de su abuela paterna). Ud. dispone, a travs de estrategias de clonado, de una sonda de la regin cromosomal donde se ubica el

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gen involucrado en esta enfermedad autosmica recesiva. Mapa de restriccion del gen que hibrida
con la sonda:

Usando esa sonda, pudo construir un mapa de restriccin de dicha regin, y adems, obtuvo datos que muestran que, en la poblacin, existe polimorfismo para sitios reconocidos por una enzima de restriccin E (indicado como +/- en la figura). Ud. aisl DNA de linfocitos de los abuelos y de los miembros vivos de la familia y ha obtenido los correspondientes fragmentos de restriccin visualizados en el esquema del Southern que se muestra abajo a la derecha. Ud. est ahora en condiciones de hacer un diagnstico pre-natal a partir de clulas fetales. Qu patrn de restricgtgctggag(t/c)aggtatcctag

cin indicara que el feto hered la enfermedad (dibjelo)? 8) A continuacin se muestran los resultados de RAPDs usando varios "primers" por separado (se probaron 144 en total; los restantes no fueron informativos y no se muestran) sobre dos lineas "isognicas" de soja: M, resistente a Pseudomonas y S, sensible (M fue obtenida por mejoramiento clsico a partir de cruzas de S con una variedad resistente a Pseudomonas y posteriores retrocruzas con S); de ambas se supone que comparten la mayor parte del genoma, excepto el gen que confiere el carcter deseado (resistencia al patgeno) y zonas vecinas debido a arrastre. a) Qu marcadores moleculares surgen del anlisis como tiles, en principio, para detectar zonas del genoma que puedan estar ligadas a o eventualmente corresponder al gen objeto del mejoramiento? b) Qu habra que hacer para confirmar el ligamiento? 9) La (kappa) -casena es una protena presente en la leche bovina y juega un papel importante en el proceso de elaboracin de quesos. Un alelo del gen de la -casena, llamado A, produce un tipo de casena que da un queso de calidad superior a la que da otro alelo, llamado a. La nica diferencia entre ellos radica en una base que abarca el sitio de restriccin para la endonucleasa Hind III, lo cual hace que el sitio est presente en A y ausente en a:

sitio Hind III +/regin 3 no codificante regin codificante DNA amplificado (874 pb)
ggtcacaacaa cgtg agatg

Al hacer PCR con iniciadores ("primers") especficos (indicados en la fig.) sobre muestras de sangre de cinco toros y posterior tratamiento con Hind III, se obtuvieron los siguientes resultados (Animal Genetics 22, 11 [1991]): 1 2 3 4 5 pb 874 521 353 a) Qu clase de marcador estamos analizando: dominante o codominante?

b) Cul es el genotipo de los toros testados? c) Si Ud. fuera un rico y poderoso productor agropecuario que abastece leche a una importante fbrica de muzzarella, - cules bovinos elegira para realizar apareamientos dirigidos? - seleccionara adems basndose en otras caractersticas fenotpicas? - financiara un proyecto de investigacin a realizar por un Licenciado en Biologa para optimizar (por ejemplo automatizar) la tipificacin genotpica? d) Qu ventajas tiene este mtodo sobre el clsico de RFLP? e) De qu otros tejidos se podra extraer DNA de los toros?

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f) Se podra determinar el genotipo de vacas, haciendo PAGE no desnaturalizante de protenas en muestras de leche? 10) Se desea hallar un marcador molecular asociado al locus que determina resistencia al barrenador del tallo (Diatraea saccharalis) en maz para utilizarlo en seleccin indirecta. Por esta razn se analiz el patrn de bandas generado por 5 RAPD utilizando una poblacin de 23 lneas recombinantes endocriados provenientes de un cruzamiento entre un padre resistente por otro sensible al ataque del insecto. a) Qu marcadores son polimrficos? b) Qu marcadores estn seguramente ligados al locus? 7. Inmunogentica 1) La iguana voladora de la isla de Krakatoa posea en su saliva una extica sustancia, la krakatona, que inyectada en una persona, tena como nico efecto matar a todos aquellos linfocitos B que se unieran por sus receptores a la krakatona. En 1987 el profesor Vulkan descubri que si la saliva de las iguanas voladoras era hervida antes de ser inyectada, la persona poda producir anticuerpos contra la Krakatona y quedaba vacunada por un tiempo contra la mordedura de la iguana voladora. Los estudios del Prof. Vulkan fueron interrumpidos por la famosa erupcin volcnica que destruy la isla y extingui completamente a las iguanas y al Prof. Vulkan, por lo que quedaron pendientes las siguientes cuestiones: Era letal la mordedura de la iguana? Explique. Quedaban vacunadas contra la krakatona aquellas personas mordidas por iguanas vivas que, se entiende, no haban sido hervidas previamente? Podan ser vacunadas con krakatona hervida aquellas personas que previamente haban sido mordidas por iguanas voladoras? Justifique. Haban perdido muchos linfocitos B por accin de la krakatona las personas mordidas? Por qu ? 2) Se sabe que existe un slo par de alelos para la inmunoglobulina M (IgM) por clula. Hay dos formas de IgM, la de membrana y la secretada, las cuales difieren en las regiones C-terminales de sus cadenas pesadas. La IgM de membrana tiene una secuencia hidrofbica de transmembrana (o anclaje) que no est presente en la forma secretada. Ud. dispone de un oligonucletido sinttico correspondiente a la secuencia de anclaje, como as tambin de un anticuerpo monoclonal que slo conoce dicha secuencia aminoacdica. Con estas dos herramientas moleculares, analice DNA, RNA y protenas de dos tipos celulares: linfocitos B inmaduros (LB) y plasmocitos (PL) .

c) Indique qu marcadores seguramente NO estn ligados al locus. d) Indique el/los marcadores para el/los que, con los actuales datos, no puede afirmar que estn ligados. RESISTENTES SENSIBLES
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10111213141516171819202122 23

A B C= = = = = == == === D E

LB PL

LB PL

LB PL

7 kb 52 kDa

1,5 kb

SOUTHERN
sonda: oligonucletido de sec. de anclaje marcado con 32P

NORTHERN
sonda: oligonucletido de sec. de anclaje marcado con 32P

WESTERN
"sonda": anticuerpos anti sec. de anclaje marcados con 125 I

a) Interprete los resultados. Cul de los dos tipos celulares fabrica la IgM de membrana y cul la secretada? b) Por qu mecanismo supone Ud.que se generan las dos formas de IgM? Justifique. c) Qu resultados se habran obtenido si con los mismos filtros se hubieran usado como sondas un oligonucletido sinttico y un anticuerpo monoclonal correspondientes a las regiones constantes de la cadena pesada de la IgM? d) Dibuje una molcula de IgM unida a membrana y una soluble. 3) Ud. entra a trabajar a un laboratorio como becario y su director le pide que realice 4 experimentos de "Western" para analizar en cada uno de 10 cultivos celulares (del A al J) de linfocitos B, precursores de linfocitos B o plasmocitos, con el objeto de confirmar la identificacin del tipo celular exacto al cual corresponde cada uno de ellos. Cada uno de los 4 "Westerns" es revelado con un anticuerpo especfico diferente segn se

ve abajo. La flecha indica la posicin de las inmunoglobulinas en el gel del Western. 1. Revelado con anticuerpo anti VH de un clon celular X 2. Revelado con anticuerpo antisecuencia de anclaje de inmunoglobulinas 3. Revelado con anticuerpo anti C. 4. Revelado con anticuerpo anti C El papel donde tena anotado a qu cultivo corresponda cada calle del Western fue utilizado un da en que jugaron Boca-River ya sabe para qu...Antes de que se entere su jefe, por favor indquenos a qu tipo celular corresponde cada uno de los 10 cultivos y qu funcin o respuesta hace.
A B C D E F G H I J A B C D E F G H I J

Ud. dispone de cinco lneas celulares homocigotas para dicha clase de antgenos y de un individuo incgnita. Brevemente, se realiz PCR con oligonucletidos particulares (que hibridan en zonas constantes) para amplificar la regin variable de dicho gen de cada lnea y del individuo incgnita. Los fragmentos obtenidos se desnaturalizaron, se mezclaron adecuadamente y se dejaron renaturalizar lentamente. Los productos obtenidos se resolvieron mediante electroforesis en gel de agarosa. Analice las bandas obtenidas en el en el siguiente experimento e indique que alelos tiene el individuo incgnita. 8 1 2 3 4 5 8+1 8+2 8+3 8+4 8+5

__ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __
J

-- --__ __ __ __ __ __ __ __

A B C D E

F G H I J

A B C D E F G H I

4) Un trozo de piel de ratn de la cepa A es rechazado cuando se lo injerta en un ratn de la cepa B. Sin embargo, el trozo de piel de la cepa A no es rechazado cuando se lo injerta en: a. un ratn adulto de una cepa genticamente carente de timo (ratones nude) b. un ratn adulto de la cepa A c. un ratn adulto de la cepa B que desde el nacimiento fue inmunizado con dosis bajas y contnuas de antgenos extrados de piel de ratones de la cepa A. Explique la causa de la ausencia de rechazo en los casos a, b y c, y proponga un mtodo diferente al de c para prevenir el rechazo de la cepa B. 5) Para tipificar polimorfismos de alelos en un determinado exn de un gen de histocompatibilidad clase II peuden emplearse las tcnicas de PCR, desnaturalizacin y renaturalizacn de ADN y electroforesis en geles de agarosa.

6) Analice los experimentos de Northern blot que se grafican a continuacin especificando en qu estado de diferenciacin de Linfocitos B se encuentra cada muestra: A B C D A B C D a b

A c

a-revelado con oligonucletido complementario a una regin constante de cadena pesada M b-revelado con oligonucletido complementario a la regin de secuencia de anclaje c-revelado con oligonucletido complementario a una regin constante de cadena pesada G - Cmo se vera un experimento de Western blot revelado con anticuerpos anti-: a- IgA, b- IgG, cIgM?

Trabajo Prctico: Bioinformtica Primera parte: Secuenciacin Automtica Edicin y anlisis de secuencias de ADN Los productos de reaccin que se siembran en el gel Objetivos: de secuenciacin, provienen de un tipo particular de 1) Entrenarse en la interpretacin de cromatogramas PCR (cycle sequencing) que implica, a diferencia de de secuencias provenientes de reacciones de secuenla PCR comn, la amplificacin desde un solo cebaciacin automtica. dor (one-side PCR). Adems, utiliza una Taq poli2) Entrenarse en el uso de programas de edicin de merasa modificada, y ciclos de temperatura que gesecuencias y en la construccin de CONTIGs de neran una gran cantidad de productos de cadena secuencias. terminales a partir de una pequea cantidad de tem3) Realizar una bsqueda de homologa de secuenplado. cias en una base de datos mundial. Introduccin. El objetivo ltimo de un Proyecto Genoma es obtener la secuencia de ADN completa de un organismo. En el marco de este tipo de proyectos, la tecnologa automatizada se ha convertido en una de las herramientas de eleccin ya que permite la recoleccin de datos a gran escala y en poco tiempo. La secuenciacin automtica del ADN es un ejemplo de aplicacin de este tipo tecnologas, la cual est reemplazando cada vez ms a la forma manual debido a su costo relativamente bajo, rapidez y mayor precisin en la obtencin de los datos. La secuenciacin automtica se basa en el mtodo de terminacin de la cadena por incorporacin de nucletidos dideoxi (ddNTPs), dando como resultado la sntesis de productos de reaccin que tienen el mismo extremo 5 terminal, pero diferentes extremos 3 (ver figura 1). A principios de los 80, Lee Hood y colaboradores fueron los pioneros en el desarrollo de esta metodologa. Ellos aplicaron por primera vez un sistema de deteccin fluorescente en paralelo a una electroforesis en gel, lo que permiti precisamente la automatizacin del mtodo. Este instrumento comenz a ser comercializado por Applied Biosystems Incorporated (ABI), y se convirti en el caballito de batalla en los comienzos del Proyecto Genoma Humano. El sistema ABI utiliza los cuatro dinucletidos marcados con fluorocromos que emiten a longitudes de onda distintas. De esta manera, puede llevarse a cabo una nica reaccin de secuenciacin incluyendo las cuatro bases marcadas en un mismo tubo, y resolver los productos de distinta longitud en una sola calle del gel. El sistema ABI permite, adems, la obtencin instantnea de los datos. Esto se logra a travs de la excitacin de la marca fluorescente activada por un lector lser que se encuentra en el punto justo de la corrida electrofortica, lo cual maximiza la resolucin de los fragmentos. Usando este mtodo, se pueden obtener fragmentos confiables de secuencias de algo ms de 500 pares de bases (p.b.) en menos de cuatro horas. Mas recientemente se desarrollaron secuenciadores capilares que permiten la corrida simultanea de 96 muestras que en solo dos horas arrojan secuencias de hasta 1000 p.b.

En la actualidad existen otras tcnicas ms sofisticadas que pueden implementarse para secuenciar el ADN (p. ej.: pirosecuenciacion, basada en deteccin quimioluminiscente de nucletidos incorporados o la utilizacin de CHIPs de secuenciacin, descripta en Brown, 1999 o Griffiths et al, 2000). Aun con el desarrollo de estas nuevas tcnicas de secuenciacin, la obtencin de la secuencia completa de una molcula larga de ADN debe reconstruirse a partir de secuencias mas cortas. Un conjunto de secuencias cortas que se superponen en sus extremos se denomina un CONTIG de secuencias (ver fig 2). Es en este punto (y en muchos otros) en donde interviene la informtica como herramienta indispensable para el desarrollo de Proyectos Genmicos. Existen programas que permiten buscar superposiciones en se-

cuencias y de este modo reconstruir la secuencia original. Los algoritmos que se aplican en estos casos se denominan, en forma generalizada, algoritmos de alineacin, los cuales se basan fundamentalFigura 2.

mente en la comparacin de secuencias con el fin de buscar regiones similares, es decir que presenten una buena coincidencia (good match).

Molcula de ADN Conjunto de secuencias cortas cuyos extremos se

............ATTCGAATCGCGATTGAAT CGATTGAATCGCGATExisten dos tipos de alineamientos: locales y globales. Estos ltimos se basan en la comparacin de 2 o ms secuencias en toda su extensin y son los que se utilizan para la bsqueda de extremos coincidentes en la construccin de CONTIGs, y tambin en estudios de reconstruccin filogentica. Los alineamientos locales tienen por objeto buscar regiones dentro de una secuencia entera que presenten una buena coincidencia con otras regiones de secuencias provenientes, por ejemplo, de una base de datos. En general los algoritmos de alineacin global tienen por objeto calcular un valor de alineamiento ptimo entre dos o mas secuencias. Por ejemplo, a las coincidencias de bases (match) el programa le asigna un valor positivo, y a las discordancias (mismatch) un valor negativo. El alineamiento ptimo es aquel que presente el mximo valor. Dado que dos secuencias cualesquiera pueden ser alineadas con un valor mximo de coincidencia agregando una delecin (gap) cada vez que aparezca una no coincidencia, la incorporacin de una delecin debe ser penalizada de algn modo en el clculo de dicho valor ptimo de alineamiento, de manera tal de evitar alineamientos con una alta incidencia de gaps. Este proceso penaliza tanto la apertura de gaps como la extensin de los mismos. El programa ms comnmente utilizado para el alineamiento global, es el CLUSTAL (Higgins y Sharp, 1988, 1989). Por otro lado, el BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, desarrollado por el National Center for Biotechnology Information, USA) es el programa ms utilizado para alineamientos locales. Este ltimo es un algoritmo de bsqueda de homologa de secuencias, que utiliza clculos estadsticos para identificar coincidencias significativas entre una secuencia provista por el usuario (llamada incgnita o query) y una secuencia de ADN del banco de datos. Se utiliza, por ejemplo para determinar si una secuencia incgnita se parece o pudiera corresponderse a parte de otra secuencia de un gen ya identificado por otros investigadores y almacenada en la base de datos en donde se est realizando la bsqueda. Los parmetros de bsqueda son elegidos por el usuario, los que determinan en ltima instancia, el porcentaje de coincidencias que va a ser tomado como significativo. Ambos programas, el CLUSTAL y el BLAST sern utilizados para el desarrollo de este trabajo prctico. Acceso a la informacin sobre Gentica Molecular va Internet En la dcada de 1990 se vivi un gran desarrollo en todo lo relacionado con la informtica y la comunicacin de la informacin en general. La gentica molecular es una de las tantas disciplinas que se ha visto favorecida por este vertiginoso avance. En un principio, el objetivo de los cientficos de esta especialidad era el de almacenar y diseminar la informacin que se fuera obteniendo sobre datos de secuencias de ADN. Esta tarea se llevaba a cabo a travs de redes informticas subvencionadas por gobiernos, y que conectaban distintos centros acadmicos. Actualmente, en cambio, se utiliza INTERNET operando a travs de una poderosa interfase grfica, la World Wide Web (WWW). Esta red permite la apertura de archivos como objetos multimedia conectados por medio de direcciones de hipertexto. Diversos programas informticos, llamados buscadores de red (web browsers) permiten a los usuarios usar la interfase con la WWW, lo que, como es bien sabido, se logra a travs de computadoras personales conectadas a INTERNET. Es decir que actualmente, cualquier persona, pertenezca o no a un centro acadmico, puede acceder a una base de datos de secuencias de ADN. Existen muchas vas para acceder, pero uno de los ms convenientes es a travs del GenBank. El GenBank est mantenido por el National Institute for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, Maryland, USA). Se muestra una serie de direcciones Web de utilidad para los genetistas moleculares.

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Direccin de Internet Descripcin de la pgina (http:/) /www.nih.gov/ National Institute of Health /www.ncbi.nlm.nih.gov National Center for Biotech/ nology Information /www.ncbi.nlm.nih.gov Sitio para iniciar una bs/BLAST/ queda BLAST /www.ncbi.nlm.nih.gov Proyecto Anatoma del Ge/ncicgap/ noma del Cancer. /gdbwww.gdb.org/ /www.genome.ad.jp/ /www.tigr.org/ /wwwgenome.wi.mit.edu/ /www.bio.net/ La base de datos del Genoma Japan GenomeNet El instituto para la investigacin del Genoma Humano Instituto de Tecnologa de la Investigacin del Genoma, de Massachusetts. BIOSCI bio-net newsgroup. para esto el programa BioEdit Sequence Alignment (www.mbio.ncsu.edu/RnaseP/info/programa /BIOEDIT/bioedit.html). Editor

Este programa (de utilizacin gratuita) permite abrir grficos de cromatogramas de secuencias, editarlos, armar CONTIGs (usando para esto subprogramas como el CLUSTAL y el CAP) y hacer bsquedas en INTERNET de secuencias homlogas mediante BLAST. La secuencia incgnita se construir a partir de 4 secuencias ms cortas que fueron amplificadas a partir de cebadores externos (Z1 y Z35) y cebadores internos (Z2 y Z33), como se indica en la siguiente figura:

5
Fig. 3

Z33 35 950

Z35 35 1316

/www.elsevier.com/loc Elsevier Publishing techniate/tto cal Tips. Desarrollo del Trabajo Prctico: Los alumnos debern editar una secuencia incgnita de aproximadamente 1300 pares de bases, utilizando

1 350 53 53 3 Z1 Z2

Los cromatogramas correspondientes a los cuatro productos de amplificacin se encuentran en 4 archivos diferentes cuyos nombres y ubicacin en la computadora sern indicados por el docente. Para poder visualizarlos y analizarlos se seguirn los siguientes pasos: 1)Ingresar al programa BioEdit

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2)Abrir la carpeta que contiene los cuatro archivos con los cromatogramas (seleccionando FILE, OPEN de la barra de herramientas), y dentro de ella, abrir uno de los archivos de secuencias. Se abrir una ventana que contiene una secuencia y su cromatograma correspondiente (bajo el ttulo ABI chromatogram) y otra ventana que contiene la secuencia escrita solamente o slo texto (bajo el ttulo DNA sequence), como lo muestra la figura 4. En ambos casos, dichas secuencias se encuentran numeradas cada 10 pares de bases. 3)Observar los cromatogramas en cuanto a los colores usados para cada base, forma de los picos, picos superpuestos y posiciones con base indeterminada (N). 4)Identificar las regiones del cromatograma que permitan definir la secuencia con mayor certeza. Esta eleccin se basar en la presencia de picos bien definidos, baja frecuencia de superposicin de picos en una misma posicin que den lugar a bases no definidas (N), baja frecuencia de bases repetidas en tandem muchas veces. 5)Registrar las posiciones iniciales y finales de la porcin utilizable. 6)Dentro de cada regin elegida (porcin utilizable), ubicar las bases ambiguas (N) y resolverlas en base al cromatograma. Para esto, se debe primero transformar al cromatograma en editable, seleccionando VIEW, EDITABLE SEQUENCE. 7)Guardar los cambios. Para esto seleccionar la opcin EXPORT as FASTA del men FILE de la barra de herramientas y adjudicarle un nombre de archivo. 8)Repetir este procedimiento para cada secuencia. 9)Eliminar las regiones no utilizables de los cromatogramas de la siguiente manera: a) abrir los archivos recin creados; b) ubicarse sobre el nombre de la secuencia que aparece a la izquierda de la ventana (p.ej.: PT/Z1); c) seleccionar la opcin EDIT SEQUENCE del men SEQUENCE de la barra de herramientas, lo que permitir que se abra una segunda ventana; e) pintar con el botn derecho del mouse las bases a borrar. Eliminar con DELETE, primero las ltimas de la secuencia y despus las primeras; f) oprimir APPLY and CLOSE. Las modificaciones se habrn incorporado a la ventana de secuencias slo texto; g) guardar los cambios con FILE, SAVE; h) repetir esto con cada secuencia. Armado de los CONTIGs de secuencias 1)Agrupar todas las secuencias en un mismo archivo. Para esto, ubicarse en cada ventana, pintar el nombre de la secuencia ubicado a la izquierda, seleccionar la opcin COPY SEQUENCE, del men EDIT y pegarlo en el archvo de destino con la opcin PASTE SEQUENCE, del mismo men EDIT. 2)Guardar el nuevo archivo (FILE, SAVE). 3)Para poder armar los CONTIGs, las cuatro regiones secuenciadas deben corresponderse a la misma hebra y deben estar escritas en la misma direccin (ej 5 3). Dada las caractersticas de los productos de amplifica-

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cin de los cuales provienen estas secuencias (figura 3), habr dos hebras que debern ser modificadas para que cumplan con ambos requisitos. Elegir las secuencias a modificar (pintar nombre de la izquierda) y seleccionar de la barra de herramientas SEQUENCE, NUCLEIC ACID, REVERSE COMPLEMENT. Luego guardar con FILE, SAVE. 4)Seleccionar las cuatro secuencias (pintando los nombres en la columna izquierda) y seleccionar ACCESORY APPLICATION y luego CAP (Contig Assembly Program). Aparecer una ventana como lo muestra la figura 5. Elegir una superposicin mnima de 10 bases y 85% - 90% de homologa. Seleccionar RUN APPLICATION. Cerrar la ventana de DOS. Modificar los parmetros de tal manera de aumentar la rigurosidad y porcentaje de superposicin mnima. Pudieron armarse los CONTIGs? 5)Analizar la secuencia en las regiones de superposicin. Existen discrepancias en estas regiones o hay un 100% de coincidencia? Qu criterio utilizara para resolverlas? 6)Modificar el CONTIG (que aparecer como una secuencia ms por debajo de las otras en la ventana solo texto bajo el nombre de contig) en caso de encontrar errores. Para esto seleccionar la opcin EDIT SEQUENCE. Bsqueda de marcos abiertos de lectura (ORF) El programa buscar posibles codones de iniciacin (AUG) y codones STOP (UAG, UAA, UGA), de manera de determinar posibles marcos de lectura abiertos. Para ello seleccionar el CONTIG en la columna de la izquierda de la ventana solo texto, y elegir la opcin SEQUENCE, NUCLEIC ACID, SORTED SIX-FRAME TRANSLATION. Por qu encontr ms de un marco de lectura posible? Identificacin de la secuencia incgnita: bsqueda de homologa en INTERNET Se proceder a identificar la secuencia con que trabajamos mediante un alineamiento local, utilizando el programa BLAST. Para ello seleccionar el CONTIG en la columna de la izquierda de la ventana solo texto, y elegir la opcin ACCESORY APPLICATION de la barra de herramientas. Luego seleccionar BLAST, NCBIBLAST over INTERNET, SEARCH. Corresponder esta secuencia a una regin codificante? pudo homologarse a algn gen de algn organismo? a cul? existe homologa con un nico organismo? Por qu? Bibliografa Brown, T.A. 1999. Genomes. John Wiley & Son Inc., Publication. New York. Griffiths, A.J.F., Miller, J.H., Suzuki, D.T., Lewontin, R.C., Gelbart, W.M. 2000. An Introduction to genetic analysis. W.H. Freeman Publ., New York. Higgins, D.G. y Sharp, P.M. 1988. CLUSTAL: A package for performing multiple sequence alignement on a microcomputer. Gene 73: 237-244. Higgins, D.G. y Sharp, P.M. 1989. Fast and sensitive multiple sequence alignments on a microcomputer. CABIOS 5: 151-153. Hillis, D.M., Moritz, C., y Mable, B.K. 1996. Molecular Systematics. Sinauer Associates, Inc. Sunderland, USA. Miesfeld, R. L. 1999. Applied Molecular Genetics. John Wiley & Son Inc., Publication. New York. Proyecto Genoma Humano (HGP, Nature) Como introduccin al Trabajo Practico de Bioinformtica, se utilizara el CD editado por Nature referente al proyecto de mapeo, secuenciacin y ensamblado del genoma humano (Septiembre 2000). Una vez cargado el programa, los alumnos podrn: a) Seguir el time line con una recopilacin cronolgica de los avances en gentica, desde Darwin (1859) y Mendel (1865) hasta la culminacin del Proyecto Genoma Humano (2003). b) Ir a how to sequence a genome, donde podrn encontrar una descripcin de las distintas etapas que involucran el HGP (Human Genome Project). El HGP tiene como objetivo el estudio completo de toda la secuencia del genoma humano. Esto implica la secuenciacin de aproximadamente 3000 millones de bases repartidas en 23 pares de cromosomas. El PGH trabaja sobre secuencias representativas dado que cada ser humano comprende un set nico de secuencias. Alrededor de 100 personas donaron sangre en forma annima para este proyecto cuyo inicio se remite a 1990. Los investigadores a cargo del proyecto se quedaron con unas pocas muestras para encarar la lectura del genoma. El HGP fue cumpliendo distintas etapas desde el desarrollo de un mapa gentico detallado, mapeo fsico y secuenciacin a full hasta el ensamblado de las secuencias obtenidas. Seccin 1. Mapeo gentico La primera etapa del HGP focalizo el desarrollo y mapeo de miles de marcadores para ayudar a navegar a travs de cada uno de los cromosomas humanos. El primer mapa detallado fue publicado en 1994 y contena 6000 marcadores, o sea un marcador en promedio cada 700.000 bases. En 1996, el mapa fue saturado a un marcador cada 100.000 bases. El desarrollo de mapas genticos no solo fue fundamental para encarar el proyecto de secuenciacin completo sino que tambin posibilito la localizacin de genes involucrados en distintas enfermedades. A principios de la dcada pasada el HGP elaboro las estrategias de clonado del ADN humano en bacterias utilizando vectores adecuados para hacer mas eficiente la secuenciacin completa del genoma humano.

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Seccin 2. Construccin de colecciones de ADN En 1990 el HGP emprendi la construccin de una coleccin de ADN humano en BACs que permiten el clonado de fragmentos grandes de ADN (100.000200.000 bases). En los aos sucesivos se desarrollo el mapa fsico localizando los distintos marcadores en cada uno de estos clones BACs. Seccin 3. Subclonado Para obtener reacciones de secuencia de alta calidad, los fragmentos de ADN debieron subclonarse en vectores que permiten la insercin de fragmentos mas cortos (hasta 2000 pares de bases). Seccin 4. Almacenamiento y preservacin de clones. Para preservar y hacer reproducible los resultados de la secuenciacin de los distintos fragmentos, las colecciones de ADN se almacenan en placas de alta densidad ordenadas en congeladores. Seccin 5. Preparacin de ADN para secuenciacin. Se realizan purificaciones de ADN plasmidico haciendo uso de automatizacin y robtica tanto para el crecimiento de clones, la purificacin y la posterior reaccin de secuenciacin. Seccin 6. Reaccin de secuenciacin. El HGP encara la secuenciacin completa del ADN humano utilizando secuenciacin automtica a travs de la introduccin de cuatro marcadores fluorescentes distintos para cada base nucleotidica en la reaccion de secuenciacin. Seccin 7. Productos de secuenciacin. Una reaccin de secuenciacin completa tiene un conjunto de molculas de ADN de distintos tamaos. La mas corta es igual a la longitud del primer utilizado para la secuenciacin y la mas larga varia entre 500 y 800 bases, longitud determinada por el agotamiento de reactivos de secuencia. Seccin 8. Separacin de la rechino de secuenciacin. Las molculas se separan por electroforesis en geles o en los secuenciadores mas modernos, en capilares. Las molculas marcadas fluorescentemente son excitadas por un laser del secuenciador automtico. Seccin 9. Lectura de los productos de secuenciacin. La seal emitida por los distintos marcadores fluorescentes al ser excitados por el laser, es detectada por una cmara y as las molculas de ADN se leen una a una y la informacin es compilada en computadoras. Seccin 10. Ensamblado de resultados. Distintos programas de computacin ayudan a ingresar los resultados obtenidos de la secuenciacin diaria de miles de bases de ADN. Para la secuenciacin completa del genoma humano fueron necesarias muchas lecturas. El HGP propuso que cada base de ADN sea leda en promedio nueve veces. Algunas regiones son de fcil lectura y pueden ser ledas con menor numero de pasadas. Otras regiones de ADN, en cambio, necesitan lecturas mltiples. Para generar la secuenciacin completa del genoma humano fueron necesarias mas de 50.000.000 reacciones de secuenciacin, efectuadas por mas de 2000 cientficos en dos docenas de laboratorios en todo el mundo. Seccin 11. Borrador de trabajo (Working draft) Cientficos integrantes del Consorcio Publico del HGP se comprometieron a enviar a bases publicas de secuencias de 2000 bases o mas dentro de las 24 horas de producidas. De esta manera las secuencias estn disponibles para cualquier persona con acceso a Internet en forma inmediata. En 1999 se finalizo la secuenciacin y ensamblado del cromosoma 22 detectndose alrededor de 500 genes en el mismo. A principios de 2000, el cromosoma 21 fue totalmente ensamblado con aproximadamente 300 genes detectados. En la primavera del 2000, El HGP dio a conocer el borrador que cubre el 90% del genoma humano con un 99.9% de certeza. El numero total de genes humanos se estiman actualmente en 30.000, numero significativamente menor a lo estimado al iniciarse el HGP. Aun quedan gaps y ambigedades por dilucidar que se iran salvando cuando todo el genoma sea secuenciado al menos 9 veces. Estos gaps y ambigedades se deben a ciertas regiones difciles de secuenciar por propiedades qumicas y en otros casos a secuencias repetidas que dificultan el ensamblado. El numero de secuencias repetidas varia tanto en longitud como en numero de repeticiones. Algunas estn repetidas millones de veces y otras solo estn dos veces. Cuando el genoma Humano este totalmente terminado, lo que se prev para el 2003, se estima que no habr mas de un error cada 10.000 bases o sea que el grado de certeza ser del 99.99%.