These Doctorat Mauricio Schoebitz

UNIVERSIT DE NANTES UFR SCIENCES ET TECHNIQUES
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COLE DOCTORALE SCIENCES POUR LINGNIEUR GOSCIENCES ARCHITECTURE
N attribu par la bibliothque
Anne 2010
tude de lencapsulation de rhizobactries pour la biofertilisation du bl
THSE DE DOCTORAT
Discipline : Sciences de lIngnieur Spcialit : Gnie de Procds
Prsente et soutenue publiquement par
Mauricio Ivan SCHOEBITZ CID

Le 22 de septembre 2010, devant le jury ci-dessous
Prsident: Rapporteurs: Examinateurs:
Grald Thouand, Professeur Universit de Nantes, France. Yvan Monne-Loccoz, Professeur Universit Lyon 1, France. Stphane Declerck, Professeur Universit Catholique de Louvain, Belgique. Rmi Saurel, Professeur AgroSup Dijon, France. Hlne Simonin, Matre de Conference, ONIRIS, France Co-encadrant de thse. Denis Poncelet, Professeur, ONIRIS, France Directeur de thse.
ED : .
(Uniquement pour STIM et MTGC)
Cette thse a t ralise dans le cadre dun projet europen financ par RHIBAC Food Quality & Safety FP6-FOOD-CT-2006-036297 www.rhibac.org
REMERCIEMENTS Ce travail a t ralis au laboratoire de Gnie de Procds Alimentaires de l'cole Nationale Vtrinaire, Agroalimentaire et de l'Alimentation Nantes-Atlantique : ONIRIS. Je tiens remercier Monsieur Denis Poncelet, qui, en tant que Directeur de thse, s'est toujours montr trs disponible tout au long de la ralisation de ce travail, ainsi pour sa confiance et la libert qu'il m'a accord ainsi que nos nombreuses discussions mont permis de progresser. Mes remerciements sadressent galement Mme. Hlne Simonin, matre de confrences lONIRIS, pour leur encadrement, leur soutien, disponibilit et les remarques substantielles quelle a formules pour la finalisation de ce travail. Sans elle, ce travail naurait pas sa forme actuelle. Mes remerciements les plus respectueux vont M. Yvan Monne-Loccoz, Professeur de lUniversit Lyon 1 et M. Stphane Declerck, Professeur de lUniversit Catholique de Louvain qui mont fait lhonneur de prendre connaissance de ce travail et den tre rapporteurs. Merci M. Rmi Saurel, Professeur de lAgroSup Dijon et M. Grald Thouand, Professeur de lUniversit de Nantes, davoir accept de prsider le jury de cette thse. Mes remerciements sadressent galement Ren Cardenas, pour sa gnrosit et pour ses prcieux conseils qui mont guid au cours de mes tudes. Je ne saurais oublier dexprimer ma reconnaissance Mme. Anne Franois Miegeville pour son aide fourni dans la prparation des chantillons pour la microscopie lectronique balayage. Je veux prsenter, mes sincres gratitudes tous les enseignants et lquipe technique de lONIRIS qui ont contribu la ralisation de ce travail. galement, j'exprime ma gratitude toute lquipe de Microencapsulation: Gisle, Luca, Ming, Audrey, Guy, Lola, Sariah et Carole. tous les moments passs ensemble au labo et en dehors. laccueil chaleureux que vous mavez fait lors de mon arrive et au soutien que vous mavez apport tout au long de ma thse. Enfin, j'adresse mes plus sincres remerciements ma famille, qui m'a toujours soutenu et encourag au cours de la ralisation de ce travail de recherche.
Sommaire
Sommaire
INTRODUCTION GNRALE .........................................13 TUDE BIBLIOGRAPHIQUE ...........................................17
1. Introduction ..............................................................................................17 2. La flore microbienne du sol .....................................................................18
2.1. La Rhizosphre......................................................................................................21 2.2. Les champignons: mycorhizes arbusculaires.......................................................22 2.3 Les rhizobactries...................................................................................................24 2.3.1. Mcanisme de fixation de lazote.......................................................................26 2.3.2 Production des phytohormones...........................................................................28 2.3.3. Solubilisation des phosphates dans le sol .........................................................29
3. Inoculation des rhizobactries dans le sol ..............................................31

3.1 Inoculum liquide ....................................................................................................32 3.1.1 Imprgnation des semences ................................................................................32 3.1.2 Pulvrisation de linoculum................................................................................32 3.2. L'inoculum sous support.......................................................................................33 3.2.1 Formulations base de talc ................................................................................34 3.2.2 Formulations base des tourbes ........................................................................36 3.2.3 Formulations base de vermiculite....................................................................36 3.2.4. Formulations base d'argile .............................................................................37
4. Lencapsulation des rhizobactries .........................................................39

4.1. Caractristiques principales de lencapsulation ..................................................40 4.1.1. Immobiliser et/ou isoler......................................................................................40 4.1.2. Protger...............................................................................................................41
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Sommaire
4.1.3. Librer progressivement.....................................................................................42 4.1.4. Structurer et fonctionnaliser..............................................................................42 4.1.5 Pourquoi encapsuler des rhizobactries?...........................................................43 4.2 Les techniques dencapsulation.............................................................................43 4.2.1 Le dripping ....................................................................................................44 4.3 Les matriaux dencapsulation .............................................................................46 4.3.1. Caractristique de lalginate de sodium ............................................................47 4.3.2 Survie des rhizobactries encapsule dans des matrices dalginate..................49 4.3.3 Ladjonction de lamidon la matrice dencapsulation ....................................50
Conclusion .....................................................................................................53
MATRIELS & MTHODES ............................................55

1. Micro-organismes et conditions de culture ............................................56
1.1 Souches de rhizobactries ......................................................................................56 1.2. Milieux de culture .................................................................................................57 1.2.1 Composition milieu YEP .....................................................................................57 1.2.2 Milieu de culture de lInstitut Maurice R&D ....................................................58 1.2.3 Prparation du milieu Trypticase soy broth (TSB) ............................................59 1.3 Rhydratation et conservation des souches bactriennes.....................................60 1.3.1. Protocole de conservation ..................................................................................60 1.4 Cultures cellulaires.................................................................................................60 1.4.1 Cultures en Erlenmeyer ......................................................................................61 1.4.2 Cultures en fermenteur .......................................................................................61 1.5 Dnombrement des cellules....................................................................................63 1.6 Dnombrement des cellules contenues dans les capsules. ...................................64 1.7 Mthodes de caractrisation des bactries ............................................................65 1.7.1 Microscopie optique et loupe binoculaire ..........................................................65
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Sommaire
1.7.2 Morphologie et croissance des colonies .............................................................65
2. Procd dencapsulation ..........................................................................67

2.1 Prparation de rhizobactries pour lencapsulation.............................................67 2.2 Prparation de la matrice dencapsulation ...........................................................69 2.2.1 Matriaux ............................................................................................................69 2.2.2 Choix de lalginate ..............................................................................................69 2.2.3 Choix des agents de charge.................................................................................70 2.2.4 Fabrication de la matrice et des solutions de glification .................................71 2.3 Le schage des capsules .........................................................................................73 2.4 Stockage des capsules.............................................................................................73
3. valuation de ladhsion des cellules sur les grains damidon .............76

3.1 Test de cosdimentation .........................................................................................76 3.2 Observation de ladhsion des cellules sur les granules damidon au microscopique lectronique balayage.......................................................................78 3.2.1 Protocole de prparation des chantillons pour la microscopique lectronique balayage (MEB) ........................................................................................................79
4. Libration des rhizobactries des capsules dans leau et dans le sol ...80
4.1 Libration des rhizobactries dans leau...............................................................80 4.2 Libration des bactries dans le sol .......................................................................81
5. Production des capsules chelle pilote .................................................84

5.1 Production de la biomasse lONIRIS .................................................................84 5.1.1 Prparation de la matrice....................................................................................85 5.1.2 Schage des capsules...........................................................................................87 5.1.3 Schage sur lit fluidis ........................................................................................88 5.1.4 Schage ltuve.................................................................................................89 5.2 Production des capsules lUniversit Austral du Chili (UACH) .......................91 5.2.1 Encapsulation des bactries................................................................................93
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6. tude de lefficacit des inoculums encapsuls en champs ..................95

6.1 Essais en champs au Chili .....................................................................................95 6.2 Essai en champs en Angleterre..............................................................................99
RSULTATS & DISCUSSION ..........................................103

1.Caractrisation de la survie des rhizobactries au procd dencapsulation ...........................................................................................104
1.1 Leffet de la nature de la matrice dencapsulation sur la viabilit cellulaire ....104 1.2 volution du nombre de cellules vivantes diffrentes tapes du procd d'encapsulation ..........................................................................................................111 1.3 volution du nombre de cellules vivantes dans des billes sche durant le stockage 4 C ...........................................................................................................118 1.4 Influence de lchelle de production ...................................................................121 1.4.1. Production des capsules pour lUACH ...........................................................122 1.4.2. Production de capsules sches dalginate-amidon pour le partenaire industriel Masstock. ....................................................................................................................127
2. Optimisation de la survie des rhizobactries au procd dencapsulation ...........................................................................................132

2.1 Optimisation par la modulation de ltat physiologique des bactries...............132 2.1.1 Linfluence de la phase de croissance sur la survie des cellules pendant lopration de schage ltuve. ...............................................................................132 2.1.2 Influence de l'adjonction dosmo-protecteurs dans le milieu de culture........135 2.2 Optimisation par la modulation des paramtres du procd dencapsulation ..138 2.2.1 Influence de l'adjonction de glycrol dans la matrice dencapsulation .........138 2.2.2 Modification du sel de calcium utilis pour la glification de lalginate........139 2.2.3 Modulation du niveau de schage et stockage des capsules............................142
3. tude de ladhsion des rhizobactries sur lamidon ..........................146

3.1. Influence de la souche de rhizobactries sur ladhsion la surface des granules damidon .....................................................................................................147
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3.2. Influence de ltat physiologique dEnterobacter ludwigii sur sa capacit dadhsion aux granules damidon ...........................................................................148 3.3. Effet du type damidon sur ladhsion cellulaire...............................................149 3.4. Pourcentage dadhsion cellulaire en fonction de la concentration de lamylose dans les granules damidon. ......................................................................................152 3.5. Observation au microscope lectronique balayage des bactries adhres sur la surface des granules de lamidon. .........................................................................155
4. Libration progressive des rhizobactries et efficacit en champs ....161

4.1 Libration des rhizobactries dans leau et dans le sol ......................................161 4.1.1 Libration des B. pumilus et R. terrigena dans leau ......................................161 4.1.2 Libration dans le sol de B. pumilus encapsule .............................................163 4.2 tude de lefficacit des inoculums encapsuls en champs................................166
CONCLUSION & PERSPECTIVES ................................175 BIBLIOGRAPHIE..............................................................179
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I. Introduction Gnrale
INTRODUCTION GNRALE
Pendant la priode qui comprend les annes 1960-1990, le monde a vcu une immense transformation politique et conomique, connue comme la Rvolution Verte. Cette rvolution a permis une augmentation de la productivit agricole. Elle a t rendue possible par la mise au point de nouvelles varits de crales haut rendement et par le dveloppement de produits de la chimie de synthse, comme les pesticides et les engrais. Grce la rvolution verte, le rendement des cultures a augment, et cela a permis de nourrir la population mondiale tout en maintenant le prix des denres alimentaires des niveaux stables.
Depuis les annes 90, nous avons pris conscience davoir pay trop cher le gain de productivit du la Rvolution Verte. Lutilisation excessive des produits agrochimiques a conduit une grave pollution de lenvironnement et mis en pril la sant publique.
La recherche scientifique sest intresse l'tude et l'exploration du potentiel des microorganismes du sol, afin dutiliser leurs proprits phytosanitaires et phytostimulantes pour diminuer lutilisation des produits agrochimiques. Les produits contenant des microorganismes, comme les bactries ou les champignons, sont caractriss de bioengrais. Ces micro-organismes peuvent tre inoculs seuls ou en mlanges. Les rhizobactries permettent de fixer l'azote atmosphrique ou de le solubiliser et de mobiliser les lments nutritifs du sol. Ils peuvent galement scrter des substances stimulant la croissance des cultures.
Les rsultats des recherches sur les proprits des bioengrais ouvrent des nouvelles pistes offrant ainsi une alternative lutilisation des engrais chimiques. Cette alternative plus cologiquement durable permet d'accrotre la fertilit des sols dans le cadre d'une production agricole durable et respectueuse des agro-cosystmes.
Actuellement, linoculation du sol est ralise par pandage de tourbe pralablement mlange une culture microbienne. Toutefois, lencapsulation des cellules dans des hydrogels s'est avre comme une technique prometteuse (Cassidy et al. 1996). En effet,
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l'encapsulation des cellules protge les micro-organismes des agressions de l'environnement et de la flore concurrente dj prsente dans le sol et permet une diffusion progressive des micro-organismes dans le sol (Fages 1992; Bashan 1998).
La diminution du taux de survie, durant lencapsulation et tout particulirement pendant l'tape de schage, reste cependant une difficult majeure. Selon plusieurs auteurs, le nombre de cellules viables diminue jusqu une valeur infrieure 1% au cours du procd d'encapsulation (Paul et al. 1993). La phase de schage des capsules constitue donc l'tape la plus critique du procd dencapsulation . Elle demeure cependant indispensable, car elle permet de maintenir l'activit biologique des capsules malgr une priode de stockage prolonge (Bashan et Gonzalez, 1999).
Lhydrogel le plus utilis pour lencapsulation des micro-organismes est l'alginate de sodium. Les billes dalginate sont en fait, trs fortement hydrates, 97% de leur masse tant de leau, et ne sont pas capables de protger les micro-organismes pendant la dure du schage. Aprs schage, les capsules sont petites et contractes, et prsentent un taux de mortalit des microorganismes lev. Afin d'amliorer cet tat, l'ajout d'adjuvants, tel que lamidon, a permis daugmenter la concentration initiale en matire sche (Ivanova 2006). La formulation des capsules base dalginate et damidon permet une diminution de la consommation dnergie par le procd de schage et un meilleur taux de survie des micro-organismes.
Lobjectif principal de ce travail de recherche est l'augmentation de la survie des rhizobactries encapsules et la mise au point dune mthode dinoculation fiable pour permettre la protection des rhizobactries au sein dune matrice sche d'alginate-amidon via limmobilisation des bactries au sein des capsules.
On sattachera notamment dterminer une formulation de matrice dencapsulation dalginate, alginate-argile et alginate-amidon, ainsi quidentifier les conditions techniques optimales permettant de raliser lencapsulation. On valuera galement la survie des cellules durant le procd dimmobilisation et durant leur stockage ainsi que leur libration dans l'eau et le sol.
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Ce travail se dcline en quatre parties :
Le premier chapitre prsente une revue bibliographique, portant sur la flore microbienne naturelle du sol, linoculation des rhizobactries dans le sol et la production dinoculant biologique par immobilisation des rhizobactries.
Le second chapitre porte sur la description des quipements, des techniques exprimentales et des mthodes dexploitation des donnes employes au cours de ce travail.
Le troisime chapitre dcrit les rsultats obtenus au cours de cette tude et leur interprtation, qui comprend: la caractrisation et loptimisation de la survie cellulaire aux diffrentes tapes de lencapsulation en fonction des espces bactriennes, la comprhension des mcanismes de protection cellulaire par lamidon et enfin les rsultats dapplication des capsules en champs.
Enfin, une conclusion approfondie permettra de discuter de nos rsultats et danalyser les perspectives qui en dcoulent. Notamment, les perspectives concernant lutilisation future et de manire massive des capsules dans le domaine agricole seront discutes.
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II. tude Bibliographique
TUDE BIBLIOGRAPHIQUE
1. Introduction
Les rhizobactries sont un groupe de bactries qui vivent associes aux racines des vgtaux qui jouent un rle important pour la croissance des plantes. Elles colonisent les racines des cultures cralires. Les mcanismes responsables de l'amlioration de la croissance incluent: la fixation dazote atmosphrique, la production des hormones favorisant la croissance des cultures et la solubilisation/mobilisation des phosphates du sol.
Lutilisation des rhizobactries dans lagriculture permet de rduire lemploi de produits chimiques de synthse effet nfaste pour l'environnement ou doptimiser lutilisation des engrais chimiques dans le cadre dune agriculture raisonne.
En consquence, un nombre croissant de recherches et d'tudes portent sur la gestion du systme sol-vgtal et micro-organismes. Il s'agit de recherches encourages et dveloppes dans le cadre de nombreux projets internationaux. Elles ont permis notamment lidentification et la slection de diffrents genres de rhizobactries, telles que lAzospirillum (Krieg et Dbereiner 1984), Raoultella (Van Elsas et al. 2007) et Bacillus (Siddiqui 2006).
Le but de ces recherches est de dvelopper des bioengrais sous forme sche et d'obtenir une concentration bactrienne ncessaire pour amliorer la croissance des plantes. Le travail de recherche porte sur lencapsulation des rhizobactries, qui est considre actuellement comme lune des techniques les plus prometteuses pour atteindre cet objectif.
Ltude bibliographique dcrira en premier lieu les mcanismes daction des rhizobactries. Une deuxime partie sera consacre aux diffrents modes dinoculation possibles des dites bactries dans le sol. Elle sera suivie dune troisime partie concernant la production dinoculants contenant des rhizobactries immobilises.
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2. La flore microbienne du sol

Les micro-organismes vivants dans le sol sont des bactries, des champignons, des algues, on retrouve aussi les parties souterraines des plantes ainsi que des animaux trs varis allant des protozoaires aux mammifres. Tous participent dune manire ou dune autre la formation de la rhizosphre. Le tableau II.1 prsente les organismes vivants qui composent la rhizosphre.
Tableau II.1. Abondance des organismes vivants du sol (n.d. = non dtermin) (Gobat et al. 2003).
Organismes par gramme de sol sec 106 - 109 n.d. 103 105 104 106 0,1 1 000 n.d. n.d.
Nombre par m3
Biomasse moyenne kg/ha prof. 20 cm 1 500 3 500 10 1 000 250 1 5 000 6 000 env. 12 000 % (sans les racines) 25 59 Traces 4 12 100
Bactries Champignons Algues Protozoaires Faune du sol Racines Total
1011 - 1014 n.d. 108 10 109 109 1011 5.106
n.d. n.d.
Bactries Au sens large, le terme de bactrie regroupe les organismes unicellulaires organisation de type procaryote (Bactries et Archaea), contrairement par exemple aux levures, qui sont des eucaryotes. Certaines bactries du sol se dplacent laide de flagelles qui fonctionnent comme des hlices de bateau entranes par un moteur rotatif. Dautres, frquentes dans les sols et litires, se meuvent en rampant la surface de corps solides (Huang et al, 2002).
Le changement de composition du sol et du gaz dans un terrain est surtout li aux fonctions bactriennes (Hurst et al, 2001). Par exemple, lactivit respiratoire arobie, qui consomme loxygne, peut mener lanoxie : cela concerne les sols hydromorphes, o la diffusion de lair est restreinte, mais aussi le centre de grandes particules dans des sols ars. En prsence dun excs de substrat carbon, les bactries accaparent lazote disponible. En revanche,
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dautres, dans des conditions de carence en azote, sont capables de fixer lazote atmosphrique N2 et denrichir le sol en azote organique et minral.
Les cyanobactries sont photosynthtiques et leur activit est identique celle des chloroplastes des algues et les vgtaux. Nombre dentre elles (ex. Nostoc, Anabaena) peuvent fixer lazote. Certaines vivent en symbiose avec des plantes, comme Anabaena azolla dans les tissus des plantes fougres flottantes du genre Azolla. Elles constituent alors, limage des algues vertes, des symbioses semblables des lichens (cyanolichens).
Par la synthse de facteurs de croissance (vitamines) dune part, et dantibiotiques dautre part, certaines bactries exercent un contrle positif ou ngatif sur dautres organismes.
Mais cest avant tout par leurs fonctions biogochimiques, telles que la minralisation de la matire organique, loxydation des composs inorganiques rduits, la rduction anarobique des composs inorganiques oxyds, la solubilisation ou la prcipitation de minraux, sans oublier la transformation de certains composants organiques en humine, que les bactries jouent un rle essentiel dans la formation et lvolution du sol.
Le bon droulement de toutes les tapes de croissance des plantes ncessite des sols bien vivants dont les habitants (faune, champignons, algues et bactries) contribueront tous rechercher et mettre la disposition de la plante tous les lments nutritifs dont elle a besoin. Parmi tous ces lments, lazote est celui dont la disponibilit est souvent critique pour la production du bl.
Champignons Les champignons sont tous des eucaryotes htrotrophes arobies digestion extracellulaire. Ils peuvent toutefois appartenir des groupes taxonomiques trs variables.
Les champignons transportent activement des quantits importantes deau et de substances dun endroit lautre du sol. La translocation des lments organiques sert fertiliser le sol. Lextraction des sels minraux prend toute sa signification chez les mycorhizes. Cest pourquoi les racines dun vgtal ralisent une forte association symbiotique avec les
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champignons. Le champignon est ici un collecteur des sels minraux, quil transfre la plante ou garde en rserve pendant la saison morte.
Certains champignons sont spcialiss dans lutilisation de polysaccharides vgtaux et/ou lignine, et peuvent accumuler dans leur myclium ou dans leurs spores des composs mlaniss prcurseurs des matires humiques. Dautres sont habitus vivre avec les plantes, en prlevant directement les aliments organiques dont ils ont besoin. Cette adaptation est souvent symbiotique, comme dans le cas des mycorhizes dj voques, mais parfois parasitaires.
Algues Les algues microscopiques, unicellulaires ou en colonies filamenteuses, sont souvent abondantes dans les sols, mais restent surtout localises la surface ou dans de larges fissures.
Trois groupes taxonomiques eucaryotes sont reprsents : les algues vertes (Chlorophyces : Chlamydomonas, Chlorellia, Pleurococcus), les algues jaune-vertes (Xantophyces : Heterococcus, Vaucheria) ces deux groupes dominent dans les sol acides et les diatomes (Bacillariophyces, Achnanthes, Navicula, Pinnularia), majoritaires dans les sols neutres ou alcalins. Quand aux algues bleues, les cyanophyces, elles sont en ralit des bactries.
Selon les sols, la biomasse algale, cyanobactries incluses, est comprise entre 10 et 1000 kg de matire sche par hectare, avec un maximum de 24 kg pour les seules cyanobactries des rizires. Il a t dnombr de 102 109 individus par gramme de terre dans les sols (Davet, 1996).
Grce leur activit photosynthtique, les algues colonisent rapidement les surfaces minrales brutes, dont elles acclrent laltration par les substances dissolvantes. Elles produisent aussi les polysaccharides extracellulaires qui agrgent les particules solides et en renforcent la cohsion. En milieu aquatique et dans les sols submergs, certaines forment de la craie en prcipitant la calcite.
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2.1. La Rhizosphre La rhizosphre est le volume de sol qui adhre aux racines des plantes. Cest la zone d'absorption des nutriments et de l'eau et dinteraction entre les racines des plantes et les micro-organismes associs. Les interactions dans la rhizosphre sont trs importantes et intensives entre la plante, le sol et les micro-organismes du sol. En fait, les interactions biochimiques et les changes de molcules de signalisation entre les plantes et les microorganismes du sol peuvent influencer de manire significative la croissance des crales (Pinton et al 2001; Werner 2004).
Figure II.1. Schma de linteractions entre les bactries et les vgtaux au niveau de la rhizosphre.(http://biosol.esitpa.org/).
Les plantes vivent au contact de nombreux micro-organismes. Ce contact est permanent et troit puisque l'on peut dtecter plus de 109 microorganismes par gramme de racine. La plupart de ces micro-organismes vivent probablement en saprophytes (leur action principale est le recyclage de la matire organique). Certains exercent un effet nfaste (organismes pathognes par exemple) et d'autres peuvent, au contraire, protger et favoriser le dveloppement des vgtaux.
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Dans la rhizosphre les organismes vivants qui favorisent la croissance des vgtaux sont essentiellement, des bactries et des champignons, grce leur capacit de fixation d'azote, production dhormones et solubilisation des phosphates.
2.2. Les champignons: mycorhizes arbusculaires Les champignons constituent un rgne part, ils constituent dans notre cas ce qu'on pourrait appeler la flore fongique . Ils ne font partie ni du rgne animal, ni du rgne vgtal. Cependant, leur comportement alimentaire les rend davantage semblables aux animaux quaux plantes. Tout comme les animaux, ils sont htrotrophes vis--vis du carbone, cest-dire quils ont besoin dune source de carbone organique externe pour salimenter, contrairement aux plantes vertes qui produisent elles-mmes ces lments grce la photosynthse.
La dnomination de mycorhizes a t utilise la premire fois en 1885 par A.B Frank pour dcrire la modification des structures de certaines espces forestires. Elle a t utilise depuis pour designer les associations symbiotiques entre les champignons et les racines des plantes (Smith et Read 1997).
Le mot arbuscules dsigne des structures intracellulaires trs ramifies, les arbuscules proprement dits sont censs tre des sites de transfert des lments nutritionnels entre le champignon et la plante. Ces arbuscules maximisent la surface de contact entre la plante hte et les champignons pour permettre l'change d'lments nutritifs (Sylvia 2005).
Les mycorhizes arbusculaires sont constitues par lassociation symbiotique dun champignon et des racines dune plante. En dautres termes, il s'agit l d'une racine colonise par un champignon mycorhizien qui en a modifi sa morphologie. Les mycorhizes arbusculaires dplacent activement des quantits importantes deau et des substances nutritionnelles dun endroit lautre du sol. Le dplacement mcanique des lments organiques permet de fertiliser le sol. Cest pourquoi les racines des vgtaux effectuent une forte association symbiotique avec les champignons. Le champignon est un collecteur de sels minraux, qui les
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transfre la plante, les minraux rcolts ce qui constitue une rserve pendant la saison morte.
Ces champignons appartiennent aussi bien aux Basidiomyctes quaux Ascomyctes et Glomromyctes et ils forment des symbioses mycorhiziennes avec les racines de la majorit des plantes terrestres. Les diffrents types de mycorhizes qui existent se distinguent la fois par les groupes taxonomiques des partenaires symbiotiques impliqus (plantes et champignons) et par les structures typiques formes dans la symbiose (Peduzzi et BoucherRodoni 2002).
Plus de 80 % des espces vgtales de la plante s'organisent sous la forme dassociation symbiotique avec les mycorhizes (German et al. 2000; Siddiqui 2006). Suite la colonisation par les mycorhizes, la fonction des racines se modifie sous leffet du myclium structur sous la forme de mycorhizes arbusculaires. ce jour, on dnombre environ 120 espces de champignons capables de former ce type de mycorhizes; ils appartiennent tous aux Glomromyctes et ne peuvent pas tre cultivs seuls (en labsence de la plante hte). Leur cycle biologique dans le sol repose entirement sur la prsence de racines vivantes de la plante hte .
En association avec le champignon, un nombre important de processus physiologiques des plantes sont amliors: nutrition minrale, rsistance aux stress biotiques (maladies) et abiotiques (pollution), enracinement et floraison. Leffet sur la croissance des plantes est trs positif: accroissement parfois important en poids sec, en taille et modification de la teneur en lments. La nutrition de la plante notamment en azote (minral surtout) et en phosphore est amliore par son transfert du champignon vers la plante (les capacits lytiques du champignon sont largement suprieures celles de la plante, de mme que la surface draine). De mme, le transfert de leau est favoris; on a pu montrer que les mycorhizes accroissent sensiblement la rsistance la scheresse, notamment en conditions extrmes (zones arides). On observe galement les effets non nutritionnels comme la protection de la plante contre les bactries et champignons phytopathognes et la tolrance des plantes aux mtaux lourds, ainsi qu'ventuellement une tolrance au calcaire (plantes calcifuges). De son ct, le champignon reoit des sucres, des vitamines et des molcules complexes (Weger et al. 1995).
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La colonisation des plantes par les mycorhizes arbusculaires peut affecter de manire importante la population des bactries bnfiques associes la rhizosphre. La synergie entre rhizobactries et mycorhizes ont t dcrites comme ayant un effet de promotion sur la croissance des plantes et des arbres (Glick et al. 1999). 2.3 Les rhizobactries Les rhizobactries sont des bactries qui sont aptes coloniser les racines de faon intense. Les bactries non symbiotiques rpondant cette dfinition appartiennent diffrents genres et espces dont les plus tudis sont: Azospirillum spp, Bacillus spp, Pseudomonas spp. (Kilian et al. 2000). Les effets bnfiques des rhizobactries sont lis leur position stratgique linterface sol-racine. En effet, le rhizoplan et la rhizosphre sont le sige dchanges intenses entre la plante et le milieu environnant (Brown 1974). Ces changes sont rciproques. La plante libre des exsudats racinaires qui sont constitus de substances organiques carbones et azotes : polysaccharides, acides organiques et protines (Beckmann et al. 1994). De mme, la densit des bactries est plus leve dans la rhizosphre que dans le sol distant des racines : il sagit de leffet rhizosphre (Fages 1992; Ravikumar et al. 2004). La quantit et la composition des exsudats racinaires conditionnent galement la nature des activits bactriennes. Ces activits rsultent de la synthse de mtabolites tels que les sidrophores, les substances de croissance et les lipopolysaccharides .
Si la plante libre des composs organiques, linverse elle prlve de leau et des lments minraux indispensables son mtabolisme. Ce prlvement est dailleurs associ lextrusion de protons qui contribue abaisser la valeur du pH de la rhizosphre. Les racines sont galement capables dabsorber certaines molcules organiques, produites par les microorganismes prsents dans la rhizosphre. Les changes entre la plante et le sol sont influencs par les rhizobactries et ce dautant plus que leur densit et leur activit sont leves. Cette influence se manifeste par une modification de la croissance de la plante et de la frquence des infections fongiques de la racine. Selon les rhizobactries prsentes, ces modifications peuvent tre positives ou ngatives pour la plante. Leur tude a donc suscit lintrt de nombreux chercheurs .
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Les rhizobactries sont les bactries prsentes dans la rhizosphre. Elles peuvent promouvoir la croissance des plantes grce plusieurs mcanismes : la fixation biologique de lazote, la synthse des phytohormones, l'augmentation de la disponibilit du phosphate, la diminution du stress environnemental et la synergie avec dautres micro-organismes dans le sol (FuentesRamirez et Caballero-Mellado 2005).
Le nombre de bactries identifies en tant que rhizobactries ou PGPR (en anglais Plant Growth Promoting Rhizobacteria ) a connu une croissance notable ces dernires annes, ceci est le rsultat de plusieurs tudes et recherches incluant un grand ventail de plantes. Le tableau II.2 montre leffet de lutilisation des rhizobactries sur laugmentation de la croissance et de la protection aux maladies chez les plantes.
Tableau II.2. Les rhizobactries: laugmentation de la croissance des plantes et la protection aux maladies.
Rhizobactrie Pseudomonas fluorescens Bacillus pumilus Paenibacillus macerans et Bacillus subtilis Azospirillum brasilense Pseudomonas fluorescens Pantoea agglomerans Bacillus simplex et Bacillus firmus
Culture Betterave Tomate Riz
Effet Meilleure rsistance aux maladies Meilleure rsistance aux maladies
Rfrence (Moenne-Loccoz et al. 1999) (Benhamou et al. 1998)
Promotion de la croissance (Vasudevan et al. 2002) des plantes Promotion de la croissance (Kim et al. 2005) des plantes Promotion de la croissance (de Freitas et Germida des plantes 1992) Promotion de la croissance (Amellal et al. 1998) des plantes Promotion de la croissance (Barneix et al. 2005) des plantes
Bl Bl Bl Bl
Ces recherches ont contribu au progrs des connaissances des diffrents mcanismes daction directe et/ou indirecte des rhizobactries (Baker et Cook 1974).
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Les mcanismes indirects se manifestent lorsque les rhizobactries agissent en tant que contrle biologique. Elles confrent ainsi la plante une rsistance accrue aux maladies fongiques et bactriennes. Ce mcanisme indirect stimule galement la croissance des autres bactries symbiotiques qui protgent aussi les plantes des sols dj contamins par microorganismes pathognes.
Les mcanismes directs incluent la production de phytohormones, lamlioration du captage des lments nutritifs chez les plantes (libration des phosphates) et la fixation de lazote atmosphrique. Les diffrents mcanismes directs de promotion de la croissance sont ici dtaills.
2.3.1. Mcanisme de fixation de lazote La dcouverte de la fixation de lazote par les lgumineuses remonte au 19me sicle. Il a fallu prs de cinquante ans pour tablir que laptitude des lgumineuses utiliser lazote de lair tait due la prsence de nodules sur les racines, induites par des ferments contenus dans le sol. Cette dcouverte fut rapidement suivie par lisolement des Rhizobium, puis de plusieurs autres bactries fixatrices dazote dans la rhizosphre (Glick et al. 1999).
La canne sucre a t considre comme un modle vgtal, dans lequel a t tudie la fixation dazote (Smith 1995).
La raction ralise par le complexe nitrognase exige :
8 lectrons et 8 protons pour la rduction 16 ATP pour la fourniture de lnergie dactivation
La raction complte est donc :
N2 + 8e + 8H+ 16 ATP 2NH3 + H2 + 16ADP + 16Pi
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La formation dammoniaque saccompagne toujours de celle dhydrogne. Les lectrons proviennent de deux sources selon les souches :
de NADH, H+ ou/et FADH2 fournis par les processus cataboliques (cycle de Krebs, -oxydation des acides gras, etc.).
de la ferrdoxine ou/et de NADH, H+ form au cours de la photophosphorylation acyclique.
Le complexe enzymatique de nitrognase est constitu de 2 mtalloprotines qui comportent trois groupements prosthtiques diffrents. La premire est une rductase (appele nitrognase 1) et renferme 2 sous-units identiques. Elle contient du fer et se comporte comme une rductase. Pour chaque lectron rcupr du donneur et cd la nitrognase, il y a consommation de 2 liaisons phosphatiques riches en nergie (2 ATP). La seconde est la nitrognase (nitrognase 2), organise en 2 sous-units identiques et en 2 sous-units identiques. Sous forme ttramrique 22, elle reoit les lectrons de la rductase pour rduire lazote atmosphrique.
Figure II.3. Fixation biologique de lazote par le complexe nitrognase.
L'activit de la nitrognase est contrle par la concentration du milieu en NH4+ et par la concentration en oxygne. La prsence des ions ammonium inhibe lactivit enzymatique. La molcule doxygne peut endommager l'enzyme nitrognase de manire irrversible, par
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oxydation des protines enzymatiques. Il existe aussi dautres facteurs qui influencent cette activit, et par consquent la fixation dazote.
2.3.2 Production des phytohormones Une phytohormone est une molcule gnralement produite par la plante. C'est une molcule qui rgule la croissance vgtale ou qui intervient dans la communication entre individus vgtaux diffrents. Ces phytohormones peuvent avoir des effets bnfiques sur la croissance vgtale et le dveloppement des plantes (Salysbury et Ross 1992).
Pour tre une phytohormone, une substance doit normalement tre:

endogne (non fournie par l'environnement), oligodynamique (agir faible dose, de l'ordre de la micromole) et vectrice d'une information (apporte une cellule cible slectivement sensible son action et dont elle influence le fonctionnement).
La plupart des rhizobactries produisent des hormones auxquelles les vgtaux sont sensibles. Ces hormones scrtes par les bactries sajoutent l'ventail ou "Pool" des hormones vgtales endognes (Bashan 1998). Ainsi, les hormones bactriennes stimulent le dveloppement du systme racinaire ainsi que la croissance globale de la plante hte. Dans le mme temps, l'augmentation rsultante de la production des mtabolites vgtaux est utilise par les bactries pour leur propre croissance, ce qui permet une relation rciproque bnfique entre plantes et rhizobactries (Patten et Glick 2002).
La promotion de la croissance des racines par les hormones est l'un des facteurs principaux qui ont t identifis comme tant bnfiques au rendement de production des plantes. La production bactrienne des hormones constituerait l'essentiel du mcanisme de stimulation de la croissance des plantes grce la grande sensibilit des racines aux hormones. Par exemple, les rhizobactries scrtent de faibles quantits dhormones telles que les auxines qui stimulent l'longation des racines. Par ce biais, elles sont capables de promouvoir la croissance des racines latrales ou le dveloppement des poils absorbants (Brick 1996).
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Figure II.4. Racines de plantes de tomate a et b racines de plantes contrle sans rhizobactries; c et d racines de plantes inocules avec Enterobacter ludwigii.
La figure II.4 montre leffet de l'augmentation des poils absorbants dans les plantes de tomate due linoculation dEnterobacter ludwigii isole par Schoebitz et al. (2009). Sur les figures II.4 a et b les racines des plantes de tomate non inocules, nous navons observ aucune promotion de croissance. En revanche, les figures c et d montrent un dveloppement abondant des poils absorbants.
2.3.3. Solubilisation des phosphates dans le sol Les micro-organismes du sol peuvent galement favoriser la croissance des plantes en amliorant les transformations de la matire organique des sols et en mobilisant des nutriments inorganiques.
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Les phosphates sont prsents sous forme insoluble dans le sol et ne sont donc pas accessibles par les plantes. Certaines rhizobactries peuvent librer des acides organiques et des enzymes qui solubilisent les molcules phosphates.
Par exemple, Pseudomonas spp. libre dans le sol l'enzyme phytase. Cette enzyme est responsable de la libration du phosphate, tel que linositol hexaphosphate. Dans des essais pratiqus au Qubec (Canada) en champ ouvert, linoculation de Pseudomonas spp. a gnr une augmentation du rendement du champ de mas tudi. Dans un autre essai, ce mme rhizobactrie a permit une augmentation du rendement des cultures de laitue de 18 % (Smith 1995).
Les scientifiques sont bien convaincus et daccord aujourdhui pour dire que lun des moyens pour raliser cet objectif est dapporter ou de rintroduire dans les sols des rhizobactries. Plusieurs types de bactries peuvent remplir cette fonction de solubilisations des phosphates dans le sol, mais il est ncessaire de mettre au point une stratgie pour isoler les bactries les plus performantes, optimiser leur intgration dans les sols et vrifier leur efficacit dans les champs.
Concernant leur intgration dans les sols, nous parlerons dans la partie suivante de lincorporation de rhizobactries par inoculation sous forme de cultures liquides et par lintermdiaire de supports solides comme la tourbe, le talc, la vermiculite ou sous forme encapsule.
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3. Inoculation des rhizobactries dans le sol

Ltude des effets bnfiques de linoculation des rhizobactries nest pas rcente, car durant les annes 1897, l'entreprise Bayer avait mis sur le march allemand un produit fabriqu base de bactries stimulantes de la croissance des crales. Les bioengrais ont t fabriqus l'aide de la souche Bacillus subtilis (Marshall 1968). Linoculation des rhizobactries sur les champs a t ralise grande chelle par lUnion Sovitique en 1958 sur 10 millions dhectares. Les bactries utilises appartenaient principalement aux espces Azotobacter chroococcum et Bacillus megaterium (Cassidy et al. 1996). Cependant, Mishutin et Naumova (1962) ont estim que ce traitement na engendr que des augmentations modestes de rendements et sur seulement 50 70 % des surfaces. Malgr ces rsultats, linoculation des rhizobactries a fait lobjet dexprimentations prcises ralises petite chelle dans divers pays (Bashan 1986; Hernandez et al. 2009). partir des annes 90, aux tats-Unis, la rhizobactrie B. subtilis a commenc tre employe sur 2 millions d'hectares de cultures . Les donnes accumules (1974-1994) de l'inoculation sur le terrain dans le monde suggrent que les techniques d'inoculation ont connu une augmentation significative du rendement des cultures de l'ordre de 5-30% (Okon et Labandera-Gonzalez 1994).
La microflore rhizosphrique est constitue dun ensemble de micro-organismes en quilibre, si la rhizobactrie introduite ne colonise pas la rhizosphre de faon agressive, son activit bnfique ne peut pas sexprimer, car lquilibre microbien antrieur linoculation se rtablit rapidement. Par contre, lutilisation de certaines souches dAzospirillum brasilense aptes se maintenir et se dvelopper sur le systme racinaire saccompagne deffets bnfiques significatifs pour les plantes inocules (Krieg et Dbereiner 1984; Fages 1990). la suite de lintrt suscit par ces publications, une grande partie du travail de recherche ralis sur les rhizobactries est maintenant effectue sur des bactries appartenant au genre Azospirillum.
Pour amliorer la colonisation des rhizobactries dans la rhizosphre, ces dernires doivent tres implantes au plus prs des graines sous la forme dinoculum liquide, ou solide (talc, tourbe vermiculite et argile) ou d'inoculum encapsul. Dans les parties suivant, nous montrerons les diffrents aspects de lintroduction de rhizobactries dans le sol.
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3.1 Inoculum liquide Les inoculums sous forme liquide sont les plus simples utiliser et les moins coteux. La prparation de ce type dinoculum s'effectue en mlangeant les bactries soit avec un milieu de culture, soit avec une solution spcifique pralablement formule.
Il existe principalement deux faons de traiter les semences pour lapplication dinoculum liquide bactrien. La premire faon consiste mlanger les graines dans linoculum liquide et la deuxime pulvriser linoculum sur le sillon des semis.
3.1.1 Imprgnation des semences Les semences sont mlanges dans la suspension avant les semis. Cette mthode permet une mise en contact direct et immdiat entre les bactries et les graines. La probabilit de prsence des rhizobactries sur les racines est par consquent particulirement leve. Cette mthode dapplication ne permet pas davoir sur toutes les semences le mme nombre des bactries, car on n'obtient pas un mlange homogne dans tout l'ensemble des semences. Par ailleurs, les bactries ne sont pas suffisamment protges contre les conditions de l'environnement et les contaminations durant le transport et lapplication dans les champs (Bashan et al. 2002).
Cest pourquoi les semences imprgnes sont parfois sches l'air libre, pour tre ultrieurement utilises dans les deux prochains jours. Ce type dinoculum est couramment utilis aux tats-Unis, au Canada, en Argentine et au Brsil, et principalement pour la culture du soja, du mais, des lentilles, des petits pois et des arachides (Bashan 1998).
3.1.2 Pulvrisation de linoculum La pulvrisation de linoculum liquide sur les graines ou lpandage dans les champs de linoculum doivent tre effectus quelques jours aprs ensemencement des graines. Pour ce type de pratique, lagriculteur doit possder quelques connaissances en microbiologie, car linoculum doit tre gnralement prpar juste avant son application (Morgan et al. 2006). L'agriculteur doit investir dans l'achat des rservoirs refroidis pour permettre la conservation de linoculum liquide dans de bonnes conditions.
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Linoculum liquide peut tre pulvris directement dans le sillon des semis, ce qui offre une plus grande quantit de bactries disponibles que celles qui sont inocules directement sur les semences (Cassidy et al. 1996).
Pour certaines rhizobactries, telles que Azospirillum spp., les formulations liquides s'avrent largement dfavorables, car elles ne fournissent pas un environnement protecteur pour lesdites rhizobactries. Pour certaines espces vgtales, les inoculant liquides doivent tre appliqus pendant plusieurs jours aprs les semis gnrant ainsi un travail supplmentaire et un cot additionnel non ngligeable pour lagriculteur.
Lemploi optimal dengrais biologique dans le monde agricole actuel ncessiterait donc son stockage sans que celui-ci perde son efficacit et viabilit cellulaire. Afin de faciliter la manipulation, lapplication et la conservation de linoculum liquide, il est donc, ncessaire de dshydrater les bactries sous un support solide afin de protger les rhizobactries. 3.2. L'inoculum sous support Les microorganismes peuvent galement tres introduits dans le sol par lintermdiaire dun inoculant solide, dont le composant principal est appel support. Un bon support doit avoir comme caractristiques essentielles: la capacit de librer un grand nombre de cellules viables dans de bonnes conditions physiologiques et ce au moment opportun.
Le plus souvent, les supports utiliss dans les formulations solides sont organiques et minraux. Il sagit de tourbe, de talc, dargile et de vermiculite (figure II.5). Ils permettent damliorer le taux de survie des bactries. Le tableau II.3 reporte la concentration de diffrents inoculums solides aprs des temps de stockage variables et pour diverses espces de rhizobactries. La diminution du temps de conservation des bactries varie selon le type bactrien, le type dinoculant utilis et selon la granulomtrie des particules.
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Tableau II.3. Dure de conservation des formulations en fonction des bactries et des inoculant utiliss (Siddiqui 2006).
Support
Rhizobactries
Stockage
Concentration finale CFU/g 1,3x107 1,0x106 1,0x103 1,0x108 7,0x106 1,0x109 1,0x108 1,0x106 1,0x106 1,0x103 2,8x106
Talc Talc Talc Talc Tourbe Tourbe + chitine Tourbe Vermiculite Vermiculite Vermiculite Argile
P. fluorescens Pf1 B. subtilis P. putida P. putida (souches 30,180) P. fluorescens Pf1 B. subtilis P. chlororaphis (PA23) et B. subtilis (CBE4) P. fluorescens Pf1 B. subtilis P. putida P. fluorescens Pf1
8 mois 45 jours 45 jours 6 mois 8 mois 6 mois 6 mois 8 mois 45 jours 45 jours 4 mois
3.2.1 Formulations base de talc
Le silicate de magnsium est un minral naturel couramment connu sous le nom de talc, celuici est disponible un faible cot sous forme de poudre. Le talc est trs peu hygroscopique et inerte temprature ambiante ce qui rend possible une longue priode de stockage. Ce produit est souvent utilis comme lment constituant de base dans de nombreuses formulations bactriennes pour lagriculture.
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Kloepper et Schroth (1981) ont dmontr que le talc pouvait tre un bon support pour la formulation de la rhizobactrie P. fluorescens. La mthode a consist mlanger de la gomme de xanthane et du talc. Ainsi, 5 ml de gomme de xanthane (20%) ont t mlangs avec 5 ml d'une suspension bactrienne de 1,0x109 UFC/ml. Aprs avoir laiss le mlange pendant 20 min, le talc (environ 5 fois le volume du mlange bactries-gomme) a t ajout et soigneusement mlang. Le mlange rsultant a t sch 12C pendant 3-4 jours. Les auteurs ont observ une viabilit initiale de 8,2x107 UFC/g de poudre et aprs deux mois de conservation ils nont pas constat une diminution du nombre des rhizobactries. Par contre, aprs de 10 mois de stockage le nombre des rhizobactries a diminu jusqu 4,0x104 UFC/g (Kloepper et Schroth 1981a).
Figure II.5. Les principaux supports utiliss pour linoculation de Rhizobactries dans le sol : la tourbe (a), le talc (b), largile (c), et la vermiculite (d).
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3.2.2 Formulations base des tourbes La tourbe est un matriau vgtal organique qui se trouve couramment dans des rgions marcageuses. Elle est issue majoritairement de la dgradation anarobie de divers vgtaux. La tourbe est couramment employe en tant que support de stabilisation des rhizobactries. Lavantage de lutilisation des formulations base de tourbe est la conservation de lactivit physiologique des rhizobactries. En effet, la multiplication bactrienne peut se poursuivre mme pendant la priode de stockage, condition, videmment, que les bactries disposent de suffisamment de nutriments et quelles soient stockes une humidit et une temprature adquates.
La principale difficult concernant l'utilisation de la tourbe comme support est lie sa grande variabilit organique fortement en relation avec son origine gographique. La tourbe est en effet une matire organique complexe. La variabilit organique de la tourbe affecte grandement la qualit du produit final et sa stabilit au cours du stockage et a un effet important la densit de cellules vivantes dans le produit (Siddiqui 2006). Un autre inconvnient de lutilisation de la tourbe et sa contamination microbiologique. En effet, les formulations des supports base de tourbe sont sujettes aux contaminations par dautres microorganismes, ce qui se traduit par une rduction de la dure de conservation de l'inoculum (Bashan 1998).
3.2.3 Formulations base de vermiculite La vermiculite est un minerai naturel proche de la famille des micas qui a subi un traitement de chauffage trs haute temprature. Ce traitement ne fait pas fondre le matriau, mais permet sa dilatation. La principale proprit de la vermiculite est la rtention dhumidit, raison pour laquelle elle est utilise comme support pour le dveloppement des formulations des agents microbiens.
L'un des problmes qui limitent l'utilisation de la vermiculite comme support aux rhizobactries, est que ce matriau offre des avantages rduits en ce qui concerne la survie des micro-organismes pendant le stockage. Amer et Utkhede (2000) ont travaill avec lutilisation
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de la vermiculite, en tant que support pour deux souches de rhizobactrie: la souche Bacillus subtilis cultive dans un bouillon de dextrose de pomme de terre et la souche Pseudomonas putida cultive sur milieu King's B durant 48 h 150 revs/min 22 C. Puis, 50 ml de la suspension bactrienne ont t mlangs avec 50 g de vermiculite. La concentration finale a t denviron 108 UFC/ml. Les matriaux ont t stocks dans un rfrigrateur (4C) et temprature ambiante (22 C), pour dterminer la population bactrienne aprs 45 jours. En ce qui concerne le taux de survie de P. putida, sa viabilit a diminu jusqu 103 UFC/g 0C et de 102 UFC/g 22C. En revanche, la viabilit de la rhizobactrie B. subtilis a t de 106 UFC/g 4C et 22C (Amer et Utkhede 2000).
3.2.4. Formulations base d'argile Largile est une roche sdimentaire compose majoritairement de silicates daluminium hydrats qui prsentent une structure feuillete. On distingue plusieurs types dargile en fonction de lpaisseur des feuillets, telles que la kaolinite et la montmorillonite.
Laddition dargile dans la formulation bactrienne peut limiter la mortalit des cellules et leur confre une meilleure protection. Cependant, toutes les argiles n'apportent pas le mme effet protecteur. Par exemple, l'utilisation de l'argile du type montmorillonite protge mieux les Rhizobium trifolii des tempratures leves lorsque l'opration de schage s'effectue aux environs de 70C (Bashan 1998). En revanche, l'argile de type kaolinite noffre pas cette protection. Marshall et al. (1974) a expliqu cet effet par la formation dune enveloppe de protection autour des cellules permettant ainsi de modifier le flux de leau entrant et sortant dans les cellules pendant l'opration de schage et la rhydratation.
De plus, Bushby et Marshall (1977) ont dmontr que largile de montmorillonite protgeait les cellules des Rhizobium leguminosarum et Rhizobium trifolii mais quelle ne protgeait pas les autres types de bactries telles que Rhizobium lupini et Rhizobium japonicum.
L'utilisation de l'argile dans la matrice prsente cependant un problme non ngligeable: ce matriau offre une surface charge susceptible d'attirer des mtaux lourds. En effet, Cassidy et
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al. (1996) ont suggr que les argiles peuvent attirer les ions de quelques mtaux lourds et ainsi devenir toxiques.
Largile reste cependant un matriau intressant si elle est utilise en complment dans une matrice dencapsulation. Par exemple, la survie de Pseudomonas fluorescens inocule 108 UFC g-1 de sol est suprieure aprs 84 jours si les bactries ont t encapsules dans une matrice compose dalginate et de 3% de bentonite (p/v) (107 UFC g-1 de sol) en comparaison aux bactries libres (103 UFC g-1 de sol sec) ou aux cellules encapsules avec de l'alginate seul (106 CFU g-1 de sol) (Cassidy et al. 1996).
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4. Lencapsulation des rhizobactries

Au cours des dernires dcennies, lencapsulation des rhizobactries dans des hydrogels par la mthode de dripping a t value. Le polymre qui a t le plus utilis est lalginate de sodium, car il forme des gels dans des conditions douces pour les micro-organismes. Ces polymres ont dmontr largement leur potentiel en tant que supports bactriens (Bashan 1998). Ils offrent des avantages substantiels par rapport la tourbe qui est reporte dans le tableau II.4.
Le principe de l'encapsulation des cellules est de protger les micro-organismes vis--vis du milieu environnant pour mieux les librer dans le sol et de faon progressive et prolonge (Paul et al. 1993). La vitesse de dgradation du polymre employ dpendra de l'activit biologique des micro-organismes du sol. En rgle gnrale la dgradation du polymre doit se produire lors de la germination des semences.
Les capsules dshydrates sont stockes temprature ambiante pendant une longue priode. La capsule offre aux bactries un milieu favorable en diminuant le risque de mortalit et permettant une longue conservation (Wang et al. 1999). Ces inoculants peuvent tre amliors avec lapport de types de nutriments pour les bactries afin d'amliorer la survie des microorganismes, ce qui est indispensable pour la russite de l'inoculation de bactries dans le sol.
Les prparations encapsules ont rsolu de nombreux problmes lis aux inoculants traditionnels tel que la tourbe, qui est le support couramment utilis pour les inoculants biologiques. titre de comparaison, les caractristiques des formulations base d'alginate et des formulations base de tourbe sont prsentes dans le tableau II.4.
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Tableau II.4. Comparaison des inoculant base dalginate et de tourbe (MattilaSandholm et al. 2002).
Alginate Technologie industrielle existante coteuse Chimiquement et physiquement uniformes Biodgradable dans le sol
Tourbe Divprocdscd industriels existent Pas uniforme (matire organique complexe) Biodgradable dans le sol
Libration des bactries progressive et Libration des bactries immdiate prolonge Contrle de qualit techniquement Qualit de production non constante simple Longue dure de conservation temprature ambiante Volume de stockage rduit Forte rsistance la contamination Dure de conservation limite Besoin de grand volume Faible rsistance la contamination.
Faible mortalit bactrienne dans le sol Faible mortalit bactrienne dans le sol Rsistante aux fluctuations dhumidit Forte sensibilit aux fluctuations dhumidit
Concentration maximale de l' inoculant La concentration de linoculant bactrien:1011 CFU/g bactrien peut atteindre 108 CFU/g
4.1. Caractristiques principales de lencapsulation Les principales fonctions de lencapsulation sont ici dcrites.
4.1.1. Immobiliser et/ou isoler Limmobilisation et/ou lisolation de produits actifs permettent dviter le contact direct des produits avec l'environnement. L'encapsulation est une mthode qui permet par exemple deux ractifs d'tre spars et de n'entrer en contact direct avec le milieu que lors de la rupture de la microcapsule. Le pigeage des armes au sein de microcapsules permet soit un effet
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aromatique prolong, soit sa libration uniquement lors d'une opration spcifique comme une cuisson par exemple. Dans le cas de cellules vivantes ou denzymes, l'immobilisation dans des microcapsule favorise leur utilisation prolonge au sein des biracteurs fermentation continue. Dans ce cas les capsules sont permables aux substrats et aux produits de la fermentation, mais permettent de consigner les bactries dans un espace. La fermentation se produit l'intrieur des capsules sphriques et non pas dans le milieu liquide de culture extrieure. Ceci permet daugmenter la densit de bactries et par voie de consquence daccrotre les performances du fermenteur (Cassidy et al. 1996). Lencapsulation de cellules vivantes peut galement avoir pour but de les librer de manire contrle dans un endroit cibl comme cest le cas des bactries probiotiques encapsules par exemple.
4.1.2. Protger De nombreux composs organiques sont fragiles et doivent par consquent tre protgs de leur milieu environnant. Par exemple, les vitamines ou les acides gras polyinsaturs sont facilement dnaturs par raction d'oxydation.
De nombreux additifs industriels sont employs dans l'industrie agroalimentaire dont le fer; son incorporation favorise l'oxydation des acides gras ce qui n'est pas forcement souhaitable. Technologiquement il est plus avantageux d'incorporer cet lment dans le support de capsules charges en Fe, dans ce cas, ce sera le support des capsules qui subira l'oxydation et non pas l'aliment. En somme, ce type de microencapsulation ferrique confre une plus grande efficacit technologique et est par voie de consquence plus conomique en ce qui concerne le cot li aux pertes engendres par un produit dfectueux.
Les cellules vivantes sont galement sensibles aux stress physiques et chimiques provoqus par des modifications de leur environnement. Les bactries probiotiques, par exemple, peuvent ne pas survivre au pH trs acide de lestomac. La microencapsulation des probiotiques peut permettre ainsi de protger les cellules du transit stomacal permettant datteindre leur cible intestinale (Ki-Yong et Tae-Ryeon 2000).
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4.1.3. Librer progressivement Un compos actif confin indfiniment ne prsente en soi qu'un intrt trs limit. Lencapsulation permet de librer le principe actif ou le mdicament un moment prcis et selon une cintique bien dfinie.
Ce n'est toutefois pas toujours le compos encapsul lui-mme qui sera libr, mais un sousproduit li la raction avec une autre molcule venant de l'extrieur (l'eau par exemple). Le compos encapsul sera l'un des produits de la raction, ou le catalyseur (enzyme) de ladite raction. Dans ce cas, il est plus juste de penser en termes de transfert du principe actif vers l'intrieur de la capsule ou vice versa, plutt qu'en terme d'une libration simple de celui-ci.
En ce qui concerne la libration progressive des rhizobactries. Bashan et al. (2002) ont valu la libration progressive de la souche A. brasilense depuis des billes dalginate en milieu liquide. Aprs 1 jour dessai le nombre des bactries libres a t de 3,7x103 UFC/g de billes, aprs de 6 jours 2,3x105 UFC/g et depuis 10 jours la concentration de A. brasilense libre a t de 6,3x105 UFC/g.
4.1.4. Structurer et fonctionnaliser L'encapsulation permet de crer de nouvelles fonctions et des structures innovantes. Par exemple, la permabilit de la membrane de la capsule peut tre fonction du pH du milieu, ainsi le principe encapsul sera alors libr en fonction de la permabilit de la membrane.
L'aspect de la microcapsule peut mme servir pour la diffrentier. Par exemple, sa forme peut servir d'indicateur pour renseigner le consommateur sur la nature du produit contenu dans la capsule. On trouve souvent sur le commerce des enrobages spcifiques possdant par exemple un "aspect mtallis" afin de diffrencier les aliments fonctionnels des poudres mdicamenteuses et alimentaires.
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4.1.5 Pourquoi encapsuler des rhizobactries? Selon Bashan et al. (1998; 2002), il existe de nombreux avantages lis lencapsulation de rhizobactries, cela permet:
De rduire la possibilit de contamination des inoculant pendant le stockage, le transport et lapplication. De produire linoculant en grande quantit et le stocker durant une longue priode sous la forme de capsules sches. De produire des inoculants avec une forme adapte aux quipements de semoir existant. De librer de manire contrle et progressive les cellules dans le sol. De plus, les capsules sont biodgradables et non toxiques.
Nanmoins, lencapsulation des rhizobactries peut prsenter un certain nombre dinconvnients :
La diffusion des gaz et de leau sont rduites dans la capsule. Le procd dencapsulation peut entraner des modifications mtaboliques des cellules, notamment dues au stress hydrique engendr par le schage (Cassidy et al. 1996). Ainsi, il peut tre ncessaire de rpter lapplication des capsules dans le sol pour un effet optimal.
Les chercheurs ont actuellement leur disposition un ventail de techniques et de matriaux pour immobiliser des cellules qui se sont largement dveloppes durant ces trente dernires annes. Lencapsulation constitue certainement lheure actuelle la voie la plus prometteuse pour permettre l'inoculation et une protection efficace des rhizobactries dans les sols.
4.2 Les techniques dencapsulation Lencapsulation est utilise dans un grand nombre dactivits industrielles (Jackson et Lee 1991). Le nombre de travaux de recherche en encapsulation sest densifi dans lindustrie agricole, en partie pour ce qui est de la rduction de lemploi d'engrais chimique (Marshall
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1968; Cassidy et al. 1996). Diffrentes tudes ont port sur lencapsulation des rhizobactries (Cassidy et al 1995; Mattila-Sandholm et al. 2002; Bashan et al. 2002), avec les objectifs suivants: lobtention dune concentration cellulaire finale suprieure ou gale 106 bactries viables/plante, maintien de la viabilit au cours du stockage pour au moins 6 mois dans des conditions ambiantes de temprature et dhumidit, libration progressive des cellules dans le sol. L'encapsulation est ralise gnralement en trois tapes :
- La premire tape consiste en l'incorporation du principe actif dans la matrice ou le cur de la capsule peut tre liquide ou solide.
- La deuxime tape est une opration mcanique consistant soit raliser une dispersion liquide/air ou liquide/liquide (cas d'une matrice liquide), soit pulvriser une solution sur les particules solides sous agitation mcanique (cas d'une matrice solide).
- La dernire tape consiste en une stabilisation par un procd chimique de polymrisation, ou par un procd physico-chimique (glification, coacervation), ou physique (vaporation, solidification) ralise sur les gouttelettes ou sur lenrobage form durant ltape prcdente.
Les applications potentielles offertes par lencapsulation ont conduit linvention et au dveloppement de nombreuses mthodes et techniques. Cette diversit de mthodes a fini par susciter des classifications complexes souvent incompltes (Shahidi et Han 1993; Risch 1995; Thies 1996). Il est souvent trs difficile de les diffrencier par catgories. Il existe ainsi une grande confusion dans les termes. Une mme technologie porte des noms variables en fonction du domaine, un mme terme pouvant parfois tre utilis pour des technologies diffrentes. Il y a souvent aussi confusion entre encapsulation et enrobage. 4.2.1 Le dripping Son principe drive de la production simple de gouttelettes issues d'une aiguille ou d'un injecteur. L'intrt principal de cette mthode est de former des gouttelettes dont la dispersion de taille est infrieure 10% de la taille moyenne.
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Les appareils de dripping disponibles actuellement sont les suivants:
a) Gnrateur simple de gouttelettes consistant faire passer le liquide travers une buse ou une aiguille. b) Gnrateur de gouttelettes haut dbit par rupture de jet : le jet liquide refoul la sortie de la buse est tranch par des fils fixs sur un disque tournant grande vitesse, ce tranchage est l'origine de la formation des gouttelettes. c) Gnrateur de gouttelettes disque tournant : un disque rotatif, sur lequel coule le liquide, entrane la projection de gouttelettes la priphrie du disque.
Scale-up
a) Gnrateur simple
b) Rupture de jet
c) Disque tournant
Figure II.6 Schma des diffrentes mthodes par dripping
Lencapsulation par dripping s'effectue gnralement par interaction ionique (entre alginate et calcium) ou action thermique (cires). Les deux principes peuvent galement tre combins, comme dans le cas du Carraghnane/KCl.
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4.3 Les matriaux dencapsulation Les matriaux dencapsulation doivent tre non toxiques, non polluants, et de qualit stable pendant une longue dure de conservation, c'est--dire prsenter une activit et une densit suffisante de cellules afin de les librer de manire progressive et prolonge dans le sol.
Les polymres naturels et synthtiques ont t utiliss pour lencapsulation de bactries. Les polysaccharides extraits des algues sont considrs comme naturels, comme l'alginate, le carraghnane, l'agar-agar, et l'agarose. Certains polymres synthtiques sont galement utiliss pour lencapsulation de cellules vivantes, ce sont les polyacrylamides, polystyrne et polyurthane (Trevors et al. 1992). Ces polymres synthtiques offrent, en effet, une bonne rsistance mcanique qui peut tre intressante pour une utilisation en fermenteur. Cependant, les gels sont forms par polymrisation ou par formation de ponts covalents interchanes (rticulation), qui doivent tres raliss en prsence des microorganismes et cela peut tre relativement hostile pour les cellules et provoquer des pertes dactivit cellulaire importantes.
L'alginate est l'un des produits le plus couramment utiliss pour l'encapsulation de microorganismes. Les inoculums qui en rsultent sont utiliss des fins diverses: l'immobilisation des organelles des cellules et des enzymes pour la fermentation et l'application d'agents de lutte biologique (Bashan et Holguin 1994).
Plusieurs polymres sont utiliss en microbiologie industrielle et environnementale, le tableau II.5 montre le potentiel technologique important de ces diffrents supports bactriens (Marshall 1968; Cassidy et al. 1996). Ainsi que leurs caractristiques fondamentales, leurs avantages et leurs limites sont prsents.
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Tableau II.5. Proprits des diffrents polymres employs pour l'immobilisation des rhizobactries.
Matriel Polyacrylamide
Avantages Facilement disponible
Inconvnients coteux, monomre trs toxique, dgradation lente coteux et dgradation lente Coteux
Utilisation Inoculation de Rhizobium
Rfrence (Dommergues et al. 1979)
Agar et agarose
Facilement disponible
XanthaneFournis une Gomme caroube protection pour les bactries Alginate Protection des rhizobactries et libration dans le sol de manire progressive
Encapsulation d'A. Bashan et al brasilense et de 1982 P. fluorescens (information non publie) Inoculation de (Jung et al. 1982) Rhizobium (Bashan et al. 2002)
Rduction de la Inoculation diffusion de dA. brasilense loxygne
4.3.1. Caractristique de lalginate de sodium Lalginate de sodium est produit par les algues brunes (Figure II. 6), comme Macrocystis pyrifera, Laminaria digitata, Laminaria hyperborea et Eklonia cava. La production dalginate n'est pas une exclusivit des algues, en effet, chez les bactries il existe aussi d'une production dalginate extracellulaire. Un exemple est celui d'Azotobacter vinelandii et de plusieurs souches de Pseudomonas (Fett et al. 1986; Fett et Wijey 1995). Les principaux pays producteurs d'alginate au monde sont: la Norvge, la France, les tats-Unis, le Prou et le Chili.
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La figure II.7. Algues brunes, source principale dalginate, attaches aux roches, images des ctes de lIle de Chilo, Chili.
Les alginates sont des macromolcules linaires constitues de deux monomres lis en alpha 1-4: lacide -D-mannuronique et lacide -L-guluronique dont la masse molculaire est comprise entre 20.000 et 200.000 Da. Lalginate glifie en prsence de certains cations divalents et principalement le Ca2+ par simple formation de liaison ionique entre les polymres. Les proprits de lalginate sont variables selon lorigine des algues et le procd de fabrication. Selon leur masse molculaire, les alginates ont des proprits de solubilit et de complexation avec le calcium.
Chaque molcule contient des rgions mannuroniques et des rgions guluroniques, et aussi des rgions o les deux types de rsidus salternent. Le polyuronide constitu par lenchanement des deux acides sappelle lacide alginique. Ces deux monomres ne sont pas rpartis au hasard dans les macromolcules, mais rpartis en segments dune vingtaine dunits. Lassemblage de ces segments en proportions variables dpend de lespce, de la partie de lalgue considre, de lge de lalgue, du lieu de rcolte. La rpartition des monomres dtermine les proprits glifiantes de lalginate. Nanmoins par slection de la matire premire, il est possible de fabriquer une varit d'alginate aux caractristiques constantes.
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La concentration d'alginate de sodium couramment employe pour l'encapsulation varie entre 1 et 3%. La solution d'alginate est mlange la culture cellulaire et est extrude dans une solution de CaCl2 dont la concentration varie ente 0,05 et 0,1M.. Le temps de sjour des billes dans cette solution pour obtenir la glification complte est de 30 minutes .
Plusieurs prparations base d'alginates ont t utilises pour l'encapsulation de mycorhizes arbusculaires, dectomycorhiziens et pour l'inoculation de bactries du genre Frankia (Bashan et al. 2002). Cette technologie a galement t utilise pour encapsuler les rhizobactries A. brasilense (Bashan 1986; Bashan et Holguin 1994; Bashan et Gonzalez 1999) et P. fluorescens (Paul et al. 1993).
4.3.2 Survie des rhizobactries encapsule dans des matrices dalginate La matrice d'alginate protge les cellules du stress mcanique et limite leur mortalit pendant le temps de stockage prolong (Morgan et al. 2006). Aprs un an de stockage temprature ambiante, le taux de survie dAzospirillum lipoferum encapsule dans des billes d'alginate sches est de 1010 CFU/g, la concentration dans ce cas est plus forte que dans les vecteurs classiques (Fages 1992).
Aprs 3 ans de stockage 4C, le taux de survie de Bacillus subtilis et de Pseudomonas corrugata immobiliss dans des billes d'alginate de sodium est de 108 UFC g-1. Aprs ces trois annes de stockage, les bactries n'ont pas perdu leur aptitude de stimulation la croissance des vgtaux tests. Ainsi, pendant le stockage les micro-organismes ont conserv leurs proprits physiologiques, celles-ci taient comparables celles du bouillon de culture de la formulation initiale (Trivedi et Pandey 2008). La survie de la souche A. brasilense Cd et P. fluorescens 313 encapsules en billes dalginate aprs 14 annes de stockage a t de 105-106 UFC/g des billes. Aprs cette priode longue de stockage, les rhizobactries n'ont pas perdu leur aptitude de stimulation de croissance des plantes de bls. Cette tude a prouv que les bactries peuvent survivre dans l'inoculant d'alginate au-dessus de longues priodes (Bashan et Gonzalez 1999).
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Du point de vue agricole et industriel, il est trs intressant de pouvoir utiliser des formulations dshydrates. Cependant, la dshydratation des capsules engendre un stress hydrique important sur les cellules ce qui entraine la mortalit dune grande proportion de la population bactrienne (Paul et al. 1993). Nanmoins lorsqu'elles sont correctement dshydrates le nombre de cellules survivantes peut tre suffisant pour effectuer une inoculation correcte.
De plus, dans des conditions de stress quelques espces bactriennes sont en mesure de produire et de stocker des substances osmoprotectrices. Par exemple, Azospirillum et Rhizobium produisent de la proline et du glutamate pour faire face une dshydratation (Botsford et Thomas 1990; Bashan et al. 2004). La proline et le glutamate sont des molcules de grande importance pour la survie des cellules vis--vis du stress hydrique (Morgan et al. 2006).
Il est galement possible daugmenter la protection des bactries vis--vis de la dshydratation par lutilisation de matriaux supplmentaires dans la formulation.
4.3.3 Ladjonction de lamidon la matrice dencapsulation Les amidons sont souvent employs par lindustrie agroalimentaire de faon varie, car ils fournissent une large gamme de fonctionnalit. La fonction recherche par cette industrie est principalement la formation de gel et sa proprit collante. Dans les formulations pharmaceutiques, lamidon est utilis comme additif et adhsif.
Lamidon est un hydrate de carbone qui constitue le principal moyen de stockage d'nergie des vgtaux. Ce glucide est stock sous forme insoluble et morphologiquement granulaire avec une structure semi-cristalline. Lamidon possde deux polymres de glucose : l'amylose et l'amylopectine. Ces polymres constituent 98% de la masse totale sche des granules natifs, le reste correspondant la masse des lipides, des minraux et des phosphates.
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Figure II.8. Les granules damidon de crales et des tubercules (Boursier, 2005).
Les granules damidons possdent une taille comprise entre 1 et 100 m, ils sont de forme polygonale, sphrique ou lenticulaire et sont composs damylose, et damylopectine avec des degrs de cristallisation variant dune espce botanique lautre (Wang et al. 1999) (Figure II. 8). Certaines bactries ont laptitude d'adhrer la surface de granules damidon et il a t suggr que l'adhsion des cellules sur les grains damidon tait lie son utilisation comme substrat (Jankowski et al. 1997).
Figure II. 9. Adhsion des bifidobactries sur la surface des granules damidon (MattilaSandholm et al. 2002).
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Au cours des dix dernires annes, un grand nombre de travaux de recherche ont vis limiter la mortalit des cellules encapsules. Lamidon a t utilis dans ce but pour lapplication de bactries probiotiques dans les produits laitiers ferments. L'adjonction de lamidon diminue la mortalit prmature des cellules. Le phnomne mcanique d'adhsion des bactries sur les granules d'amidon a t mis en vidence pour le genre Bifidobacterium. On a galement observ que ces cellules qui adhraient aux granuls d'amidon taient mieux protges lors du stockage ainsi que pendant le transit intestinal (O'Riordan et al. 2001). La figure II.9 montre des bifidobactries adhr la surface de grains damidon.
Figure II.10. Amidon partiellement hydrolys (haut) et amidon de pomme de terre rempli avec des bactries adhres lintrieur (bas).
Il est galement possible dencapsuler des bactries lintrieur de grains damidon pralablement partiellement hydrolyss. Ceci permet daugmenter la protection des bactries (figure II.10) (Benhamou et al. 1998).
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5. Conclusion
La prvision de production de crales pour rpondre laugmentation de la population mondiale indique des besoins en engrais azots trs importants. Un des moyens pour pallier cette demande est de fertiliser le sol avec des micro-organismes capables daugmenter la croissance des plantes. Leur intgration dans le sol doit cependant encore tre optimise et vrifier leur efficacit dans les champs.
Le dveloppement et l'industrialisation des produits biologiques bass sur les microorganismes bnfiques pour lagriculture ont fait crotre la protection et le rendement agricoles. Lemploi des bioengrais est apparu comme une solution prometteuse pour amliorer les rendements des cultures, sans apport d'engrais chimique. Au cours de cette dernire dcennie, beaucoup de travaux de recherche ont t consacrs identifier les rhizobactries les plus efficaces pour l'amlioration des cultures. Dune part, les donnes accumules en ce qui concerne l'inoculation en grandeur nature et sur le terrain un peu partout dans le monde suggrent que les techniques d'inoculation ont connu un succs entre 60 70%. Dautre part, un incrment significatif du rendement des cultures de l'ordre de 5-30% a t obtenu (Okon et Labandera-Gonzalez 1994).
De plus, l'emploi de cellules immobilises a t identifi comme une technologie intressante pour des applications dans le domaine de la protection de l'environnement. Certaines bactries peuvent, en effet, tre utilises en tant que bio-pesticides et en tant qu'agent de biodgradation de produits toxiques rsiduels susceptibles de polluer les nappes phratiques (Barneix et al. 2005).
Dans la plupart des cas, les rhizobactries sont inocules directement dans le sol sous forme liquide ou en utilisant soit de la tourbe ou de l'argile (Bashan et al. 2002). De nombreux travaux de recherches ont montr que l'encapsulation des cellules dans des billes d'alginate pourrait apporter une meilleure protection des cellules contre les agressions du milieu environnant proche et pourrait conduire un effet sur la croissance des plantes moins incertain (Dommergues et al. 1979).
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Lencapsulation a merg comme tant l'une des meilleures options technologies dintroduction dune flore bnfique dans un sol, car les capsules confrent aux bactries une protection cruciale pendant les premires tapes d'adaptation des micro-organismes l'environnement du sol (Amellal et al. 1998).
Dans ce travail, nous proposons dimmobiliser des rhizobactries dans des capsules partir dune formulation possdant un taux de matire sche initial lev. Cette forte concentration de matire sche de dpart devrait permettre de limiter la dure et la consommation nergtique de ltape de schage ainsi que doptimiser la viabilit des rhizobactries au procd dencapsulation.
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MATRIELS & MTHODES

Dans ce chapitre sont dcrits les matriaux et les mthodes utiliss pour ce travail de recherche. Nous avons tout dabord mis au point loptimisation de procd dencapsulation, puis nous avons test la capacit dadhsion des rhizobactries sur la surface des granules damidon et finalement nous avons produit des capsules grande chelle pour tudier la libration des cellules dans le sol.
Nous avons choisi de prsenter le chapitre Matriels & Mthodes en cinq sous-chapitres:
Micro-organismes et conditions de culture.
Procd dencapsulation.
valuation de ladhsion des cellules sur les grains damidon.
Libration de rhizobactries des capsules dans leau et dans le sol.
Production des capsules chelle pilote.
III. Matriels & Mthodes
1. Micro-organismes et conditions de culture

Dans cette partie, nous allons dcrire les souches de rhizobactries utilises pour cette recherche et leurs conditions de culture.
1.1 Souches de rhizobactries Les rhizobactries ont t utilises dans cette tude, en tant que souches modles, car ce sont des genres rhizobactriens bien tudis et souvent pris comme rfrence par dautres auteurs. Leurs effets sur la promotion de la croissance des vgtaux sont largement dcrits dans la littrature (Kloepper et Schroth 1981; Okon et Labandera-Gonzalez 1994; Zlotnikov et al. 2001; Schoebitz et al. 2009).
Le tableau III.1 rcapitule lensemble des souches qui ont t utilises pour ce travail.
Tableau III.1. Type des souches rhizobactrienne utilis dans cette thse.
Souches Azospirillum brasilense Sp245 et Sp7 Bacillus pumilus C26*
Source
Caractristiques
tat de conservation Agar solidifie
Universit Bacilles de 1-2 m, Catholique de Gram ngatif, mobile, Louvain, Belgique arobie
Universit Austral Bacilles sporulant, Gram Lyophilis du Chili positif, mobile
Raoultella terrigena Austrian Research Bacilles Gram ngatif, Agar solidifie TFI08* Centers GmbH immobiles, aroanarobies Enterobacter ludwigii Universit Austral Gram ngatif, arobie Lyophilis EMN037 (Schoebitz du Chili et al. 2009) Paenibacillus Universit de Bacilles Gram positif, Agar solidifie polymyxa MXC5* mobile, formant une Hohenheim, spore, aro-anarobie Allemagne * Souches isoles dans le cadre du projet Rhibac; en cours de publication.
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1.2. Milieux de culture Le milieu de culture est la matrice permettant la croissance bactrienne. Il sagit dune solution aqueuse o sont dissous tous les nutriments essentiels la croissance des bactries. La plupart des microorganismes cultivs ont besoin pour vivre d'lments chimiques essentiels pouvant tre incorpors dans le milieu soit par un substrat riche en protines, sucres et vitamines soit par lajout des lments essentiels en quantit prcise sous forme de sels minraux. Les milieux de culture utiliss pour produire la biomasse des rhizobactries sont le milieu YEP (Ivanova, 2006), le milieu dvelopp par l'Institut Maurice et le milieu TSB. La composition de ces milieux est prsente dans les tableaux III.2, III.3 et III.4.
1.2.1 Composition milieu YEP Le milieu de culture utilis pour les souches de rhizobactries figurant dans le tableau III.2, est couramment connu sous le nom de YEP (Yeast extract peptone).
Tableau III.2. Composition de milieu de culture YEP
Produit Peptone de viande
Nom commercial Peptone pancratique de Viande Type 2
Fournisseur
Concentration 5 g/l
Biokar Diagnostic, France Biokar Diagnostic, France
Extrait de levure
Extrait autolytique de levure
5 g/l
Chlorure de sodium
Chlorure de sodium
Fisher Chemicals, France
5 g/l
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Prparation du YEP:
Dans un Erlenmeyer de 1500 ml, introduire 500 ml deau distille. Introduire les diffrents produits du milieu de culture (tableau III.2). Verser les produits dans lErlemeyer contenant les 500 ml deau distille et agiter le mlange laide dun agitateur magntique jusqu' obtenir une solution homogne. Ajouter 500 ml d'eau distille. Striliser ce milieu de culture liquide dans un autoclave 121C pendant 20 minutes.
1.2.2 Milieu de culture de lInstitut Maurice R&D Dans ce travail de thse, nous avons galement employ le milieu de culture qui est prsent dans le tableau III.3.
Tableau III.3. Composition du milieu de culture de lInstitut Maurice R&D (Brussels, Belgium).
Produit H 20 Nutrient broth Yeast Extract Tryptone Peptone NaCl K2HPO4 MgSO4*7H20
Quantit 900 ml 16 g 8g 4g 3,2 g 4g 0,16 g 0,8 g
Fournisseur
Biokar, France Biokar, France Biokar, France Biokar, France Sigma Fisher Merck, Allemagne
Aprs, la strilisation des produits lautoclave. Le glucose et le chlorure de calcium ont t striliss par filtration.
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Tableau III.4. Additifs ajouts aprs strilisation du milieu de culture de lInstitut Maurice R&D.
Produit Glucose CaCl2
Concentration 22 g/l 1,6 g/l
Fournisseur Merck, Allemagne Biokar, France
Prparation de milieu de culture de lInstitut Maurice:
Dans un Erlenmeyer de 1500 ml, introduire 500 ml deau distille. Introduire les diffrents ingrdients du milieu de culture (tableau III.3). Agiter pendant 10 min le contenu de l'Erlenmeyer de 1500 ml sur un agitateur chauffant une temprature de 80C. Retirer l'Erlenmeyer de l'agitateur et ajouter 465 ml deau distille. Introduire l'Erlenmeyer dans un autoclave 121C pendant 20 minutes. Laissez refroidir le milieu de culture, puis on ajoute les additifs (tableau III.4) pralablement filtr laide dun filtre Millipore de 0,2 m.
1.2.3 Prparation du milieu Trypticase soy broth (TSB) Dans un Erlenmeyer de 1500 ml, introduire 500 ml deau distille. Peser 30 g/l de TSB dshydrate et prt lemploi (Grosseron, France). Le bouillon contient ainsi: tryptone 17 g/l, peptone papanique de soja 3 g/l, glucose 2,5 g/l, phosphate dipotassique 2,5 g/l et chlorure de sodium 5 g/l. Verser le contenu de la coupelle dans lErlemeyer contenant les 500 ml deau distille et agiter le mlange laide dun agitateur magntique jusqu' obtenir une solution homogne. Ajouter 500 ml d'eau distille. Striliser ce milieu de culture liquide, dans un autoclave 121C pendant 20 minutes.
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1.3 Rhydratation et conservation des souches bactriennes La conservation des souches bactriennes doit permettre de pouvoir disposer dun matriel bactrien stable aux proprits physiologiques constantes pendant une longue priode de stockage. La conservation des micro-organismes comprend trois tapes successives: la purification qui consiste isoler un clone unique, la multiplication qui permet de disposer d'une quantit suffisante de cellules et enfin le stockage.
1.3.1. Protocole de conservation La multiplication et la purification dune souche destine la conservation sont ralises de la manire suivante :
Prlever une fraction de lchantillon bactrien (colonie provenant d'un milieu dagarose). Inoculer les bactries dans un bouillon de culture YEP. Incuber 30C pendant 12 h. Prlever 0,1 ml du bouillon de culture incub et l'taler sur la bote de Ptri. Incuber la bote de Ptri pendant 24 h. Prlever de celle-ci un chantillon d'une colonie isole. L'chantillon ainsi prlev est plac dans un tube d'Eppendorf qui contient 1,8 ml de YEP agar + 0,2 ml de glycrol (20%). Stocker une temprature de 80C.
1.4 Cultures cellulaires La prparation des rhizobactries pour lencapsulation se droule en deux tapes; la premire est la rgnration de la souche, cest--dire la prparation de la pr-culture, la seconde est la culture proprement dite. La biomasse de rhizobactries t produite en Erlenmeyer, pour les essais au laboratoire et en fermenteur pour la production lchelle pilote.
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1.4.1 Cultures en Erlenmeyer Afin damorcer la fermentation, il faut multiplier les bactries dans une pr-culture. Cette tape consiste faire crotre les microorganismes, jusqu ce que la densit de population bactrienne soit suffisante pour coloniser efficacement le fermenteur de production.
Prparation de la pr-culture :
Prendre un Erlenmeyer de 50 ml. Introduire dans l'Erlenmeyer 9,8 ml de milieu de culture YEP. Ajouter 0,2 ml damorce bactrienne. Placer 24 h l'Erlenmeyer sous agitation (120 tours min-1) dans lincubateur une temprature de 30C.
Aprs la fermentation de la pr-culture, un chantillon de ce dernier est transfr dans lErlenmeyer, pour dmarrer la fermentation de la culture.
Prparation de la culture :
Prendre un Erlenmeyer de 100 ml. Verser 29,4 ml de milieu YEP dans l'Erlenmeyer. Ajouter 0,6 ml de pr culture. Placer dans lincubateur 30C pendant 24 h sous agitation l'Erlenmeyer (120 tours min-1). Aprs lincubation, prlever 1 ml de la culture afin de pouvoir effectuer le dnombrement de la concentration initiale de cellules (voir chapitre III.1.5).
1.4.2 Cultures en fermenteur Afin didentifier le milieu de culture qui permet la production dune grande quantit de biomasse pour les bactries, nous avons utilis diffrents types de milieux de culture. Parmi les milieux de cultures, nous avons valu le TSB (trypticase soy bean), le YEP et le milieu dvelopp par linstitut Maurice R&D.
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La production de la biomasse a t ralise dans un fermenteur (figure III.1) d'une capacit de 1500 ml, disposant seulement d'une rgulation de temprature et dun systme dagitation.
Tableau III.5. Paramtres utiliss pendant la fermentation.
Paramtre Temprature pH Agitation Temps Alimentation en oxygne
Valeur 302C 70,3 350 tours min-1 24 h 0
Figure III.1. Fermenteur pour la production de biomasse d'une capacit de 2 l (Setric Gnie Industriel, Toulouse, France).
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1.5 Dnombrement des cellules Lobjectif de cette partie est de connatre le nombre de bactries, prsentes la fois dans le milieu de culture cellulaire, et dans les capsules humides ou sches. Lorsquil sagit de dnombrer les cellules viables dans les capsules, une procdure de dissolution des capsules doit tre pralablement suivie.
Mode opratoire:
Prlever 1 ml du milieu culture choisi ou 1 ml de suspension cellulaire issue de la dissolution des capsules (voir chapitre III.1.6), le diluer dans 9 ml d'une solution physiologique strile. Rpter successivement la dilution encore 9 fois (figure III.2). Prlever 0,1 ml de dilution de chaque tube essai. taler chacune des dilutions sur toute la surface de chacune des botes de Ptri contenant de milieu glose YEP agar Placer les botes de Ptri pendant 24 ou 48 h dans l'tuve une temprature de 30C. Effectuer le comptage du nombre de colonies sur chaque bote de Ptri et le calcul de la concentration bactrienne a t effectu de la faon suivante:
UFC/ml = nombre de colonies* 10n 0,1
n=nombre de la dilution
Remarque: Le seuil de validation se situe entre 30-300 colonies. Un comptage se situant en dehors du seuil cit n'a pas t considr.
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Dans ce travail, nous avons exprim les rsultats de viabilit de diffrentes manires : - CFU/total : exprime le nombre de cellules vivantes pour un batch de production de capsules diffrentes tapes de la production. - CFU/g de capsules. - CFU/capsule.
Figure III.2. Schma de la technique dtalement sur la surface dune bote de Ptri contenant de YEP Agar.
1.6 Dnombrement des cellules contenues dans les capsules. Le procd de dissolution des capsules a t ralis afin de dnombrer la concentration en rhizobactries immobilises au sein des capsules. La mthode inclut les procdures de rhydratation et de dissolution des capsules.
Procdure de rhydratation des capsules: Prendre un tube essai vide et strile. Introduire 10 capsules. Ajouter 2 ml de NaCl 0,8%. Rhydrater sous agitation pendant 30 min.
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Procdure de dissolution des capsules: Introduire les 10 capsules rhydrates dans un autre tube essai vide et strile. Ajouter 10 ml de tri-citrate de sodium (60 g/l). Agiter pendant 30 min pour obtenir une suspension homogne. Prlever 1 ml de la suspension pour dnombrer sa concentration bactrienne (voir chapitre III.1.5 ).
1.7 Mthodes de caractrisation des bactries Afin de caractriser les bactries nous avons utilis le microscope optique et la loupe qui permet dobserver la morphologie et croissance des rhizobactries. 1.7.1 Microscopie optique et loupe binoculaire Deux types de matriels ont t utiliss: un microscope optique (Leica, Leica Microsystem Wetzlar GmbH, Allemagne) et une loupe binoculaire (Leica Wild M3C, Leica Microsystem Wetzlar GmbH, Allemagne).
Pour lobservation des bactries, on utilise un grossissement de x1000 grce un objectif x100 immersion ce qui permet de visualiser les bactries dont la taille est proche de 1 m.
La prparation microscopique est ralise en dposant un frottis fix et color pralablement pour la coloration de Gram (protocole au-dessous) sur une lamelle de verre. La loupe binoculaire a t employe pour lanalyse prliminaire de la surface des diffrentes capsules. 1.7.2 Morphologie et croissance des colonies Le dveloppement des colonies la surface de la glose aide identifier la puret des bactries, aprs le procd dencapsulation. En effet, chaque espce forme des colonies qui ont souvent une taille et une morphologie caractristiques. La structure des colonies bactriennes a t examine lil nu et laide dune binoculaire.
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Cette identification se fait en plusieurs tapes :
Inoculer 9,8 ml de bouillon nutritif (milieu YEP) avec 0,2 ml des bactries partir du stock conserv (80C) 28C pendants une nuit. Faire des dilutions progressives 102,103 etc... Transfrer 0,1 ml de chaque dilution au centre dune bote de glose (milieu YEP Agar) et taler en surface laide dun taloir en plastique strile. Incuber les botes de Ptri pendant 72 h 28C. Aprs lincubation, prendre une bote de glose avec des colonies bactriennes la surface. Mettre sous la binoculaire. Observer les colonies.
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2. Procd dencapsulation
Lencapsulation est une technique qui permet dincorporer une substance active dans une matrice. Cette technique est utilise pour immobiliser les rhizobactries dans des capsules. Elle consiste mlanger les bactries avec une matrice dencapsulation, cette dernire tant l'tat liquide. Ensuite, ce mlange est extrud travers une buse en goutte--goutte. Les gouttelettes ainsi formes tombent dans une solution de chlorure de calcium. Elles se transforment instantanment en des microparticules de gel sphriques.
Les diffrentes tapes doivent tre bien coordonnes et certaines peuvent tre ralises en parallle pour optimiser le temps et lefficacit de lopration. Une procdure globale dencapsulation (figure III.3) a t labore pour faciliter le suivi des oprations.
2.1 Prparation de rhizobactries pour lencapsulation L'ensemble du matriel utilis a t pralablement strilis dans lautoclave et l'opration d'encapsulation a t ralise dans des conditions aseptiques, en utilisant une hotte flux laminaire.
Protocole de concentration cellulaire:
Centrifuger la culture 8720 g +4 C pendant 10 min. Ajouter au culot cellulaire 3 ml de solution physiologique (0,85 % de NaCl) puis le centrifuger pendant 10 minutes. Extraire le surnageant l'aide d'une micropipette. Rpter encore ces trois dernires oprations. Aprs la dernire centrifugation, mlanger le culot obtenu avec 3 ml de peptone (1 g l-1) afin d'obtenir une suspension homogne.
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Figure III.3. Schma du procd dencapsulation et libration de rhizobactries.
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2.2 Prparation de la matrice dencapsulation Aprs la production de la biomasse, nous avons prpar la matrice dencapsulation afin de crer un support pour les rhizobactries. La composition de la matrice comprenait au moins lalginate plus un matriau pour augmenter la teneur en matire sche. Ces solutions ont t extrudes dans une solution de chlorure de calcium afin dobtenir une glification des billes dalginate. Les matriaux utiliss sont dcrits dans le tableau III.4.
2.2.1 Matriaux Les matriaux utiliss dans le procd dencapsulation sont dcrits dans le tableau III.6.
Tableau III.6. Description des matriaux utiliss dans le procd dencapsulation.
Nom Alginate de sodium Amidon de mas Amidon modifi Chlorure de calcium Gluconate de calcium
Rfrence Satialgine S60
Fournisseur Cargill, France
Amidon standard de mas Sigma-Aldrich, Allemagne Cleargum CO 01 Chlorure de calcium Calcium D-Gluconate Roquette, France Pancreac, Espagne Sigma-Aldrich, Allemagne
2.2.2 Choix de lalginate Nous avons test trois types dalginate en fonction de leur viscosit en solution et en fonction de la forme des capsules rsultante. Le principe tait datteindre une faible viscosit de la matrice dencapsulation afin de permettre son extrusion ou dripping sous forme de gouttes permettant d'obtenir des capsules de forme sphrique. Dans le tableau III.7, les alginates tests sont rpertoris ainsi que leurs proprits.
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Tableau III.7. Comparaison de trois types dalginate de sodium.
Alcogel 6021 Concentration (%) Viscosit 1% dans leau (Pa.s) Fournisseur 3 0,15-0,3 Cargill, France
Satialgine S550 3 0,2-0,4 Cargill, France
Satialgine S60 3 0,03-0,06 Cargill, France
Lalginate est le polymre le plus rpandu dans les applications dimmobilisation cellulaire, grce ses proprits: forte rsistance mcanique, chimiquement inerte, soluble (dans un milieu sans calcium); biodgradable, bonne protection des bactries et pendant une longue priode de stockage (Bashan 1998).
Il faut noter quau cours du dveloppement de nouvelles capsules ou de nouveaux produits pour lagriculture, il nest pas vident de trouver un matriau qui permette lui seul de satisfaire les diffrentes proprits recherches (Ivanova 2006). Par exemple, le faible pourcentage de matire sche que possde lalginate, il faudra ajouter des adjuvants la matrice dencapsulation, comme lamidon de mas ou largile.
2.2.3 Choix des agents de charge Dans le tableau III.8 sont dtailles les caractristiques des capsules dalginate, alginate-argile et alginate-amidon:
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Tableau III.8. Caractristiques des capsules dalginate, alginate-argile et alginateamidon.
Ingrdients alginate alginate-argile alginate-amidon
Matire sche (g/100 ml) 3 9 35
Diamtre capsule sche (mm) 1,0 0,11 1,3 0,03 2,3 0,16
2.2.4 Fabrication de la matrice et des solutions de glification La matrice a t prpare par l'intermdiaire soit d'un mlange d'alginate seul, soit d'alginateargile, soit d'alginate-amidon, le tout dissout dans l'eau distille et strile selon la prparation suivante :
Striliser sparment sous forme de poudre 3 g dalginate de sodium, 44,6 g damidon standard et 2,4 g damidon modifi pour la matrice alginate-amidon ou 7 g dargile et 3 g dalginate pour la matrice alginate-argile, dans un autoclave 120C, pendant 15 min. Prendre un bcher strile de 250 ml. Introduire 100 ml deau distille dans le bcher. Placer le bcher sous agitation. Ajouter la poudre dalginate doucement, afin dviter la formation de grumeaux. Agiter le tout durant 30 min pour obtenir une solution homogne. Ajouter au mlange homogne les poudres striles damidon standard et d'amidon modifi ou dargile. Agiter le tout pendant 15 minutes. Prparation de la solution de glification :
Prendre un bcher de 2000 ml. Introduire 14,7 g de Ca2+ chloride ou de Ca2+ gluconate. Ajouter 1000 ml deau distille.
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Mlanger avec un agitateur magntique pendant 10 min. Striliser la solution dans lautoclave 120C pendant 15 min.
2.3. Fabrication des capsules La fabrication des capsules a t ralise avec lappareil dextrusion ou dripping (Figure III. 4). Le principe consiste faire passer la matrice dencapsulation contenant des rhizobactries travers une aiguille pour obtenir des gouttelettes. Les gouttelettes formes par extrusion sont rceptionnes dans une phase aqueuse glifiante contenant du chlorure de calcium. Elles se transforment instantanment en des microparticules de gel sphriques.
Figure III.4. Procd dextrusion de billes dalginate en goutte goutte
La fabrication des capsules a t ralise avec lappareil dextrusion selon la procdure suivante :
Produire la biomasse (voir dtails dans le chapitre III.1.4). Centrifuger 30 ml du milieu de culture (8720 x g, 10 min 4C). Incorporer le culot dans 3 ml de solution de peptone 1%. Mlanger la solution dans 30 ml de la matrice choisie. Homogniser pendant 15 min. Aspirer le mlange matrice-suspension cellulaire dans une seringue de 50 ml.
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Placer la seringue contenant la matrice dans une pousse-seringue (Kd Scientific, tatsUnis). Extruder la matrice contenant les rhizobactries un dbit de 120 ml/h. Rceptionner les gouttelettes dans la solution de glification pralablement place sous agitation dans un bcher. Au contact de la solution, les gouttelettes formes se transforment instantanment en des particules de gel sphriques (hauteur de chute 15 cm). Agiter les capsules dans la solution de Ca2+ pendant 30 min. Rincer les capsules 2 fois avec une solution physiologique (0,8 % de NaCl). Rcuprer les capsules contenues dans le bcher laide dun tamis.
2.3 Le schage des capsules Le schage des capsules contenant des rhizobactries est une opration critique pour la viabilit des cellules, cest pourquoi deux systmes de schage ont t tests au cours de ce travail. Le schage ltuve a t utilis prfrentiellement pour le schage en laboratoire et ltuve et lit fluidis ont t utiliss pour le schage l'chelle pilote (voir chapitre 5.1.3).
2.3.1 Schage ltuve Le schage des capsules est une opration critique qui permet daugmenter la dure de conservation des capsules. Pour la plupart des expriences dcrites, dans ce travail de recherche, nous avons opt par le schage dans l'tuve. Les capsules sont places en mono couche dans une bote de Ptri contenant du papier filtre ltuve une temprature de 35C, pendant 24 h.
2.4 Stockage des capsules Pour la plupart des expriences prsentes dans ce travail, les capsules sont stockes 4C dans des flacons en plastique ferms aprs leur schage complet.
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Figure III.5. Capsules dalginate-amidon stock dans des flacons en plastique ferm.
Pour une partie des expriences, les capsules ont t stockes diffrentes activits de leau aprs un schage partiel sur lit fluidis (tableau III.9). Lhumidit relative a t fixe dans des bocaux grce la prsence de solutions satures en sel (figure III.6). Le bocal dessiccateur est quip d'un support en verre sous laquelle on dispose une solution sature en sels ayant une activit de leau bien dtermine (tableau III.10).
Tableau III.9. Linfluence du temps de schage au lit fluidis des capsules sur la perte de lactivit de leau (Aw).
Temps de schage (min) 80 85 90 105 110
Aw 0,84 0,75 0,55 0,31 0,11
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25 C
Grille perfore Solution sature en sel
Figure III.6. Schma du bocal de stockage des chantillons des capsules de lamidonalginate 25C et avec un Aw rguls.
Les capsules ont t stockes dans les bocaux pour une priode de 16 semaines.
Tableau III.10. LAw en prsence des solutions en sel satures 25C.
Sel LiCl MgCl2 Mg(NO3)2 NaCl KCl
Aw 0,114 0,313 0,550 0,750 0,845
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3. valuation de ladhsion des cellules sur les grains damidon

3.1 Test de cosdimentation Dans notre travail de recherche concernant l'adhsion cellulaire sur les granules d'amidon, nous avons tudi diffrents types de rhizobactries et damidon:
A. brasilense Sp245, Sp7. B. pumilus C26. E. ludwigii BNM 0357. P. polymyxa MXC5. R. terrigena TFi08.
Les amidons suivants ont t tests :
Mas standard (native maize starch, Sigma, USA). High mas (1043, high-amylose, National starch, UK). Waxy mas (waxy corn starch; Sigma, St. Louis, USA). Bl (unmodified starch, Sigma, St. Louis, USA). Pomme de terre (Native starch, Sigma, Steinheim, Germany).
Le protocole de sdimentation a t adapt partir de celui de Crittenden et al. (2001): 10 ml de milieu de culture contenant des rhizobactries sont rincs avec 10 ml dune solution tampon phosphate pH 7,0 (0,1 M). Ensuite le culot bactrien est mlang avec 10 ml de solution tampon phosphate.
Dans un tube essai, on mlange 5 ml de la suspension de rhizobactries et 5 ml de la suspension tampon qui contient 10 g/l d'amidon.
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La suspension rsultante est laisse au repos pendant 1 h temprature ambiante (voir figure III.7).
2 ml du tube essai de la mme suspension 0,5 cm au dessous de la surface du liquide ont t prlevs. Cet chantillon est analys l'aide du spectrophotomtre afin dvaluer la densit cellulaire. Pour ce travail de recherche, une densit optique de DO540 est utilise. Une solution de tampon phosphate est choisie comme solution talon de rfrence laquelle a servi pour toutes les mesures de spectrophotomtrie.
La mesure du pourcentage de rhizobactries adhres aux granules damidon pendant les tests effectus sur les chantillons prlevs, sont compars avec des chantillons de rfrence qui contenaient des rhizobactries sans amidon et des chantillons d'amidon sans bactries.
Le pourcentage de rhizobactries adhres aux granules damidon s'expriment selon la l'expression suivante (Crittenden, et al. 2001) :
X= % des rhizobactries adhr aux granules damidon a= Do540 des chantillons d'un tube essai avec de l'amidon + rhizobactries b= Do540 des chantillons d'un tube essai avec seulement de lamidon c= Do540 des chantillons d'un tube essai avec seulement des rhizobactries
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amidon
bactries
Figure III.7. Schma du test de cosdimentation des cellules libres et adhres sur les granules de lamidon.
3.2 Observation de ladhsion des cellules sur les granules damidon au microscopique lectronique balayage La microscopique lectronique balayage (MEB) est une technique puissante dobservation de la morphologie des micro-organismes et de la structure des capsules. Elle est fonde principalement sur la dtection dlectrons secondaires mergents de la surface sous limpact dun trs fin faisceau d'lectrons primaires qui balaye la surface observe et permet dobtenir des images avec un pouvoir sparateur infrieur 5 nm et une grande profondeur de champ.
Pour rendre la surface conductrice et permettre une observation fine haute tension, on dpose par pulvrisation cathodique sur l'chantillon, un film mtallique trs fin (30-50 nm) de prfrence en or ou platine.
Ces lments lourds amplifient lmission dlectrons secondaires et assurent une excellente rsolution spatiale. De plus, comme ils sont inaltrables, ils permettent une longue conservation.
Mais il nest pas toujours facile de raliser une couche fine et uniforme, en particulier sur les chantillons poreux et les chantillons avec surfaces trs accidentes ou les chantillons trs htrognes.
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3.2.1 Protocole de prparation des chantillons pour la microscopique lectronique balayage (MEB) Les bactries sont prleves aprs 24 h de culture 30C, dans un milieu de culture YEP.
Une gouttelette de culture est verse sur le filtre Whatman Anodisc 25 de 0,2 m de seuil de coupure et de 2,5 cm de diamtre. Ensuite les filtres ont t placs dans une bote de Ptri ouverte. Il sera dpos par la suite dans une tuve durant 30 min 30C.
Le filtre avec les bactries dshydrates est dpos dans un flacon qui contient une solution tampon phosphate pH 7,0 pendant 10 min.
La membrane o sont dposes les rhizobactries est plonge dans une solution aqueuse de Glutaraldhyde de concentration 0,25% et laisse pendant 2 h. Pour ce qui est des prparations des capsules, on emploi du Glutaraldhyde une concentration de 2%.
La dernire tape est celle de la dshydratation l'aide de diffrente concentration dthanol, savoir: 30, 50, 70, 80, 90 et 99.
Les filtres avec les bactries fixes ou les capsules fixes dans le filtre ont t placs dans une bote de Ptri contenant une concentration de 30dthanol, pendant 10 minutes. En suite les filtres ont t placs, dans des concentrations dthanol suprieur, jusqu 99C. Aprs de la dshydratation lthanol, les cellules sont prtes pour lobservation au microscope lectronique balayage.
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4. Libration des rhizobactries des capsules dans leau et dans le sol

L'objectif de ces essais est danalyser et de mesurer la libration des rhizobactries des capsules vers le milieu extrieur, dans leau et dans le sol. Pour cela, nous avons mesur le nombre des bactries libres rellement dans le sol et le nombre de bactries qui restent dans les capsules. 4.1 Libration des rhizobactries dans leau La libration des rhizobactries par les capsules a t effectue au laboratoire dans les fioles Erlenmeyer (figure III.8). Les tapes sont les suivantes :
Prendre 0,5 g de capsules contenant des rhizobactries. Les verser dans la fiole Erlenmeyer. Ajouter 10 ml de solution physiologique strile (0,85 % w/v). Mlanger pendant 24 h; 30C 120 tours min-1. Prlever l'aide d'une micropipette 1 ml de la solution contenue dans lErlenmeyer. Dnombrer la concentration bactrienne dans la solution physiologique. Vider la solution restante. Rpter les cinq dernires oprations prcdentes plusieurs fois.
Figure III.8. tapes exprimentales pour tester la libration des rhizobactries dans leau.
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4.2 Libration des bactries dans le sol Lobjectif de cette partie a t de mesurer la libration progressive des rhizobactries depuis les capsules. Nous avons comptabilis le nombre des B. pumilus librs dans le sol strilis. Le dnombrement a t effectu durant une priode de 3 semaines.
L'chantillon du sol type argileux (pH 5,2) a t prlev Nantes lanne 2009 et tamis deux fois laide dun tamis en acier inoxydable de porosit 50 m afin de le dbarrasser des grosses particules et des petits cailloux et dobtenir une texture fine. Par la suite, l'chantillon de sol a t strilis par autoclave en deux cycles de 15 minutes dans des flacons en verre et une temprature de 120C.
Protocole de libration des bactries dans le sol (figure III.9):
Prendre un flacon strile de 7 cm de hauteur x 2,5 cm de diamtre. Prendre 10 capsules dalginate-amidon contenant des rhizobactries. Verser les capsules dans des flacons en plastique strile Ajouter 20 g de sol sec. Mettre 3 ml de solution physiologique strile (teneur en eau finale 10%). Mlanger le sol et les capsules laide dune spatule strile. Fermer le bouchon du flacon. Laisser les flacons ltuve pendant 4 semaines une temprature de 25C Retirer les capsules chaque 4 jours, pendant une priode de temps de 4 semaines. Dnombrer la concentration bactrienne du sol.
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Figure III.9. tapes exprimentales pour tester la libration dans le sol des rhizobactries contenues dans les capsules. Nous avons valu le taux de survie de B. pumilus dans le sol inocul sous forme liquide et dans les capsules. 24 flacons striles ont t remplis avec 20 g d'chantillon de sol strile puis inocul avec 3 ml de culture bactrienne (1x107 UFC/ml). 24 flacons supplmentaires ont t inoculs avec 10 capsules chacun. Lensemble a t homognis laide dune spatule strile puis incub ltuve pendant 4 semaines une temprature de 30C.
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Figure III.10. Mesure de la concentration bactrienne dans le sol.
Le prlvement des sols a t fait chaque 4 jours, pendant 4 semaines. Le contenu de chaque flacon a t vers dans un sac stomacher, puis dilu au dixime dans une solution physiologique strile. Lensemble a t homognis pendant 1 minute dans l'appareil de stomacher avant dtre dnombr par dilutions successives.
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5. Production des capsules chelle pilote

Afin de tester lefficacit des capsules en champs, nous avons ralis des productions plus grande chelle. Tout dabord, nous nous sommes dplacs Valdivia (Chili) pour produire environ 14 kg des capsules dalginate pour une application immdiate sur le sillon de plantation des semences de bl (session de plantation septembre 2009).
Nous avons galement fabriqu des capsules dalginate-amidon contenant la souche B. pumilus C26 chelle pilote au sein de notre laboratoire lONIRIS et dans la halle de technologie du mme tablissement que nous avons envoy notre partenaire industriel du projet Rhibac en Angleterre. 5.1 Production de la biomasse lONIRIS La souche B. pumilus C26, slectionne pour le projet Rhibac, pour ses capacits augmenter la croissance des plantes en climat tempr a t utilise pour produire des capsules dalginate-amidon. La production de la biomasse a t effectue dans deux bonbonnes en plastique rsistantes au passage dans lautoclave, l'intrieur dune tuve une temprature de 30C. Les paramtres utiliss durant ltape de fermentation sont dcrits dans le tableau III.11.
Tableau III.11. Paramtres utiliss pour la production de la biomasse dans la bonbonne de fermentation.
Paramtres Milieu de culture YEP Temprature pH Temps T
Valeur 10 L 30 C 7.0 24 h 30 C
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Nous avons utilis le milieu de culture YEP, pour la production de la biomasse de la souche B. pumilus. Le milieu de culture a t strilis deux fois (121C ; 20 min), pour assurer une strilisation complte du milieu de culture, en particulier au centre de la bonbonne. Le temps de fermentation a t de 24 h, avec une agitation ralise laide dun barreau magntique de 6 cm de longueur insr l'intrieur de la bonbonne (figure III.11).
Figure III.11. Production de la biomasse en deux bonbonnes de fermentation.
Contrairement la production lchelle laboratoire (30 ml de milieu de culture), ltape de centrifugation a t limine du fait dun volume de culture obtenue trop importante (10 l) et les bactries ont t encapsules dans leur milieu de culture.
Les poudres dalginate et amidon nont pas t strilises, car les contaminations microbiologiques taient au-dessus dune dilution de 102. Finalement, les 10 litres de milieu de culture ont t mlangs avec lalginate et lamidon laide dun mlangeur de matrice type cutter vertical (figure III.12).
5.1.1 Prparation de la matrice La prparation de la matrice d'encapsulation alginate-amidon a t faite selon la mme proportion dalginate et damidon que la procdure ralise dans le laboratoire. Dans la production de la matrice chelle pilote, nous avons utilis galement 45 % damidon
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standard de mas, 2 % damidon modifi et 3 % dalginate de sodium satialgine S60. Les quantits de chaque lment de la formulation sont prsentes dans le tableau III.12.
Tableau III.12. Prparation dun batch de matrice dencapsulation dalginate-amidon.
Matrice dencapsulation Solution microbienne Masse de l'amidon de mas Masse de l'alginate Masse de lamidon modifi Masse totale
Poids (kg) 10,5 4,68 0,32 0,25 15,75
La solution microbienne de B. pumilus et la matrice dencapsulation ont t mlanges laide dun mlangeur vertical. Une matrice homogne a t obtenue aprs 30 300 tours par minute.
Figure III.12. Mlangeur de matrice type Cutter vertical 515.
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Lutilisation du mlangeur type cutter vertical a permis lobtention dun mlange homogne entre la matrice dalginate-amidon et la biomasse bactrienne.
Figure III.13. Systme de dripping muni de 8 buses d'extrusion (a), les gouttes formes sont glifies dans un bain de solution de CaCl2 sous agitation (b).
Lencapsulation a t ralise par dripping munie de 8 buses d'extrusion, ayant chacune un diamtre interne de 1,5 mm. Ce systme d'encapsulation est reli une pompe pristaltique, qui extrude sur chacune des buses la matrice d'encapsulation dalginate-amidon. Les gouttelettes formes par extrusion ont t rceptionnes dans 5 litres de CaCl2. Le dbit gnr par cet appareil se situe aux environs de 1,2 kg de capsules humides par heure.
5.1.2 Schage des capsules Nous avons test deux systmes de schage, le premier a t le lit fluidis. Dans ce cas, le principe du lit fluidis est de scher les particules mises en suspension dans lair. Ce dernier est fourni au lit par une plaque de distribution perfore spcialement conue. La vitesse dentre de lair est rgle pour tre suffisante pour soutenir le poids des particules en suspension. Lavantage de cette technique est que le temps de schage des capsules est
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d'environ 2 h. Le deuxime systme de schage test a t ltuve couple un ventilateur, avec un temps de schage de 72 h.
5.1.3 Schage sur lit fluidis Nous avons utilis le lit fluidis pour le schage des capsules, car ce systme permet de scher un grand volume de capsules en un temps assez rduit.
Les paramtres de temprature et vitesse de lair pour le schage de la souche B. pumilus C26 sont montrs dans le tableau III.14.
Tableau III.14. Caractristiques du schage en lit fluidis
Valeur Temps schage t moyen Vitesse de lair Poids total des capsules humides Poids total des capsules sches 75 min 25 C 2,0 m/s 2,0 kg 0,675 kg
Le schage des capsules a t ralis selon la procdure ci-dessous:
Placer les capsules humides dans la cuve du lit fluidis quipe dune grille perfore pour permettre le passage de lair. Faire passer lair une temprature de 25C et une vitesse de 2,0 m/s. Arrter le schage quand l'activit de leau (Aw) des capsules est infrieure ou gale 0,25 et que la teneur en eau est comprise entre 12-15 %.
Le nombre total de bactries a t dtermin avant et aprs le schage. Nous avons suivi aussi la survie des rhizobactries au cours du schage en prlevant des chantillons des capsules. La figure III.19 prsente le systme de schage sur lit fluidis.
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Figure III.14. Systme de schage sur lit fluidis (a) et la chambre de schage des capsules (b).
Nous avons utilis dabord le lit fluidis pour le schage des capsules, car ce systme permit le schage dun grand volume de capsules en un temps de schage assez rduit. Les paramtres de temprature et de vitesse de lair pour le schage de la souche B. pumilus ont t montrs dans le tableau III.14.
On a constat durant le dbut du procd de schage, une fluidisation limite des capsules. La figure III.14 b ci-dessus montre le passage de lair seulement pour certaines zones du lit. Aprs, que les capsules ont perdu une partie importante d'humidit.
5.1.4 Schage ltuve Les 10 kg de capsules humides produits ont t placs et rpartis sur 4 claies de schage. Les capsules humides ont t mlanges priodiquement, pour assurer un schage homogne de l'ensemble. Le tableau III.13 prsente les conditions de schage et les caractristiques finales des capsules sches.
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Tableau III.13. Caractristiques du schage ltuve.
Valeur Temps schage t moyen Humidit de lair Poids total capsules humides Poids total capsules sches Teneur en eau finale Aw final 72 h 35 C 10 % 10 kg 4 kg 7,0 % 0,15
Ltuve est quipe de capteurs qui donnent la temprature et lhumidit de lair. Lair de schage a t pralablement sch grce un dshumidificateur. Au dbut, le schage des capsules a t htrogne, car seulement les capsules places en surface ont t sches. Raison pour laquelle le temps de schage (72 h) a t prolong pour scher les 10 kg de capsules.
La figure III. 14 (gauche) montre ltuve utilise pendant le schage et la figure IIl.14 (droite) prsente les 4 claies contenant 2,5 kg de capsules humides.
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Figure III.14. tuve de schage modle Vtsch VC 7018 munie dun ventilateur l'intrieur et de 4 tages pour placer les claies de schage.
5.2 Production des capsules lUniversit Austral du Chili (UACH) La premire tape de ce travail a t de sassurer dune quantit dinoculum suffisant pour raliser nos lots l'chelle pilote. Trois souches ont t employes: R. terrigena TFI08, P. fluorescens C139, B. pumilus C26. Pour ce qui est de chacune des trois souches, une fermentation par souche a t ncessaire pour produire chaque type de biomasse. La fermentation a t effectue partir dune pr-culture.
Lamorce de linoculum de R. terrigena a t fournie par lAustrian Research Center, Vienne, Autriche (ARC) et le B. pumilus et P. fluorescens ont t fournis par lUACH sous la forme dinoculum lyophilis. Pour chaque type de rhizobactries, une fermentation a t ncessaire pour produire la biomasse. La fermentation a t ralise lUACH dans le fermenteur de type Biotron de 8 litres de capacit, avec un contrle automatique du pH, la concentration de l'oxygne, la temprature et le tour dagitation. Pour les fermentations, les paramtres suivants ont t utiliss:
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Tableau III.14. Paramtres utiliss pendant la production de la biomasse dans le fermenteur de type Biotron.
Paramtres Milieu de culture YEP Temprature pH Temps Agitation Alimentation en oxygne
Valeur 8l 30 C 7,0 24 h 350 tours min-1 1,0 vvm (volume doxygne par volume de liquide par minute)
La fermentation des rhizobactries a t effectue dans deux cuves de fermentation de 5 l et de 3 l de capacit. La rgulation du pH a t effectue avec une solution de 30 % dacide H3PO4 et une solution de 10 M de la base NaOH.
Figure III.15. Production de biomasse dans un fermenteur Biotron de 8 litres de capacit.
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5.2.1 Encapsulation de bactries Lorsque les cellules ont t bien disperses, on a ajout 3 % de lalginate (Gely Gum 7208). Le mlange est homognis l'aide d'un robot de cuisine. Le mlange biomasse-alginate a t aspir l'aide d'une pompe pristaltique pour tre ensuite refoul sur un systme d'coulement multi buses en acier inoxydable (40 buses avec un diamtre interne de 1,5 mm). Ce dispositif exprimental a t mis au point par le professeur Luigi Ciampi de l'Universit Austral du Chili. Cet appareil exprimental a permis un gain de temps et d'efficacit, car le mlange extrud en goutte--goutte s'est ralis via les 40 buses dans le bain de glification de chlorure de calcium. Le dbit dextrusion de la solution atteint a t de 3 4 l/h. Le diamtre des billes produites tait de 3 mm.
Figure III.16. Formation de la matrice dencapsulation, homognisation de culture bactrienne et lalginate de sodium.
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Figure III.17. Le systme dextrusion goutte goutte Multi buses munies de 40 buses d'extrusion en acier inoxydable, chacune dbite des gouttes d'environ 3 mm diamtre.
Le systme d'encapsulation utilis est connu comme un systme dextrusion goutte goutte multi buses, a t fabriqu en acier inoxydable (figure III.17). Ce systme d'encapsulation est reli une pompe pristaltique, qui extrude sur chacune des buses la matrice gel-liquide d'encapsulation. Le dbit gnr par cet appareil se situe aux environs de 55000 billes/h, ce qui confre ce dispositif exprimental de bonnes perspectives pour l'adapter des oprations d'encapsulation chelle de grands pilotes ou industrielle.
Il a t choisi de faire des billes humides, car lutilisation de cet inoculant biologique de sol a t ralis dans les jours suivants notre tape dencapsulation. La formulation des billes humides a comme inconvnient lutilisation immdiate dans les essais sur les champs de culture et l'impossibilit de stocker les billes pour une priode de temps prolonge. Dun autre ct, le schage de billes diminue en 2 logs le taux de survie des rhizobactries, donc lutilisation de billes humides permet dinoculer le sol avec une concentration leve des rhizobactries.
94
6. tude de lefficacit des inoculums encapsuls en champs

Afin de permettre des essais en champs par nos partenaires du projet Rhibac, Masstock (Angleterre) et lUniversit Australe du Chili, nous avons ralis une production lchelle pilote de rhizobactries encapsules. Au cours de la production, nous avons fabriqu 14 kg de capsules dalginate humides pour lessai au Chili et 2 kg de capsules dalginate-amidon sche pour les essais en l'Angleterre. Nous avons ralis ces productions lUACH et ONIRIS Nantes, France.
6.1 Essais en champs au Chili Pendant la priode Juillet-Aout 2009, nous nous sommes dplacs Valdivia, Chili, pour produire des rhizobactries immobilises dans des capsules dalginate pour les essais en champs de notre partenaire du projet Rhibac. L'ensemencement des graines de bl de la varit Pandora et linoculation des rhizobactries immobiliss ont t faits le 3 septembre 2009.
L'objectif de cet essai a t dvaluer leffet des 3 genres de rhizobactries isols par notre partenaire du projet sur leur capacit solubiliser les phosphates du sol (concentration moyen de phosphate du sol: 11 ppm). Le but a t daugmenter la disponibilit du phosphate afin daugmenter la croissance des plantes de bl. Cest pourquoi lUACH a valu 5 traitements diffrents et dans tous les cas, avec la mme fertilisation azote. Le tableau III.15 rcapitule les essais raliss par notre partenaire.
95
Tableau III.15. Fertilisation base des phosphates (P2O5) et nitrates d'ammonium (NH4) NO3 dans les essais des champs au Chili.
Traitements + phosphates - phosphates Billes de R. terrigena Billes de P. fluorescens Billes de B. pumilus
Fertilisation P2O5 (Kg/ha) 150 0 0 0 0
Fertilisation (NH4)NO3 (Kg/ha) 300 300 300 300 300
La fertilisation base de phosphate a t incorpore dans seulement un traitement au dbut de lensemencement. La fertilisation base de nitrates a t de 300 kg/ha pour tout le traitement. Cette quantit dazote a t divise par trois et ajoute au sol au dbut de lessai, dans ltape de tallage et finalement dans ltape de formation de lpi.
Nous avons adapt notre production de inoculants biologiques, par rapport aux demandes de notre partenaire, pour obtenir une concentration en rhizobactries leve pour chaque semence de bl. Le tableau ci-dessous montre les caractristiques chimiques du sol et les caractristiques de lessai de terrain.
Tableau III.16. Caractristiques chimiques du sol en Valdivia, Chili. Valeur 6,0 11,9 2652 43,2 11,5 136,5 8,1 12,5 14
pH P (ppm) Ca (ppm) Mg (ppm) Na (ppm) K (ppm) Al (ppm) N (ppm) MO (%)
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Tableau III.17. Description de la caractristique de lessai dinoculation des rhizobactries encapsules en champ.
Valeur Semences de bl Taille de lot Traitement N rptition Total surface 350 graines/m2 7,5 m2 5 3 112 m2
Les capsules ont t incorpores en mme temps que l'ensemencement des graines de bl. Les capsules et les graines de bl ont t semes laide dun semoir employ par notre partenaire. Elles ont t ajoutes 1-2 cm des semences du bl. Une deuxime inoculation liquide de 20 ml par ligne (106 UFC/ml) a t faite au cours de ltape de tallage des plantes pour tous les essais, afin de renforcer linoculation des rhizobactries. Linoculation liquide a t disperse sur les fouilles de bl, laide dune pulvrisateur dos de 50 l de capacit total.
Tableau III.18. Description de la concentration en rhizobactries par billes et par semence.
Valeur Concentration billes Concentration billes Poids bille Billes par lot Graines par lot Billes par m2 Relation graines/billes 1,5x1012 UFC/g 2,1x1010 UFC/billes 0,014 g 0,3 kg 0,16 kg 0,04 kg/m2 1:8
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Le rendement de la biomasse total de culture de bl a t mesur travers la matire sche, en pesant la masse de feuilles, de tilles, dpis et de graines. Le rendement de bl a t mesur en pesant le poids des graines de bl.
Les figures III.18 et III.19 reprsentent respectivement un aperu gnral des lots et dun lot dinoculation de rhizobactries encapsules.
Figure III.18. Aperu gnral des lots raliss pour notre partenaire UACH, Valdivia, Chili.
Figure III.19. Aperu dun lot (1,5x5 m) dinoculation de rhizobactries encapsules dans la culture de bl.
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6.2 Essai en champs en Angleterre Nous avons produit au sein de notre laboratoire des capsules sches dalginate-amidon pour le partenaire industriel Masstock. L'ensemencement des graines de bl de la varit Paragon dans la zone de Cambridgeshire et linoculation des rhizobactries immobilises a t fait le 24 davril 2009. L'objectif tait dvaluer leffet de nos capsules dalginate-amidon sur le rendement de production du bl dans un autre pays avec des conditions climatiques et un sol diffrents de ceux du Chili. Les caractristiques chimiques du sol sont dcrites dans le tableau III.19 Les caractristiques chimiques du sol et la description de lessai sont donnes dans la partie matriel et mthodes et est rsume dans le tableau III.19 et III.20.
Tableau III. 19. Caractristiques chimiques du sol en Cambridgeshire, UK. Valeur pH P (ppm) Ca (ppm) Mg (ppm) Na (ppm) K (ppm) 6,5 26 1600 50 90 241
Tableau III.20. Description de lessai dinoculation des rhizobactries encapsules en plein champ. Valeur Semences de bl Taille de lot Taux dazote N rptition Total surface 400 graines/m2 15 m2 3 4 180 m2
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Les capsules ont t incorpores en mme temps que l'ensemencement des graines de bl avec un rapport dune semence pour trois capsules. La concentration finale en bactries par semence tait de 1x108 UFC.
Tableau III.20. Description de la concentration en rhizobactries par bille et par semence. Valeur Bactries dans la bille sche Bactries dans la bille sche Poids de bille Billes par lot Semences par lot Billes par m2 Relation semence/bille 2,9x109 UFC/g 4,7x107 UFC/bille 0,02 g 0,3 kg/lot 0,3 kg/lot 0,02 kg/m2 1:3
La figure III.20 prsente les champs raliss par notre partenaire Masstock, contenant des rhizobactries encapsules.
Figure III.20. Image des essais en champs raliss par notre partenaire Masstock, lAngleterre.
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La taille de lot utilis en Angleterre a t de 15 m2. Lincorporation des semences et des capsules a t effectue simultanment laide dun semoir. Linoculation des rhizobactries a t effectue seulement une fois au dbut de lensemencement des graines de bl. Le mthode statistique utilise a t les blocs alatoires complets (4 rptitions)
101
IV. Rsultats & Discussion
RSULTATS & DISCUSSION

Ce chapitre est consacr la discussion des rsultats obtenus pendant ce travail de thse. Ce travail de recherche vise dmontrer que l'emploi des bactries encapsules en tant qu'engrais biologique pour une agriculture respectueuse de l'environnement est terme possible.
Les paramtres abiotiques et biotiques jouent un rle trs important pour dterminer le taux de survie des rhizobactries dans le sol. L'humidit du sol, la temprature, le pH, la texture, la disponibilit de loxygne sont des facteurs qui dterminent la viabilit cellulaire. Parmi les facteurs biologiques, les plus importants sont la prdation par les protozoaires et la mortalit des bactries lors de linoculation. Lencapsulation des rhizobactries rpond une ncessit de disposer d'une technique pour prvenir ce type de contraintes lors de l'inoculation des bactries dans le sol.
Notre travail a consist essentiellement valuer le potentiel de dveloppement de bioengrais, fond sur les techniques d'encapsulation des rhizobactries dans une matrice dalginateamidon.
Ce chapitre est compos de quatre parties:
Caractrisation de la survie des rhizobactries au procd dencapsulation Optimisation de la survie des rhizobactries tude de ladhsion des rhizobactries sur lamidon Libration contrle des rhizobactries et efficacit en champs
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1.Caractrisation de la survie des rhizobactries au procd dencapsulation

Limmobilisation des cellules est une technique qui permet dincorporer des rhizobactries dans une matrice de polymres. La mthode dencapsulation que nous avons utilise dans ce chapitre est le dripping. Les mthodes classiques dimmobilisation des rhizobactries comprennent lencapsulation des cellules dans une matrice principalement constitue d'alginate de sodium (Paul et al. 1993; Bashan et Gonzalez 1999). Les capsules dalginate contiennent une teneur en matire sche trs faible. Le schage de telles capsules suppose llimination dune grande quantit deau. Nous avons donc dcid de rajouter de largile ou de lamidon la matrice dencapsulation, ce qui a eu comme consquence l'augmentation de la matire sche permettant ainsi d'offrir une protection accrue aux rhizobactries encapsules.
Notre travail a comport notamment la mise au point du procd dencapsulation dAzospirillum brasilense Sp245 et Raoultella terrigena TFi08 on optimisant lutilisation des substances osmo-protectrices. Le but tait amliorer le taux de survie des rhizobactries modles choisies pour le projet Rhibac pour ses proprits promotrice de la croissance des plantes.
1.1 Leffet de la nature de la matrice dencapsulation sur la viabilit cellulaire

La mthode la plus usuelle d'encapsulation des bactries est leur inclusion dans des billes d'alginate de sodium (Cassidy et al. 1996). En soi la mthode est simple et permet le pigeage d'un nombre important de bactries durant l'encapsulation (Bashan et al. 2002). Les billes ainsi formes contiennent plus de 95 % d'eau. Nanmoins, la viabilit des cellules dcroit de plusieurs units logarithmiques en quelques semaines aprs inoculation (Paul et al. 1993).
Le schage des billes permet d'obtenir un produit plus stable, mais l'tape de schage ellemme conduit une forte mortalit (Paul et al. 1993). Nous avons voulu dans un premier temps vrifier ces observations.
104
Nous avons donc ralis une encapsulation dA. brasilense Sp 245 par suspension des cellules dans de l'alginate de sodium, extrude goutte goutte dans une solution de glification de CaCl2 suivi d'un schage l'tuve. Aprs encapsulation, les cellules ont t libres par dissolution des billes et numration aprs dilution squentielle. Le tableau IV.1 donne l'volution du nombre total des bactries aux diverses tapes de la production.
Tableau IV.1. volution du nombre total de cellules dA. brasilense Sp245 vivantes diverses tapes dencapsulation.
Type de billes
Cellules initiales UFC/ total
Billes humides UFC/total
Rendement d'encapsulation
Billes sches UFC/total
Rendement du schage
Alginate
(5,65 1,86)x1010
(1,64 2,0)x 1010
29 %
(3,67 5,14)x108
2,2 %
(Cette exprience a t rpte trois fois, les donnes de ce tableau sont la moyenne et lcart-type).
1 mm
1 mm
Figure IV.1. Billes dalginate de sodium avant et aprs schage ltuve. On a observ que l'encapsulation dA. brasilense dans des billes d'alginate humides permet de maintenir un taux de survie de 30 %. Par contre, la viabilit chute moins de 2,2 % aprs schage, o on observe une forte diminution de la taille des billes (figure IV.1).
Nous avons observ que les billes d'alginate sches ainsi obtenues ont une taille petite et de forme irrgulire. Le schage des billes cause ainsi une forte rduction de leur taille entrainant
105
une contraction de leur structure. Les billes prsentent une structure craquele et poreuse. Afin de rduire la porosit des billes, nous avons ajout des matriaux de remplissage, tel que largile ou lamidon.
Ainsi, cette opration permet rduire, la quantit d'eau vaporer et permet d'offrir un support plus consistant pour les cellules. En effet, largile et lamidon ont comme rle principal d'ajouter de la matire sche initiale sans augmenter trop fortement la viscosit de la suspension, requise pour une extrusion gouttes gouttes. D'autre part dans notre slection, nous dsirions chercher des matriaux moins onreux, biodgradables et compatibles avec des applications agricoles. Les essais prliminaires ont permis de slectionner l'argile et l'amidon comme agents de remplissage. Afin de permettre une extrusion ou dripping correcte, nous avons pu tablir les formulations suivantes :
Tableau IV.2. Comparaison des diffrents types de matrice dencapsulation. Concentration en Concentration en Matire sche alginate dans la agent dans la initiale des matrice (p/p) matrice (p/p) capsules humides 3% 2,7% 2% 0% 6,4% 35% 3% 9% 37%
Dnomination Alginate Alginate- argile Alginate-amidon
Nous avons choisi largile comme agent de remplissage avec une concentration maximale de 7% car pour des concentrations suprieures, la matrice dencapsulation est trop visqueuse. Nous avons travaill aussi avec lamidon de mas, avec une concentration maximale de 44,6 % damidon standard et 2,4 % damidon modifi. Ce dernier a t utilis dans la formulation pour stabiliser le mlange des polymres de la matrice.
La figure IV.2 montre des capsules de forme sphrique et des capsules de forme irrgulire. Cette dernire d lutilisation de lalginate Alcogel 6021 de forte viscosit (entre 0,15-0,30
106
Pa.s) que lalginate Satialgine S60 (0,03-0,06 Pa.s). Cela montre quune viscosit leve rend une extrusion goutte goutte dlicate et ne permet pas la formation de capsules de forme sphrique. 2 mm 2 mm
Figure IV.2. Capsules dalginate-amidon forms partir dune matrice damidonalginate satialgine S60 (photo de gauche) et damidon-alginate alcogel 6021 (photo de droite). Par la suite, nous avons pu dterminer des concentrations optimales de chacun des constituants permettant dobtenir des capsules dalginate de formes rgulires tout en contenant une concentration en matire sche maximale.
La formulation dalginate de faible viscosit et lamidon de mas ont t utiliss pour la suite de ltude et figurent dans le tableau IV.3.
Tableau IV.3. Caractrisation des billes utilises pour immobiliser des rhizobactries.
Type des billes alginate alginate-argile alginate-amidon
Matire sche initiale 3% 9% 37%
Quantit d'eau vaporer 97 % 91% 63%
Taille des billes sches 1,0 0,11 1,3 0,03 2,3 0,16
107
Daprs le tableau IV.3, la concentration en eau est suprieure dans les billes dalginate et dalginate-argile que dans les billes dalginate-amidon. La matire sche initiale dans la matrice dalginate est 8 fois infrieure celle prsente dans la matrice dalginate-amidon. a b c
1 mm
1 mm
1 mm
Figure IV.3. Illustration de la taille des capsules aprs schage ltuve (a) capsules dalginate (b) capsules dalginate-argile et (c) capsules dalginate-amidon.
Les photos de la figure IV.3 montrent que les capsules dalginate se reprsentent sous la forme de billes dont le diamtre est de 1,0 mm et de forme irrgulire. Les capsules dalginate-argile sont de forme sphrique, mais de petite taille: 1,3 mm. En revanche, les capsules dalginateamidon prsentent une taille plus grande: 2,3 mm et elles sont sphriques et de forme rgulire aprs schage. Nous avons par la suite, mesur le taux de survie dA. brasilense Sp245 dans les billes ayant diffrentes compositions et calcul le rendement dencapsulation et de schage.
Tableau IV.4. Test de viabilit de la souche A. brasilense Sp245 pour diffrents types des capsules.
Type de capsules Culture initiale CFU total Billes humides Rendement CFU total d'encapsulation Billes sches CFU total Rendement du schage
Alginate
(5,6 2,0)x1010
(1,6 2,0)x1010
29 %
(3,7 5,1)x108
2,2 %
Alginate-argile Alginate -amidon
(7,4 0,7)x1010
(2,3 0,2)x1010
31 %
(4,5 0,5)x108
2,0 %
(3,3 1,4)x1010
(2,3 0,2)x1010
90 %
(3,4 2,3)x109
11,5 %
(Cette exprience a t rpte trois fois, les donnes de ce tableau sont la moyenne et lcart-type de ces rptitions).
108
Les capsules dalginate contiennent environ 97 % deau. En utilisant ce type de matrice, la protection des cellules au cours du schage est assez faible. En effet, nous avons observ dans ce cas pour A. brasilense Sp245 une diminution du nombre de cellules vivantes de 2 units logarithmiques.
Nous avons ajout la matrice dencapsulation 7% dargile, malgr laugmentation de la concentration en matire sche, nous avons observ que l'ajout dargile ne permettait pas d'augmenter le rendement de la viabilit dA. brasilense Sp245 durant le schage. Finalement, on a travaill avec un mlange de 3% dalginate et 30% damidon de mas. Cette matrice a t formule par Ivanova (2006) dans son travail de thse fait au sein de notre laboratoire.
Dautre part, il apparat que la viabilit apparente des cellules diminue durant la fabrication des billes d'alginate-amidon pH 4,9 mais cet effet n'apparat pas si le pH est ajust 7,2. La perte apparente de viabilit bas pH pour la souche A. brasilense Sp245 pourrait tre due un phnomne d'adhsion des cellules aux granules damidon comme il le sera dmontr plus tard (Chapitre 3 de Rsultats & Discussion).
La figure IV.4 prsent de faon schmatique, leffet de ladjonction damidon dans la matrice dencapsulation.
Figure IV.4. Laugmentation de la concentration de la matire sche par incorporation de lamidon, dans la matrice dencapsulation (Ivanova 2006).
109
Les billes dalginate ont t utilises en agriculture pour encapsuler diffrents types de microorganismes, tels que Rhizobium japonicum (Jung et al. 1982) Azospirillum brasilense (Bashan et al 2002) et Bacillus subtilis (Young et al. 2006). Lalginate est le polymre le plus utilis pour lencapsulation des micro-organismes (Cassidy et al. 1996). Nanmoins, lencapsulation dA. brasilense dans une matrice dalginate seule ne permet pas la protection des rhizobactries vis--vis du procd dimmobilisation, notamment dans la phase de schage des capsules.
Les billes d'alginate ne constituent pas un engrais biologique satisfaisant, car leur taille est trop petite et de forme irrgulire. Il est donc primordial d'ajouter un adjuvant dans la matrice dencapsulation. Dans la littrature, nous avons trouv plusieurs types d'adjuvants, comme largile, composant naturel du sol (Vasudevan et al. 2002) et lamidon de mas (Ivanova 2006). Le principe a t d'incorporer un agent de remplissage, pour augmenter la matire sche, amliorer la stabilit de l'inoculant bactrien et surtout rduire le cot et la dure du schage.
Les capsules d'alginate-argile ne reprsentent pas une bonne solution pour une utilisation dans le domaine de l'agriculture en tant que bio-engrais. Cela est principalement d au fait que largile ne fournit pas une protection efficace des cellules (seulement 2% de survie pour A. brasilense aprs schage). Lutilisation dune concentration suprieure 7% dargile pourrait donner de meilleurs rsultats de viabilit, mais une augmentation de la viscosit de la matrice, ne permet pas la formation des billes dalginate-argile de tailles homognes et sphriques.
Nous avons galement fabriqu des capsules dalginate-amidon avec une forte teneur en matire sche. L'amidon est un matriau de remplissage bien adapt, accessible et de surcrot peu onreux pour la fabrication des capsules. En effet, l'amidon est l'un des biopolymres les plus employs dans l'industrie agroalimentaire (Hickman 1999).
Ainsi, une nouvelle matrice dencapsulation contenant 33 % de matire sche a t mise au point. Lutilisation de cette matrice destine la production dun inoculum encapsul dans des billes de taille importante (2,3 mm) permet dobtenir un nombre significatif dA.
110
brasilense Sp245 (denviron 2,7x106 UFC/capsule) ayant une dure de vie prolonge comme nous le verrons dans le chapitre suivant. La diminution du taux de mortalit cellulaire lors de l'encapsulation n'est pas un sujet scientifique simple. La survie des cellules dpend en effet de plusieurs facteurs : la composition des milieux de culture, lespce et la souche bactrienne et l'tat physiologique des cellules (Paul et al. 1993). Chaque facteur doit tre tudi afin d'assurer la meilleure activit de l'inoculant aprs schage et pendant le stockage de celui-ci. En combinant ces facteurs, nous avons pu obtenir un inoculant dshydrat, avec une forte densit de bactries immobilises vivantes. Ladjonction damidon la matrice dencapsulation peut tre utilise aussi, comme une source de carbone par les rhizobactries, ce qui favorise ventuellement leur dveloppement dans le sol. Ce type de capsules pourrait permettre une libration progressive de ces dernires et une colonisation efficace de la rhizosphre du bl.
Le pH initial de la matrice dencapsulation alginate-amidon a une valeur de 4,9. Nous avons choisi d'ajuster le pH final 7,2, car nous avons observ une diminution du nombre des bactries libres (bactries non adhres sur lamidon), par effet dun phnomne dadhsion des rhizobactries sur lamidon pH 4,9. Cet aspect sera trait en profondeur dans le chapitre 2 des rsultats & discussion.
partir de ce choix de matrice, nous avons cherch tudier la survie de plusieurs espces de rhizobactries aux diffrentes tapes du procd dencapsulation. Cela nous permettra par la suite identifier les tapes critiques du procd dencapsulation et denvisager des voies doptimisation spcifiques chaque espce bactrienne.
1.2 volution du nombre de cellules vivantes diffrentes tapes du procd d'encapsulation

Lencapsulation des rhizobactries dans des billes dalginate est la mthode la plus connue dimmobilisation cellulaire (Park et Chang 2000). Nanmoins, nous avons dmontr dans le point prcdent, que les billes ainsi formes contiennent un bas pourcentage de matire sche initiale (5%) et que le taux de survie de la souche A. brasilense Sp245 a t seulement de 2,2% aprs schage.
111
Nous avons voulu vrifier le rendement du procd dencapsulation sur dautres types de rhizobactries et les comparer avec la souche A. brasilense. Les rhizobactries utilises ont t les suivants: Enterobacter ludwigii BNM 0357, Raoultella terrigena TFi08 et Bacillus pumilus C26. Elles ont donc t immobilises dans les capsules et ont t sches ltuve. Le tableau IV.5 montre lvolution du nombre total des rhizobactries diverses tapes dimmobilisation.
Tableau IV.5. Taux de survie de diffrentes souches de rhizobactries immobilises dans des capsules dalginate-amidon.
Souche E. ludwigii R. terrigena B. pumilus A. brasilense
Culture initiale UFC total (2,78 1,0)x1010 (2,50 0,34)x1011 (1,03 0,30)x1011 (3,3 1,4)x1010
Capsules sches UFC total (1,24 3,5)x107 (1,10 0,4)x1010 (1,0 0,5)x1010 (3,41 2,3)*109
Survie % 0,04 4,40 10,0 10,0
On observe que lencapsulation dE. ludwigii dans des capsules dalginate-amidon ne permet pas de maintenir une forte viabilit durant tout le procd dencapsulation. Par contre, le taux de mortalit de R. terrigena, B. pumilus et A. brasilense varient entre 4 10 % de rendement selon les rhizobactries. Les rsultats montrent que les espces B. pumilus et A. brasilense sont celles qui prsentent la meilleure survie.
Le taux de survie de R. terrigena, B. pumilus et A. brasilense a t suprieur aux taux de survie des rhizobactries immobilises dans des capsules dalginate trouves dans la littrature. Ces travaux concernent les bactries encapsules A. brasilense Cd sches ltuve (38C) (Bashan et al. 2002). A. lipoferum sches par flux dair (Paul et al. 1993), et Pseudomonas aeruginosa (Cassidy et al. 1995). Dans tous ces travaux scientifiques, le taux de survie aprs schage prsentait une valeur infrieure 1%.
112
Cette diffrence de viabilit pourrait tre lie la concentration leve en matire sche dans la matrice, par rapport la composition classique de la matrice dencapsulation base seulement dalginate. Une autre explication cette meilleure survie pourrait tre due la prsence dune source de carbone dans la matrice dencapsulation.
Afin de mieux comprendre les phnomnes qui influencent le taux de survie final, nous avons mesur la survie dE. ludwigii, de B. pumilus, dA. brasilense et de R. terrigena aprs les diffrentes tapes du procd dencapsulation, c'est--dire respectivement dans la culture initiale, dans la matrice dencapsulation, dans les capsules humides et dans les capsules sches. Les rsultats prsents (figure IV.5) sont la moyenne et lcart-type de la rptition de trois essais.
Figure IV.5. volution de la survie dE.ludwigii au cours du procd dencapsulation.
On observe que lencapsulation dE. ludwigii dans des capsules dalginate-amidon permet de maintenir une forte viabilit jusqu ltape o les capsules sont humides. En revanche, le nombre de bactries diminue notablement au cours de ltape de schage o lon observe une chute de trois units logarithmiques du taux de survie.
113
Nous observons galement que le nombre de cellules vivantes de R. terrigena est stable pendant ltape dencapsulation, mais diminue significativement durant ltape de schage avec une dcroissance de plus dune unit logarithmique du nombre de cellules vivantes comme le montre la figure IV.6.
Figure IV.6. volution de la survie de R. terrigena au cours du procd dencapsulation.
Daprs la figure IV.7, on observe dans le cas de B. pumilus une faible diminution du nombre de cellules vivantes dans la phase dencapsulation, principalement lors du passage en capsules humide. Le schage entrane galement une diminution de viabilit de moins une unit logarithmique (10% de rendement final).
114
Figure IV.7. volution de la survie de B. pumilus au cours du procd dencapsulation.
Figure IV.8. Survie de lA. brasilense dans les procds dencapsulation.
On observe que lencapsulation dA. brasilense dans des capsules dalginate-amidon permet de maintenir une forte viabilit jusqu ltape de schage des capsules humides. En revanche, le nombre des bactries diminue au cours de ltape de schage puisque daprs la figure IV.8, la survie chute denviron une unit logarithmique.
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Plusieurs types de rhizobactries ont t slectionns pour leurs aptitudes de stimulation de la croissance chez les vgtaux. A. brasilense est le rhizobactrie modle dans cette tude, car ses qualits de promotion de la croissance ont dj t largement tudies et dmontres (Fages 1994; Okon et Labandera-Gonzalez 1994; Fallik et Okon 1996; German et al. 2000; Kim et al. 2005). E. ludwigii est une nouvelle rhizobactries rcemment isole du sol des climats temprs pour ses effets daugmentation de la croissance de Lolium perenne (ryegras) (Schoebitz et al. 2009). R. terrigena est une souche slectionne par notre partenaire autrichien (ARC) pour sa fixation biologique dazote. B. pumilus a t isole par notre partenaire chilien, pour sa production dhormones et son aptitude former des spores de rsistance.
Si la slection de ces rhizobactries a t faite pour leurs capacits physiologiques stimuler la croissance des plantes (intrt agricole), nos rsultats montrent que toutes les souches subissent une perte importante en cellules viables lors du schage. Il a t montr par Paul et al. (1993) que la dshydratation dA. lipoferum immobilise en billes dalginate pourrait avoir des effets prjudiciables sur ltat des cellules et inhiberait une partie de leurs processus physiologiques (fonctionnement des protines et lactivit enzymatique) entranant une diminution de la viabilit cellulaire. De plus, lors du schage les rhizobactries sont soumises un stress mcanique important. En effet, l'augmentation de la pression osmotique dans le milieu extracellulaire entrane une sortie deau de la cellule due losmose et provoque la plasmolyse. Cette dernire se matrialise par la rupture de la membrane plasmique (Mille et al. 2002).
Nanmoins, toutes les souches nont pas la mme rsistance aux stress subits pendant le procd dencapsulation et en particulier vis--vis du schage. La survie de la souche E. ludwigii dcrot de trois units logarithmiques pendant la phase de schage. Il semble donc que la bactrie E. ludwigii soit trs sensible au stress hydrique, consquence du schage. Malgr son intrt dun point de vue physiologique, cette souche nest pas adapte au procd de schage, donc son potentiel dutilisation pour la production de bioengrais est limit. Cette souche demanderait donc des recherches plus approfondies afin dobtenir une production de capsules avec une forte densit en cellules vivantes qui seraient physiologiquement actives.
116
Les bactries A. brasilense et B. pumilus sont celles qui ont prsent la meilleure rsistance au procd de schage. A. brasilense est capable de former des kystes et de produire une substance rsistante: le PHB (poly--hydroxybutyrate) dans certaines conditions de stress hydrique et nutritionnel (Sadasivan et Neyra 1987; Neyra et al. 1999). Dans le sol o la disponibilit en carbone ou en azote est faible, laccumulation de PHB est favorise, augmentant ainsi la survie et la comptitivit dA. brasilense (Kadouri et al. 2003). La production de kystes rend le genre Azospirillum plus rsistant la dshydratation, ce qui a t mis en vidence par le travail de Hubert (1991). La production des kystes pourrait donc tre la cause de la meilleure rsistance vis--vis du stress hydrique dA. brasilense. Cette espce bactrienne est donc plus adapte au procd de bioencapsulation et plus prcisment au schage.
Comme pour A. brasilense, nous avons obtenu un pourcentage final de viabilit de 10 % pour B. pumilus. La formation des spores chez le genre Bacillus, lui confre une forte rsistance dans les conditions de stress, comme le schage (Ivanova 2006). Ainsi, la formation de spores (observ aprs de 24 h de fermentation) pourrait expliquer la grande rsistance aux diverses tapes du procd observe avec cette bactrie.
Les rsultats de survie varient fortement en fonction de la rhizobactrie utilise. Tout particulirement, une souche sporulante ou formatrice de kystes pourrait permettre dobtenir un taux de survie plus lev. Le fait que le taux de mortalit de cellules vivantes au cours dun schage dpend la fois de lespce et la souche bactrienne ainsi que des conditions de schage est largement report dans la littrature (Morgan et al. 2006). Il faut donc prendre en considration le type de rhizobactries encapsules et optimiser spcifiquement lencapsulation de chaque souche bactrienne.
Ivanova (2006) a montr que la survie dA. brasilense Sp245 lencapsulation est lie la taille des capsules. Elle a montr que dans des capsules dalginate-amidon de grande taille (3,5 mm), le taux de survie tait de 36 % aprs schage. Par contre, pour des capsules dune taille de 2 mm, elle nobtenait que 15 % de viabilit aprs schage. Dans notre cas, nous avons observ 10 % de survie pour A. brasilense Sp245, aprs schage dans des capsules dalginate-amidon (2,3 mm). Nos rsultats confirment donc ceux dIvanova (2006). La taille
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des capsules influence la vitesse de schage et cela peut tre la cause dune meilleure survie pour de grandes capsules qui schent plus lentement. La vitesse de schage des cellules vivantes a, en effet, un impact important sur leur survie (Paul et al. 1993). Le taux de survie dans les capsules pourrait donc galement tre optimis en faisant varier les procds et les paramtres de schage (temprature, humidit relative). Une solution pour maintenir une forte densit de cellules vivantes serait de saffranchir du schage. Cest ce que nous avons fait dans le cadre de notre essai de production lchelle pilote (voir 1.4 des Rsultats et Discussions). Dans ce cas, les capsules humides ont t incorpores dans le sol immdiatement aprs leur production. Cependant, les capsules humides prsentent linconvnient majeur de ne pas pouvoir tre stockes pendant de longues priodes sans perdre une grande partie de lactivit physiologique des rhizobactries. Le niveau de schage optimal sera tudi dans la partie IV.2.2.3. La partie 1.3 prsente ltape de stockage qui suit le procd de schage.
1.3 volution du nombre de cellules vivantes dans des billes sche durant le stockage 4 C
On a ralis lencapsulation dA. brasilense Sp245 et de la R. terrigena TFi08 par suspension des cellules dans l'alginate-amidon de mas. Aprs encapsulation, environ 10 g des capsules sches ont t dposs dans des flacons en plastiques. Les flacons ont t installs l'intrieur du rfrigrateur une temprature moyenne de 4 C.
Lvolution du nombre de cellules vivantes (par gramme de capsules) pour A. brasilense et R. terrigena au cours dun stockage de 400 jours est prsente sur la figure IV.9.
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Figure IV.9. volution de la concentration en cellules vivantes dans des capsules dalginate-amidon pour A. brasilense (courbe bleue) et R. terrigena (courbe rouge) au cours dun stockage 4 C.
Le nombre de cellules dA. brasilense vivantes dans les billes d'alginate-amidon est demeur constant environ 109 UFC/g au cours de 400 jours de stockage 4C. Les capsules d'alginate et d'amidon permettent donc de protger les cellules pendant le stockage et de maintenir un taux lev et constant de survie dA. brasilense durant plus d'un an de stockage.
Le nombre initial des cellules viables de R. terrigena prsentes dans les capsules sches tait de 109 CFU/g, cette valeur a diminu dune unit logarithmique aprs 100 jours de stockage. La valeur du taux de survie est reste constante, pour finalement diminuer de faon notoire et atteindre 106 CFU/g, aprs un an de stockage.
Le deux rhizobactries testes ont montr un comportement compltement diffrent vis--vis de la survie dans ltape de stockage. La diffrence de survie entre les deux rhizobactries aprs 400 jours de stockage a t de trois logs. La stabilit de la survie dA. brasilense durant le stockage, pourrait tre lie la capacit de cette dernire former des cellules enkystes, lors de lapparition dune priode de stress hydrique.
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Nos rsultats montrent que R. terrigena ne possde pas une bonne rsistance aux conditions de stockage, en effet nous avons montr une diminution du nombre de cellules vivantes de trois units logarithmiques aprs un an de stockage. Nanmoins, selon lentreprise Nitragin, un des principaux producteurs dinoculants biologiques dans le monde, lefficacit dun inoculum liquide dA. brasilense est assure jusqu une concentration de 1x108 UFC/ml (Nitragin 2010). Nous observons que nous assurons bien une concentration minimale de 1x108 UFC/g pour R. terrigena encapsule dans des billes dalginate-amidon pendant les 6 premiers mois de stockage 4C.
Par ailleurs, la FAO, lOrganisation des Nations Unies pour lalimentation et lagriculture, a publi une norme pour la production de bioengrais partir du genre Azospirillum (IS: 14806:2000) selon laquelle linoculum peut tre stabilis pendant une priode maximale de 6 mois une temprature entre 20 - 25 C condition que sa concentration en cellules vivantes soit de 1x107 UFC/g de support et quaucune contamination par dautres micro-organismes soit dtectable une dilution de 105 (Tandon et Roy 2004).
Nos rsultats montrent que le taux de survie de R. terrigena encapsule, aprs 6 mois de stockage, est similaire au taux de viabilit recommand par la socit Nitragin pour assurer une bonne efficacit de linoculum et est suprieur aux exigences de la FAO. Nanmoins, ces recommandations concernent un autre genre bactrien et lefficacit en champs doit tre dmontre pour le rhizobactrie R. terrigena.
Dans notre tude, nous avons utilis une temprature de stockage diffrente du protocole de la FAO puisque le stockage a t ralis 4C. Bashan et al. (2002) ont tudi la survie dA. brasilense durant le stockage. Ils ont mesur la viabilit des bactries dans des billes dalginate sches aprs 10 jours de stockage 4 C; la diminution de la viabilit a t de lordre de 4 units logarithmiques. Ils ont aussi montr que laddition dosmo-protecteurs, tel que du lait crm a eu peu deffet sur la viabilit dA. brasilense, pendant le stockage. Ces rsultats montrent que lencapsulation base dalginate-amidon favorise la survie des bactries. La taille des capsules et probablement la composition de la matrice jouent un rle important dans la survie des cellules.
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Selon Cassidy et al. (1996) la perte de viabilit pourrait tre lie la lente pntration de loxygne ou de la vapeur deau au sein des capsules. Nos capsules dalginate-amidon ayant un diamtre de 2,3 mm suprieur au diamtre des capsules de Bashan et ses collaborateurs (0,3 mm), la diffusion de l'oxygne au coeur des capsules est donc rduite et limite.
Ivanova (2006) a montr que la viabilit dA. brasilense aprs 6 mois de stockage dans des capsules dalginate-amidon sches tait peu diffrente entre un stockage 4C et un stockage 20C. En effet, elle a observ moins dune unit logarithmique de diffrence dans les capsules stockes a 4C.
Donc, la temprature de stockage ne semble pas avoir un impact important sur la diminution de la survie chez A. brasilense. Par contre, le niveau dhydratation des capsules a un effet primordial sur le taux de survie. Si le schage est une tape ltale pour une partie des cellules, il permet cependant un stockage de longue dure des capsules avec une densit en cellules vivantes importante. Par la suite, nous avons cherch optimiser le niveau de dshydratation qui permettait de minimiser les pertes cellulaires tout en assurant un bon niveau de survie des cellules au stockage (voir partie IV.2.2.3).
La partie suivante concerne la dernire tape de la caractrisation de la survie des rhizobactries, il sagit dvaluer linfluence de lchelle de production.
1.4 Influence de lchelle de production

Afin de permettre des essais en champs par deux des partenaires du projet Rhibac, nous avons ralis une production lchelle pilote de capsules pour notre partenaire de lUniversit Austral du Chili (UACH) et pour notre partenaire industriel d'Angleterre (Masstock). Les mthodes employes pour ces deux productions de capsules grande chelle sont dcrites dans la partie III.6.2 de Matriel et Mthodes. Nous reportons ici les rsultats de densits en cellules vivantes obtenues pour diffrentes espces bactriennes.
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1.4.1. Production des capsules pour lUACH La production de la biomasse et limmobilisation de 3 souches de rhizobactries ont t mises en oeuvre pour satisfaire la demande de capsules pour les essais en champs de notre partenaire. Nous nous sommes dplacs Valdivia, Chili pour produire environ 14 kg de capsules dalginate humides pour une application immdiate sur le sillon de plantation des semences de bl (session de plantation septembre 2009).
Production de la biomasse
Diffrentes souches de rhizobactries ont t utilises: R. terrigena TFi08, B. pumilus C26, et P. fluorescens C139 (souches isoles en climat tempre). Lamorce de linoculum de R. terrigena a t fournie par lAustrian Research Center, Vienne, Autriche (ARC) et le B. pumilus et P. fluorescens C139 ont t fournis par lUACH sous la forme dinoculum lyophilis. Pour chaque type des rhizobactries, une fermentation a t ncessaire pour produire la biomasse. La fermentation a t ralise lUACH dans le fermenteur de type Biotron de 8 litres de capacit (III.5.2 de Matriels & Mthodes).
Lextrusion de la matrice dalginate sur le systme de dripping multi buses a permet de produire billes dalginate avec une concentration leve en rhizobactries. Le systme de dripping utilis a t confectionn avec 40 buses dacier inoxydable prsentant un diamtre interne de 1,5 mm. Le diamtre des billes produit a t de 3 mm. Les capsules obtenues sont prsentes sur la figure IV.10.
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Figure IV.10. Capsules humides dalginate dun diamtre de 3 mm produit par dripping avec le systme goutte goutte Multi buses .
Les tableaux IV.6, 7, 8, et 9 montrent lvolution du taux de survie bactrienne.
Tableau IV.6. Concentration en cellules vivantes diffrentes tapes du procd dencapsulation pour la souche Bacillus pumilus C26
Culture UFC/ml UFC/total UFC/g 4,0x109 3,2x1013 -
Matrice 6,1x1010 5,0x1014 -
Capsules humides 7,8x1015 1,51x1012
Tableau IV.7. Concentration en cellules vivantes diffrentes tapes du procd dencapsulation pour souche P. fluorescens C139
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Matrice 1,0x1010 8,2x1013 -
Tableau IV.8. Concentration en cellules vivantes diffrentes tapes du procd dencapsulation pour souche R. terrigena TFi08
Matrice 6,8x109 5,6x1013 -
La masse moyenne de chaque capsule humide a t d'environ 14 mg, la production totale a t de 4,5 kg de capsules humides. La concentration des bactries encapsules par capsule et pour chaque souche a t dnombre et est reporte dans le tableau IV.9.
Tableau IV.9. Concentration des rhizobactries par capsule dalginate
B. pumilus UFC/capsule 2,12x1010
P. fluorescens 9,71x109
R. terrigena 1,26x109
Daprs le tableau IV.9, nous obtenons par cette mthode une concentration en rhizobactries trs leve pour les trois souches immobilises. Avec cette concentration, une capsule est suffisante pour fournir un nombre de cellules vivantes optimal pour une semence de bl, car, la densit optimale d'Azospirillum pour promouvoir la croissance des plantes est de 105-106 UFC/plante pour le bl (Kapulnik et al. 1985) et 107 UFC/plante pour le mas (Arsac et al. 1990). Il est noter que des concentrations plus faibles de bactries nauraient aucun effet sur la croissance des plantes. contrario, des densits plus leves nauraient pour but que de
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rduire la surface des racines; critre le plus discriminant pour valuer les effets favorisant de linoculation des rhizobactries (Fallik et al. 1994). En utilisant ce systme d'encapsulation multi buses, nous avons obtenu des capsules d'alginate avec une forte concentration en micro-organismes allant jusqu' 2,12x1010 UFC/capsule humide, avec une capacit de production de 780 g de capsules/h.
La diffrence entre la production des capsules dans le laboratoire et l'chelle pilote ont t la densit cellulaire, le rendement dencapsulation et le temps de production. La fermentation des rhizobactries dans le laboratoire (Erlenmeyer) a donn 3,0x109 UFC/ml et 5,0x109 UFC/ ml pour R. terrigena TFi08 et jusqu' 1,7x1010 UFC/ml pour la souche P. fluorescens C139 lchelle pilote (fermenteur). Une production des cellules plus leve a t obtenue, car nous avons contrl la temprature (30C), le pH (7,0), le volume doxygne et lagitation (350 tours/min), pendant toute la priode de fermentation, alors que dans le cas de la production dans lErlenmeyer, seulement lagitation et la temprature ont t rgules.
Une concentration plus leve en rhizobactries immobilises a t obtenue lchelle pilote, car la quantit de cellules initiale a t plus leve. Par ailleurs, le dbit dextrusion a t de 0,8 kg/h. La masse totale de la matrice par souche a donc t de 8 kg, avec un temps de production suffisant (10 h) pour permettre une croissance et augmenter encore le nombre de bactries dans la matrice. Le temps dextrusion l'chelle de laboratoire, a t de moins de 30 min, temps assez rduit pour obtenir une croissance de bactries durant le temps dimmobilisation des cellules.
Le passage dune production de capsules humides lchelle laboratoire (30 g de matrice) une production chelle pilote (14 kg de matrice) prsente plusieurs difficults. Tout dabord, la manipulation de grandes quantits de produits pour la fabrication du milieu de culture, ainsi que pour la production de la biomasse et la production de la matrice dencapsulation exige des prcautions particulires afin dviter toute contamination par dautres microorganismes. Nous avons travaill strilement pendant le procd de fermentation et nous avons utilis un bec Bunsen dans ltape de dripping, pour liminer les contaminants microbiologiques. Le systme de dripping ralis en acier inoxydable a permis nanmoins un
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nettoyage facile de l'appareil pour empcher le dveloppement et laccumulation des microorganismes dans le systme de production.
Lextrusion de la matrice dalginate sur le systme de dripping multi buses a permis de produire 0,8 kg/h de billes humides dalginate avec une concentration leve en rhizobactries (109-1010 UFC/capsule). Dautre part, il est possible damliorer encore la capacit de production des capsules grce une augmentation du nombre de buses. Nous pouvons galement utiliser des buses avec un diamtre interne de 2-3 mm pour obtenir des billes dune taille de 4-6 mm, ce qui correspond la taille moyenne des semences de bl. En utilisant des billes de cette taille, lensemencement peut tre ralis simultanment avec la plantation de semences laide du semoir.
Nous avons choisi de produire des billes humides car celles-ci ont t dposes dans le sol le jour suivant la production. Cependant, ces billes ne peuvent tre stockes pour une priode suprieure 3-4 semaines. Toutefois, nous savons que le schage des billes aurait fortement diminu le taux de survie des rhizobactries donc lutilisation des billes humides a permis dinoculer le sol avec une concentration trs leve de 1,5x1012 UFC/g.
Actuellement, les entreprises qui produisent des inoculants biologiques dAzospirillum utilisent principalement des inoculants liquides. Lutilisation de la microencapsulation comme technique de production de bioengrais nest pas couramment utilise. Le cot de production de 1 kg de capsules sches dalginate-amidon est de 2,1 euros (Ivanova, 2006). Pour linoculation des capsules (106 UFC/semence) dans le champ, il est ncessaire dutiliser environ 60 kg de capsules (126 /ha). En comparaison, le cot dun inoculant liquide est denviron 3 /ha, mais avec une trs faible concentration de 104 UFC/semence, avec un augmentation du rendement de graines du bl de 7 % selon les informations du produit Bonus de l'entreprise Nitragin base dA. brasilense destin la culture de bl (Nitragin 2010). Nanmoins, si on produit des capsules pour inoculer les graines avec une concentration de 104 UFC/semence, le prix de capsules sera de 1,26 /ha, cot qui est moins cher que les inoculants liquides proposs par Nitragin.
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Lutilisation de lencapsulation des rhizobactries pourrait apporter aux agricultures des avantages non ngligeables :
- Une concentration leve en rhizobactries inocules pour chaque graine. - Une manutention plus aise des inoculants. - Une protection des rhizobactries dans le sol. - Une libration progressive des bactries dans le sol.
Les rsultats des effets sur la croissance de la culture de bl en plein champ obtenu avec ces capsules seront prsents dans le dernier paragraphe de la partie rsultats et discussions. La partie qui suit prsente la deuxime ralisation de capsules de rhizobactries pour notre partenaire industriel Masstock.
1.4.2. Production de capsules sches dalginate-amidon pour le partenaire industriel Masstock. Nous avons fabriqu des capsules dalginate-amidon de la souche Bacillus pumilus C26 lchelle pilote au sein de notre laboratoire ONIRIS et dans la halle technologique du mme tablissement. Afin de permettre des essais dinoculation de rhizobactries en plein champ, nous avons produit des bactries encapsules que nous avons envoyes notre partenaire industriel du projet Rhibac en Angleterre (voir chapitre III.5.2).
a) Schage sur lit fluidis Les billes ont t sches laide du lit fluidis de grande capacit (10 kg des capsules) situ au hall technologique de lONIRIS de Nantes (figure III.14). Nanmoins, lhumidit de lair na pas t contrle comme les essais de schage dans le lit fluidis de 0,5 kg de capacit (chapitre IV. 2.2.3). Les rsultats obtenus pour le schage des capsules par lit fluidis sont donns dans le tableau IV.10.
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Tableau IV.10. volution de la temprature, teneur en eau, activit de leau (lAw) et du taux de viabilit au cours de schage.
Temps schage (min) 0 15 25 35 45 55 65 75
TC 16 16 23 25 25 25 24 24
Teneur en eau % 65 48 28 19 13 12 13 12
Aw 1,00 0,98 0,94 0,80 0,45 0,37 0,35 0,25
Viabilit UFC/g MS 1,48x108 2,84x108 2,34x108 0,00E+00 0,00E+00 0,00E+00 0,00E+00 0,00E+00
La temprature initiale de schage est de 16 C et au fur et mesure que les capsules schent la temprature monte jusqu 25 C lintrieur du lit. Puis, la temprature diminue jusqu 24C, lorsque les capsules ont t sches (12-13 % de teneur en eau). La vitesse de schage est ici trs rapide par rapport au schage en couches minces ltuve utilise chelle du laboratoire. En effet, une grande partie de leau libre des capsules est perdue durant les 35 premires minutes de schage. Aprs quune grande partie de leau libre ait t entrane, cest leau lie des capsules qui est lentement entrane vers lextrieur pendant les 40 dernires minutes du schage. Aprs lvaporation de leau libre lactivit de leau a t de 0,8, valeur trop leve pour stocker les capsules durant une priode suprieure 6 semaines (voir partie IV.2.2.3). Pour arriver obtenir une valeur dAw de 0,25 et ainsi permettre d'assurer un stockage de longue dure (Faiveley 2009), il faut 75 minutes de schage (tableau IV.10).
Nanmoins, il savre que le schage rapide et efficace des capsules ne permet pas de prserver un nombre de cellules vivantes important, puisquaprs 25 minutes de schage, aucune bactrie vivante ntait dtecte dans les capsules.
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Nous avons donc cherch une mthode de schage plus douce qui permettait le traitement de grandes quantits de capsules. Le choix sest port sur le schage en couche mince ltuve.
b) Schage ltuve
Au cours du schage en couches minces ltuve, les capsules de la surface de la claie ont t les premires tre sches. Aprs 72 h., l'ensemble des capsules sont sches avec une teneur en leau et un Aw compatibles avec un stockage de longue dure. Ce schage est moins homogne que le prcdent, mais permet nanmoins dassurer le maintien dune concentration bactrienne leve par gramme de capsules. En effet, le schage lent de la souche B. pumilus ltuve a mme permis une augmentation du nombre total de bactries de 159% par rapport au nombre de bactries comptabilises dans le milieu de culture (8,2x1012 UFC/total). Nous avons obtenu un augmentation du nombre de B. pumilus, car nous avons ajout 1 l du lait crm au 9 l de milieu de culture YEP. Les capsules ont t formes en mlangeant le milieu de culture, lalginate et lamidon. Donc, la prsence des nutriments dans la capsules et une conditions de temprature de 30C a permis la croissance de bactries dans les capsules pendant le procd de schage.
La production des rhizobactries encapsules chelle pilote nest pas un sujet simple, car un quipement ad hoc doit tre requis pour la production dune grande quantit de biomasse. Malgr les difficults que nous avons pour produire la biomasse des rhizobactries, nous nous sommes quips dune bonbonne en plastique pour faire la fermentation de la souche B. pumilus. La concentration des bactries finale a t de 109 UFC/ml. L'agitation irrgulire produite par le barreau magntique l'intrieur de la bonbonne a t un frein pour obtenir une concentration bactrienne plus leve.
Nous avons sch les capsules en utilisant le lit fluidis et ltuve. Toutes les bactries taient mortes aprs de 35 minutes de schage en lit fluidis. La temprature de schage maximale a t de 33 C. Cette temprature pourrait tre la cause de la chute du taux de survie des rhizobactries, car B. pumilus est une rhizobactrie rsistante aux tempratures leves. En effet, le genre Bacillus est capable de former des spores de rsistance lorsque la temprature
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augmente (Dworkin et al. 2006). Mais, si le temps de schage est rduit (35 min) les bactries ne sont pas capables de former des spores de rsistance pendant le procd de schage.
La vitesse du schage peut tre la cause aussi de la diminution de la viabilit cellulaire. Nous avons observ une diminution trop acclre du pourcentage de la teneur en eau des capsules. La diminution dune grande quantit deau libre en moins de 30 minutes a t trop agressive pour lobtention dune stabilisation des bactries pendant lopration de schage. Selon la revue bibliographique sur limmobilisation des bactries de Cassidy et al. (1996), un grand nombre de bactries immobilises est plac la surface des billes, car la diffusion de loxygne l'intrieur des billes est trop limite. Si cest le cas, une grande partie des bactries ne sont pas protges et elles sont susceptibles dtre soumises directement au flux dair de schage. Une diminution de la vitesse de schage pourrait garantir le maintien de l'intgrit des rhizobactries.
Le schage ltuve a t fait sous des conditions moins agressives pour les bactries. La temprature de schage 35 C a permis la multiplication des bactries B. pumilus durant cette tape. La dure de lopration et la consommation d'nergie ont t le principal inconvnient de cette mthode, car pour lobtention des 4 kg de capsules sches, la priode de schage a t de 72 h. Un autre inconvnient a t lhomognit du schage des capsules. Seulement les capsules de la surface de la claie de schage ont t sches aprs 24 h. Un mlange manuel laide dune spatule a t ncessaire pour scher l'ensemble des capsules. Le schage des capsules lchelle pilote a permis une concentration finale des bactries de 2,9x109 UFC/g suffisante pour linoculation des semences de bl. Nanmoins, le schage ltuve a plusieurs types dinconvnients, tels que l'htrognit de schage, la dure de temps de schage et une capacit de schage limite en terme de masse de capsules par batch. Il y a galement un risque important de contamination par dautres germes tant donn la longueur et la temprature de cette tape.
En choisissant les matriaux de base les moins onreux, le cot de production de ces capsules pourrait tre abordable pour leur utilisation dans lamendement des sols. Lapplication des capsules dans les champs peut tre ralise simultanment avec lpandage des semences laide de matriels couramment employs dans lagriculture.
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Linoculum bactrien immobilis l'aide de cette mthode prsente un potentiel prometteur pour une agriculture utilisant un minimum de produits chimiques. Cette tude mrite toutefois dtre poursuivie pour amliorer encore la survie cellulaire durant lencapsulation, mais galement pendant la priode de stockage. Le choix des matriaux constituant la matrice peut tre encore optimis.
Nous avons tudi lvolution du nombre de cellules vivantes de 4 rhizobactries chaque tape du procd de bioencapsulation. Lencapsulation dE. ludwigii, de R. terrigena, de B. pumilus, et dA. brasilense dans des capsules alginate-amidon permet de maintenir une forte viabilit. En revanche, au cours de ltape de schage, le nombre de bactries vivantes diminue pour toutes les souches testes. Cette diminution de viabilit montre que lvolution de la survie des bactries durant la phase dimmobilisation dpend de chaque souche de rhizobactrie. Certaines bactries prsentent un rendement de 10% de survie (A. brasilense et B. pumilus) et dautres prsentent un trs faible taux de survie final comme E. ludwigii (0,04%). Au cours de cet essai, nous avons observ que le schage constituait l'tape la plus critique du procd d'encapsulation en ce qui concerne la survie cellulaire.
Ltape de stockage est trs dlicate pour R. terrigena, par contre pour A. brasilense on peut obtenir un taux de 86% de survie aprs 400 jours. La production grande chelle a permis dobtenir un dbit de 0,8 kg/h de matrice et une concentration trs leve de bactries immobilises.
Par la suite, nous allons tester diffrentes stratgies permettant damliorer la survie des bactries au procd dencapsulation. Cela passera la fois par la modulation de ltat physiologique des cellules au moment de lencapsulation et par le procd dencapsulation en lui-mme. Lobjectif vis est damliorer la protection des cellules au cours du schage.
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2. Optimisation de la survie des rhizobactries au procd dencapsulation

Nous avons dmontr que le procd de schage est ltape la plus critique de limmobilisation des bactries. En effet, le taux de survie diminue de plus dune unit logarithmique pour les 4 souches de rhizobactries testes.
Nous avons cherch amliorer le taux de survie des bactries au schage en travaillant sur la physiologie des bactries. Pour cette tude, nous avons choisi de travailler spcifiquement avec les rhizobactries A. brasilense et R. terrigena. Ces deux souches appartiennent aux bactries modles slectionnes dans le cadre du projet Rhibac.
2.1 Optimisation par la modulation de ltat physiologique des bactries

Afin daugmenter le taux de survie au procd dencapsulation, nous avons tudi le taux de mortalit des souches A. brasilense Sp245 et R. terrigena TFi08 en fonction de leur protection pendant le schage.
2.1.1 Linfluence de la phase de croissance sur la survie des cellules pendant lopration de schage ltuve. Nous avons rcolt les bactries en phase exponentielle (12 h) ou en phase stationnaire de croissance (24 h) et nous avons mesur lvolution du nombre de bactries vivantes au cours du procd dencapsulation.
La production de la biomasse dA. brasilense et R. terrigena a t ralise dans lErlenmeyer contenant 30 ml de milieu de culture YEP. Pour chaque souche, deux priodes de fermentation ont t ncessaires: 12 h pour les bactries en phase de croissance logarithmique et 24 h pour celles en phase de croissance stationnaire.
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Tableau IV.11. Nombre de cellules vivantes dA. brasilense et R. terrigena immobilises dans des capsules dalginate-amidon.
Type de capsules A.brasilense logarithmique A.brasilense stationnaire R. terrigena logarithmique
Culture initiale CFU total (1,3 0,3)x1010
Billes humides CFU total
Billes sches CFU total (3,7 0,5)x107
Rendement du schage
(3,0 4,0)x109
22,2 %
1,2 % b
(3,3 1,4)x1010
(2,3 0,2)x1010
90,0 %
(3,4 2,3)x109
11,5 % a
(4,3 1,3)x1011
(1,9 0,6)x1011
43,8 %
(2,6 0,4)x1010
14 % b
R. terrigena stationnaire
(2,5 0,3)x1011
(2,0 0,3)x1011
78,4 %
(1,1 0,4)x1010
5,4 % b
(Cette exprience a t rpte trois fois, les donnes de ce tableau sont la moyenne et lcart-type de ses rptitions).
Daprs le tableau IV.11 nous observons un fort rendement dencapsulation pour les deux souches testes ltat stationnaire (entre 78 et 90 %) et un faible rendement dencapsulation ltat logarithmique. La viabilit dA. brasilense en tat logarithmique chute aprs schage denviron 2 units logarithmiques. En revanche, les cellules en tat stationnaire ont t plus rsistantes ltape de schage. En effet, le nombre de cellules vivantes diminue seulement dune unit logarithmique pour A. brasilense en phase stationnaire croissance. Selon le test statistique de Cochran (p<0,05) il existe diffrences significatives entre lencapsulation dA. brasilense en phase logarithmique par rapport la phase exponentielle.
Les rsultats obtenus avec la souche R. terrigena sont trs diffrents, en ce qui concerne le rendement du schage. Pour cette souche, nous observons un fort taux de viabilit pour les cellules rcoltes en phase logarithmique de croissance. Par contre, R. terrigena rcolte en phase stationnaire voit sa survie diminue dune unit logarithmique aprs schage. Nanmoins, nous navons pas observ diffrences statistiques significatives, selon le test de Cochran (p<0,05).
133
Nous avons constat que ltape physiologique optimale pour le schage des rhizobactries dpend de chaque rhizobactries. A. brasilense a montr 11,5% de rendement du schage, par contre R. terrigena a montr 14% de rendement en phase logarithmique. Il est couramment admis que la phase de croissance optimale aux contraintes hydriques est lie essentiellement au micro-organisme. Nanmoins, de nombreux travaux montrent que les bactries en phase stationnaire sont plus rsistantes la dshydratation, que les mmes cellules pendant la phase exponentielle (Vriezen et al. 2006).
A. brasilense est capable de produire en phase stationnaire des niveaux levs de polyhydroxyalcanoates (PHA) (Kadouri et al. 2003). Ces composs de stockage du carbone produits l'intrieur de la cellule, pourraient amliorer la survie bactrienne aux stress hydriques et nutritionnels. La production de ces composs de stockage interne pourrait expliquer laugmentation du taux de viabilit.
Dans le cas de R. terrigena TFi08, ses caractristiques physiologiques sont peu connues, car cest une bactrie dont les proprits de promotion de la croissance des plantes nont t mises en vidence et isoles que trs rcemment par ECOWORK situ Vienne, en Autriche (Institut partenaire dans le projet europen MICRO-N-FIX, projet prcdent RHIBAC). Nanmoins, la bactrie R. terrigena est capable de produire des exopolysaccharides (Leone et al. 2007). Les polysaccharides peuvent soit tre excrts dans le milieu environnant, soit rester lis la surface de la cellule. Le rle des exopolysaccharides le plus souvent propos est la protection de la cellule vis--vis de son environnement. La capacit de s'enrober dans une couche d'EPS avec une forte teneur en eau la rend plus rsistante la dessiccation. Mais, le travail de Leone et al. (2007) ne spcifie pas les conditions qui permettent une production maximale des dits polysaccharides, qui pourrait expliquer le taux lev de rendement du schage en phase logarithmique. Des tudes plus prcises seront ncessaires pour comprendre le comportement de la souche R. terrigena vis--vis du procd de schage.
La connaissance de la phase de croissance optimale de chaque rhizobactrie encapsule par rapport aux contraintes hydriques, prsente un important potentiel pour permettre la diminution du taux de mortalit des cellules durant le procd dimmobilisation cellulaire.
134
2.1.2 Influence de l'adjonction dosmo-protecteurs dans le milieu de culture La protection des rhizobactries pendant le schage est la partie la plus sensible du procd dencapsulation. C'est pourquoi nous avons ajout des substances osmo-protectrices dans le milieu de culture des bactries. Le principe a t de protger la membrane des cellules partir de ltape de la fermentation des bactries.
Certains sucres sont connus pour leurs effets protecteurs sur de nombreuses espces bactriennes, telles que Rhizobium et Bradyrhizobium (Streeter 1985; 2007). Les molcules principalement concernes sont des glucides, comme le fructose et le trhalose (Morgan et al. 2006). C'est pourquoi ces deux glucides ont t tests en tant que molcules osmoprotectrices.
Le milieu YEP (yeast extract peptone) a ainsi t enrichi avec 3 mmol L-1 de trhalose ou 3 mmol L-1 de fructose. Le but tait de comparer le taux de survie des cellules cultives en milieu standard YEP avec ou sans osmo-protecteurs dans les capsules sches. Les rsultats sont prsents dans les tableaux IV.12 et IV.13.
Tableau IV.12. Linfluence de l'addition du trhalose et du fructose dans le milieu de culture sur la viabilit dA. brasilense Sp245.
Type de capsules Culture initiale CFU total A.brasilense YEP A.brasilense YEP + fructose A. brasilense YEP + trhalose
Billes sches CFU total
Rendement du schage
(3,3 1,4)x1010
(2,3 0,2)x1010
90,0 %
(3,4 2,3)x109
11,5 % a
(2,7 0,6)x1010
(7,9 5,8)x109
28,7 %
(1,1 5,1)x108
14,1 % a
(5,2 0,4)x1010
(2,9 0,5)x1010
55,3 %
(6,5 1,6)x109
22,6 % a
135
On a observ que l'adjonction de fructose et de trhalose dans le milieu de culture initial permet laugmentation du taux survie. Lutilisation des sucres dans le milieu de culture suppose une protection des bactries. Dans le milieu standard, le taux de survie au schage a t de 11,5%. En utilisant le milieu de culture additionn de fructose, le rendement a augment jusqu 14%. Le rsultat le plus probant est le rendement du schage de la souche A. brasilense qui est deux fois suprieur celui obtenu avec le milieu standard, lorsquon utilise le trhalose comme molcule dosmo-protection. Nanmoins, nous navons pas observ diffrences statistiques significatives, selon le test de Cochran (p<0,05).
Tableau IV.13. Influence de l'addition du trhalose et du fructose dans le milieu de culture sur la viabilit de R. terrigena TFi08.
Type de capsules R. terrigena YEP R. terrigena YEP+fructose R. terrigena YEP+trhalose
Culture initiale CFU total (2,5 0,3)x1011
Billes humides CFU total (2,0 0,3)*1011
Billes sches CFU total (1,1 0,4)x1010
Rendement du schage
78,4 %
5,4 % b
(1,3 0,2)x1011
(6,4 0,8)x1010
47,8 %
(8,9 3,9)x109
13,9 % b
(8,4 0,2)x1011
(2,1 0,4)x1011
24,3 %
(4,2 5,7)x1010
20,4 % a
Dans le cas de la souche R. terrigena, leffet est similaire, car leffet de ladjonction des sucres a augment le rendement du schage jusqu 14% en utilisant le fructose et jusqu 20% avec le trhalose. Selon le test statistique de Cochran (p<0,05) il existe diffrences significatives entre lencapsulation de R. terrigena dans le milieu de culture+trhalose par rapport YEP standard et YEP+ fructose.
Nos rsultats nous montrent que le taux de survie bactrien chute aprs le schage, raison pour laquelle, nous avons choisi comme stratgie la protection des bactries depuis ltape de fermentation, afin dassurer une protection des rhizobactries tout au long du procd
136
dencapsulation. Ladjonction des sucres a t formule par de nombreux chercheurs comme une mthode de protection de la membrane interne des bactries (Caesar et Burr 1991; Crowe et al. 1998; Streeter 2003). Lutilisation des sucres pour protger les bactries des contraintes dues aux procds de schage pour la production des inoculants biologiques a t tudie par Streeter (1985).
Le principe consiste ajouter des sucres cumulables dans le cytoplasme, que les bactries ne peuvent pas dgrader, par leur batterie enzymatique. Ceci est le cas du trhalose, ce sucre ne se dgrade pas, donc il reste dans la partie intrieure des cellules dA. brasilense et de la R. terrigena. Lorsque le schage des bactries a t effectu, le trhalose protge la membrane cellulaire dune dessiccation. En effet, la permabilisation de la membrane pourrait tre ainsi vite (Streeter 1985).
Dans cette tude, le rendement le plus lev a t obtenu en utilisant du trhalose ajout dans le milieu de culture en tant quosmo-protecteur. Nous obtenons plus de 20% de rendement aprs schage pour A. brasilense et R. terrigena. Les deux souches ne sont pas capables de dgrader le trhalose en tant que source de carbone et dnergie. Donc, nous supposons que le stockage de trhalose l'intrieur des cellules pourrait contribuer la stabilisation de la membrane pendant la dessiccation.
Nous avons ajout galement, le fructose en tant que substance dosmo-protection. Le taux de survie dA. brasilense et de R. terrigena, aprs schage a t denviron 14%. Lutilisation de fructose a permis une lgre augmentation de la survie des rhizobactries. Nanmoins, cette protection na pas t significative, car A. brasilense et R. terrigena sont toutes les deux capables dutiliser le fructose en tant que source de carbone et dnergie (Krieg et Dbereiner, 1984).
Dans la suite de ltude, nous nous sommes aussi intresss lutilisation de glycrol incorpor dans la matrice dencapsulation, car le glycrol permet de diminuer la microporosit des billes dalginate-amidon et par consquent d'augmenter la protection des rhizobactries pendant le schage.
137
2.2 Optimisation par la modulation des paramtres du procd dencapsulation

2.2.1 Influence de l'adjonction de glycrol dans la matrice dencapsulation
Nous avons essentiellement utilis dans cet essai la souche R. terrigena TFi08. Le principe a t dutiliser le glycrol en tant que molcule osmo-protectrice pour augmenter la protection des rhizobactries pendant le schage.
La matrice dencapsulation a t faite avec la recette classique alginate-amidon. Nous avons ajout 10 ml glycrol avec une concentration de 40 % dans 90 ml de matrice dencapsulation dalginate-amidon. Ensuite, nous avons sch les capsules ltuve 35 C pendant 24 h. Le prochain tableau montre les rsultats de survie de la souche R. terrigena lencapsulation, dans une matrice dalginate-amidon et dalginate-amidon-glycrol.
Tableau IV.14. Taux de survie de R. terrigena (UFC total) immobilis dans des capsules dalginate-amidon et lalginate-glycrol-amidon.
Composition
Culture
Capsules humides 1,98x1011
Rendement Capsules sches dencapsulation 78,6 % 1,07x1010
Rendement de schage 4,2 %
alginate-amidon
2,52x1011
alginate-glycrolamidon
7,10x1010
3,70x1010
52,1 %
1,40x1010
19,7 %
Nous avons pu constater que ladjonction de glycrol la matrice dencapsulation a permis daugmenter cinq fois le rendement de la viabilit de la souche R. terrigena au schage.
Le glycrol pourrait augmenter la matire sche des capsules et permettrait de remplir les pores des capsules. Ce remplissage des pores pourrait protger les rhizobactries durant la contraction des capsules pendant le procd de schage. La dessiccation engendre la contraction membranaire pouvant entraner la plasmolyse chez les organismes qui ont une paroi rigide comme les bactries Gram ngatif (Mille et al. 2002), tel que R. terrigena. Le
138
glycrol pourrait intervenir galement comme un agent de charge qui espace les cellules et renforce la protection de la membrane cellulaire pendant le schage.
Cette exprience a t faite la fin du travail de thse, raison pour laquelle nous navons pu continuer avec cette formulation, malgr un rendement de 20 % sur le taux de survie de R. terrigena au schage.
Le cot actuel du glycrol est peu onreux ce qui le rendrait compatible pour une application dans le domaine industriel en tant que bioengrais pour une agriculture durable et respectueuse de l'environnement.
La partie qui suit prsente linfluence dun changement du sel de calcium, utilis durant le procd de glification de billes. 2.2.2 Modification du sel de calcium utilis pour la glification de lalginate L'agent de glification des capsules dalginate le plus couramment employ a t le CaCl2. En revanche, lutilisation du gluconate de calcium, qui na pas encore t test, pourrait agir la fois comme un agent glifiant et aussi en tant quosmo-protectant.
L'utilisation du CaCl2 (0,1 M) et du gluconate de calcium (0,1 M) comme source du Ca2+ a t employe dans le procd de glification des billes dalginate-amidon. Le tableau IV.15, montre les rsultats du dnombrement dA. brasilense et de R. terrigena encapsules dans des billes dalginate-amidon.
139
Tableau IV.15. Linfluence de la source de calcium sur la viabilit de lA. brasilense et R. terrigena.
Type de capsules A.brasilense CaCl2 A.brasilense Gluconate Ca R. terrigena CaCl2 R. terrigena Gluconate Ca
Culture initiale CFU total
Billes sches CFU total
Rendement du schage
(3,3 1,4)x1010
(2,3 0,2)x1010
90,0 %
(3,4 2,3)x109
11,5 % a
(2,8 0,1)x1010
(7,7 0,4)x109
28,0 %
(6,5 0,8)x106
0,08 % b
(2,5 0,3)x1011
(2,0 0,3)x1011
78,4 %
(1,1 0,4)x1010
5,4 % a
(2,7 0,1)x1011
(2,0 0,4)x1011
75,8 %
(8,4 2,9)*1010
40,9 % a
Les rsultats du dnombrement initial dA. brasilense du milieu de culture a donn la valeur de 2,8x1010 UFC total. Le nombre de cellules revivifiables a diminu aprs le schage 6,5 x106 UFC total, ce qui reprsente un rendement de 0,08%. Cette valeur est significativement plus faible que celle obtenue lors de l'utilisation du CaCl2 (agent traditionnel de glification des billes de lalginate). En revanche, la souche R. terrigena a montr un taux de survie lev en utilisant le gluconate de calcium en tant quagent de glification. Selon le test statistique de Cochran (p<0,05) il existe diffrences significatives entre lutilisation de CaCl2 et gluconate de Ca pour lencapsulation dA. brasilense. Nanmoins, nous navons pas observ diffrences statistiques significatives en utilisant diffrente source de Ca pour lencapsulation de R. terrigena.
L'utilisation de gluconate de calcium en tant qu'agent glifiant na eu aucun effet ngatif sur la survie dA. brasilense dans les tapes du procd d'encapsulation de formation des billes dalginate et de schage de ces billes.
140
La diminution de la viabilit chez A. brasilense a t surprenante, car la viabilit a chut de 3 units logarithmiques. Le gluconate de calcium est utilis dans lindustrie agroalimentaire, en tant que rgulateur dacidit. Le pH optimal de croissance dA. brasilense est compris entre 6,0 et 7,8 (Krieg et Dbereiner 1984). Notre hypothse est que la rhizobactrie A. brasilense nest pas trs rsistante au changement de pH. Nous supposons que ltape de formation des capsules, dans laquelle ces dernires rentrent en contact avec la solution de gluconate, pendant plus de 30 min, pourrait diminuer la survie des bactries. Donc, lutilisation de ce sel de calcium pourrait avoir des effets nocifs sur la viabilit dA. brasilense.
Dans le travail de Bashan et al. (2002) sur lencapsulation dA. brasilense Cd, il est observ que ltape de glification de lalginate de calcium entrane la mortalit dune partie des cellules dA. brasilense. Ces auteurs font lhypothse que la formation d'un ou de plusieurs rseaux par voie ionique, pourrait affecter ngativement la viabilit des rhizobactries. Cependant, le pH de travail nest pas prcis dans cette tude et lutilisation dune matrice acide pourrait tre la cause de ces observations.
L'utilisation du gluconate de calcium est prjudiciable la survie dA. brasilense, entre les tapes de formation des billes jusqu ltape de schage. Ce rsultat confirme le fait que l'utilisation d'un glifiant comme agent de protection cellulaire dpend de chaque microorganisme et il doit tre valu individuellement pour chaque cas.
En revanche, les rsultats pour R. terrigena immobilise dans un support glifi avec du gluconate de calcium ont montr une augmentation du rendement. Le dnombrement initial des cellules du milieu de culture a prsent la valeur de 2,7x1011 UFC total, qui a chut aprs schage une valeur de 8,4x1010 UFC total, ce que reprsente un rendement de 41% de viabilit cellulaire. Ce rsultat et significativement plus lev que celui du rendement obtenu lors de l'utilisation du CaCl2.
Le gluconate de calcium pourrait donc tre utilis comme un agent glifiant et osmo protectrice, car il fournit une protection efficace pour certaines rhizobactries, tel que la R. terrigena.
141
Par la suite, lobjectif a t de proposer une solution adquate pour optimiser la survie des rhizobactries durant ltape de stockage.
2.2.3 Modulation du niveau de schage et stockage des capsules Nous avons immobilis la souche de B. pumilus C26 dans une matrice dalginate-amidon, donc le principe de production a t dcrit dans le chapitre 2 de la partie Matriel & Mthodes. Les capsules ont t sches laide dun systme de lit fluidis construit au sein de notre laboratoire. La temprature de schage a t de 25 C, la vitesse de lair de 2 m/s et lhumidit de lair de schage de 11%. Les conditions de schage ont t diffrentes par rapport au schage lchelle pilote pour notre partenaire industriel Masstock (chapitre IV. 1.4.2).
Le schage des capsules a t arrt, selon les valeurs de lAw souhaites (tableau III.11). la suite du schage, les capsules ont t dposes dans des dessiccateurs une temprature ambiante de 25C. Nous avons galement ajout diffrents types de sel saturs pour maintenir la valeur de lAw choisie (tableau III.10 de Matriel et Mthode). 50 g de capsules dshydrates contenant 109 UFC/g ont t stocks dans des dessiccateurs lAw pralablement rgul.
Tableau IV.16. Linfluence du temps de schage des capsules sur la perte de lactivit de leau et sur la viabilit de R. terrigena.
Temps de schage (min) 80 85 90 105 110
Aw 0,84 0,75 0,55 0,31 0,11
Viabilit UFC/g des capsules 8,9x107 3,0x106 3,0x107 3,4x106 3,1x107 2,6x106 3,4x107 4,4x106 1,12x107 2,0x105
142
La figure IV.11 montre lvolution de la perte de la viabilit exprime en rduction dcimale des bactries durant une priode de stockage de 16 semaines 25C pour diffrente valeur dAw.
Figure IV.11. Linfluence de lAw sur la perte de viabilit de B. pumilus pendant les conditions de stockage.
On a constat que la viabilit de B. pumilus stocke un Aw de 0,84 diminue entre la deuxime et sixime semaine de stockage. Aprs 6 semaines, nous navons dtect aucune bactrie vivante dans ces conditions. En revanche, la conservation de bactries avec un Aw de 0,3 a permis de maintenir une concentration de B. pumilus aprs 16 semaines suprieures 1x106 CFU/g des capsules. Nous observons cependant une rduction dcimale suprieure 1 par rapport la concentration de bactries initiale. Le stockage de B. pumilus dans les dessiccateurs un Aw de 0,11 a permis dobtenir une concentration de bactries stable tout au long de la priode de stockage. Aprs 16 semaines, le nombre des B. pumilus a t suprieur 1x108 CFU/g des capsules.
Les rsultats obtenus au cours du stockage des cellules encapsules dans des billes dalginate-amidon ont montr que le taux de mortalit cellulaire semble avoir un rapport avec la quantit deau disponible. Une forte diminution de la viabilit cellulaire a t
143
observe au-dessus d'un Aw de 0,55. Le stockage des bactries un Aw de 0,75 et de 0,84 facilite la forte contamination par des champignons entrainant une diminution rapide du taux de survie des cellules. Il est reconnu que le fonctionnement des protines est affect dans un certain intervalle dAw, dans duquel certaines fonctions essentielles des cellules se dtriorent. En particulier, les activits enzymatiques diminuent fortement avec lAw dans la gamme de 0,6 - 0,8 (Marshall et al. 1974). Un dsquilibre physiologique serait lorigine de la mort cellulaire au cours du stockage dans cette gamme dAw.
Notre rsultat est en accord avec ceux qui sont obtenus pour lencapsulation en billes dalginate de la souche Azospirillum lipoferum (Paul et al. 1993). Les auteurs ont observ quau-dessus d'un Aw de 0,55 la mortalit des bactries est denviron 2 units logarithmiques aprs 12 semaines de stockage. En revanche, un Aw de 0,11 maintenue durant le stockage n'a eu aucune incidence sur la survie cellulaire. Il peut aussi tre conclu que, lors dun stockage un Aw de 0,11, la prsence d'une petite quantit d'eau d'hydratation na pas deffet sur la viabilit de B. pumilus, trs probablement parce que l'intensit des ractions induites n'tait pas assez leve.
Ainsi, la mortalit des bactries est lie avec la quantit de leau rsiduelle dans les capsules. Le stockage des capsules dans un environnement avec un Aw >0,2 entranera une chute du taux de viabilit de B. pumilus. Il est recommandable le schage des capsules jusqu une valeur dAw comprise entre 0,1-0,2. Une valeur dAw suprieure limitera la priode de stockage jusqu 6 semaines.
144
Ltat physiologique optimal pour le schage des rhizobactries encapsules dpend de chaque bactrie. A. brasilense a montr un meilleur rendement au schage en phase stationnaire de croissance (11,5%), alors que R. terrigena a montr un meilleur rendement au schage en phase logarithmique (14%). Par ailleurs, il est galement possible de modifier ltat des cellules et ainsi les rendre plus rsistants au schage en ajoutant des osmo-protectants dans le milieu de culture. Le trhalose est la molcule qui a permis dobtenir les meilleurs rsultats.
Pour les deux espces A. brasilense et R. terrigena, nous avons obtenu plus de 20% de rendement de survie aprs schage en ajoutant du glycrol dans la matrice dencapsulation. Le gluconate de calcium pourrait galement tre utilis comme un agent glifiant et osmo-protecteur, car il fournit une protection efficace pour certaines rhizobactries, comme R. terrigena.
Enfin, pour une survie des bactries optimale pendant le stockage des capsules, nos rsultats confirment quun schage un Aw>0,2 entrainera une diminution de la survie des cellules. Un schage de B. pumilus encapsules jusqu une valeur dAw entre 0,10,2 est donc recommand.
Ce travail de caractrisation et doptimisation de la survie est suivi dun travail de recherche de comprhension. Dans le chapitre 3 de rsultats et discussion nous avons tudi ladhsion des diffrentes souches de rhizobactries aux granules damidon afin de corrler ce phnomne une protection cellulaire au procd dencapsulation et/ou une libration contrle des bactries.
145
3. tude de ladhsion des rhizobactries sur lamidon

Le phnomne mcanique d'adhsion des bactries sur les granules d'amidon a t mis en vidence pour le genre Bifidobacterium utilis dans les prparations probiotiques (Wang et al. 1999). Ces travaux suggrent que l'incorporation d'amidon diminue la mortalit prmature des cellules, car ladhsion de bactries sur lamidon protge les bactries pendant leur passage dans le transit intestinal.
On a galement observ que ces cellules adhres aux granules d'amidon ont t mieux protges lors du stockage, ainsi que pendant le transit intestinal (Wang et al. 1999; Crittenden et al. 2001). Nous avons donc voulu tester la capacit dadhsion des rhizobactries aux grains damidon pour la mettre en relation avec la survie des cellules pendant le procd dencapsulation dans une matrice alginate-amidon.
Ladhsion des bactries sur lamidon est un phnomne naturel. Jusqu prsent les recherches scientifiques ont dmontr deux causes pour le mme phnomne. Dun ct, selon le travail de Crittenden et al. (2001) les mcanismes dadhsion du genre Bifidobacterium sur lamidon, semblent impliquer une protine de surface cellulaire. Dun autre ct, il a t montr prcdemment que certaines bactries intestinales peuvent adhrer aux granules d'amidon et que l'adhsion est parfois ncessaire pour une utilisation efficace de lamylose (Reeves et al. 1997). L'valuation du degr dadhsion des rhizobactries sur les granules damidon sinscrit dans un travail fondamental de recherche des mcanismes de protection des bactries au procd dencapsulation et de libration progressive permises par lamidon. Plusieurs travaux ont mis en vidence lintrt de ladhsion de bactries aux granules damidon pour leur protection au procd dencapsulation (Jankowski et al. 1997; Forssell et al. 2004; Lahtinen et al. 2007), pour la protection de bactries probiotiques pendant le passage dans lestomac (O'Riordan et al. 2001). Notre objectif ntait pas dexpliquer les phnomnes dadhsion, mais plutt dvaluer la capacit dadhsion des diffrentes souches de rhizobactries par rapport au type damidon et la taille de granules damidon.
146
3.1. Influence de la souche de rhizobactries sur ladhsion la surface des granules damidon Ladhsion des rhizobactries sur la surface des granules damidon a t mesure l'aide de la mthode de cosdimentation, propose par Crittenden et al. (2001). Selon lui, si le pourcentage d'adhsion est de plus de 70% les bactries sont considres comme fortement adhrentes, entre 40 et 70%, les bactries sont considres comme modrment adhrentes et celles dont la valeur est infrieure 40% sont faiblement adhrentes.
La capacit dadhsion des cellules sur l'amidon de mas a t mesure avec six souches de rhizobactries diffrentes (E. Ludwigii BNM0357, R. terrigena TFI08, Paenibacillus polymyxa MXC5, B. pumilus C26 et A. brasilense Sp7 et Sp245).
Figure IV.12. Ladhsion des rhizobactries dans granules damidon standard de mas.
La figure IV.12 montre le pourcentage dadhsion lamidon de mas de 6 souches rhizobactriennes. Les deux souches dA. brasilense et B. pumilus peuvent tre considres comme faiblement adhrentes avec des pourcentages dadhsion infrieurs 35%.
147
Les souches P. polymyxa et R. terrigena, quant elles prsente une capacit dadhsion denviron 50 %. Enfin, ces rsultats montrent que la souche E. ludwigii est la rhizobactrie la plus adhrente parmi les souches testes avec 65 % de bactries adhres.
3.2. Influence de ltat physiologique dEnterobacter ludwigii sur sa capacit dadhsion aux granules damidon Dans le but de mieux comprendre le phnomne d'adhsion cellulaire sur la surface des granules damidon nous avons choisi dapprofondir la recherche avec la souche E. ludwigii, car celle-ci est la rhizobactrie qui prsente la meilleure adhsion aux granules damidon. La figure suivante montre l'adhsion cellulaire en phase stationnaire et exponentielle de cette souche.
Figure IV.13. Pourcentage dadhsion dEnterobacter ludwigii en phase stationnaire et exponentielle sur les granules damidon standard de mas.
Il semble toutefois vident que l'adhsion des E. ludwigii a t influence par ltat physiologique des cellules. En phase stationnaire, ladhsion a t de 65 % et en phase exponentielle seulement de 35 %. Nous pouvons supposer que la substance d'adhsion est surtout produite en phase stationnaire de croissance cellulaire. Ce phnomne pourrait tre expliqu par la production de substance dadhsion dans la membrane externe de E. ludwigii connu comme exopolysaccharides (voir figure IV.24).
148
3.3. Effet du type damidon sur ladhsion cellulaire Prcdemment, nous avons montr que ladhsion dpendait du type de souche et de leur tat physiologique. Mais, ce ne sont pas les seuls paramtres qui peuvent influencer le taux dadhsion. Dans cette partie, nous nous intressons limpact du type damidon sur le pourcentage dadhsion. Pour cela, nous avons valu ladhsion de trois souches bactriennes lamidon de pomme de terre, de mas et de bl.
Les figures suivantes montrent le taux dadhsion sur les trois amidons pour les souches E. ludwigii, R. terrigena et B. pumilus.
Figure IV.14. Pourcentage dadhsion de B. pumilus sur lamidon de pomme de terre, de mas et de bl.
149
Figure IV.15. Pourcentage dadhsion cellulaire de R. terrigena sur lamidon de la pomme de terre, de mas et de bl.
Figure IV.16. Pourcentage dadhsion cellulaire dE. ludwigii sur lamidon de la pomme de terre, de mas et de bl.
Les rsultats montrent que le pourcentage dadhsion des souches R. terrigena et B. pumilus ne varie pas normment en fonction de rhizobactries ni du type damidon utilis. Ces dernires bactries, qui sont moyennement adhrentes, le sont quelle que soit lorigine
150
botanique de lamidon. Par contre, nous observons que la souche E. ludwigii prsente un pourcentage d'adhsion sur les granules d'amidon dpendant de leur origine botanique.
Les caractristiques des granules telles que la taille et le pourcentage damylose des grains damidon pourraient influencer le pourcentage dadhsion des bactries trs adhrentes. Dans cette premire partie, nous avons valu trois types damidon avec des diamtres de granules trs diffrents (tableau IV.17). Nous pouvons observer que le pourcentage dadhsion de la souche E. ludwigii est inversement proportionnel la taille des granules. Ladhsion des bactries pourrait donc tre lie aux tailles des granules. Nous pouvons mettre lhypothse quune taille plus petite des granules permet un pourcentage dadhsion beaucoup plus important, que celles des granules de plus grandes tailles, celle damidon de pomme de terre, grce un plus grand rapport surface/volume. Cet effet a dj t dcrit par Crittenden et al (2001), qui ont trouv une forte corrlation entre ladhsion cellulaire et la taille des granules damidon.
Tableau IV. 17. Type damidon et le diamtre des granules.
Type damidon Bl Mas Pomme de terre
Diamtre des granules (m) 5-15 5-25 15-100
Les figures suivantes montrent ladhsion sur lamidon avec les souches E. ludwigii, R. terrigena et B. pumilus vis--vis de lamidon de pomme de terre, mas et bl.
Nos exprimentations montrent que les pourcentages dadhsion de R. terrigena et B. pumilus sont indpendant de lorigine botanique de lamidon pour les amidons tests dans ce travail. Nanmoins, l'adhsion de E. ludwigii est trs fortement lie la taille des granules et cela pourrait tre d un rapport surface/volume plus important des granules de bl par rapport lamidon de pomme de terre. Nanmoins, cet effet na pas t dmontr en utilisant B. pumilus et R. terrigena, les deux rhizobactries ont t considres comme faiblement
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adhrentes par rapport ladhsion vis--vis de la taille des granules damidon. Nous avons observ que la capacit dadhsion des rhizobactries dans la surface des granules damidon dpende trs fortement de la production dexopolysaccharides des bactries, cela a t plus important que du rapport surface/volume des granules damidon.
Aprs avoir vrifi la corrlation entre le pourcentage dadhsion des rhizobactries et la taille des granules damidon, nous avons vrifi la relation entre l'adhsion cellulaire et le pourcentage damylose dans lamidon.
3.4. Pourcentage dadhsion cellulaire en fonction de la concentration de lamylose dans les granules damidon. Nous avons test leffet de la concentration en amylose de lamidon sur ladhsion de trois souches de rhizobactries en utilisant trois amidons de mas avec des teneurs en amylose connues (tableau IV.18).
Tableau IV.18. Concentration en amylose des amidons tests
Type damidon mas waxy mas standard mas high (hylon)
% de lamylose 1 25 70
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Figure IV.17. Pourcentage dadhsion de B. pumilus sur lamidon de mas waxy, standard et hylon.
Daprs la figure IV.17, il ny a pas de diffrence dadhsion significative de B. pumilus aux trois types damidon tests.
Figure IV.18. Pourcentage dadhsion de R. terrigena sur lamidon de mas standard, waxy et hylon.
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La figure IV.18 nous indique que globalement la souche R. terrigena est plus adhrente que la souche B. pumilus. Aucun effet significatif du type damidon nest observ.
Figure IV.19. Pourcentage dadhsion de E. ludwigii sur lamidon de mas standard, waxy et hylon.
La figure IV.19 permet dobserver dans le cas de la souche E. ludwigii, un pourcentage dadhsion suprieur 50 % pour les trois types damidon tests. De nouveau, nous navons pas trouv de diffrences dadhrence des cellules sur les granules damidon par rapport leur concentration en amylose. Cet effet pourrait tre due au fait que B. pumilus, R. terrigena et E. ludwigii ne dgradent pas lamidon en tant que source de carbone; ces micro-organismes ne font pas partie des bactries amylolytiques (absence de leurs enzymes amylolytiques, comme lamylase). Comme le montre les figures prcdentes, les rsultats mettent en vidence que le pourcentage damylose dans les granules damidon teste ont peu d'influence sur ladhsion des B. pumilus, R. terrigena et E. ludwigii.
L'adhsion des bactries la surface des grains d'amidon est une caractristique commune des bactries qui utilisent celui-ci comme substrat de carbone. Ladhsion des bactries la surface du substrat des granules est reconnue comme le dbut du processus de dgradation de lamylose par les enzymes de la paroi de la membrane des micro-organismes (Wang et al. 1999). Il existe une relation entre le pourcentage dadhsion des bactries sur lamidon et son
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utilisation en tant que source de carbone. Il a t dmontr que dans le cas de la dgradation de lamylose par Lactobacillus amylovorus, la squence est d'abord adhsion cellulaire sur les granules de lamidon, puis leur dgradation (Imam et Harry-O'Kuru 1991). Nanmoins, le travail de Crittenden et al. (2001) a montr montr quil nest pas ncessaire pour une bactrie dtre trs adhrente lamidon pour le dgrader. Ces auteurs montrent galement que ladhsion est lie la prsence de protines de surface spcifiques. Dans notre cas, l'aptitude ladhsion importante de la souche E. ludwigii nest pas lie sa capacit utiliser lamidon. Elle pourrait tre due une production d'EPS ou de "polysaccharide exocellulaire" (voir figure IV.24). Les mcanismes d'adhsion utiliss par les bactries pour s'adhrer l'amidon ne sont nanmoins pas encore bien connus. Cest pourquoi nous avons complt cette tude par des observations par microscopie lectronique.
3.5. Observation au microscope lectronique balayage des bactries adhres sur la surface des granules de lamidon. La microscopie lectronique balayage est une technique puissante dobservation de la morphologie des bactries. Nous avons aussi utilis cette technique pour lobservation de la souche R. terrigena et E. ludwigii adhres entre elles et la surface des granules damidon (figures IV. 20, 21, 22, 23 et 24).
Figure IV.20. Granule damidon sans rhizobactries ( gauche) et avec R. terrigena adhres la surface des granules damidon ( droite).
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Figure IV.21. Photo au microscope lectronique balayage qui montre des bactries de la souche R. terrigena adhres la surface des granules d'amidon.
Figure IV.22. Photo au microscope lectronique balayage de cellules dE. ludwigii adhres aux granules damidon de mas.
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Figure IV.23. Photo au microscope lectronique balayage de cellules dEnterobacter ludwigii adhres aux granules damidon de mas.
Figure IV.24. Photo au microscope lectronique balayage de cellules dE. ludwigii adhres aux granules damidon de mas.
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Figure IV.25. Photo au microscope lectronique balayage de Bacillus pumilus.
La figure IV.25 montre la souche B. pumilus (65 % dadhsion aux granules damidon) sans prsence de substance dans la partie extrieure de la membrane. En revanche les figures IV.23 et IV.24 montre lE. ludwigii (35 % dadhsion aux granules damidon) avec de connections entre les bactries (biofilms) et possible prsence dexopolysaccharides.
L'adhsion cellulaire la surface des granules damidon est une caractristique commune pour les cinq genres des rhizobactries tests (Enterobacter, Raoultella, Paenibacillus, Bacillus et Azospirillum). Nanmoins, un fort pourcentage d'adhsion cellulaire a t mis en vidence seulement pour l'une des souches bactriennes, E. ludwigii. Malgr un pourcentage dadhsion de 65 %, la bactrie ne prsente pas un taux lev de survie pendant le procd dencapsulation. Cest mme la bactrie qui nous est apparue comme la plus sensible au stress gnr par le schage. De ce point de vue, nous navons pas constat une protection des bactries par ladhsion aux granules damidon. Cependant, ces rsultats doivent tre nuancs. En effet,nous pensons que les bactries fortement adhres ne sont pas facilement spares des granules damidon. Il est donc possible que pour cette raison que le dnombrement des cellules revivifiables ait t sous-valu. Un grain damidon tant associ
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avec un nombre important de bactries, ces bactries adhres au granule damidon pourraient donner lieu la croissance dune seule colonie en surface du milieu de culture.
Imam et Harry-OKuru (1991) ont propos dutiliser du formaldhyde (2 %; pH 2) et de la glycine (1M; pH 2) pour dtacher les bactries adhres aux granules damidon. Cependant, lutilisation des solutions au pH trs faible a un effet bactricide, et ne permet donc pas de rpondre notre problmatique. Nanmoins, lutilisation de lhydrolyse enzymatique, en utilisant par exemple des amylases, pourra tre une alternative pour la dgradation des granules damidon, et une mthode pour connatre le nombre total de bactries, la suite du procd dencapsulation (Communication personnelle avec Paul Colonna, INRA, Nantes). Cela ncessite un travail de mise au point important qui pourrait faire lobjet dune tude ultrieure. Par ailleurs, le rle de ladhsion des bactries lamidon dans la libration progressive des bactries de leur support reste dterminer.
Daprs nos images acquises par microscopie lectronique, ladhsion pourrait tre lie la prsence dexopolysaccharides et laptitude des bactries former des films bactriens, prsence de connexions entre les bactries (voir figure IV.23). Il semble galement que la substance responsable de ladhsion chez les bactries soit plutt produite en phase stationnaire de croissance puisque E. ludwigii adhre significativement plus lamidon dans cette phase de croissance.
Le phnomne d'adhsion des bactries la surface des granules damidon a t utilis pour la protection des bactries probiotiques destines l'alimentation humaine contre les stress rencontrs lors du transit intestinal (Wang et al., 1999). Notre travail montre quil existe un potentiel dadhrence des rhizobactries aux granules damidon. Une seule bactrie a pu tre considre comme trs adhrente, mais cette qualit na pu tre lie une meilleure rsistance au procd dencapsulation et plus particulirement au schage. Une tude approfondie sur la survie dE. ludwigii au procd de schage en lien avec son adhsion aux granules damidon sera ncessaire pour conclure sur ce point. Cela passera par la mise au point dune technique complexe dvaluation du taux de survie des bactries aprs schage.
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Par la suite, nous allons valuer la libration progressive des diffrentes souches de rhizobactries dans leau physiologique et le sol. Puis, nous montrerons les rsultats de tests en champs des capsules produits lchelle pilote.
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4. Libration progressive des rhizobactries et efficacit en champs

Lencapsulation des cellules na de sens que si lon peut obtenir leur libration progressive dans le sol. Pour une efficacit maximale, on souhaitera avoir une libration rapide au dbut de la priode dapplication, mais aussi avec un effet prolong dans le temps. Nous avons tudi la libration des cellules de R. terrigena et de B. pumilus encapsules dans une matrice dalginate-amidon, dans leau et dans le sol. Dans le sol, nous avons pu comparer lvolution du nombre de cellules libres avec un sol inocul directement par une culture cellulaire. Puis, les rsultats dessais en plein champ raliss dans deux conditions climatiques et sur des sols diffrents seront prsents.
4.1 Libration des rhizobactries dans leau et dans le sol

4.1.1 Libration des B. pumilus et R. terrigena dans leau La mthode pour mesurer la libration des bactries dans leau a t propose par Bashan et al. (2002). Elle consiste placer 0,5 g des capsules dalginate-amidon sches sous agitation dans de leau physiologique pendant 80 h. Aprs cette priode, les capsules ont t dsagrges. Rgulirement, des prlvements ont t raliss pour dnombrer le nombre de cellules vivantes prsentes dans leau physiologique.
Lobjectif tait dvaluer la libration des souches B. pumilus C26 (rhizobactries mobile) et R. terrigena TFi08 (rhizobactrie non mobile) encapsules et inocules dans un milieu liquide. La figure IV.26 montre la libration dans leau physiologique des bactries encapsules.
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Figure IV.26. volution du nombre de bactries dans leau physiologique en prsence de capsules contenant B. pumilus ou R. terrigena.
On observe une augmentation rapide du nombre des bactries libres. La souche B. pumilus a montr une libration relativement faible de 104 UFC/g des capsules aprs 10 h dans leau physiologique. Puis, elle montre une diffusion des cellules maximales de 1010 UFC/g de capsules aprs 60 h dagitation dans leau physiologique. Aprs cette priode, la libration de B. pumilus partir des capsules commence diminuer. Par contre, la libration de la souche R. terrigena a montr un profil constant de libration partir dau plus 20 h dagitation dans leau physiologique, en effet la concentration des bactries dnombre a t comprise entre 107 109 UFC/g des capsules pendant les 80 h.
La libration plus importante de B. pumilus dans leau physiologique par rapport R. terrigena pourrait tre due la mobilit des cellules de B. pumilus qui possdent des flagelles permettant le dplacement en milieu liquide (Maplestone et Campbella 1989). En revanche, R. terrigena est considr comme une bactrie immobile (Drancourt et al. 2001). La mobilit des bactries pourrait augmenter la libration de ces dernires. Malgr la non-mobilit de R. terrigena, sa libration a t plus rapide au dbut de lessai que celle de B. pumilus. Il est possible quun grand nombre des cellules de R. terrigena aient t places proches de la
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surface des capsules, ce qui expliquerait cette libration rapide dans la premire partie de lessai. Le premier aspect considrer est linfluence de lamidon sur la le comptage de B.pumilus, cette rhizobactrie a montr un faible pourcentage dadhsion sur les granules damidon (40%), cest--dire un pourcentage lev des bactries libres non adhres. Un deuxime aspect considrer est le taux de croissance acclre de R. terrigena par rapport B. pumilus. Finalement, la diffrence de concentration initiale des bactries par capsules. La concentration de R. terrigena dans les capsules initiales tait de 8,2x105 UFC/capsule et pour B. pumilus de 1,4x108 UFC/capsule. Cette diffrence, de nombre des bactries encapsules, due la plus grande rsistance au procd de schage de B. pumilus (possible formation de spores). Donc, une concentration plus forte des B. pumilus encapsules, pourrait provoquer une libration des bactries jusqu 1x1010 UFC/g des capsules aprs 60 h dessai.
Les essais de libration dans leau pendant 80 h ont t trs dlicats. En effet, il est apparu que les capsules ont t dsagrges ce qui a rendu le dnombrement des bactries libres depuis les capsules difficiles mesurer. Pour conclure, le temps de dgradation des matriaux des capsules, la porosit des capsules et la mobilit des rhizobactries, pourraient affecter la libration progressive des rhizobactries dans leau et dans le sol. La partie suivante s'intresse la libration des rhizobactries encapsules dans le sol.
4.1.2 Libration dans le sol de B. pumilus encapsule Pour les essais de libration des bactries dans le sol, des capsules sches de B. pumilus ont t introduites dans un sol humide (voir conditionnes de sol dans le chapitre 4.2 de Matriel & Mthodes) et le nombre de cellules prsentes dans le sol, pralablement strilis, a t dnombr au cours du temps pendant 24 jours. Nous avons compar nos rsultats avec un sol ensemenc directement avec un inoculum liquide.
De manire comprendre lvolution de la densit cellulaire dans le sol pour les bactries inocules sous forme de capsules, des capsules rsiduelles ont t prleves au cours du temps aprs linoculation et le nombre de bactries prsentes dans les capsules a t dnombr. Les rsultats sont prsents sur la figure suivante et sont exprims en CFU total par essai de 20 g
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de sol. La figure suivante montre le nombre de cellules par g de sol pour deux types dinoculation : liquide et capsules.
Figure IV.27. Inoculation de B. pumilus dans le sol en forme liquide et capsules.
Nous observons une augmentation du nombre de cellules de B. pumilus dans le sol inocul en forme liquide durant les jours 6-15 qui suivent linoculation. Ce rsultat montre que les bactries sont capables de se ractiver et de se multiplier dans le sol. Le nombre de rhizobactries contenu dans le sol est alors de 107 UFC/g de sol et il reste stable jusquau jour 15. Cependant, aprs cette priode la concentration des bactries diminue progressivement dune unit logarithmique du jour 15 au jour 24.
Concernant la concentration des B. pumilus dans le sol inocul avec les capsules, le nombre de bactries reste stable au cours de notre essai.
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Figure IV.28. Capsules dalginate-amidon avant dtre mis dans le sol (A) capsules dalginate-amidon aprs 24 jours dinoculation dans le sol (B).
On a constat aprs 24 jours dinoculation des capsules dans le sol, une coloration noire sur la surface des capsules dalginate-amidon, comme le prsente la figure IV.28. Ces colorations selon notre observation au microscope ont t dues la contamination par les mycliums des champignons. Cette contamination et un ventuel affect antagonique entre micro-organismes pourrait expliquer la diminution du nombre de cellules de B. pumilus l'extrieur des capsules. Dautre part, le sol ayant au pralable t strilis, la contamination peut avoir pour origine la surface des capsules qui ntait pas strile.
Linoculation liquide a montr une multiplication des bactries au dbut de la priode dapplication, due la croissance des bactries dans le sol. Le nombre de bactries encore prsentes dans les capsules diminue tout au long de la priode dessai (figure IV.27). Cela peut tre d la contamination par un champignon la surface des capsules. Cette contamination fongique pourrait empcher ou diminuer la multiplication des bactries cause des affects antagoniques des microorganismes. Dans des conditions relles dinoculation des bactries dans le sol, il existe une varit et un nombre important de microorganismes qui interfrent entre eux. Il serait donc intressant de renouveler ces essais dans plusieurs types de sols non striles et dobserver de quelle manire les capsules sont biodgrades par les rhizobactries encapsuls. Les capsules seraient alors de vritables bio165
racteurs dans le sol. Pour viter le problme de contamination du support par dautres microorganismes, une dcontamination de la surface des capsules pourrait tre efficace et reste tester.
Afin de permettre la multiplication des bactries au sein des capsules, il serait ncessaire que les bactries utilisent lamidon comme source de carbone. Nanmoins, les rhizobactries utilises ici, telles que B. pumilus et R. terrigena nutilisent pas lamidon comme source de carbone. Dans cette perspective, lencapsulation des rhizobactries qui dgradent lamidon pourrait permettre une augmentation du nombre des rhizobactries dans les capsules. Ladjonction de nutriments (extrait de levure ou peptones par exemple) facilement assimils par les rhizobactries dans les capsules pourrait galement tre teste.
Si la libration des rhizobactries dans le sol est une tape dterminante, reste valuer l'efficacit des inoculant encapsules dans le champ.
4.2 tude de lefficacit des inoculums encapsuls en champs

Nous avons ralis une production lchelle pilote de rhizobactries encapsules. Au cours de la production, nous avons fabriqu 14 kg de capsules dalginate humides pour lessai au Chili et 2 kg de capsules dalginate-amidon sches pour les essais en l'Angleterre (MASSTOCK). Nous avons ralis ces productions lUniversit Australe du Chili (UACH) et ONIRIS Nantes, France.
La description des mthodes employes pour la fabrication des capsules est donne dans la partie III.5 de matriel et mthodes et les rsultats de densit en cellules vivantes avant utilisation sont prsents dans la partie IV.1.4 de rsultats et discussion. Les caractristiques des capsules produites pour les deux partenaires sont donnes dans le tableau IV.19.
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Tableau IV.19. Caractristiques des capsules utilises pour les essais en champs.
Partenaires
Souches
MASSTOCK UACH UACH UACH
B. pumilus B. pumilus P. fluorescens R. terrigena
Concentration en Concentration en rhizobactries (CFU/capsules rhizobactries (CFU/capsules humides) sches) 2,90x109 2,12x1010 9,71x109 1,26x109 -
Aprs de 5 mois de culture de bl, le 11 de fvrier de 2011 le bl a t rcolt au Chili. Le rendement du bl a t mesur en g/m2. La figure IV.29 montre le rendement pour chaque traitement.
Figure IV.29. Effet des traitements sur le rendement de production des graines de bl.
On a observ un rendement de 1220 g/m2 des graines pour le traitement avec 150 kg de P/ha et de 1000 g/m2 pour le traitement sans inoculation phosphate. Pour les traitements dinoculation avec les rhizobactries, la souche B. pumilus a montr la meilleure rponse daugmentation du rendement de bl gnotype Pandora. Nanmoins, aucun traitement dinoculation avec des rhizobactries n'a pas montr une diffrence statistiquement
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significative (ANOVA <0,05) avec les traitements tmoins. Ainsi, linoculation des souches de rhizobactries (P. fluorescens, R. terrigena et B. pumilus) en billes dalginate n'a pas t capable d'augmenter le rendement de bl, par l'intermdiaire de la solubilisation de phosphate du sol.
Figure IV.30. Effet des traitements sur le rendement de la biomasse total des plants de bl.
La figure IV.30 prsente les effets des traitements sur le rendement de la biomasse totale qui comprend le poids de la matire sche des feuilles, de tiges, dpis et des graines de bl. On a constat un rendement de 2400 g/m2 dans le traitement avec 150 kg de P/ha et de 2000 g/m2 dans le traitement sans inoculation phosphate. La biomasse totale na pas t modifie par linoculation des rhizobactries immobilises en billes dalginate. Le traitement dinoculation avec des rhizobactries n'a pas montr diffrence significative avec les tmoins non inoculs (ANOVA <0,05).
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Les rhizobactries P. fluorescens, R. terrigena et B. pumilus ont t isols dans le cadre du projet Rhibac. Les trois souches ont t isoles dans des climats temprs et elles sont donc adaptes des conditions de faibles tempratures. R. terrigena a t rcemment isol par notre partenaire ARC en Autriche et jusqu prsent, elle na pas t value au champ. Les genres Bacillus et Pseudomonas sont connus pour augmenter la concentration en phosphore soluble, soit par minralisation des phosphates organiques, grce des phosphatases, soit par solubilisation des phosphates inorganiques, sous leffet dacides organiques (Paul et Sundara Rao 1971; Chabot et al. 1993). Nanmoins, laction des rhizobactries na pas t suffisante pour augmenter la biomasse totale de culture du bl. Lobtention de laugmentation de la croissance des plantes, grce linoculation de rhizobactries capables de solubiliser les phosphates nest pas un sujet simple. Pendant la premire runion internationale sur la solubilisation du phosphate microbienne, (Goldstein 2007) a dclar: les tendances futures dans la recherche sur la solubilisation du phosphate microbienne: cent ans d'insolubilit. Il a mis en vidence la difficult de dvelopper un inoculant biologique pour la solubilisation des phosphates. Aprs cent ans, les microbiologistes agricoles et les cologistes du sol ont isol et caractris des bactries, mais les rsultats obtenus sont alatoires et peu satisfaisants.
Figure IV.31. Effet de linoculation de B. pumilus C26 (liquide et capsules) sur le rendement des plants de bl (tonnes/ha).
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Notre partenaire Masstock a tout dabord compar le rendement de production des grains de bl pour les 2 modes dapplication des rhizobactries : sous forme de capsules et en mlangeant et pulvrisant linoculum liquide sur les feuilles. Linoculation sous forme de capsules a t ralise avec deux concentrations de bactries, 107 et 108 UFC/semence. On observe une augmentation du rendement de culture du bl en utilisant des capsules avec une concentration de 107 UFC/semence qui nest cependant pas statistiquement significative (ANOVA <0,05). Dans ces conditions, le rendement a t de 3,5 tonnes/ha. En revanche, linoculation des capsules avec une concentration suprieure de 108 UFC/semences a t de 3 tonnes/ha. Ce dernier rendement est similaire au traitement sans inoculation bactrienne.
La concentration en rhizobactries par semences de bl utilises ici a t suprieure la quantit de bactries conseilles par la littrature, car selon Kapulnik et al (1985) chaque graine de bl doit tre associe environ 1,0x106 UFC, pour obtenir des effets daugmentation de la croissance des plantes. On aurait pu penser quune concentration bactrienne plus leve de 1,0x108 UFC/semence pouvait renforcer leffet des rhizobactries sur la production. Mais nous nobservons pas ici une augmentation significative de la production pour les cultures inocules. Donc, il faut pas formuler des inoculants microencapsules avec une concentration trop lev des rhizobactries. Cela pourrait signifier quil existe une concentration dinoculation optimale au-del de laquelle leffet sur la croissance serait nul.
Par la suite, linoculation a t ralise en complment avec une fertilisation base dazote (0, 60 et 120 kg dazote/ha). Les rsultats sont prsents sur la figure IV.32.
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Figure IV.32. Bilan de leffet de linoculation des B. pumilus C26 (liquide et capsules) par rapport au rendement de plantes du bl (tonnes/ha).
En gnral, on constate une augmentation du rendement lorsque la concentration en engrais azots augmente. Linoculation de B. pumilus sous forme encapsule avec une concentration de 107 UFC/semence et avec 120 kg dazote/ha permet dobtenir un rendement de 3,8 tonnes/ ha. En revanche, linoculation de B. pumilus encapsul 108 UFC/semence et 120 kg dazote/ ha ne permet dobtenir que 3,0 tonnes/ha, rendement similaire lutilisation de 0 et 60 kg dazote/ha pour le mme traitement. . Il semble donc quil y ait une synergie entre la prsence dazote chimique et de rhizobactries sur la croissance du bl. Le traitement sans inoculation de rhizobactries a donn un rendement de 3,0 tonnes/ha, similaire linoculation des capsules de B. pumilus avec une concentration de 108 UFC/semences. Nanmoins, nous navons pas trouv des diffrences statistiquement significatives (ANOVA <0,05) sur laugmentation du rendement de la culture du bl en utilisant des rhizobactries immobilises par rapport une inoculation sous forme liquide mlange aux semences.
Les essais en laboratoire dinoculation des rhizobactries sur les plantes ont montr une augmentation de la production des cultures. Principalement dans laugmentation du dveloppement des racines de plantes, responsables dune meilleure captation de nutriment et deau (Bashan et Holguin 1994). Okon et Labandera-Gonzalez (1994) ont tudi pendant 20
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annes leffet de linoculation dAzospirillum sur lensemencement de champs. Ils ont observ une augmentation entre 5 et 30% du rendement de diffrents types de cultures en diverses conditions de sol et de climat. Malgr, les bons rsultats montrs par Okon et LabanderaGonzalez (1994), les publications scientifiques qui montrent leffet de linoculation de rhizobactries en champs ne sont pas nombreuses.
Cest pourquoi nous avons voulu montrer nos rsultats dinoculation obtenus par ensemencement des rhizobactries encapsules au Chili et en Angleterre. Linoculation dans le sol des rhizobactries nest pas un sujet simple valuer. En effet, au cours des essais sur le terrain, il existe une grande quantit de facteurs difficiles contrler, tels que la temprature, les prcipitations pluviomtriques et les comptitions microbiologiques. Tous ces facteurs affectent directement la viabilit des cellules incorpores dans le sol. Cest pourquoi nous avons encapsul cette bactrie pour la protger des contraintes qui sont susceptibles de diminuer sa survie dans le sol.
Nanmoins, les rsultats ont montr une meilleure augmentation du rendement de la culture de bl pour la souche B. pumilus C26 encapsule par rapport aux cultures inocules sous forme liquide, mais qui ne sont pas statistiquement significatives. Il est sans doute ncessaire de rpter cette exprience plusieurs fois pour visualiser une amlioration significative de la croissance du bl avec les bactries encapsules. De plus, pour amliorer les rsultats de linoculation des rhizobactries, il pourrait tre envisag de rduire la distance entre les capsules et les graines, de gnrer linoculation dun consortium de bactries et denrober des semences de bl avec un exsudat des racines.
La distance entre la capsule et la graine peut jouer un rle sur la vitesse de colonisation des racines. Tenant compte de la distance entre les semences (2-5 cm), une rpartition relativement homogne des graines et des capsules sur le champ devrait conduire une meilleure rpartition de lapport de lazote sur l'ensemble des plantes de bl. Un semoir relativement classique permettant la distribution simultane de graines engrais pourra tre adapt pour lutilisation dun bioengrais en capsules.
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Linoculation dun consortium de rhizobactries, avec des bactries respectivement charges de la fixation dazote, de la solubilisation des phosphates du sol et du contrle biologique des pathognes, peut tre envisage. Ce consortium pourrait avoir des effets positifs sur laugmentation de la croissance des plantes, car rarement une mme souche de rhizobactrie peut avoir tous ces effets.
Le principal inconvnient de linoculation des rhizobactries est du la faible colonisation des racines. Lenrobage des semences de bl avec dexsuda des racines, pourrait permettre l'attraction des rhizobactries encapsules dans les billes dalginate ou une meilleure colonisation des rhizobactries natives du sol.
Linoculum bactrien immobilis par cette mthode prsente donc un potentiel important pour une agriculture utilisant un minimum dengrais chimique. Cette tude mrite dtre poursuivie pour encore amliorer la survie des cellules durant la priode de stockage adapt aux conditions dutilisation des agriculteurs, principaux utilisateurs de cette technologie.
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La libration des bactries B. pumilus dans leau sacclre aprs 50 h dagitation (1010 UFC/g capsules). R. terrigena a montr un profil constant de libration, avec une concentration en bactries dnombres comprises entre 107 et 108 UFC/g de capsules durant 80 h. La libration des bactries encapsules dans le sol a montr quelles sont capables de se ractiver et de se multiplier dans le sol. Le nombre de rhizobactries contenu dans le sol a t de 107 UFC/g de sol.
Linoculation des rhizobactries sous forme de billes dalginate en plein champ au Chili n'a pas eu des effets positifs vis--vis du rendement de la culture de bl par l'intermdiaire de la solubilisation du phosphate. Linoculation de B. pumilus en Angleterre encapsule avec des concentrations de 107 UFC/semence et 120 kg dazote/ha permet dobtenir le plus haut rendement de 3,8 tonnes/ha condition dajouter un complment azot chimique. En revanche, linoculation de B. pumilus encapsul 108 UFC/semences avec 120 kg dazote/ha na permis seulement dobtenir 3,0 tonnes/ha, rendement similaire lutilisation de 0 et 60 kg dazote/ha pour le mme traitement.
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CONCLUSION & PERSPECTIVES

Au cours de cette dernire dcennie, beaucoup de travaux de recherche ont t consacrs identifier les rhizobactries les plus efficaces pour l'amlioration des cultures. Les donnes accumules en ce qui concerne l'inoculation sur le terrain dans le monde entier montrent que les rsultats de linoculation sont positifs dans 60 70% des cas avec des augmentations significatives du rendement de l'ordre de 5-30% (Okon et Labandera-Gonzalez, 1994).
Dans la plupart des cas, les rhizobactries sont inocules directement dans le sol sous forme liquide ou en utilisant soit de la tourbe ou soit de largile. Nanmoins, le taux de survie des cellules aprs les priodes dimmobilisation, de stockage et dinoculation dans le sol est trs faible et le nombre de cellules actives dcrot rapidement. Or, l'encapsulation des cellules dans des billes d'alginate-amidon peut apporter une meilleure protection de la viabilit des rhizobactries.
Le but de ce travail de thse a t ax sur l'amlioration du taux de survie des rhizobactries encapsule. Dans les travaux de recherches antrieurs aux ntres, le taux de survie des cellules diminue jusqu une valeur infrieure 1% au cours du procd dencapsulation. La diminution du taux de mortalit cellulaire lors de l'encapsulation n'est pas un sujet scientifique simple. En effet, cette diminution dpend de plusieurs facteurs: le type de rhizobactrie, la formulation du milieu de culture et la matrice dencapsulation. En combinant ces facteurs, nous avons pu obtenir un inoculant dshydrat, avec une forte densit de bactries immobilises. Nous avons de plus montr que les bactries les plus prometteuses en termes deffet physiologique sur les plantes, ntaient pas forcment celles qui avaient les meilleures aptitudes technologiques (i.e. survie au stress entrans par le procd dimmobilisation et dinoculation).
Notre contribution a t essentiellement celle de diminuer le taux mortalit des rhizobactries, telle que Azospirillum brasilense, Raoultella terrigena et Bacillus pumilus, pendant le procd dencapsulation. Cette protection a consist en augmenter la teneur en matire sche des capsules obtenues en ajoutant de lamidon et du glycrol la matrice dencapsulation et
utiliser du gluconate de calcium, en tant que solution de glification. Nous avons galement recherch ltat physiologique optimal des cellules en les rcoltant dans la phase stationnaire de croissance ou en ajoutant du trhalose dans le milieu de culture.
Ce travail de recherche a permis laugmentation du taux de survie durant ltape dimmobilisation; et en particulier durant ltape de schage. Nous avons pu ainsi augmenter le taux de viabilit cellulaire jusqu une valeur suprieure 20% avec une teneur en cellules vivantes stable pendant plusieurs mois de stockage. Ceci pourrait permettre de dvelopper un engrais biologique avec une forte concentration en bactries pouvant se conserver sur une priode prolonge. On peut attribuer cet avantage la formation dune matrice avec un pourcentage de matire sche initiale plus lev grce la prsence damidon.
Par ailleurs, l'adhsion cellulaire sur la surface des granules damidon est une caractristique commune pour les cinq espces de rhizobactries testes avec des niveaux dadhrence diffrents dune bactrie lautre. Ce phnomne pourrait galement tre en relation avec la protection des cellules durant le procd dencapsulation, de stockage et lors de la priode dinoculation dans le sol.
La nouvelle matrice dencapsulation contenant 33 % de matire sche et une concentration en bactries de lordre de 1*109 bactries/capsule a pu tre produite lchelle pilote. Nous avons montr que les capsules produites permettaient une libration progressive des bactries dans leau et le sol. Les essais en champs ont effectivement montr des effets positifs de linoculation des capsules contenant B. pumilus une hauteur de 107 UFC par semence en prsence dun supplment azot chimique. Le gain de rendement par rapport une inoculation sous forme liquide na cependant pas t significatif.
En rsum, ce travail est prometteur et met en vidence des difficults qui restent surmonter pour obtenir des inoculums stables, faciles utiliser et efficaces. La poursuite des collaborations avec des laboratoires et des entreprises en amont (slection de souches) et en aval (tests rels en champs), mais aussi avec des socits pouvant assurer la production des bioengrais est indispensable afin datteindre le stade de dveloppement.
V. Conclusion & Perspectives
En choisissant les matriaux de base moins onreux, le cot de production de ces capsules pourrait tre davantage abordable pour leur utilisation damendement des sols. Le choix des matriaux constituant la matrice peut certainement tre encore optimis. Lapplication des capsules dans les champs peut tre ralise simultanment avec lpandage des semences laide de matriel couramment employ dans lagriculture. Lincorporation dun consortium de rhizobactries pouvant avoir un effet synergique pourrait conduire un effet plus significatif sur le rendement de production du bl. Linoculum bactrien immobilis l'aide de cette mthode prsenterait un potentiel prometteur pour une agriculture utilisant un minimum dintrants chimiques.
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186
Productions scientifiques
Production scientifique pendant les annes de la thse 2007 et 2010:
Publications: Schoebitz, M. Simonin, H. and D. Poncelet Bioencapsulation of Azospirillum brasilense and Raoultella terrigena in alginate-starch beads used as biofertilizers. (in progress)
Schoebitz, M., Ribaudo, C.M., Pardo, M.A., Cantore, M.L., Ciampi, L. and J.A. Cura. (2009) Plant growth promoting properties of a strain of Enterobacter ludwigii isolated from Lolium perenne rhizosphere. Soil Biology & Biochemistry 41, 1768-1774.
Brevet: Ciampi, L., Fuentes J.R., Costa, M., Nissen, J., Schobitz, R., Schoebitz, M., Aguila, P., C. Vergara (2009) New bacillus subtilis strain ATCC pta-8805, bioproducts containing said strain and use of the same to control the fungus rhizoctonia solani, an important plant pathogen that attacks economically relevant crops ed. MERCHANT & GOULD PC (P.O. BOX 2903, M., MN, 55402-0903, US) p.7. United State: Universidad Austral de Chile (Valdivia, CL)
Organisation Confrence: Principal organisateur de la Confrence Aquaculture & Microencapsulation, Puerto Varas, Chile, 26-27 novembre 2009. http://bioencapsulation.net/2009_PuertoVaras
Prsentation orale: XVI International Conference on Bioencapsulation. Cells viability of plant growth promoting rhizobacteria in alginate-starch beads. M. Schoebitz, H. Simonin and D. Poncelet. Dublin, Ireland 2008.
Posters: VII Simposio de Recursos Genticos para Amrica Latina y el Caribe. Multi-nozzles system to produce a large amount of rhizobacteria immobilized used as biofertilizer. Schoebitz, M., Poncelet, D. and L. Ciampi. Pucn Chile 2009.
XVII International Conference on Bioencapsulation. Rhizobacteria adhesion to starch granules. Schoebitz, M., H. Simonin and D. Poncelet. Groningen, Netherlands 2009.
Rhizosphere 2 International Conference. Isolation and characterization of plant growth promoting rhizobacteria of ryegrass from volcanic soil. Schoebitz, M., Ribaudo, C., Ciampi L., Poncelet , D. Montpellier, France. 2007
Prsentation orale projet europen Rhibac: 2009 Rhibac meeting Rhizobacteria for reduced fertiliser inputs on wheat Valdivia, Chile.
2008
Rhibac meeting Rhizobacteria for reduced fertiliser inputs on wheat Nantes, France.
2008
Rhibac meeting Rhizobacteria for reduced fertiliser inputs on wheat Rio de Janeiro, Brazil.
2007
Rhibac meeting Rhizobacteria for reduced fertiliser inputs on wheat Vienne, Austria.
2007
Rhibac meeting Rhizobacteria for reduced fertiliser inputs on wheat Istanbul, Turkey.
Rsum: tude de lencapsulation de rhizobactries pour la biofertilisation du bl La biofertilisation des sols est une des voies potentielles pour rduire les intrants chimiques dans lagriculture. Cette tude a pour objectif doptimiser la survie des rhizobactries par encapsulation. Les capsules ont t produites par dripping dune matrice alginate-amidon dans une solution de chlorure de calcium. La protection des rhizobactries a t optimise en jouant sur la phase de croissance, la formulation de la matrice et la nature du calcium. La phase la plus critique est le schage des billes avec une perte de la viabilit des cellules pouvant aller jusqu' trois logs. Les paramtres cits ci-dessous mais aussi le choix adquat du procd de schage permet toutefois de rduire les pertes de viabilit. Le taux de survie maximale a t obtenu par R. terrigena cultive dans le milieu de culture YEP supplment avec du trhalose et le gluconate de calcium comme agent glifiant. Dans le cas dA. brasilense, nous avons obtenu la survie maximale lorsquelle tait cultive dans le milieu de culture YEP supplment avec du trhalose et le chlorure de calcium comme agent glifiant. De plus, nous avons obtenu 85% de taux de survie dA. brasilense dans les capsules aprs un an de stockage. Nos travaux ont galement montr que les capsules formules base dalginate-amidon permettaient bien une libration progressive des bactries dans leau et dans le sol. Une tude dinoculation en champs a montr une efficacit de lensemencement par capsule identique celle de linoculation par un inoculum liquide. Ce travail a permis de mettre au point des capsules dont la concentration en cellules tait augmente dun facteur 10 voir plus par rapport aux travaux prcdents. Toutefois, nous montrons que les conditions optimales dencapsulation sont trs dpendantes des bactries mises en uvre. Cest pourquoi les recherches doivent tre poursuivies pour permettre une amlioration largement significative du rendement de production de cultures de bl. Mots-cls: bioengrais, bioencapsulation, rhizobactrie, taux de survie, alginate, amidon Abstract: Study of the encapsulation of rhizobacterias for the biofertilization of wheat The biofertilization of soils is a potential approach to reduce the chemichals fertilizers in agriculture. The aim in this study was to optimize the rhizobacteria survival by encapsulation in alginate-starch beads. Immobilized cells were produced by dripping an alginate-starch solution mixed with rhizobacteria were dropped into a calcium solution. Beads were formed by testing different factors such as cell growth-medium, bacteria growth phase, formulation of the encapsulation matrix and nature of calcium. The critical point of the encapsulation process is the drying of beads, three logs in cell viability were observed. The parameters listed below as well as the adequate choice of the drying process, allows to reduce the loss of viability. Maximum cell recovery was obtained for R. terrigena grown in YEP medium supplemented with trehalose and with calcium gluconate as gelling agent. In the case of A. brasilense maximum. cell recovery was obtained grown in YEP medium supplemented with trehalose and with calcium chloride. Furthermore, dried beads containing A. brasilense presented 85% of living cells after one year of storage. Our work also showed that the capsules formulated with alginate-starch allowed a progressive diffusion of bacteria in water and soil conditions. A field study of bacteria showed a success capsule inoculation identical to that a liquid inoculations. This work can help to develop capsules with a concentration of cells increased by a factor of 10 compared to previous work. However, we also showed that the optimum conditions for encapsulation are dependent of bacteria strains. Therefore, research should be pursued to enable a highly significant improvement to production yield of wheat crop. Keywords: biofertilizer, bioencapsulation; rhizobacteria, cell survival, alginate, starch Discipline : Microencapsulation N:

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UNIVERSIT DE NANTES UFR SCIENCES ET TECHNIQUES

COLE DOCTORALE SCIENCES POUR LINGNIEUR GOSCIENCES ARCHITECTURE

N attribu par la bibliothque

tude de lencapsulation de rhizobactries pour la biofertilisation du bl

Prsente et soutenue publiquement par

Mauricio Ivan SCHOEBITZ CID

Prsident: Rapporteurs: Examinateurs:

3. Inoculation des rhizobactries dans le sol ..............................................31

4. Lencapsulation des rhizobactries .........................................................39

MATRIELS & MTHODES ............................................55

1.7.2 Morphologie et croissance des colonies .............................................................65

2. Procd dencapsulation ..........................................................................67

3. valuation de ladhsion des cellules sur les grains damidon .............76

5. Production des capsules chelle pilote .................................................84

6. tude de lefficacit des inoculums encapsuls en champs ..................95

RSULTATS & DISCUSSION ..........................................103

2. Optimisation de la survie des rhizobactries au procd dencapsulation ...........................................................................................132

3. tude de ladhsion des rhizobactries sur lamidon ..........................146

4. Libration progressive des rhizobactries et efficacit en champs ....161

CONCLUSION & PERSPECTIVES ................................175 BIBLIOGRAPHIE..............................................................179

Ce travail se dcline en quatre parties :

II. tude Bibliographique

II. tude Bibliographique

2. La flore microbienne du sol

Bactries Champignons Algues Protozoaires Faune du sol Racines Total

1011 - 1014 n.d. 108 10 109 109 1011 5.106

II. tude Bibliographique

II. tude Bibliographique

II. tude Bibliographique

II. tude Bibliographique

II. tude Bibliographique

II. tude Bibliographique

II. tude Bibliographique

Culture Betterave Tomate Riz

Effet Meilleure rsistance aux maladies Meilleure rsistance aux maladies

Rfrence (Moenne-Loccoz et al. 1999) (Benhamou et al. 1998)

II. tude Bibliographique

La raction ralise par le complexe nitrognase exige :

8 lectrons et 8 protons pour la rduction 16 ATP pour la fourniture de lnergie dactivation

La raction complte est donc :

N2 + 8e + 8H+ 16 ATP 2NH3 + H2 + 16ADP + 16Pi

II. tude Bibliographique

de la ferrdoxine ou/et de NADH, H+ form au cours de la photophosphorylation acyclique.

Figure II.3. Fixation biologique de lazote par le complexe nitrognase.

II. tude Bibliographique

Pour tre une phytohormone, une substance doit normalement tre:

II. tude Bibliographique

II. tude Bibliographique

II. tude Bibliographique

3. Inoculation des rhizobactries dans le sol

II. tude Bibliographique

II. tude Bibliographique

II. tude Bibliographique

3.2.1 Formulations base de talc

II. tude Bibliographique

II. tude Bibliographique

II. tude Bibliographique

II. tude Bibliographique

II. tude Bibliographique

4. Lencapsulation des rhizobactries

II. tude Bibliographique

II. tude Bibliographique

II. tude Bibliographique