Pruebas de tintes de reduccin: de azul de metileno y resazurina

De: Atherton, HV y Newlander, JA 1977. Qumica y pruebas de productos lcteos. 4 ed. AVI, Westport, CT.

Prueba de reduccin de azul de metileno

La prueba de reduccin de azul de metileno se basa en el hecho de que el color impartido a la leche mediante la adicin de un colorante como el azul de metileno va a desaparecer ms o menos rpidamente. La eliminacin del oxgeno de la leche y la formacin de la reduccin de sustancias durante el metabolismo de las bacterias hace que el color desaparezca. Los organismos responsables de consumo de oxgeno son las bacterias. A pesar de ciertas especies de bacterias tienen una influencia mucho ms que otros, en general se supone que cuanto mayor sea el nmero de bacterias en la leche, ms rpido que el oxgeno se consume, ya su vez el ms rpido desaparecer el color. Por lo tanto, el momento de la reduccin se toma como una medida del nmero de organismos en la leche, aunque en realidad es probable que sea ms una verdadera medida de las reacciones metablicas total de procedimiento en la superficie celular de las bacterias. La prueba de reduccin de azul de metileno ha perdido mucha de su popularidad debido a su baja correlacin con otros procedimientos de bacterias. Esto es especialmente cierto en aquellas muestras que demuestran la multiplicacin de las especies de amplia psychrotropic. Aparato.-El equipo necesario consiste en tubos de ensayo con tapones de goma, una pipeta o cazo se gradu de entregar 10 ml de leche y un bao de agua para mantener las muestras a 35 a 37 C. El bao debe contener un volumen de agua suficiente para calentar las muestras a 35 C en 10 minutos despus de las trompas de entrar en el agua y debe tener algn medio de proteccin de las muestras de la luz durante el perodo de incubacin. Si una cmara de aire caliente se utiliza, las muestras se debe calentar a 35 C en un bao de agua caliente ya que el aire se calienta la leche con demasiada lentitud. Secos los comprimidos contienen tiocianato de azul de metileno y se puede obtener desde cualquiera de las casas de suministros habituales de laboratorio. Ellos deben ser certificados por la Comisin de Normalizacin de manchas biolgicas. La solucin se prepara mediante tratamiento en autoclave o hervir un momento 200 ml de agua destilada en un resistente a la luz (mbar) frasco tapado y luego aadir una pastilla azul de metileno en el matraz de agua caliente. El comprimido debe ser totalmente disuelta antes de la

disolucin se enfra. La solucin puede ser almacenada en el frasco tapado, mbar o un frasco de color mbar en la oscuridad. Solucin deben prepararse cada semana. Procedimiento en las pruebas.-Los procedimientos son los siguientes. (1) Esterilice todos los objetos de cristal y tapones de goma, ya sea en un autoclave o en agua hirviendo. Asegrese de que todos los objetos de vidrio est qumicamente limpia. (2) Medida 1 ml de la solucin de tiocianato de metileno azul en un tubo de ensayo. (3) Aadir 10 ml de leche y el tapn. (4) Los tubos se pueden colocar en el bao de agua inmediatamente o se puede almacenar en el refrigerador a 0o a 4o C para un momento ms adecuado de incubacin. Cuando est listo para realizar la prueba, la temperatura de las muestras deben ser llevados a 35 C en 10 minutos. (5) Cuando la temperatura llega a 36o C, lentamente invierta los tubos varias veces para asegurar la formacin de crema uniforme. No agite los tubos. Registre este tiempo como el comienzo del perodo de incubacin. Cubierta para impedir la entrada de luz. (6) Compruebe las muestras para la decoloracin despus de 30 minutos de incubacin. Hacer lecturas posteriores en intervalos de una hora despus. (7) Despus de cada lectura, retire los tubos se decolora y luego, lentamente, hacer una inversin completa de tubos restantes. (8) Registro de la reduccin del tiempo en horas completas entre la inversin pasada y la decoloracin. Por ejemplo, si la muestra se sigue azul despus de L 5 horas, pero se decolora (blanco) en la lectura de 2,5 horas, el tiempo de reduccin de azul de metileno se registrara como 2 horas. Decoloracin se considera completo cuando las cuatro quintas partes del color ha desaparecido. Clasificacin.-La clasificacin propuesta est en la lista. Clase 1. Excelente, no se decolora en 8 horas. Clase 2. Bueno, se decolora en menos de 8 horas, pero no menos de 6 horas. Clase 3. Feria, se decolora en menos de 6 horas, pero no menos de 2 horas. Clase 4. Pobres, se decolora en menos de 2 horas. Factores que afectan la prueba.-Muchos factores afectan la prueba de reduccin de azul de metileno y por lo tanto los pasos de la operacin debe ser uniforme.

Dado que el contenido de oxgeno debe ser utilizado antes de que el color desaparece, cualquier manipulacin que aumenta el oxgeno afecta a la prueba. Leche fra contiene ms oxgeno que la leche caliente, verter la leche de ida y vuelta de un recipiente a otro, aumenta la cantidad, y en el ordeo de oxgeno mucho tiempo puede ser absorbido. El tipo de organismos afecta la tasa de reduccin. Los coliformes parecen ser los organismos ms rpida reduccin, seguida de cerca por Streptococcus lactis, algunos de los estreptococos fecales y ciertos micrococos. Bacterias termodricos y psicotrpicas reducir el azul de metileno muy lentamente en todo caso. Un gran nmero de leucocitos afectan a la reduccin del tiempo de lo material. La luz acelera la reduccin y por lo tanto, las pruebas deben estar cubiertos. La concentracin del tinte debe ser uniforme como un aumento de la concentracin aumenta el tiempo de reduccin. El aumento de la temperatura de incubacin aumenta la actividad de las bacterias y por lo tanto, se acorta el tiempo de reduccin. El descreme de las muestras de ensayo provoca una serie de organismos que se elimina del cuerpo de la leche y la trajo a la superficie con el aumento de la grasa. Este factor hace que las variaciones en el tiempo de reduccin, ya que las bacterias no se distribuyen equitativamente. La precisin de la prueba es el aumento, reduccin del tiempo de reduccin y decoloracin ms uniforme si las muestras son peridicamente invertido durante la incubacin.

La prueba de resazurina
La prueba se lleva a cabo resazurina similar a la prueba de reduccin de azul de metileno con la sentencia de la calidad basado ya sea en el color que se produce despus de un perodo determinado de incubacin o en el tiempo requerido para reducir el tinte a un determinado punto final. Numerosas modificaciones han sido propuestas. Los dos ms utilizados son el "de una hora de prueba" y la "triple lectura de la prueba", tomada despus de una, dos y tres horas de incubacin. Otras modificaciones tienen un valor en aplicaciones especficas. El procedimiento para realizar la prueba de resazurina es el siguiente: Prepare una solucin de resazurina disolviendo una tableta de resazurina (contenido de colorante / comprimido, de aproximadamente 11 mg, certificado por la Comisin manchas biolgicas) en 200 ml de agua destilada caliente como se hizo en la prueba de azul de metileno . Coloque un ml de solucin de colorante en un tubo de ensayo estril, a continuacin, aadir 10 ml de muestra. Tapar el tubo, colocar en la incubadora y, cuando la temperatura alcanza los 36o C, invierta para mezclar la leche y el colorante. Incubar a 36o C. Los tubos son examinados y clasificados al final de una hora en el "de una hora de prueba" o al final de tres intervalos

sucesivos por hora en la "prueba de triplereading". Las siguientes relaciones de color y calidad son generalmente aceptadas: Color de muestra: calidad de la leche 1. Azul (sin cambio de color): Excelente Dos, a lo profundo del azul malva: Bueno 3. Profundidad de color malva de color rosa oscuro: Feria 4. Profundidad de color rosa a rosa blanquecino: Malo 5. Blanco: Malo La prueba de resazurina puede ser una valiosa herramienta para ahorrar tiempo si se realiza correctamente e interpretadas de manera inteligente, pero debe ser complementado por el examen microscpico. Los resultados sobre la fiabilidad de las pruebas resazurina son contradictorios. Un estudio en la comparacin de la prueba con el mtodo de resazurina Raza microscpicas en 235 muestras encontradas de la prueba de confianza. Otros informes afirman que la prueba de resazurina es un ndice fiable de la calidad bacteriolgica de la leche. Una crtica importante del mtodo es que la reduccin del tiempo de resazurina de leche refrigerada, ya sea embotellada o 20 37 C es demasiado largo para ser de valor en la evaluacin de deterioro bacteriolgico de la leche almacenada. Notas de los mtodos estndar que bajo ninguna circunstancia los resultados de azul de metileno sea o pruebas resazurina ser informada en trminos del nmero de bacterias. Los dos procedimientos de reduccin de medio de contraste se describen con ms detalle en el captulo 15 de la decimotercera edicin de los mtodos estndar elaborado por la Asociacin Americana de Salud Pblica.