Sunteți pe pagina 1din 79

TEHNICI DE BIOLOGIE MOLECULAR

DENATURAREA ADN-ului
Modificarea structurii acidului nucleic prin tratament cu c ldur , substan e chimice sau mediu alcalin (pH>11) Ruperea leg turilor de hidrogen dintre bazele complementare

DENATURAREA ADN-ului
Denaturarea ADN-ului prin c ldur presupune o temperatur nalt pentru desfacerea celor dou catene Punctul de topire (PT) temperatura la care 50% din dublul lan se disociaz n lan monocatenar PT este influen at de
Zonele C G Concentra ia de NaCl Concentra ia cationilor

Denaturarea chimic : anumite substan e formamida, ureea scad PT

HIBRIDIZAREA ADN-ului
Hibrida lat. metis Hibridizarea ADN-ului sau renaturarea ADN-ului reprezint refacerea leg turilor de hidrogen ntre bazele complementare de pe 2 lan uri unice de ADN, ARN sau ADN i ARN Se realizeaz prin sc derea lent a temperaturii sau a pHului Dac temperatura se reduce brusc cele 2 catene r mn separate De obicei temperaturi cu 20-30 de C fa de PT Cantitatea de ac. nucleic renaturat depinde de: Zonele C G Concentra ia de NaCl Concentra ia de formamid Concentra ia molecular a ac. nucleic din solu ie Lungimea moleculei de ac. nucleic

HIBRIDIZAREA ADN-ului
Hibridizarea este o tehnic de recombinmare a acizilor nucleici Rezult o molecul de acid nucleic dublu catenar din 2 lan uri unice separate Se folose te atunci cnd se studiaz un acid nucleic int (o secven int ) mperecherea de baze se poate face:
ADN-ADN ARN-ARN ADN-ARN

HIBRIDIZAREA ADN-ului Principiul reac iei


Se analizeaz un acid nucleic int necunoscut (o secven int ) Determinarea secvenb ei int necunoscute se face cu o sond genetic (o secven de acid nucleic cunoscut) marcat Dac sonda i secven a int sunt total sau par ial complemenetare se formeaz o molecul hibrid, n care secvene ele de baze nucleotidice sunt identificate conform secven ei cunoscute a sondei

HIBRIDIZAREA ADN-ului Factorul stringent


Factorul stingent stringen a sau intensitatea reac iei Dac dou lan uri sunt sunt complementare pe toat lungimea lor i condi iile de reac ie sunt favorabile pe toat lungimea lor, stingen a (intensuitatea) reac iei este foarte puternic Dac exist doar zone par ial complmentare, stringen a este mai sc zut (exemplu lan urile de ADN provin din 2 organisme diferite)

HIBRIDIZAREA ADN-ului Tipuri de hibridizare I Hibridizarea tip Blotting Southern Blotting (ADN Blotting) Northern Blotting (ARN Blotting) Western Blotting (Protein Blotting) Dot Blotting Slot Blotting II Hibridizarea in situ III Hibridizarea colonial

HIBRIDIZAREA DE TIP BLOTTING


Tehnic special prin care acidul nucleic in (de cercetat) este extras din materialul cercetat prin nc lzire la 100C i r cit la ghea Se fixeaz apoi pe o membran de nitroceluloz sau pe un filtru de nylon i se fixeaz Hibridizarea acidului necunoscut se face direct pe filtru cu ajutorul unor sonde genetice (acid nulcei cunoscut i marcat) BLOT (eng. pat sau grund) reprezint filtrul +acidul nucleic fixat (imobilizat) BLOTTING trecerea acidului nucleic peste filtru

BLOTTING

HIBRIDIZAREA SOUTHERN BLOTTING Descoperit i introdus n laborator de Edwin Southern n 1975 Procedeu utilizat n decelarea secven elor specifice con inute ntr-un anumit fragment de ADN din genom Fragmentele de ADN sunt separate prin gelelectroforez

HIBRIDIZAREA SOUTHERN BLOTTING ETAPELE REAC IEI Se extrage ADN-ul dintr-un produs patologic lichid (ser) sau solid (celule, esuturi) ADN-ul este t iat cu enzime de restric ie Fragmente de ADN de cca 1000 pb sunt supuse electorforezei n gel i separate n func ie de GM Fragmentele din gel sunt denaturate Trecerea fragmentelor de lan unic de ADN de pe gel pe hrtia de filtru de nitroceluloz Aplicarea sondelor genetice marcate, urmate de hibridizarea propriu-zis Eviden ierea moleculei hibride

SOUTHERN BLOTTING

SOUTHERN BLOTTING

SOUTHERN BLOTTING

HIBRIDIZAREA SOUTHERN BLOTTING APLICA II PRACTICE

Studiul gemenilor univitelini, arborele genealogic Boli genetice, tumori maligne, studiul genelor globinei la primate Originea unor specii de plante i animale Clasificarea microorganismelor (virusuri i bacterii) n medicina legal teste de paternitate, criminalistic

HIBRIDIZAREA NORTHERN BLOTTING Descoperit i introdus n laborator de Alwine n 1977 Procedeu utilizat n decelarea secven elor de ARN (de obicei ARN-m) separate prin gelelectroforez Se consider o metod complementar metodei Southern Blotting

HIBRIDIZAREA NORTHERN BLOTTING ETAPELE REAC IEI

Se extrage ARN-ul din produsul de cercetat ARN-ul este pus n contact cu o substan denaturant (glicoxal dimetilsulfoxid, formaldehid sau metilmercur) ARN-ul este supus separ rii electorforetice Transferul fragmentelor de ARN pe filtru de nitroceluloz sau nylon Hibridizarea ARN-ului pe filtru cu o sond genetic ARN sau ADN Eviden ierea moleculei hibride

NORTHERN BLOTTING

NORTHERN BLOTTING

HIBRIDIZAREA NORTHERN BLOTTING APLICA II PRACTICE

Determinarea ribotipurilor tulpinilor bacteriene (n studii genetice sau n epidemiologie) Determinarea filia iilor cazurilor de epidemii Decelarea i cuantificarea ARN-m specific diferitelor tipuri de esuturi

HIBRIDIZAREA WESTERN BLOTTING (TEHNICA IMMUNOASSAY)

Nu este o hibridizare propiu-zis (nu se construie te un acid nucleic dublu catenar pornind de la 2 lan uri separate) Substratul de cercetat este o protein Se folose te doar principiul reac iei de hibridizare Desf urarea substratului de cercetat pe gel de electroforz Trecerea pe o membran de nitroceluloz Cuplarea i eviden ierea prin intermediul unor grup ri chimice complementare

HIBRIDIZAREA WESTERN BLOTTING ETAPELE REAC IEI

Proteina este supus electroforezie n gel Transferul spoturilor proteice (antigene) pe membrana de nitroceluloz Ad gare de anticorpi specifici marca i (enzimatic sau radioactiv) Sp larea anticorpilor nefixa i Expunere i developare Citirea prin autoradiografiere a benzilor de protein cu ajutorul anticorpilor specifici marca i i fixa i

WESTERN BLOTTING

WESTERN BLOTTING

WESTERN BLOTTING

WESTERN BLOTTING

HIBRIDIZAREA WESTERN BLOTTING APLICA II PRACTICE Eviden ierea unor cantit i foarte mici de proteine din lichidele sau celulele unui organism, prin cuplarea acestora cu anticorpi specifici corespunz tori (marca i) Avantaj permite eviden ierea unei anumite proteine dintr-o mixtur complex Se folose te pentru clonarea genelor Diagnosticul unor boli virale (hepatite, HIV)

HIBRIDIZAREA DOT I SLOT BLOTTING Se execut pe o plac de plexiglas cu godeuri rotunde (DOT) sau dreptunghiulare (SLOT) n prealabil se extrage acidul nucleic din proba de cerecetat i se pune n godeu n fiecare godeu se pune un acid nucleic diferit (cte godeuri are placa) Se acoper placa cu hrtie de filtru, care va absorbi proba Denaturarea se face la 100 C i r cire la ghea Probele de pe hrtia de filtru sunt apoi hibridizate cu sonde genetice cunoscute Analiza unui nr. foarte mare de probe patologice nefrac ionate (probe de ser sau extracte celulare i tisulare)

HIBRIDIZAREA IN SITU (HIS) Se efectuez direct pe celule sau esuturi Se evalueaz exact localizarea unor anumite secven e de ADN sau ARN direct in situ Se folosesc fragmente de esuturim amprente de organe sau celule, culturi de celule (prelucrate, aplicate i fixate pe lama obiectiv) Fixarea se face cu xilol, etanol (100% i 70%) Lama obiectiv corespunde filtrului cu ac. nucleic din hibridizarea Blotting Reac ia de denaturrare i hibridizare are loc pe lama obiectiv

HIBRIDIZAREA IN SITU (HIS) APLICA II PRACTICE

Eviden ierea i localizarea diferi ilor agen i infec io i n celule i esuturi: v. hepatitei B, C, HIV, CMV, v. herpes simplex, v. papiloma Cercetarea rela iei virus-oncogenz Dg. pre- i post-natal n bolile genetice:
Localizarea cromozomial a genelor defecte (distrofia muscular Duchenne) Anomaliile cromozomiale (sdr. Down, Turner) Stabilirea sexului embrionului Tiparele de expresie genic H r i genetice cromozomiale

FLUORESCENT IN SITU HYBRIDIZATION (FISH)

Fluorescent in situ hybridization (FISH) este o tehnologie relativ nou Folose te probe fluorescente (con in un fluorocrom cuplat de acidul nucleic al sondei) pentru a detecta ADN sau de gene, pentru a confirma sau nu anomalii ale cromozomilor care sunt, n general, dincolo de rezolu ia tehnicilor de citogenetic de rutin

FISH

FISH

FLUORESCENT IN SITU HYBRIDIZATION (FISH) APLICA II PRACTICE FISH se poate utiliza n metafaz n celule specifice pentru a detecta microdele ii dincolo de rezolu ia de rutin a citogeneticii dintr-un material de origine necunoscut FISH poate detecta unele rearanjamente specifice ale cromozomilor n anumite tipuri de cancer Sdr. Cri-du-chat Deficien a de steroid sulfataz Sindromul DiGeorge (Velo-Cardio-Facial) Sindromul Kallman Sindromul Williams Sindromul Prader-Willi (Angelman)

FISH

FISH

RECOMBINAREA ADN-ului
Recombinare lat. re nou, combina - formare Informa ia genetic a lumii vii este localizat la nivelul dublului lan de ADN Materialul genetic poate fi izolat, iar cele 2 lan uri se separ i apoi se pot recombina cu un alt lan str in complementar Aceste fenomene dau posibilitatea cre rii de noi organisme n condi ii naturale sau de laborator

CROSSING-OVER

RECOMBINAREA ADN-ului PRICIPIUL METODEI


Recombinarea natural (recombinarea genetic ) CROSSING-OVER schimbul reciproc de fragmente de cromatide (gene) ntre cromozomii omologi al tura i n pachytenul meiozei 1 Recombinarea artificial (tehnologia ADNului recombinat) Genetic Engeneering Ingineria genetic

RECOMBINAREA ADN-ului
1953 J.D. Watson i Fr. Crick - Structura spa ial a ADN-ului 1970 SUA prima recombinare reu it Pe cale artificial combinarea informa iei genetice de la 2 specii diferite: organism nou recombinat = modificat genetic = transgenic Baza ingineriei genetice i a biotehnologiilor Implica ii majore n biologie molecular , biochimie, genetic , farmacologie, medicin , agricultur

RECOMBINAREA ADN-ului
Unelte de lucru n tehnologia ADNului recombinat: Enzimele de restric ie ADN-ligazele Vectorii

ENZIMELE DE RESTRIC IE
Endonucleaze de origine bacterian care cliveaz ADN-ul str in (viral) Metilarea reprezint un mecanism de ap rare al bacteriei (de protec ie) fa de propriile endonucleaze Exonucleaze se fixeaz la cap tul lan ului de ADN Endonucleaze n interiorul moleculei de ADN (endonucleaze de restric ie) Enzime de restric ie I, II, III Eco K si B (Escherichia coli )

ADN-LIGAZELE
1967 descrierea primelor ADN-ligaze Nu pot lega 2 molecule ADN monocatenare Leag doar 2 la uri ADN din aceea i molecul ADN dublu helix Formeaz o leg tur fosfodiesteric ntre 3-OH al unei extremit i i 5-P a celeilalte extremit i Consum de energie NAD+ sau ATP Procesul de legare (linker) esen ial n: sinteza normal a ADN-ului, repararea ADN-ului i recombinare genetic

VECTORII
I. Vectorii de expresie: 1. Pentru sinteza unor cantit i mari de proteine: plasmide, bacteriofagi, cosmide, fagemide, secven e de inser ie 2. De transcriere pentru sinteza ARN-ului Vectorii speciali 1. Retrovirusurile - ARN virusuri con in reverstranscriptaz : HIV 2. Retrovirusurile i plasmid Ti

PLASMIDELE
Clasa major de elemente genice mobile Prezente la procariote (bacterii) i eucariote (plante i animale) La procariote molecule de ADN dublu catenar helix circular Dimensiuni: de la 2kpb cteva sute kpb ADN extarcromozomial (cromozomi accesorii), neobligatoriu pentru supravie uire Componenete: Una sau mai multe gene pentru o anumit proprietate (rezisten a la antibiotice) Un segment de replicare (factor de replicare) Un segment de transfer (factor de transfer)

BACTERIOFAGII
Virusuri care infecteaz bacteriile Sunt obligatoriu parazi i mprumut aparatul metabolic celular al gazdei pentru propria replicare Material genetic ADN sau ARN (retrovirusuri), n form linear sau circular Fagul , 80,

RECOMBINAREA ADN-ului Etape


T ierea lan urilor ADn dublu catenare cu enzimele de restric ie Rezult ADN monocatenar T ierea ADN-ului vectorului Cele 2 fragmente se leag covalent cu ajutorul ADN-ligazelor Introducerea n celula gazd a ADN-ului de cercetat legat de vector Multiplicarea sincron , odat cu celula gazd a ADN-ului de cercetat i al vectorului Ob inerea unui nr. f mare de copii identice de ADN recombinat = CLONARE DE ADN

RECOMBINAREA ADN-ului i INGINERIA GENETIC


Termenul de Genetic Engineering (Inginerie genetic ) adesea folosit ca similar cu recombinarea ADN-ului n realitate Ingeneria genetic este doar ultima etap a recombin rii Rezult un genom nou, celula avnd caractere aparte Ingineria genetic st la baza proceselor de biotehnologie Terapia genic (Gene Targeting): boli ereditare, infec ia cu HIV, boli neoplazice, boli cardio-vasculare, boli metabolice, vaccinuri recombinate Aplica ii n agricultur i zootehnie (industria alimentar ) Conservan i alimnetari Ecologie poluare cu hidrocaburi

INGINERIA GENETIC Etape


Se porne te de la matricea ADN-ului monocatenar Copie a ADN-ului monocatenar n prezen a reverstranscriptazei Se ob ine un lan de ADN dublu catenar Clonarea acestuia Fragmentul clonat este nglobat ntrt-un vector de exprimare Vectorul este introdus n celula gazd receptoare n celula receptoare se produce transcrierea i transla ia fragmentului de ADN str in n final se ob ine protine dorit exemplu insulina sau anumite enzime

RECOMBINAREA ADN-ului

RECOMBINAREA ADN-ului

SONDELE GENETICE
Probe de acid nucleic (ADN sau ARN) marcate radioactiv sau non-radioactiv pe o singur baz nucleotidic Con in o secven cunoscut de baze Reprzint pricipalele unelte pentru metodele de hibridizare pentru analiza secven ei ADNului int Se formeaz prin acelea i metode de hibridizare Blot (S i W) sau in situ Se ob in cu ajutorul enzimelor de restric ie Etichetarea, reperarea, cartografierea tutror genelor i a ntreg genomului

SONDELE GENETICE

SONDELE GENETICE MARCAREA


A. Marcarea radioactiv :
Cu izotopi radioactivi: H3 (HIS) , S35, I125 i P32 (Blotting)

B. Marcarea non-radioactiv :
Marker: BIOTINA se va lega de uracil Eviden ierea biotinei prin legarea de AVIDIN sau STREPTOVIDIN , care se leag la rndul lor de un fluorocrom pentru o reac ie de culoare

CLONAREA
Clonarea bacterian - un grup de celule bacteriene identice dpv genetic, care provin dintr-o singur celul bacterian de origine Clonarea ADN-ului se realizeaz printr-o tehnic de recombinare a ADN-ului, urmat de ncorporarea acestuia ntr-un vector ntroducerea ntr-o celul gazd i multiplicarea sincron n biologia molecular , clonarea semnific ob inerea unei culturi de celule identice, de la o celul unic , care con ine un fragment multiplicat de acid nucleic de cercetat

CLONAREA ADN-ului ETAPE


Extragerea unui fragment de ADN, prin t ierea ADN-ului genomic cu enzime de restric ie Introducerea ADN-ului ntr-un vector Introducerea vectorului recombinant n celula gazd (plasmid cu ADN-ul de studiat) E. coli de obicei Selectarea celulelor bacteriene care conin vectorul recombinant

CLONAREA ADN-ului

CLONAREA ADN-ului

CLONAREA ADN-ului

PCR POLYMERASE CHAIN REACTION REAC IA N LAN A POLIMERAZEI PCR este folosit pentru cercetarea unor cantit i foarte mici de ADN dintr-un produs biologic Ofer posibilitatea ca dintr-o mixtur de ADN s se extrag o singur molecul de ADN, care s fie ulterior amplificat enzimatic Spectru de aplicabilitate al PCR foarte larg: medicin , oncologie, genetic , medicin legal , identificarea i crearea de noi virusuri sau bacterii, arheologie, ecologie

PCR PRINCIPIUL REAC IEI

ADN monocatenar se folose te drept matri In vitro de la acest lan se formeaz prin complementaritate un nou lan , cu ajutorul ADN-polimerazei i n prezen a unui oligonucleotid (15-20 nucleotide) denumit primer sau amors Oligonucleotidul are un cap t 3 OH liber

PCR POLYMERASE CHAIN REACTION REAC IA N LAN A POLIMERAZEI Avantajele PCR : Foarte sensibil : poate eviden ia chiar prezen a unei singure molecule de ADN Permite multiplicarea (clonarea) unei singure secven e de ADN, chiar i n afara celulei vii Ma ini automate Thermal Cycler sau Termocycler 25-30 de cicluri de amplificare n 4 ore Relativ u or de efectuat

PCR POLYMERASE CHAIN REACTION REAC IA N LAN A POLIMERAZEI

PCR ETAPELE REAC IEI PCR porne te fie de la un ADN dublucatenar care va fi sec ionat i transformat n monocatenar, fie direct de la un lan monocatenar Denaturarea ADN-ului de cercetat (95C) con ine secven a int Sc derea temperaturii i ad ugarea primerului sau amorsei hibridizare la temperatur redus (36-65C) Primerul trebuie s fie n exces pentru a mpiedica renaturarea Sinteza unui nou lan cu ajutorul ADNpolimerazei n prezen a celor 4 tipuri de nucleotide ADN (A, C, G, T)

PCR POLYMERASE CHAIN REACTION REAC IA N LAN A POLIMERAZEI

PCR ETAPELE REAC IEI Fiecare ciclu se ncheie cu sinteza unui lan dublu catenar i ncepe cu denaturarea acestui lan n al doilea ciclu se folose te drept matri att ADN-ul de origine, ct i ADN-ul nou sintetizat (datorit ADN-polimerazei) Cu fiecare ciclu de denaturare-sintez se dubleaz cantitatea de ADN rezultat din ciclul anterior (cre tere exponen ial ) Se repet 30-50 de cicluri, pn se ob ine cantitatea necesar de ADN pentru celelalte reac ii dorite (hibridiz ri, sonde, etc) Pentru evitarea erorilor se recomand repetarea de mai multe ori a acelea i reac ii pentru proba dat i folosirea de controale negative

POLIMERAZELE FOLOISTE N PCR n anii 1980 polimeraza Klenow (fragment de ADN-polimeraz I de la E. coli) Dezavantaje termolabil Apoi Taq-polimeraza, termostabil , izolat de la o bacterie termofil Thermus aquaticus n acest fel s-a ajuns n prezent la automatizarea complet a reac iei n ma inile numite Thermal Cycler Dup 4 ore i aproximativ 25-30 de cicluri de amplificare se poate ajunge la o amplificare de 106 109 ori Produsele ADn ob inute prin PCR se separ prin electorforez n gel, benzile sunt citite cu UV Apoi se realizeaz hibridiz ri prin metodele blotting (Southern sau Dot)

PCR POLYMERASE CHAIN REACTION REAC IA N LAN A POLIMERAZEI

PCR POLYMERASE CHAIN REACTION REAC IA N LAN A POLIMERAZEI

APLICA IILE PRACTICE ALE PCR Medicin : Boli ereditare: fibroz chistic , distrofia muscular Duchenne, fenilcetonuria Boli infec ioase: HIV (din stadiile precoce ale infec iei, prin identificarea ARN-ului viral), hepatite virale, herpes virus, papiloma virus, EBV, bacterii Mycobacterium tuberculosis, Clostridium difficile, Neisseria meningitidis, parazi i malaria, toxoplasmoz Boale Whipple, malakoplakia, boala Crohn Medicin legal (fire de p r, celule, snge sau sperm ) Biologie strudii de evolu ie a speciilor, migra ie uman , fosile Ecologie eviden ierea unor microorganisme din p mnt sau ap care nu au putut fi cultivate n laborator p n n prezent Arheologie mumii egiptene

SECVEN IEREA ADN-ului


Analiza structruii ADN-ului a nceput n anii 70 cu metodele de secven iere i de analiz a secven elor de nucleotide din aceste structuri Se folosesc enzimele de restric ie (endonucleaze) care pot t ia fragmentele de ADn pn la cteva sute sau mii de perechi de baze Aceste fragmente sunt apoi separate electroforetic i analizate n Germania i SUA exist b nci de date n cre sunt stnse toate secven ele de ADN cunoscute pn n prezent 1995 secven ierea complet a primului genom bacterian Haemophilus influenzae, urmat la foarte scut timp de cel al Mycoplasma genitalium n prezent - genomul uman complet

SECVEN IEREA ADN-ului


Pricipiu: t ierea lan ului de ADN n segmente i analiza ulterioar a secven elor de baze nucleotidice Prin descifrarea acestor secven e se pot delimita genele i implicit, secven a de aminoacizi codificat de acea gen , n proteina final Nu se pot ob ine, ns , informa ii despre procesele posttransla ionale pe care le sufer o protein , respectiv structura ter iar i cuaternar a acesteia Este o variant a tehnicii de recombinare a ADN-ului Condi ia necesar este existen a unui nr. suficient de mare de copii de ADN, ob inut prin clonare sau PCR

SECVEN IEREA ADN-ului i FINGERPRINTING GENOMIC Se folosesc 2 metode n prezent: metoda enzimatic Sanger (chain Termination Technique) Metoda chimic Maxam-Gilbert )de obicei combinat cu metoda Sanger) Amprente de ADN sau FINGERPRINTING genomic: pe baza analozelor secven elor de ADN, s-a demonstrat c fiecare individ este unic i c este caracterizat printr-un fingerprinting genomic (o amprent unic de ADN) Patternul individual unic este dat de regiunile hipervaraibile din ADN-ul genomic, i anume de zona ADN-urilor microsatelite Genomul uman cuprinde 70% de secven e unice identice la to i indivi ii i 30% secven e repetitive, specifice fiec rui individ Figerprintigul genomic (amprenta genetic ) este caracteristic fiec rui individ, se suprapune par ial la rude i poate fi identic la gemenii univitelini

SECVEN IEREA ADN-ului

SECVEN IEREA ADN-ului

SECVEN IEREA ADN-ului

TEHNICI DE BIOLOGIE MOLECULAR